Artykuł metodologiczny

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62217

⸱

14 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, 2Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building, University of Oxford, 3UK Dementia Research Institute, Cardiff University

W tym artykule

Podsumowanie

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Streszczenie

Mikroglej koordynuje reakcje neuroimmunologiczne w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Parkinsona i chorobie Alzheimera. Mikroglej usuwa martwe i umierające neurony w procesie efferocytozy, wyspecjalizowanej formy fagocytozy. Funkcja fagocytozy może zostać zakłócona przez środowiskowe lub genetyczne czynniki ryzyka, które wpływają na mikroglej. W artykule przedstawiono szybki i prosty protokół mikroskopii in vitro do badania efferocytozy mikrogleju w modelu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) mikrogleju, przy użyciu ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y) znakowanej barwnikiem wrażliwym na pH dla ładunku fagocytarnego. Procedura skutkuje wysoką wydajnością martwych komórek nerwiaka zarodkowego, które wykazują powierzchniową fosfatydyloserynę, rozpoznawaną przez fagocyty jako sygnał "zjedz mnie". Test na 96-dołkowej płytce nadaje się do obrazowania poklatkowego żywych komórek lub płytkę można z powodzeniem utrwalić przed dalszym przetwarzaniem i określić ilościowo za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości. Mikroskopia o wysokiej zawartości komórek stałych umożliwia zwiększenie skali testu w celu badań przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek lub oceny funkcji fagocytarnej linii iPSC wariantu genetycznego. Chociaż test ten został opracowany do badania fagocytozy całych martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC, test można łatwo dostosować do innych ładunków istotnych dla chorób neurodegeneracyjnych, takich jak synaptosomy i mielina oraz inne typy komórek fagocytarnych.

Wprowadzenie

Mikrogleje są makrofagami rezydującymi w tkance mózgowej, a do ich funkcji należą nadzór odpornościowy, koordynowanie odpowiedzi zapalnych na urazy/infekcje, przebudowa synaptyczna oraz fagocytoza martwych komórek, mieliny, agregatów białkowych i patogenów. Fagocytoza to proces, w którym mikrogleje rozpoznają ładunek za pomocą receptorów powierzchniowych i reorganizują swój cytoszkielet, aby pochłonąć obiekt do fagosomu, który następnie łączy się z lizosomami w celu degradacji ładunku. Zdrowe mikrogleje fagocytują apoptotyczne komórki mózgu, aby usunąć je, zanim ulegną one nekrozie1. Fagocytoza apoptotycznych komórek jest również znana jako efersocytoza i wymaga ekspozycji sygnału „zjedz mnie” w postaci fosfatydyloseryny przez obumierającą komórkę2. Liczne receptory mikroglejów wiążą się bezpośrednio z fosfatydyloseryną, w tym TIM-4, BAI1, Stabilin-2 i TREM2. Receptory TAM mikroglejów (np. MERTK) i integryny wiążą się z fosfatydyloseryną pośrednio, wykorzystując odpowiednio białka pomocnicze GAS6 lub MFG-E8. Do rozpoznania obumierających komórek niezbędne mogą być inne sygnały „zjedz mnie”, do których należą zmiany w glikozylacji lub ładunku białek powierzchniowych; ekspresja wewnątrzkomórkowych białek ICAM3, kalretikuliny i aneksyny-I na powierzchni komórki; utlenione LDL lub powlekanie apoptotycznej komórki produkowanym przez mikrogleje kompleментом C1q1,2.

Choroby neurodegeneracyjne, w tym choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, otępienie czołowo-skroniowe oraz stwardnienie zanikowe boczne, wiązane są z upośledzeniem funkcji mikrogleju, w tym z gromadzeniem się produktów przemiany materii w mózgu, takich jak martwe komórki, fragmenty mieliny i agregaty białkowe, a także z nadmiernymi odpowiedziami zapalnymi na te bodźce3. Fagocytoza może być upośledzona w chorobach neurodegeneracyjnych i przyczyniać się do patologii w wyniku połączenia starzenia się organizmu, stanu zapalnego lub specyficznych genetycznych wariantów ryzyka4,5. Z drugiej strony, dowody z modeli zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych wskazują, że mikroglej może niewłaściwie fagocytować żywe neurony lub synapsy6,7,8. Mechanizm ten jest prawdopodobnie inicjowany przez ekspozycję fosfatydyloseryny na uszkodzonych neurytach, która jest bezpośrednio wykrywana przez receptory fagocytozy mikrogleju TREM2 lub GPR56, albo pośrednio przez rozpuszczalne białko dopełniacza C1q pokrywające membranę wzbogaconą w fosfatydyloserynę, co prowadzi do fagocytozy zapośredniczonej przez CR39,10,11.

Testy fagocytozy in vitro, stosowane np. do oceny wpływu fenotypowego wariantu genetycznego ryzyka w mikrogleju, są często przeprowadzane z użyciem niefizjologicznych ładunków, takich jak kulki lateksowe4. Stosuje się również bakterie znakowane fluorescencyjnie oraz zymosan, które są fizjologiczne, lecz nie mają związku z chorobami neurodegeneracyjnymi. Niefizjologiczne ładunki fagocytarne mogą służyć do wykrywania defektów w podstawowym mechanizmie pochłaniania fagocytarnego, jednak nie pozwalają na dokładne modelowanie pierwszego etapu „rozpoznawania” w fagocytozie apoptotycznych neuronów. Wielkość, kształt, sztywność i rodzaj ładunku determinują również aktywowane wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne, co prowadzi do różnych stanów aktywacji mikrogleju. Na przykład bakterie E.coli są małe i sztywne, w przeciwieństwie do ludzkich komórek, a lipopolisacharydy na ich powierzchni są rozpoznawane przez receptor Toll-podobny 4 (TLR4), który aktywuje fagocytozę oraz prozapalne szlaki sygnalizacyjne2,12.

W kontekście badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi bardziej odpowiednim ładunkiem fagocytarnym byłoby taki, który wykazuje obecność fosfatydyloseryny na błonach komórkowych ssaków, a najlepiej pochodzenia ludzkiego i neuronalnego, aby uwzględnić sygnały, z którymi prawdopodobnie spotkają się mikrogleje. W tym protokole fagocytozy jako model neuronów wybrano linię komórkową neuroblastoma człowieka SH-SY5Y, która jest łatwa w hodowli. Trwała ekspozycja fosfatydyloseryny na powierzchni została sztucznie wywołana za pomocą paraformaldehydu, o którym wcześniej wykazano, że powoduje ekspozycję fosfatydyloseryny w płytkach krwi13. Jako model komórkowy mikrogleju wykorzystano ludzkie makrofagi iPSC, które naśladują ontogenezę i profil transkrypcyjny ludzkiego mikrogleju i wykazują zdolność do fagocytozy14,15,16,17. Makrofagi iPSC nie są najbardziej autentycznym dostępnym modelem mikrogleju, np. nie naśladują morfologii mikrogleju; można jednak zastąpić je bardziej autentycznym modelem monokultury mikrogleju iPSC, jeśli jest to pożądane, na przykład zgodnie z Haenseler et al.15. Ludzkie modele iPSC są preferowane w badaniach nad neurodegeneracją w porównaniu z pierwotnym mikroglejem gryzoni ze względu na obawy dotyczące ograniczonego nakładania się modułów transkrypcyjnych mikrogleju obserwowanych w tkankach dotkniętych chorobami neurodegeneracyjnymi u ludzi i myszy18. Martwe komórki SH-SY5Y barwi się barwnikiem wrażliwym na kwasy, który fluorescuje słabo przy pH obojętnym i silniej wewnątrz fagolizosomów makrofagów iPSC po fagocytozie. Zastosowanie barwnika wrażliwego na kwasy poprawia dokładność wykrywania zdarzeń fagocytarnych, zapewniając wszechstronność w odczytach z makrofagów żywych i utrwalonych19. Niniejszy protokół opisuje zarówno obrazowanie fagocytozy w czasie rzeczywistym (time-lapse) na żywych komórkach, jak i utrwalony test obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) dla fagocytozy, przy zastosowaniu tych samych etapów przygotowania komórek przed odczytem (Rysunek 1).

Schemat procesu przekształcenia komórek SH-SY5Y w makrofagi iPSC; barwienie komórek, obrazowanie, analiza danych.
Rycina 1Schemat metodologii. Schemat testu fagocytozy, w którym przygotowanie komórek SH-SY5Y oraz barwienie makrofagów pochodzących z iPSC przeprowadzane są równolegle, a następnie komórki SH-SY5Y są naddawane pipetą na makrofagi iPSC. Następnie przeprowadza się natychmiastowe obrazowanie poklatkowe żywych komórek lub komórki są inkubowane w 37 °C/5% CO2 przez wymagany czas i utrwalone przed przeprowadzeniem wysokotreściowej mikroskopii (high-content microscopy). PFA: paraformaldehyd, HBM: buforowane HEPES medium bez czerwieni fenolowej, pHr: roztwór pH-czułego czerwonego barwnika fluorescencyjnego STP Ester, PRFMM: medium dla makrofagów bez czerwieni fenolowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi stosowania ludzkich linii komórek iPS pochodzących z University of Oxford, Oxford Parkinson's Disease Centre (Komitet Etyczny: National Health Service, Health Research Authority, NRES Committee South Central, Berkshire, UK (REC 10/H0505/71)). Ludzkie iPSC należy hodować w szafce bezpieczeństwa klasy II, aby chronić pracownika przed możliwymi czynnikami zewnętrznymi. Należy przestrzegać lokalnych, krajowych i unijnych przepisów BHP. Składy pożywek do hodowli komórkowej szczegółowo opisano w Tabeli 1, a wszystkie materiały wymieniono w uzupełniającej Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórek przed eksperymentem

  1. Kultury iPSC należy hodować w pożywce do iPSC (Tabela 1>) w płytkach 6-dołkowych uprzednio pokrytych matrycą błony podstawnej kwalifikowaną dla hESC, w stanie subkonfluencji i przy niskim numerze pasażu.
  2. Różnicowanie ludzkich iPSC do prekursorów makrofagów iPSC: należy wysiać cztery miliony iPSC do 24-dołkowej płytki z mikrodofkami o niskiej adhezji w 2 mL pożywki do ciałek embrionalnych (Tabela 1>), aby pobudzić tworzenie ciałek embrionalnych, a następnie codziennie wymieniać 75% pożywki przez 5-6 dni. Ciałka embrionalne należy przenieść do kolb T175, około 150 ciałek embrionalnych na kolbę, zawierających 20 mL pożywki produkcyjnej (Tabela 1). Dożywianie należy przeprowadzać raz w tygodniu poprzez dodanie 10-20 mL pożywki produkcyjnej.
    UWAGA: Prekursory makrofagów iPSC pojawiają się w nadpłynach po około 2-3 tygodniach i są produkowane w sposób ciągły przez kilka miesięcy. W tym eksperymencie zaleca się stosowanie komórek około 6 tygodni po uruchomieniu kultur różnicujących. Wcześniej zbierane makrofagi iPSC mogą zachowywać pewną zdolność do proliferacji i wykazują mniejszą adhezję, co utrudnia równomierne wysiewanie przy niskiej gęstości komórkowej. Nie określono górnej granicy wieku dla zdolności do fagocytozy.
  3. Różnicowanie prekursorów makrofagów iPSC do makrofagów iPSC: prekursory należy zebrać, usuwając wymaganą objętość nadpłynu; przepuścić go przez sito komórkowe 40 µm w celu usunięcia grudek; wirować przy 400 x g przez 5 min, aby uzyskać osad komórkowy, a następnie resuspendować w pożywce dla makrofagów (Tabela 1). Makrofagi iPSC należy wysiać w gęstości 20 000-30 000 komórek na dołek w 96-dołkowej mikropłytce do hodowli tkanek (TC)-treated z czarnymi ściankami dołków i optycznie przezroczystym dnem, w 100 µL pożywki dla makrofagów na dołek. Należy unikać wysiewania w dołkach brzegowych i wypełnić je PBS; jest to istotne dla ograniczenia wpływu parowania na test. Różnicowanie przeprowadza się przez 6-10 dni podczas inkubacji w 37 °C/5% CO2.
    UWAGA: W tym teście zastosowano linię iPSC BIONi010-C (ECACC ID: 66540023); można jednak zastąpić ją inną linią iPSC.
  4. Komórki SH-SY5Y należy utrzymywać w stanie subkonfluencji w kolbach T75 z 20 mL pożywki dla SH-SY5Y (Tabela 1>), przeprowadzając pasażowanie co 3-4 dni.
NazwaPożywka podstawowaDodatek, stężenie końcowe
pożywka do iPSCmTeSR1-
pożywka do ciałek zarodkowychmTeSR1BMP4, 50 ng/mL
VEGF, 50 ng/ml
SCF, 20 ng/mL
Pożywka fabrycznaXVIVO15GlutaMAX, 2 mM
Penicylina, 100 j./ml
Streptomycyna, 100 µg/mL
2-merkaptoetanolo, 50 µM
IL-3, 25 ng/mL
M-CSF, 100 ng/mL
Pożywka dla makrofagówXVIVO15GlutaMAX, 2 mM
Penicylina, 100 j/ml
streptomycyna, 100 µg/mL
M-CSF, 100 ng/mL
pożywka dla linii SH-SY5YDMEM/F12Płódkowa surowica bydlęca, 10%
Penicylina, 100 j/ml
Streptomycyna, 100 µg/mL

Tabela 1: Składy pożywek.

Składniki pożywek do hodowli komórkowych użytych w protokole. Dalsze szczegóły dotyczące komponentów pożywek znajdują się w Tabeli Materiałów.

2. Przygotowanie martwych komórek SH-SY5Y

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przeprowadzić dysocjację komórek SH-SY5Y poprzez dodanie 4 mL buforu do dysocjacji komórek zawierającego rekombinowane enzymy podobne do trypsyny oraz 1,1 mM EDTA (patrz Tabela materiałów); należy go niezwłocznie usunąć, tak aby pozostało mniej niż 1 mL w formie cienkiej warstwy pokrywającej komórki. Inkubować przez 2-3 min w temperaturze 37 °C / 5% CO2.
  2. Do kolby T75 dodać 10 mL HBSS w celu wypłukania, a następnie przenieść komórki SH-SY5Y pipetą do 15 mL stożkowej probówki wirówkowej. Wirować przy 400 x g przez 5 min. Odessać supernatant i resuspender komórki w 2 mL pożywki buforowanej HEPES bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów). Należy starannie resuspender osad, używając pipety 100-1 000 µL w celu rozbicia skupisk przed utrwaleniem.
  3. Utrwalić komórki, dodając do probówki 2 mL 4% paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%). Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, okresowo delikatnie agitując probówkę.
  4. Do probówki dodać 10 mL HBSS. Wirować przy 1 200 x g przez 7 min i resuspender w 2 mL pożywki buforowanej HEPES bez czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Po kroku 2.4 jakość preparatu utrwalonych komórek SH-SY5Y można kontrolować poprzez barwienie anneksyną V-FITC w celu wykazania dostępnej fosfatydyloseryny oraz jodkiem propidyny w celu pomiaru przepuszczalności komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Porównać utrwalony preparat z żywymi komórkami SH-SY5Y uzyskanymi w kroku 2.2. Patrz sekcja 7 oraz Rycina uzupełniająca S1. Przechowywanie utrwalonych komórek SH-SY5Y po kroku 2.4 nie jest zalecane, ponieważ nie zostało to ocenione.

3. Znakowanie martwych komórek SH-SY5Y barwnikiem fluorescencyjnym o barwie czerwonej, czułym na pH

  1. Po kroku 2.4 należy policzyć komórki i przenieść wymaganą całkowitą liczbę komórek do probówki o pojemności 2 mL o niskim wiązaniu białek. Dla każdego 1 miliona komórek SH-SY5Y należy uzupełnić całkowitą objętość w probówce 2 mL do 300-500 µL za pomocą pożywki buforowanej HEPES bez czerwieni fenolowej. Probówkę należy krótko ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Należy zrekonstytuować pH-czuły czerwony barwnik fluorescencyjny STP ester (patrz Tabela materiałów) i dodać 12,5 µg barwnika na milion komórek SH-SY5Y do ogrzanej probówki 2 mL z komórkami. Wymieszać delikatnie za pomocą pipetowania. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 min, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Ester STP barwnika pH-czułego reaguje z aminami pierwotnymi, dlatego bufor znakujący nie może zawierać wolnych amin. Ze względu na potencjalnie ograniczoną rozpuszczalność w buforach wodnych, barwnik rozpuszczony w DMSO należy dodawać wyłącznie do ogrzanego buforu wodnego, natychmiast wymieszać i sprawdzić pod kątem obecności osadu (ciemnych cząsteczek pod mikroskopem świetlnym).
  3. Dodać 1 mL HBSS i wirować przy 1200 x g przez 7 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i przemyć 2 mL HBSS. Powtórzyć wirowanie.
  4. Odrzucić nadsącz i ponownie zawiesić komórki w pożywce dla makrofagów bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów), do stężenia 200 000-1,2 miliona komórek/mL, tak aby 50 µL zawierało 10 000-60 000 komórek (tj. od 0,5x do 3x więcej komórek SH-SY5Y niż makrofagów iPSC).
    UWAGA: Czerwień fenolowa w pożywce zwiększa fluorescencję tła, dlatego w przypadku obrazowania żywych komórek należy stosować pożywkę bez czerwieni fenolowej. Przechowywanie zabarwionych komórek SH-SY5Y przez więcej niż kilka godzin nie jest zalecane, ponieważ nie zostało to ocenione. Przechowywać zabarwione komórki SH-SY5Y na lodzie i chronić przed światłem.

4. Barwienie makrofagów pochodzących z iPSC

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować w pożywce dla makrofagów roztwór głęboko czerwonego fluorescencyjnego, przenikającego przez błony komórkowe barwnika reagującego z estremytami succinimidylowymi (patrz Tabela materiałów). Dodać Hoechst 33342 (patrz Tabela materiałów). Podgrzać roztwór roboczy do 37 °C w kąpieli wodnej.
  2. Ostrożnie odessać pożywkę dla makrofagów iPSC, przenosząc supernatant komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnego zbiornika. Do makrofagów iPSC dodać 70 µL/studzienkę przygotowanego w kroku 4.1 roztworu barwnika, używając pipety wielokanałowej. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C/5% CO2.
  3. Przygotować preparaty do eksperymentalnych traktowań w pożywce dla makrofagów wolnej od czerwieni fenolowej. Włączyć 10 µM cytochalazyny D jako traktowanie kontrolne negatywne. Po inkubacji bardzo delikatnie odessać pożywkę dla makrofagów iPSC za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie dodać 100 µL/studzienkę zbuforowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) w celu przemycia. Natychmiast usunąć HBSS poprzez delikatne pipetowanie, a następnie dodać 100 µL pożywki ± związki. Inkubować od 10 min do 1 h w temperaturze 37 °C/ 5% CO2.
    ​UWAGA: Cytochalazyna D jest silnym inhibitorem aktyny i blokuje fagocytozę. W przypadku traktowań eksperymentalnych wymagających dłuższej inkubacji, np. 24-72 h, przeprowadzić traktowanie przed krokiem 4.1, stosując 100 µL/studzienkę preparatu w pełnej pożywce dla makrofagów. Następnie wykonać kroki 4.1-4.3 zgodnie z protokołem, aby przeprowadzić barwienie komórek, a następnie ponownie zastosować traktowanie w pożywce dla makrofagów wolnej od czerwieni fenolowej na pozostały czas testu fagocytozy.

5. Obrazowanie fagocytozy

Poniżej przedstawiono dwie różne metody odczytu fagocytozy; należy wybrać podrozdział 5.1 lub 5.2.

  1. Obrazowanie timelapse żywych komórek
    1. Przed rozpoczęciem fagocytozy włącz mikroskop do obrazowania timelapse żywych komórek (patrz Tabela materiałów), komputer, komorę środowiskową oraz dopływ gazu CO2. Otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazów. Sprawdź, czy kostki filtracyjne DAPI, RFP i CY5 są zainstalowane w mikroskopie. Kliknij Time Lapse | Incubate | Enable Environment Chamber i wybierz ogrzewanie do 37 °C z gazem CO2, upewniając się jednocześnie, że opcja wilgotności jest odznaczona. Odczekaj 30 min, aż mikroskop nagrzeje się do 37 °C.
    2. Podczas inkubacji z związkiem w kroku 4.3 włóż płytkę z iPSC-makrofagami do mikroskopu.
    3. Kliknij Image | Capture | Vessel Expert. Wybierz Well Plate i wybierz typ płytki 96-dołkowej.
    4. W zakładce Image włącz kanał fazowy i ustaw ostrość (grubą i precyzyjną) za pomocą suwaków pionowych, tak aby komórki były w polu widzenia. Dostosuj poziomy oświetlenia za pomocą suwaka poziomego. Kliknij kanały DAPI, RFP i CY5 i dostosuj poziomy oświetlenia dla każdego z nich.
    5. W zakładce System kliknij Calibrate Vessel Alignment i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie.
    6. Kliknij Time Lapse | Routines | Create New Routine. Na pierwszym ekranie kreatora Time Lapse Wizard nadaj nazwę procedurze. Kliknij Next. Na drugim ekranie wybierz obiektyw 20x, wybierz przechwytywanie Monochrome i zaznacz kanały DAPI, RFP, CY5 oraz fazowy. Nie wybieraj następujących opcji: Auto Find Sample, Auto fine focus, Z-Stack, Auto lighting. Kliknij Next.
    7. Na następnym ekranie ustaw punkt odniesienia (beacon) w centrum każdego dołka, co pozwoli mikroskopowi powracać do tych samych współrzędnych z tymi samymi ustawieniami oświetlenia dla każdego punktu czasowego. Ustawienia ostrości i oświetlenia dla każdego punktu odniesienia są niezależne. Aby ustawić punkt odniesienia: przeciągnij niebieski okrąg w odpowiednie miejsce na mapie płytki, użyj pionowego suwaka ostrości grubej i precyzyjnej, a po uzyskaniu satysfakcjonującego efektu kliknij Add Beacon. Ustawienia punktów odniesienia można zaktualizować później za pomocą przycisku Update Selected.
    8. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia testu fagocytozy, wyjmij płytkę testową i umieść ją w komorze bezpiecznej biologicznie. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 50 µL komórek SH-SY5Y do każdego dołka, dozując ciecz przy ściance każdego dołka na brzegu cieczy.
    9. Włóż płytkę do mikroskopu i odczekaj około 30 min, aż nastąpi wyrównanie termiczne.
      UWAGA: W ciągu pierwszych 30 min przebywania płytki w mikroskopie zmiana temperatury płytki testowej spowoduje przesunięcie ostrości. Jeśli płytce nie zostanie zapewniono czasu na wyrównanie temperatury, przechwycone obrazy będą tracić ostrość podczas sekwencji timelapse.
    10. Kliknij każdy punkt odniesienia i zaktualizuj ustawienie ostrości. Kliknij Next. Na następnym ekranie kreatora Time Lapse Wizard wybierz format pliku TIFF, włącz opcję Save Individual Channels (zapisuj poszczególne kanały), włącz opcję Create Video for Each Beacon (twórz wideo dla każdego punktu odniesienia) oraz zaznacz opcje pod napisem Include the following information as a watermark (dołącz następujące informacje jako znak wodny). Kliknij Next.
    11. Ustaw Number of Scenes na 1. Kliknij Next. Ustaw czas trwania i interwały obrazowania timelapse, np. 3 h i obrazowanie co 5 min. Nie zaznaczaj opcji Capture one frame only. Kliknij Next.
    12. Włącz komorę środowiskową z temperaturą 37 °C i CO2 (wilgotność jest opcjonalna przy krótkich eksperymentach). Kliknij dwukrotnie Next. Wybierz ścieżkę zapisu danych. Kliknij Next. Kliknij Start, aby rozpocząć timelapse.
  2. Obrazowanie high-content utrwalonych komórek
    1. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 50 µL znakowanych komórek SH-SY5Y do każdego dołka, dozując ciecz przy ściance każdego dołka na brzegu cieczy. Inkubuj w 37 °C/ 5% CO2 przez 3-5 h.
    2. Po inkubacji fagocytowej ostrożnie odessij supernatanty komórkowe za pomocą pipety wielokanałowej i je odrzuć. Przemyj raz 100 µL PBS.
    3. Utrwal płytkę, dodając 100 µL 2% paraformaldehydu, inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    4. Odessij zawartość dołków i dodaj 100 µL PBS. Przykryj uszczelniaczem do płytek i folią; przechowuj w 4 °C do czasu użycia.
      UWAGA: Płytkę testową można tak przechowywać przez co najmniej tydzień bez znaczącej degradacji sygnału; dłuższe przechowywanie nie było badane.
    5. Włącz mikroskop do obrazowania high-content (patrz Tabela materiałów) i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazów. Włóż płytkę testową do mikroskopu, klikając ikonę Load w górnej części ekranu.
    6. Wybierz zakładkę Setup. W menu rozwijanym w górnym lewym polu: wybierz odpowiedni typ płytki, opcję autofokusa Two Peak (Default), obiektyw 40x Water, NA1.1, tryb Confocal oraz binning 1.
    7. Przed użyciem przepłucz obiektyw wodny 40x poprzez menu Settings.
    8. W polu Channel Selection użyj ikony +, aby dodać kanały DAPI, Alexa 647 oraz Alexa 568. Ustaw je tak, aby pomiar odbywał się w jednej płaszczyźnie o grubości 1 µm. Zoptymalizuj ustawienia Time (czas) i Power (moc) dla wydajności barwienia płytki testowej.
      UWAGA: Jako wytyczne ustaw dla DAPI czas ekspozycji 200 ms i moc 100%, dla Alexa 647 czas ekspozycji 1500 ms i moc 100%, a dla Alexa 568 czas ekspozycji 100 ms i moc 40%.
    9. Upewnij się, że kanały nie są mierzone jednocześnie, klikając Channel Sequence, aby rozdzielić kanały.
    10. W sekcji Navigation | Define Layout wybierz dołki do pomiaru i wybierz od 9 do 12 pól na dołek.
    11. Podczas konfiguracji kliknij reprezentatywne pole na mapie płytki i sprawdź po kolei każdy kanał pomiarowy, aby upewnić się, że barwienie jest obecne, a obrazy są ostre, regulując przesunięcie kanału (channel offset).
    12. Aby dane zostały przesłane na serwer do zdalnej analizy, kliknij pole Online Jobs i odpowiednią nazwę ekranu; umożliwi to automatyczne przesyłanie danych na serwer po obrazowaniu.
    13. Zapisz protokół badania, klikając przycisk Save.
    14. Kliknij zakładkę Run Experiment u góry i nadaj nazwę płytce eksperymentalnej, a następnie kliknij Start.

6. Analiza danych

Poniżej przedstawiono dwie różne metody analizy danych; wybierz podrozdział 6.1, jeśli zastosowano procedurę z podrozdziału 5.1, lub podrozdział 6.2, jeśli zastosowano procedurę z podrozdziału 5.2.

  1. Analiza obrazów fagocytozy uzyskanych za pomocą mikroskopu time-lapse do żywych komórek
    1. Pobierz i zainstaluj zalecane oprogramowanie open-source (patrz Tabela materiałów). Otwórz oprogramowanie.
    2. W polu modułów wejściowych (Input modules) wybierz Images.
    3. W Eksploratorze Windows otwórz folder z danymi, zawierający podfoldery o nazwach Beacon-1, Beacon-2 itd. Wybierz i przeciągnij wszystkie foldery Beacon do pola File list.
    4. W polu Input modules wybierz Metadata. Dla opcji Extract Metadata? wybierz Yes. W menu rozwijanym obok Metadata Extraction Method wybierz Extract From File/Folder Names. Jako Metadata Source wybierz Folder Name. Kliknij lupę po prawej stronie wyrażenia regularnego i wpisz ".*[\.*](?P.*)$" w polu tekstowym Regex (bez cudzysłowów). Kliknij Submit. Dla opcji Extract Metadata From wybierz All Images. Kliknij Update na dole ekranu. Obrazy zostaną teraz pogrupowane według beaconów.
    5. W polu Input Modules wybierz NamesAndTypes. Następujący proces pozwoli przypisać obrazy z każdego punktu czasowego do odpowiedniego kanału fluorescencji. Przypisz nazwę do Images Matching Rules (menu rozwijane). Wybierz kryteria dopasowania reguły All (menu rozwijane) z następujących reguł: File (menu rozwijane), Does (menu rozwijane), Contain (menu rozwijane), DAPI (pole tekstowe). Nazwa do przypisania do tych obrazów: DAPI (pole tekstowe). Wybierz typ obrazu Greyscale Image (menu rozwijane). Ustaw zakres intensywności na Image Metadata (menu rozwijane).
    6. Na dole ekranu kliknij Add Another Image i powtórz krok 6.1.5. Zastąp DAPI przez RFP, aby zgrupować obrazy RFP.
    7. Powtórz krok 6.1.6 dla obrazów z kanału CY5.
    8. Kliknij Update na dole ekranu; pliki obrazów zostaną teraz wyświetlone w trzech kolumnach oznaczonych jako DAPI, RFP i CY5.
    9. W polu Input Modules wybierz Groups. Dla pytania Do you want to group your images? wybierz Yes. W menu rozwijanym dla Metadata Category wybierz Beacon.
    10. W polu Analysis Modules kliknij prawym przyciskiem myszy na białym obszarze, aby wyświetlić listę wszystkich modułów.
    11. Kliknij Add | Image Processing | EnhanceOrSuppressFeatures. Wybierz DAPI z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obraz wyjściowy „DAPIspeckles”. Wybierz typ operacji Enhance i typ cechy Speckles, z rozmiarem cechy 20 pikseli. Wybierz opcję szybkości i dokładności Fast/Hexagonal.
    12. Utwórz nowy moduł: Add | Object processing | IdentifyPrimaryObjects. Wybierz DAPIspeckles z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obiekty pierwotne „Nuclei”. Wprowadź typową średnicę obiektów od 10 do 35 jednostek pikseli; parametr ten można zoptymalizować. Wybierz strategię progowania Global, metodę progowania RidlerCalvard, metodę wygładzania Automatic i podaj czynnik korekcji progu 12 z granicami dolną i górną 0-1. Zmień metodę rozdzielania zlepków obiektów na Shape, pozostawiając pozostałe parametry w ustawieniach domyślnych.
      UWAGA: Jądra makrofagów iPSC zostały wstępnie wysegmentowane w kroku 6.1.12, po etapie przetwarzania obrazu redukującym średnicę i zwiększającym kontrast jąder. Ważne jest, aby wybrać tylko najjaśniejsze jądra, ponieważ w przeciwnym razie komórki SH-SY5Y będą widoczne jako słabiej fluorescencyjne jądra i zostaną pomylone z makrofagami iPSC. Aby dostosować proporcję wybranych jąder, zwiększ lub zmniejsz czynnik korekcji progu. W fazie testowej porównaj wynikowy wybór jąder z obrazem fazowym beacona, na którym łatwo jest odróżnić makrofagi iPSC od SH-SY5Y na podstawie morfologii komórek.
    13. Utwórz nowy moduł: Add | Image processing | CorrectIlluminationCalculate. Wybierz CY5 z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obraz wyjściowy „IllumCY5”. Dla opcji Select How the Illumination wybierz Background z menu rozwijanego. Pozostałe parametry pozostaw w ustawieniach domyślnych.
    14. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | Image processing | CorrectIlluminationApply. Wybierz CY5 z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obraz wyjściowy „CorrCY5”. Dla opcji Select the Illumination wybierz IllumCY5 z menu rozwijanego. Dla opcji Select How the Illumination wybierz Divide z menu rozwijanego.
      UWAGA: Celem kroków 6.1.13-6.1.14 jest korekcja zmienności oświetlenia tła obrazów CY5, co w przeciwnym razie utrudniłoby prawidłową segmentację komórek.
    15. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | Object processing | IdentifySecondaryObjects. Wybierz CorrCY5 z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Wybierz Nuclei jako obiekty wejściowe. Nazwij obiekty wtórne „Mac”. Wybierz metodę identyfikacji Distance - B. Wybierz strategię progowania Global, metodę progowania RidlerCalvard, metodę wygładzania No smoothing i podaj czynnik korekcji progu 1 z granicami dolną i górną 0-1. Pozostałe parametry pozostaw w ustawieniach domyślnych.
      UWAGA: Ten etap segmentacji komórek może wymagać optymalizacji poprzez dostosowanie czynnika korekcji progu w celu powiększenia lub pomniejszenia granic komórek. Efektywność segmentacji można również poprawić poprzez zwiększenie intensywności barwienia makrofagów iPSC lub natężenia oświetlenia kostki CY5 podczas obrazowania.
    16. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | Image processing | EnhanceOrSuppressFeatures. Wybierz RFP z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obraz wyjściowy „FilteredRFP”. Wybierz typ operacji Enhance i typ cechy Speckles, z rozmiarem cechy 15 pikseli. Rozmiar cechy można zoptymalizować. Wybierz opcję szybkości i dokładności Fast/Hexagonal.
    17. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | Object processing | IdentifyPrimaryObjects. Wybierz FilteredRFP z pierwszej listy rozwijanej jako obraz wejściowy. Nazwij obiekty pierwotne „pHr”. Wprowadź typową średnicę obiektów od 5 do 20 jednostek pikseli. Wybierz strategię progowania Manual i wpisz próg ręcznie, np. 0.005. Zmień metodę rozdzielania zlepków obiektów na Shape, pozostawiając pozostałe parametry w ustawieniach domyślnych.
      UWAGA: Komórki SH-SY5Y zostały wysegmentowane w kroku 6.1.17, po etapie przetwarzania obrazu redukującym średnicę i zwiększającym kontrast punktów. Kluczowe jest ręczne ustawienie progu, ponieważ intensywność barwnika wrażliwego na pH rośnie w czasie w cząstkach fagocytowanych, a inne strategie progowania sztucznie zawyżyłyby liczbę punktów barwnika wrażliwego na pH w wczesnych punktach czasowych. Ręczne progowanie musi być dostosowywane dla każdego kolejnego powtórzenia eksperymentu przy użyciu trybu testowego.
    18. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | Object processing | RelateObjects. Wybierz obiekty potomne (child objects) pHr z menu rozwijanego. Wybierz obiekty nadrzędne (parent objects) Mac z menu rozwijanego. Dla opcji Calculate Per-Parent Means for All Child Measurements? wybierz Yes. Nie obliczaj odległości między potomkami a rodzicem (None).
      UWAGA: Krok 6.1.18 wiąże sygnał barwnika wrażliwego na pH z makrofagami iPSC, co pozwala na pomiar średniej liczby fagocytowanych obiektów na jeden makrofag iPSC.
    19. Utwórz nowy moduł: kliknij Add | File processing | ExportToSpreadsheet. Wybierz separator kolumn Tab i dodaj prefiks do nazw plików, aby wskazać numer beacona. Wybierz konkretne pomiary do eksportu, zgodnie z poniższymi wskazówkami (kroki 6.1.19.1 - 6.1.19.4); pozostałe parametry pozostaw w ustawieniach domyślnych.
      1. Image | Count | Wybierz pHr i Mac
      2. Image | FileName
      3. Image | Group
      4. Mac | Children | pHr
    20. W polu Output kliknij View Output Settings. Utwórz na pulpicie nowy folder dla tego eksperymentu i ustaw go jako domyślny folder wyjściowy.
    21. Zapisz potok przetwarzania: File | SaveProject As....
    22. Przetestuj i zoptymalizuj potok na reprezentatywnym obrazie, klikając Start Test Mode w lewym dolnym rogu. Program automatycznie wybiera pierwszy obraz do testów; każdy krok potoku można przejrzeć, klikając symbole oka (aby wyświetlić wynik), a następnie klikając Run. Aby zmienić beacona używanego do testów, w górnym pasku menu kliknij Test | Choose Image Group. Aby zmienić obraz (punkt czasowy) w obrębie beacona, w górnym pasku menu kliknij Test | Choose Image Set. Parametry wymagające optymalizacji zostały określone w poprzednich krokach.
    23. Po uzyskaniu satysfakcjonujących wyników potoku kliknij Exit Test Mode i kliknij otwarte symbole oka, aby je zamknąć. Zapisz potok. Kliknij Analyze Images, aby rozpocząć pełną analizę obrazów.
    24. Wygenerowane pliki tekstowe można otworzyć jako arkusz kalkulacyjny za pomocą odpowiedniego oprogramowania; plik oznaczony jako „Image” będzie zawierał wiersz dla każdego punktu czasowego obrazu, a kolumny będą reprezentować parametry.
      UWAGA: Count_Mac i Count_pHr reprezentują liczbę makrofagów iPSC oraz liczbę zidentyfikowanych obiektów wrażliwych na pH na obrazie. Nie używaj danych Count_pHr, ponieważ liczba ta obejmuje słabo fluorescencyjne komórki SH-SY5Y, które nie zostały fagocytowane. Kolumna Mean_Mac_Children_pHr_Count podaje średnią liczbę fagocytowanych obiektów pHr na jeden Mac (krok 6.1.18 RelateObjects) dla pojedynczego obrazu, czyli pojedynczego punktu czasowego beacona.
    25. Uporządkuj dane tak, aby każdy beacon stanowił oddzielną kolumnę w arkuszu, obrazy były ułożone w wierszach w kolejności chronologicznej, a różne parametry znajdowały się w różnych arkuszach skoroszytu.
    26. Pomnóż pomiary Mean_Mac_Children_pHr_Count przez Count_Mac, aby uzyskać parametr „Liczba punktów na obraz”. Oblicz średnią wartość Count_Mac dla każdego Beacona. Podziel liczbę punktów na obraz przez średnią wartość Count_Mac dla tego beacona, aby uzyskać parametr „Liczba punktów na komórkę”.
      UWAGA: Krok 6.1.26 koryguje ewentualne błędne wahania, które mogą wystąpić w liczbie makrofagów iPSC (Count_Mac), poprzez normalizację danych do średniej liczby makrofagów iPSC we wszystkich punktach czasowych danego Beacona.
    27. Przypisz do każdego wiersza obrazu czas od rozpoczęcia fagocytozy (w min).
    28. Wylicz średnie i odchylenia standardowe dla powtórzeń w studzienkach/beaconach. Wykreśl liczbę punktów na komórkę (oś y) w funkcji czasu (oś x), aby zwizualizować tempo fagocytozy.

Schemat segmentacji komórek ilustrujący internalizację SH-SY5Y w makrofagach iPSC.
Rysunek 2: Segmentacja komórek w analizie fagocytozy wysokiej treści. Ilustracja demonstrująca prawidłową i nieprawidłową segmentację makrofaga iPSC znajdującego się w bliskim sąsiedztwie niefagocytowanej komórki SH-SY5Y, przy czym druga komórka SH-SY5Y została w pełni fagocytowana. Przy obu typach komórek przedstawionych w kolorze szarym, obrys granicy komórki makrofaga iPSC wyznaczony przez analizę komputerową zaznaczono kolorem niebieskim. Komórki SH-SY5Y liczone jako zdarzenia fagocytozy są obrysowane kolorem zielonym, natomiast te wykluczone z analizy – kolorem czerwonym. Obraz w środku przedstawia nieprawidłową segmentację; makrofag iPSC posiada nieoptymalne wyznaczenie granicy, która obejmuje niefagocytowaną komórkę SH-SY5Y wewnątrz obrysu komórki, co zostanie policzone jako zdarzenie fagocytozy. Obraz po prawej stronie przedstawia prawidłową segmentację dzięki zastosowaniu bardziej rygorystycznych parametrów definiujących granicę komórki makrofaga iPSC, co doprowadziło do poprawnego wykluczenia niefagocytowanej komórki SH-SY5Y z analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Analiza obrazów fagocytozy uzyskanych za pomocą mikroskopu wysokoprzepustowego (high-content)
    1. Zaloguj się do zalecanego oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów).
    2. Wybierz folder z nazwą ekranu oraz podfolder z uruchomieniem obrazowania z menu po lewej stronie. Kliknij w Analiza obrazu ikona (ekran z lupą). Wybierz reprezentatywną studzienkę na schemacie płytki, aby skonfigurować potok analizy.
    3. Pierwszym modułem analizy jest obraz wejściowy. Pozostaw ustawienia domyślne dla przetwarzania stosu (Poszczególne płaszczyzny) oraz korekcja pola płaskiego (Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.). Kliknij znak + w prawym górnym rogu bloku, aby dodać kolejny blok budulcowy, a następnie wybierz Wykrywanie jąder komórkowych.
    4. W Wykrywanie jąder komórkowychustaw kanał jako DAPI, populację ROI jako Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., metoda segmentacji jako CPole metody zawiera menu rozwijane umożliwiające optymalizację parametru, z ustawieniami dla wspólnego progu (tj. 0,40) i obszaru (tj. >30 µm2). Nazwij populację wyjściową „Nuclei”. Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, a następnie wybierz Lokalizacja cytoplazmy.
    5. W Lokalizacja cytoplazmy, ustaw kanał jako Alexa 647 a metoda jako BPole metody zawiera menu rozwijane, które umożliwia optymalizację parametru, z ustawieniami dla progu wspólnego (tj. 0,45) oraz progu indywidualnego (tj. 0,20). Dodaj kolejny blok budulcowy, klikając symbol +, a następnie wybierz Wybór populacji.
      UWAGA: Kluczowe jest odpowiednie zoptymalizowanie segmentacji cytoplazmy w taki sposób, aby wykluczyć wszystkie sąsiednie komórki SH-SY5Y, które nie zostały poddane fagocytozie, przy jednoczesnym zachowaniu sfagocytowanej zawartości (patrz Rysunek 2).
    6. W Wybór populacjizachowaj ustawienia domyślne, które będą dotyczyć populacji Jądra komórkowe, metoda Najczęstsze filtry, kleszcz dla Usuwanie obiektów z krawędzioraz nazwij populację wyjściową „Nuclei Selected”. Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, a następnie wybierz Obliczanie właściwości morfologicznych.
    7. W Obliczanie właściwości morfologicznych, ustaw wielkość populacji na Wybrane jądra komórkoweregion do Komórka, metoda w celu StandardW menu rozwijanym upewnij się, że wybrano pole (area) oraz okrągłość (roundness) (µm2). Nazwij populację wyjściową „Morphology Cell”. Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, a następnie wybierz Wybór populacji.
    8. W Wybór populacji (2)wybierz populację Wybrane jądra komórkoweoraz metoda Filtruj według właściwościW rozwijanym polu pod Filtr F1, wybierz Morfologia: Pole powierzchni komórki [µm2]Wybierz > z menu rozwijanego po prawej stronie i wpisz 160 w polu po prawej stronie. Nazwij populację wyjściową „Nuclei Selected 2”. Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, a następnie wybierz Znajdź plamki.
      UWAGA: Ten krok wyklucza z dalszej analizy wszelkie nieprawidłowo wysegmentowane oraz martwe komórki. Może być konieczna optymalizacja poprzez zwiększenie lub zmniejszenie wartości odcięcia.
    9. W Znajdź plamkiwybrać kanał Alexa 568populacja ROI Wybrane jądra 2, obszar ROI Komórka, metoda Bi nazwij populację wyjściową „Spots”. W razie potrzeby metodę można zoptymalizować za pomocą menu rozwijanego, dostosowując ustawienia czułości detekcji (np. 0,20) oraz czułości rozdzielania (np. 0,400). Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, i wybierz Obliczanie właściwości morfologicznych.
    10. W Obliczanie właściwości morfologicznych (2)wybierz populację Plamyregion Plama, oraz metoda StandardW menu rozwijanym upewnij się, że wybrano pole powierzchni oraz okrągłość (µm2). Nazwij właściwości wyjściowe „Morphology Spot”. Dodaj kolejny blok budulcowy, klikając symbol +, a następnie wybierz Wybór populacji.
    11. W Wybór populacji (3), wybierz populację Plamki oraz metoda Filtruj według właściwościW rozwijanych polach pod Filtr F1wybierz Powierzchnia plamki [px]2], >, 20W polach rozwijanych poniżej Filtr F2wybierz Powierzchnia plamki [px]2], <, 2500W polach rozwijanych poniżej Filtr F3, wybierz Morfologia okrągłości plamki, >, 0.6W rozwijanych polach pod Filtr F4wybierz Intensywność plamki w stosunku do regionu, >, 2.5Nazwij populację wyjściową „Spots Selected”. Dodaj następny blok budulcowy, klikając symbol +, a następnie wybierz Wybór populacji.
      UWAGA: Automatyczny wybór punktów spowoduje wysegmentowanie wielu niewielkich fluorescencyjnych plamek, które wynikają z obecności ciał autofluorescencyjnych w makrofagach pochodzących z iPSC. Celem tego etapu jest odfiltrowanie ciał autofluorescencyjnych poprzez zastosowanie rygorystycznych progów odcięcia dla pola powierzchni, okrągłości i intensywności punktów; krok ten może wymagać optymalizacji.
    12. W Wybór populacji (4)wybierz populację Wybrane jądra 2 oraz metoda Filtruj według właściwościW rozwijanych polach pod Filtr F1wybierz Liczba plam, >, 0.5Nazwij populację wynikową „Spot Positive Cells”. Dodaj kolejny blok, klikając symbol +, a następnie wybierz Zdefiniuj wyniki.
    13. W Zdefiniuj wynikiwybrać pierwszą metodę jako Lista wynikówUstawienie domyślne określa liczbę obiektów, które mają zostać obliczone dla każdej populacji. Kliknij menu rozwijane dla Populacja: Wybrane jądra 2 i upewnij się, że Liczba obiektów jest zaznaczone, a w Zastosuj do wszystkich wybierz z menu rozwijanego Ostra białaczka limfoblastycznaDla populacji Znakuj komórkę dodatniąupewnij się, że Liczba obiektów zaznaczone. W przypadku pozostałych populacji nie ma potrzeby raportowania żadnych parametrów. Wybierz drugą metodę jako Wynik formułyi wpisz wzór (a/b)*100Wybierz zmienną A Liczba obiektów – komórki pozytywne w teście Spot, a jako zmienną B wybierz Wybrane jądra 2 – Liczba obiektówNazwij wynik jako „Spot Positive Cells (%)”.
    14. Zapisz potok: kliknij ikonę Zapisz analizę na dysku (dyskietka ze strzałką skierowaną w dół).
    15. Kliknij ikonę Analiza seryjna (ikona lejka i kół zębatych u góry ekranu). Z folderów eksperymentalnych po lewej stronie wybierz plik z surowymi danymi, co powinno zaktualizować liczbę wybranych pomiarów na 1W ramach Opcje analizy region, kliknij menu rozwijane dla Metoda, i wybierz Istniejąca analizaKliknij symbol … obok pola Script File i wyszukaj zapisany plik analizy (z rozszerzeniem .aas). Następnie kliknij zieloną strzałkę obok przycisku Start Analysis. Postęp analizy można monitorować, klikając w Status zadania (w prawym górnym rogu ekranu).
    16. Po zakończeniu analizy kliknij kartę Eksportwybrać folder eksperymentu, a następnie wskazać folder docelowy. Pozostawić ustawienia domyślne, które eksportują dane, ale nie obrazy TIFF, i rozpocząć eksport.
    17. Otwórz pobrany plik w odpowiednim programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Studzienki są uporządkowane w wierszach, a parametry w kolumnach. Wybierz dane w kolumnach opisanych jako Spot Positive Cells (%), Nuclei Selected 2 - Number of Spots - Mean per Well oraz Nuclei Selected 2 - Total Spot Area - Mean per Well i skopiuj je do nowych arkuszy dla każdego parametru. Oblicz średnią wartość parametru dla powtórzeń studzienek w każdym wariancie badawczym i przedstaw wyniki na odpowiednich wykresach.

7. Analiza kontroli jakości jednorodności utrwalonych komórek SH-SY5Y

  1. Pobrać alikwot żywych komórek SH-SY5Y z kroku 2.2 i resuspendować w buforze wiążącym anneksynę z zestawu do barwienia anneksyną V-FITC (patrz Tabela materiałów) do uzyskania stężenia około 200,000 komórek na mL.
  2. Pobrać alikwot utrwalonych komórek SH-SY5Y z kroku 2.4 i resuspendować w buforze wiążącym anneksynę do uzyskania stężenia około 200,000 komórek na mL.
  3. Przygotować dwie probówki zawierające 5 µL anneksyny V-FITC i 5 µL jodku propidyny (patrz Tabela materiałów). Do jednej probówki dodać 500 µL żywych komórek SH-SY5Y, a do drugiej 500 µL utrwalonych komórek SH-SY5Y.
  4. Przygotować trzy probówki kontrolne: jedną z 5 µL anneksyny V-FITC, jedną z 5 µL jodku propidyny oraz jedną pustą. Wymieszać żywe i utrwalone komórki SH-SY5Y w stosunku 1:1, a następnie dodać po 500 µL tej mieszaniny do każdej probówki kontrolnej.
  5. Delikatnie wymieszać zawartość probórek poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, chroniąc przed światłem.
  6. Niezwłocznie zmierzyć próbki na cytometrze przepływowym (Ex = 488 nm; Em = 530 nm), wykorzystując detektor sygnału FITC (zazwyczaj FL1) dla anneksyny V-FITC oraz detektor sygnału emisji fikoerytryny (zazwyczaj FL2) dla jodku propidyny.
  7. Użyć dowolnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, aby wyświetlić wykresy kropkowe sygnału FITC względem PI i za pomocą prostokątnego narzędzia bramkowania wybrać populację podwójnie negatywną. W obrębie populacji podwójnie negatywnej wyświetlić FSC względem SSC i za pomocą wielokątnego narzędzia bramkowania utworzyć bramkę wykluczającą wokół populacji o bardzo niskich wartościach FSC i SSC, która jest klasyfikowana jako debris i tym samym wykluczona z dalszej analizy. Wyświetlić pozostałe zdarzenia jako sygnał FITC względem PI i użyć kontroli z pojedynczym barwieniem oraz kontroli niebarwionej do ustawienia bramki kwadrantowej dla zdarzeń FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC-/PI+ oraz FITC+/PI+.
    UWAGA: Należy unikać gwałtownego obchodzenia się z próbkami, wstrząsania w wortexie lub długich inkubacji żywych komórek SH-SY5Y, co mogłoby sztucznie wywołać ekspozycję fosfatydyloseryny. Przystąpić do cytometrii przepływowej bez zwłoki. Pożądanym wynikiem jest proporcja zdarzeń FITC-/PI- <5% w utrwalonych komórkach SH-SY5Y. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Ryc. uzupełniającej S1.

Wyniki

Obrazowanie typu time-lapse żywych komórek przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, wysiewając makrofagi pochodzące z iPSC typu dzikiego w zagęszczeniu 20 000 komórek na studzienkę. Zastosowano różne ilości komórek SH-SY5Y (od 10 000 do 30 000 na studzienkę, zgodnie z szacunkiem z liczenia komórek w kroku 3.1), a w niektórych studzienkach przeprowadzono preinkubację (1 h) z cytochalazyną D, inhibitorem fagocytozy, która służyła jako kontrola hamująca fagocytozę dla każdej ilości komórek SH-SY5Y. Obrazowanie rozpoczęto 40 min po dodaniu komórek SH-SY5Y, a obrazy rejestrowano w odstępach 5-minutowych przez kolejne 3 h (dane obejmują początkową 40-minutową przerwę). Reprezentatywny film time-lapse znajduje się w Dane uzupełniająceoraz przeanalizowano dane ilościowe przedstawione w Rycina 3Przy gęstości 10 000 komórek SH-SY5Y na studzienkę liczba fagocytowanych cząsteczek (punktów) na komórkę wzrastała liniowo w czasie i została zahamowana o około 50% przez cytochalazynę D. Hamowanie przez cytochalazynę D było słabsze od oczekiwanego, co najprawdopodobniej wynikało z niewystarczającej liczby powtórzeń technicznych lub biologicznych, ponieważ w każdej warunkach obrazowano tylko jedną studzienkę w trzech polach widzenia. Przy większych ilościach komórek SH-SY5Y na studzienieczkę (20 000 i 30 000) fagocytoza wykazywała słabą liniowość, co prawdopodobnie było spowodowane błędną segmentacją makrofagów i komórek SH-SY5Y pochodzących z iPSC w bardziej zagęszczonym polu widzenia.

Obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) utrwalonych komórek przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, wykorzystując makrofagi iPSC typu dzikiego w zagęszczeniu 20 000 komórek na studzienkę oraz kilka różnych ilości komórek SH-SY5Y (od 10 000 do 80 000 na studzienkę); płytkę testową utrwalono i obrazowano po 5 h. Reprezentatywny obraz fagocytozy przedstawiono na Rysunku 4A, a przeanalizowane dane na Rysunku 4B17. Zwiększenie liczby komórek SH-SY5Y doprowadziło do wzrostu liczby fagocytowanych cząsteczek (punktów) na komórkę; jednak dwukrotny wzrost ilości SH-SY5Y spowodował jedynie 1,5-krotny wzrost liczby punktów na komórkę. Wskazuje to, że badane ilości nie są czynnikiem limitującym tempo fagocytozy. Następnie test fagocytozy z obrazowaniem wysokotreściowym zwalidowano przy użyciu kilku inhibitorów fagocytozy (Rysunek 4C)17. Inhibitory polimeryzacji aktyny, cytochalazyna D i jasplakinolid, znacząco zahamowały fagocytozę odpowiednio o 91% i 90%, gdy inkubowano je wstępnie przez 1 h przed fagocytozą. Solidny wskaźnik Z' testu przy zastosowaniu cytochalazyny D lub jasplakinolidu jako kontroli negatywnych obliczono odpowiednio na 0,7 i 0,820. Inhibitor zakwaszania lizosomów, bafilomycyna A1, znacząco zredukowała fagocytozę o 31% przy inkubacji przez 1 h przed fagocytozą. Słabszy efekt inhibitora zakwaszania lizosomów w porównaniu z inhibitorami aktyny sugeruje, że detekcja zinternalizowanego ładunku może nie wymagać pełnego zakwaszenia fagosomu. Rekombinowaną anneksynę V zastosowano jako kontrolę w celu specyficznego zablokowania fosfatydyloseryny eksponowanej na powierzchni komórek SH-SY5Y, co uniemożliwia receptorom fagocytarnym dostęp do liganda, który jest ważnym sygnałem „zjedz mnie”. Dodatek rekombinowanej anneksyny V znacząco zredukował fagocytozę o 30%, gdy została ona dodana do studzienek bezpośrednio przed dodaniem komórek SH-SY5Y. Potwierdzono, że utrwalone komórki SH-SY5Y eksponują fosfatydyloserynę, stosując fluorescencyjną sondę anneksyny V, podczas gdy żywe komórki SH-SY5Y były negatywne w barwieniu anneksyną V (Rysunek 4D).

Wcześniej wykazano, że receptor fagocytozy mikroglialnej TREM2 jest istotny dla fagocytozy apoptotycznych neuronów21. Mutacja R47H w genie TREM2 jest genem ryzyka późnej postaci choroby Alzheimera i przypuszcza się, że zmniejsza ona wiązanie ligandów przez TREM223. W celu oceny funkcji fagocytycznej TREM2 R47H oraz TREM2 KO przeprowadzono wysokoprzepustowy test fagocytozy na utrwalonych komórkach z wykorzystaniem izogenicznych linii makrofagów iPSC z wariantami WT/R47H/KO TREM217. Przetestowano kilka przedziałów czasu trwania fagocytozy od 1 do 5 h, stosując kaskadowe dodawanie ładunku fagocytowanego (40 000 komórek SH-SY5Y). Uzyskany sygnał wzrasta liniowo do 4 h, a następnie lekko stabilizuje się w 5 h (Rysunek 5)17. Obniżone tempo i wydajność fagocytozy (procent komórek z dodatnimi punktami) były widoczne w przypadku TREM2 KO w porównaniu z WT, podczas gdy mutant TREM2 R47H nie wykazał zaburzeń fagocytozy. Defekt fagocytyczny w komórkach TREM2 KO nie jest fenokopiowany przez mutację TREM2 R47H, co prawdopodobnie wynika z faktu, że funkcja TREM2 jest wystarczająca do wspierania prawidłowej fagocytozy.

Wykres z mikroskopii fluorescencyjnej, plamki phrodo w czasie, komórki SH-SY5Y; wpływ cytochalazyny D.
Rycina 3: Przykładowe dane z analizy fagocytozy w czasie w żywych komórkach. Pobieranie martwych komórek SH-SY5Y przez makrofagi iPSC typu dzikiego BIONi010-C (ECACC ID: 66540023), obrazowane w odstępach 5 min przez 3 h. Czasy przedstawione na wykresie liczone są od rozpoczęcia fagocytozy, wliczając pierwsze 40 min bez pomiaru. Wykreślono średnią liczbę plamek na komórkę z trzech powtórznych studzienek. Fagocytoza 10 000 komórek SH-SY5Y jest hamowana przez 10 µM cytochalazyny D przy 1 h wstępnej inkubacji, podczas gdy przy większej liczbie komórek SH-SY5Y (20 000 i 30 000) uzyskano nieoptymalną ilościową ocenę fagocytozy. Średnia ± odchylenie standardowe (SD), N = 1 eksperyment. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie komórkowe i wykres liczby zarodników: obrazy mikroskopowe i analiza danych komórek SH-SY5Y.
Rysunek 4: Optymalizacja i walidacja wysokoprzepustowego testu fagocytozy w utrwalonych komórkach. (A) Reprezentatywny obraz mikroskopii wysokoprzepustowej komórek SH-SY5Y fagocytowanych przez makrofagi iPSC typu dzikiego BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Przedstawiono punkt czasowy 3 h z użyciem 40 000 komórek SH-SY5Y. Kanały fluorescencji są nałożone; barwienie makrofagów iPSC zaznaczono na czerwono, jądra na niebiesko, a komórki SH-SY5Y na żółto. Panel wstawkowy stanowi fragment obrazu powiększony 3x. (B) Liczba punktów na komórkę fagocytowanych martwych komórek SH-SY5Y po 5 h, przy zastosowaniu różnych ilości dodanego materiału do makrofagów iPSC typu dzikiego. Średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), dla N = 3 zbiorów. (C) Fagocytoza (3 h) jest hamowana przez 10 µM cytochalasyny D (Cyt), 1 µM bafilomycyny A1 (Baf), 1 µM jasplakinolidu (przy 1 h wstępnej inkubacji; Jas) oraz 13 µg/mL rekombinowanej anneksyny V (dodanej jednocześnie z martwymi komórkami SH-SY5Y; Ann). Jako kontrolę negatywną (-ve) wykorzystano makrofagi iPSC bez dodanych komórek SH-SY5Y, a kontrolą dodatnią (+ve) były nieleczone makrofagi iPSC z dodatkiem komórek SH-SY5Y. Dane znormalizowano do średniej dla powtórzenia eksperymentu. Średnie ± SEM, dla N = 3-6 zbiorów i dwóch linii komórkowych typu dzikiego (SFC840-03-03, charakterystyka tej linii opisana w (Fernandes et al.21) oraz BIONi010-C). Jednoczynnikowa analiza ANOVA z testem post-hoc Dunnetta, porównania do komórek nieleczonych. *p < 0.05, ***p < 0.001. (D) Świeżo utrwalone komórki SH-SY5Y barwią się jednorodnie pod kątem ekspozycji fosfatydyloseryny (anneksyna V-FITC) i mają ograniczoną przepuszczalność błony komórkowej (jodek propidyny). Żywe komórki SH-SY5Y nie barwią się na anneksynę V-FITC ani jodek propidyny, z wyjątkiem ogniskowego barwienia obecnego w nielicznych martwych komórkach w hodowli. Rysunki powielono za zgodą czasopisma Alzheimer's Research & Therapy17. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizy fagocytozy; dane eksperymentalne dotyczące wariantów TREM2; metryki plamek komórkowych w czasie.
Rysunek 5: Fagocytoza jest zredukowana w makrofagach z iPSC TREM2 KO, ale nie w makrofagach z iPSC R47H TREM2. Wysokoprzepustowy test fagocytozy przeprowadzony z użyciem 40 000 komórek SH-SY5Y na studnię z sekwencyjnym dodawaniem. Ilościowo określono średnie dla parametrów: liczba plamek na komórkę, suma powierzchni plamek (µm2) na komórkę oraz procent komórek zawierających fagocytowane cząstki na pole widzenia. Dane znormalizowano do średniej dla każdego genotypu w każdym eksperymencie. Średnia ± SEM, dla N = 3 serii zbiorów. Dwuway ANOVA z pomiarem powtórzonym, post-hoc test Dunnetta, porównania parzyste z WT dla każdego punktu czasowego: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Rysunki powielone za zgodą Alzheimer's Research & Therapy17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina dodatkowa S1: Przykładowa kontrola jakości (QC) przygotowania linii SH-SY5Y.Rozdzielone komórki SH-SY5Y utrwalono przez 10 min przy użyciu 0% (żywe komórki), 1% i 2% paraformaldehydu (PFA), a następnie przemyto. Komórki barwiono anneksyną V-FITC oraz jodkiem propidium (PI), po czym niezwłocznie poddano analizie cytometrycznej. Wykresy kropkowe gęstości kolorów utworzono w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej, wykorzystując kontrole pojedynczo barwione i niebarwione do wyznaczenia bramki kwadrantowej. Kwadranty są opisane procentową liczbą zdarzeń w obrębie każdego z nich. Żywe komórki znajdują się głównie w Q4, a komórki utrwalone głównie w Q2. Q1 = anneksyna V-/PI-, Q2 = anneksyna V+/PI+, Q3 = anneksyna V+/PI-, Q4 = anneksyna V-/PI- (żywe komórki). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające: Time-lapse fagocytozy żywych komórek.Reprezentatywne nagranie time-lapse przedstawiające fagocytowane komórki SH-SY5Y przez makrofagi iPSC-macrophages BIONi010-C typu dzikiego (ECACC ID: 66540023). Obrazy były rejestrowane co 5 min przez 3 h. Nagranie zostało przycięte i odtwarzane jest z prędkością 3 klatek na sekundę, pokazując ostatnie 1,5 h testu. Komórki SH-SY5Y barwione barwnikiem wrażliwym na kwasy są widoczne na czerwono; intensywność sygnału wzrasta wraz z zakwaszaniem fagosomu. Jądra komórkowe barwione Hoechst 33342 są widoczne na niebiesko. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Mikroglej pełni ważne funkcje, które wpływają na inicjację i progresję chorób neurodegeneracyjnych, w tym fagocytozę neuronów apoptotycznych. Upośledzona fagocytoza mikrogleju i niewłaściwa fagocytoza synaps są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, chociaż mechanizmy leżące u podstaw i przyczynowość nie są dobrze poznane 4,23. W tym artykule przedstawiono test fagocytozy do pomiaru fagocytozy komórek apoptotycznych za pomocą makrofagów iPSC, z odczytem obrazowania poklatkowego żywych komórek lub mikroskopią o wysokiej zawartości komórek stałych, lub kombinacją obu w jednym teście. Ta wszechstronność oznacza, że test może być używany do badania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych w czasie w kilku studzienkach lub wykorzystywany do badań przesiewowych o wysokiej zawartości z wieloma schorzeniami lub zabiegami. Ponieważ test o wysokiej zawartości jest ustalany w jednym punkcie czasowym, można jednocześnie przygotować wiele płytek testowych. Test o wysokiej zawartości ma potencjalną przydatność w charakteryzowaniu makrofagów/mikrogleju z wariantami genetycznymi związanymi z chorobą lub w badaniach przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek pod kątem zmian w fagocytozie. Test można również łatwo dostosować do badania fagocytozy innych modeli mikrogleju lub potencjalnie astrocytów. Test fagocytozy można potencjalnie multipleksować za pomocą barwienia żywych komórek, np. mitochondriów, wapnia lub wskaźników ROS, a także można przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne po utrwaleniu dla białek będących przedmiotem zainteresowania. W porównaniu z istniejącymi testami fagocytozy, które wykorzystują apoptotyczne komórki neuronalne, głównymi zaletami tego protokołu jest to, że przygotowanie ładunku fagocytarnego jest stosunkowo proste i szybkie, a w efekcie uzyskuje się jednolity produkt. Inne testy indukują apoptozę neuronów lub SH-SY5Y z S-nitrozo-L-cysteiną przez 2 godziny25, kwasem okadaikowym przez 3 godziny22, staurosporyną przez 4-16 godzin 26,27,28,29 lub promieniowaniem UV przez 24 godziny30 i mogą prowadzić do powstania komórek na różnych etapach apoptozy. Co więcej, o ile autorzy wiedzą, obrazowanie żywych komórek i odczyty obrazowania o wysokiej zawartości nie zostały wcześniej opisane. Głównym ograniczeniem stosowania utrwalania paraformaldehydu do przygotowania ładunku fagocytarnego jest to, że nie podsumowuje on w pełni procesu apoptozy, ponieważ utrwalenie zapobiega rozpadowi komórek na ciała apoptotyczne, które prawdopodobnie zostaną szybciej fagocytozowane ze względu na ich mniejszy rozmiar. Nie wiadomo, jaki wpływ ma fiksacja na wydzielanie nukleotydowych sygnałów "znajdź mnie" (np. ATP, UDP) z komórki docelowej, które przyciągają fagocyty. Podobnie jak komórki apoptotyczne, utrwalone SH-SY5Y wykazują pewną przepuszczalność błony dla jodku propidyny. Przepuszczalność błony jest związana z uwalnianiem sygnałów "znajdź mnie"; jednak nie zostało to zbadane w utrwalonych SH-SY5Y, a jeśli nukleotydy zostaną uwolnione zbyt szybko, zostaną zmyte przed dodaniem SH-SY5Ys do makrofagów iPSC.

Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie martwych SH-SY5Y estrem STP wrażliwego na pH czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Barwnik ten szybko i kowalencyjnie reaguje z wolnymi aminami pierwszorzędowymi na powierzchni martwych SH-SY5Ys. Czas barwienia nie musi być optymalizowany; Należy jednak zachować ostrożność przy obchodzeniu się z barwnikiem przed etykietowaniem. Reakcji znakowania nie wolno przeprowadzać w zawierających wolne aminy. Ponadto istnieje ryzyko wytrącania się, jeśli wsad DMSO zostanie rozcieńczony w zimnym buforze wodnym lub w wysokim stężeniu końcowym. Osady pojawią się pod mikroskopem jako gęste ciemne obiekty. Dodatkowo wrażliwy na pH roztwór barwnika przykleja się do zwykłych plastikowych probówek wirówkowych i powoli się zmywa; Dlatego na etapie etykietowania zalecane są tuby o niskim stopniu wiązania. Zastosowanie barwnika wrażliwego na pH, zamiast barwnika trwale fluorescencyjnego, pomaga w identyfikacji pochłoniętych cząstek w porównaniu z cząstkami sąsiadującymi z błoną plazmatyczną. Ponieważ występuje pewna fluorescencja przy neutralnym pH, gęstość ładunku fagocytarnego i makrofagów iPSC musi być utrzymywana na tyle niska, aby można było ją dokładnie segmentować, chociaż na tyle wysoka, aby wychwycone zostały liczne zdarzenia fagocytarne. Mikroskopia o wysokiej zawartości była w stanie dokładnie zidentyfikować fagocytozę ze średnią gęstością ładunku w odwiercie (ponad 2 SH-SY5Ys na makrofag iPSC). I odwrotnie, ze względu na słabszą czułość mikroskopu w widmie głębokiej czerwieni, segmentacja makrofagów iPSC w danych obrazowania poklatkowego żywych komórek była mniej pewna i konieczne było użycie bardzo niskiej gęstości ładunku, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wyników fałszywie dodatnich (1 SH-SY5Y na każde dwa makrofagi iPSC). Walidację prawidłowej segmentacji i gęstości ładunku należy przeprowadzić na podstawie porównań między odwiertami niepoddanymi działaniu cytochalazyny D i odwiertów poddanych działaniu cytochalazyny D. W dobrze zoptymalizowanym teście cytochalazyna D powinna zmniejszyć średnią liczbę plamek na komórkę o 90% w porównaniu z próbkami nietraktowanymi.

Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie makrofagami iPSC, które pozwala na identyfikację komórki i segmentację w analizie obrazu, tak aby wszelkie zewnętrzne SH-SY5Y były wykluczone ze zliczania. Zalecany barwnik przenika komórki, przekształca się w nierozpuszczalny produkt fluorescencyjny w cytoplazmie, utrwala się i jest nietoksyczny (patrz tabela materiałów). Etap barwienia został zoptymalizowany pod kątem użycia makrofagów iPSC z testem fagocytozy obrazowania o wysokiej zawartości i sugerujemy, że należy go ponownie zoptymalizować, jeśli stosowane są inne typy komórek. Czas barwienia komórek można wydłużyć, aby poprawić osadzanie się nierozpuszczalnego produktu fluorescencyjnego w komórkach. Jeśli stężenie barwnika jest zoptymalizowane, należy zachować ostrożność, aby uniknąć toksycznych poziomów nośnika rozpuszczalnika organicznego.

Trzecim czynnikiem decydującym o powodzeniu testu jest analiza danych. Dostarczone potoki analizy mają charakter orientacyjny, a nie nakazowy, ponieważ różnice w intensywności barwienia lub morfologii komórek mogą zmniejszyć skuteczność segmentacji potoków zgodnie z zapisem. W związku z tym wymagane będą pewne optymalizacje, z testowaniem rurociągu na odpowiednich kontrolach dodatnich i ujemnych, a parametry, które powinny być optymalizowane, są wskazane w tekście protokołu. Kontrole ujemne powinny obejmować stan, w którym makrofagi iPSC są wstępnie traktowane silnym inhibitorem fagocytozy, takim jak cytochalazyna D, przed dodaniem SH-SY5Ys. Inną możliwą kontrolą ujemną jest dodanie SH-SY5Ys do wcześniej nieleczonych studzienek makrofagów iPSC na końcu testu, 10 minut przed utrwaleniem, co pozwala na pewne osiadanie ładunku, ale jest zbyt krótkie, aby wystąpiła znaczna ilość fagocytozy. Zdarzenie fagocytozy definiuje się jako obiekt o czerwonej fluorescencji w granicach makrofaga iPSC, zdefiniowany przez algorytm oprogramowania przy użyciu kanału głębokiej czerwonej fluorescencji. Jeśli segmentacja komórek jest słaba (ryc. 2), wiele niefagocytozowanych SH-SY5Y w bliskim sąsiedztwie makrofagów iPSC może zostać błędnie włączonych do analizy, tj. wyniki fałszywie dodatnie. Najważniejszym czynnikiem w osiągnięciu dobrej segmentacji jest ścisłe rozgraniczenie makrofagów iPSC. Segmentacja dla obu analiz jest zautomatyzowana, więc nie jest możliwe uzyskanie idealnej segmentacji dla każdej komórki; Jednak kilka parametrów można dostosować, aby segmentacja była bardziej optymalna, używając kilku obrazów testowych jako odniesienia. Kontrola cytochalazyny D jest ważna dla oceny optymalnej segmentacji, ponieważ duża liczba zdarzeń fagocytarnych wykrytych w tym stanie wskazuje, że segmentacja jest nieoptymalna. Optymalizacja potoku analizy danych powinna być w idealnym przypadku powtarzana do momentu, gdy liczba zdarzeń fagocytarnych na komórkę będzie o 80%-90% niższa w stanie cytochalazyny D w porównaniu z brakiem inhibitora.

Problemy z testem fagocytozy, które są najbardziej prawdopodobne, to: (1) słaba fluorescencja wrażliwa na pH w kontrolach pozytywnych, (2) rzadki lub nierównomierny rozkład makrofagów pod koniec testu lub (3) wysoka liczba wyników fałszywie dodatnich w analizie z niefagocytozowanych SH-SY5Y. Rozwiązywanie problemów ze słabą fluorescencją wrażliwą na pH powinno najpierw sprawdzić, czy barwienie SH-SY5Ys spowodowało powstanie osadu komórkowego o silnym purpurowym kolorze. Jeśli kolor jest słaby, upewnij się, że użyto świeżego barwnika, upewnij się, że bufor do etykietowania jest wolny od amin, dodaj dodatkowe płukanie do SH-SY5Ys przed barwieniem, sprawdź, czy zabarwiono prawidłową liczbę SH-SY5Y, upewnij się, że nie ma widocznych osadów barwnika i zoptymalizuj stężenie barwnika na etykiecie. Jeśli SH-SY5Y są silnie wybarwione, sprawdź, czy stężenie dodane do płytki testowej jest prawidłowe i upewnij się, że makrofagi iPSC są zdrowe i nie są zbyt stare. Drugi rodzaj problemu, nierównomierne rozmieszczenie makrofagów, może wynikać z utraty komórek podczas pipetowania i należy podjąć kroki w celu zmniejszenia sił pipetowania odczuwanych przez komórki, unikając końcówek o wąskich otworach. Jeśli problem będzie się powtarzał, skróć czas inkubacji ładowania makrofagów iPSC barwnikiem przepuszczalnym dla komórek. Trzeci problem, dotyczący błędnego włączenia do analizy cząstek niefagocytozowanych, wskazuje, że konieczna jest dalsza optymalizacja potoku analizy. Rozwiązywanie problemów powinno w pierwszej kolejności koncentrować się na segmentacji komórek i na tym, czy oprogramowanie obejmuje sąsiednie obiekty. Konkretne parametry, które można dostosować, są sugerowane w uwagach poniżej odpowiednich kroków (kroki 6.1.11-6.1.15 dla analizy poklatkowej na żywo i kroki 6.2.4-6.2.8 dla analizy o wysokiej zawartości). Jeśli segmentacja komórek nie może być dalej ulepszona, analiza o wysokiej zawartości obejmuje dodatkowy etap (krok 6.2.8), który wyklucza nieprawidłowo segmentowane makrofagi iPSC. Co więcej, moduł, który filtruje akceptowane miejsca fluorescencji wrażliwej na pH w makrofagach iPSC, może być zoptymalizowany, zwiększając intensywność progową akceptowanych obiektów, co powinno pomóc w wykluczeniu niefagocytozowanych SH-SY5Y (krok 6.1.17 dla analizy poklatkowej żywych komórek i krok 6.2.11 dla analizy o wysokiej zawartości).

Opracowaliśmy dwa rodzaje odczytu mikroskopowego dla testu fagocytozy, z których każdy ma zalety i ograniczenia. Obrazowanie poklatkowe żywych komórek ma tę zaletę, że dostarcza dodatkowych informacji na temat kinetyki fagocytozy i jest szerzej dostępne niż platformy obrazowania o wysokiej zawartości. Zalecane oprogramowanie typu open source jest niezależne od źródła mikroskopu i może być używane z dowolnym dobrej jakości mikroskopem fluorescencyjnym, z funkcją poklatkową żywych komórek lub bez niej. Głównym ograniczeniem obrazowania żywych komórek jest ograniczona czułość i optyka, co utrudnia wykrycie i przeprowadzenie dobrej segmentacji makrofagów iPSC. Ograniczenie to można złagodzić, wydłużając czas barwienia makrofagów iPSC lub przełączając się na bardziej czuły mikroskop, jeśli jest dostępny. Test fagocytozy obrazowania o wysokiej zawartości jest zalecanym odczytem, jeśli dostępny jest system obrazowania o wysokiej zawartości. Systemy obrazowania o wysokiej zawartości zapewniają większą przepustowość i bardziej wiarygodne dane, co umożliwia wykorzystanie tego testu do badań przesiewowych, w których oczekuje się solidnego Z' wynoszącego ≥0,7 dla "liczby plamek na komórkę" wyjściowej20. W porównaniu z metodą poklatkową żywych komórek, odczyt mikroskopii o wysokiej zawartości ma wyższą czułość, wyższy stopień automatyzacji i szybkości, można przetwarzać więcej studzienek i pól obrazowania oraz tworzyć obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości. Segmentacja komórek jest bardziej efektywna przy dobrych obrazach, a segmentacja jest dodatkowo wspomagana przez oprogramowanie do analizy obrazowania o wysokiej zawartości, które zapewnia więcej metod segmentacji komórek odpowiednich dla komórek o bardzo nieregularnych kształtach. Oprogramowanie do analizy obrazowania o wysokiej zawartości obliczyło również więcej parametrów fagocytozy w porównaniu z oprogramowaniem typu open source, takich jak procent komórek fagocytarnych. Głównym ograniczeniem testu fagocytozy o wysokiej zawartości jest koszt i dostępność systemu obrazowania i oprogramowania analitycznego.

Podsumowując, ilościowy test fagocytozy przedstawiony w tym artykule jest użytecznym narzędziem do modelowania fagocytozy mikrogleju martwych neuronów in vitro. Mikroglej jest modelowany przez makrofagi iPSC, a martwe neurony są modelowane przez SH-SY5Ys utrwalone paraformaldehydem. Chociaż nie są to najbardziej autentyczne modele mikrogleju i martwych/apoptotycznych neuronów, są one łatwe do przygotowania i skalowalne. Sam test jest bardzo wszechstronny, ze szczegółowymi dwoma rodzajami odczytu obrazowania i ma potencjał do dostosowania do stosowania z różnymi modelami monokultur mikrogleju/makrofagów lub innym typem komórek, aby działać jako ładunek fagocytarny. Odczyt obrazowania o wysokiej zawartości jest korzystny dla uzyskania danych ilościowych i może być skalowany w celu oznaczenia małocząsteczkowych modulatorów fagocytozy lub badań przesiewowych wariantów genetycznych w makrofagach iPSC. Ponieważ jednak systemy obrazowania o wysokiej zawartości są drogie i wymagają dużej ilości danych, w protokole uwzględniono alternatywny odczyt obrazowania przy użyciu mikroskopu poklatkowego z żywymi komórkami, który w razie potrzeby można zastąpić dowolnym dobrej jakości konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Val Millar i dr Sohaib Nizami za pomoc w mikroskopii o wysokiej zawartości oraz dr Danielowi Ebnerowi za dostęp do mikroskopów o wysokiej zawartości. Ponadto autorzy dziękują dr Emmie Mead za porady dotyczące opracowywania testów oraz pani Cathy Browne za wsparcie w zakresie iPSC. Prace te były wspierane przez Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, numer grantu ARUK-2020DDI-OX), z dodatkowym wsparciem dla James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) z Oxford Martin School LC0910-004; Nagroda Monument Trust Discovery Award przyznana przez Parkinson's UK (J-1403); nagrody MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 oraz Momentum MC_PC_16034 Awards.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml stożkowa probówka wirówkowaFalcon352096Do wirowania komórek
2-20 &mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L Mikropipety
2-merkaptoetanol 50 mMGibco31350010Składnik pożywki fabrycznej
4% paraformaldehyd w PBSAlfa AesarJ61899Do utrwalania komórek
Płytka 6-dołkowa, poddawana
Płytka 24-dołkowa AggreWell-800STEMCELL Technologies3481524-dołkowa płytka Microwell o niskiej przyczepności do tworzenia ciał zarodkowych
Annexin V-FITC Zestaw do barwienia / wykrywania apoptozyAbcamab14085Zestaw do barwienia aneksyny V-FITC, jako test do kontroli jakości utrwalonych SH-SY5Ys. Zestaw zawiera bufor wiążący aneksynę, aneksynę V-FITC i jodek propidyny.
Automatyczny licznik
Wirówka
Mikrowirówka
CellCarrier-96 Ultra Microplates, poddana działaniu kultur tkankowych,, 96-dołkowa z pokrywkąPerkin Elmer605530296-dołkowa mikropłytka do hodowli tkankowej (TC) z czarnymi ściankami i optycznie przezroczystym dnem, do oznaczania
fagocytozyOprogramowanieOprogramowanie typu open source do analizy obrazów fagocytozy uzyskanych za pomocą mikroskopu poklatkowego żywych komórek. Pobierz za darmo ze strony internetowej (http://cellprofiler.org/), protokół ten korzystał z wersji 2.2.0.
Barwnik CellTracker Deep RedThermo FisherC34565Ciemnoczerwony fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek, reaktywny barwnik sukcynimidylowo-reaktywny z estrem sukcynimidylu do barwienia cytoplazmy makrofagów iPS. Rozpuść barwnik CellTracker Deep Red w DMSO do 2 mM (1,4 mg/ml). Stosować przy 1 μ M, przez rozcieńczenie materiału wyjściowego DMSO pożywką makrofagową.
bezpieczeństwa laminarnego przepływu powietrza klasy 2
ButlaAkcesorium do
inkubatora EVOS FL Auto CO2, ustawione na 37° C i 5 % CO2
System przechowywania i analizy danych obrazowych ColumbusPerkin ElmerColumbusPlatforma przechowywania i analizy danych dla Opera Phenix. Obsługuje wszystkie główne instrumenty przesiewowe o wysokiej zawartości.
Cytochalazyna DCayman11330Leczenie kontrolą ujemną w teście fagocytozy. Rozpuścić w DMSO do 10 mM i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20° C, unikaj dalszych cykli zamrażania i rozmrażania. Stosować przy końcowym stężeniu 10 &mikro;M.
DMEM/F12Gibco11320074Składnik nośnika SH-SY5Y
DMSOSigmaD8418Rozpuszczalnik do barwników CellTracker i pHrodo
EVOS FL System automatycznego obrazowaniaThermo FisherAMF4300Mikroskop do obrazowania poklatkowego z żywymi komórkami
EVOS Light Cube CY5Thermo FisherAMEP4656Akcesorium do EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPIThermo Akcesorium FisherAMEP4650do EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFPThermo FisherAMEP4652Akcesorium do
inkubatora scenicznegoThermo FisherAMC1000Akcesorium do automatycznej
płodowej surowicy bydlęcejEVOS FL SigmaF4135Składnik podłoża SH-SY5Y
Cytometr
Cytometria przepływowa oprogramowanie
Geltrex LDEV-Free, z kwalifikacją hESC, matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostuInvitrogenA1413302matryca błony podstawnej z kwalifikacją hESC do hodowli iPSC
Suplement GlutaMAXGibco35050-038Składnik pożywki zarówno fabrycznej, jak i makrofagowej
HBSSLonzaBE 10-547FHank' s zbilansowany roztwór soli do etapów mycia
Ludzki rekombinowany BMP4GibcoPHC9534Składnik pożywki dla ciała embrionalnego
Ludzka rekombinowana IL-3GibcoPHC0033Składnik pożywek fabrycznych i makrofagowych Ludzki
rekombinowany SCFMiltenyi Biotech130-096-695Składnik pożywki dla ciała embrionoidalnego
Ludzka rekombinowana pożywka VEGFGibcoPHC9394Składnik pożywki dla ciała embrionalnego
Roztwór do obrazowania żywych komórekThermo FisherA14291DJBezczerwone pożywki buforowane przez HEPES bez fenolu do znakowania martwych SH-SY5Ys
Probówki 2 ml o niskim poziomie wiązania z białkamiEppendorf30108.132Do barwienia SH-SY5Ys
M-CSFThermo FisherPHC9501Składnik pożywek fabrycznych i makrofagowych
mTeSR1 MediumSTEMCELL Technologies85850Pożywka iPSC
20-200 uLDo pracy z płynami na 96-dołkowej płytce
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbesThermo FisherR37605Hoechst 33342 w butelce z zakraplaczem do barwienia jąder makrofagów iPS, należy użyć 0,5 kropli/ml w pożywce makrofagowej.
System badań przesiewowych o wysokiej zawartościPerkin ElmerHH14000000mikroskop do obrazowania o wysokiej zawartości, używany z oprogramowaniem Harmony w wersji 4.9.
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122Składnik pożywki fabrycznej, makrofagowej i SH-SY5Y
pHrodo iFL Red STP-EsterThermo FisherP36011wrażliwy na pH czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania martwych SH-SY5Ys. Rozpuść proszek estru pHrodo iFL Red STP w DMSO do stężenia 5 mg/ml. Na każdy 1 milion SH-SY5Ys dodaj 2,5 μ L (12,5 μ g) z zapasu pHrodo iFL Red STP Ester do wstępnie ogrzanych komórek zawieszonych w roztworze do obrazowania żywych komórek. 
Serologiczny napełniacz do pipet
Kolba T175, poddana działaniuNaczynie do różnicowania prekursorów makrofagów iPSC, znane jako "Fabryki"
KolbaNaczynie do hodowli SH-SY5Y
Przezroczyste zgrzewarki do płytekGreiner Bio-One676001Do przechowywania i transportu płytek testowych
TrypLE Express (1X), bez czerwieni fenolowejGibco12604013Bufor dysocjacji komórek zawierający rekombinowane enzymy podobne do trypsyny i 1,1 mM EDTA, użyj schludnego.
Łaźnia wodna, ustawiona na 37& C
X-VIVO 15 Pożywka z L-glutaminą, gentamycyną i czerwienią fenolowąLonzaBE04-418FSkładnik pożywki fabrycznej i makrofagowej
Pożywka X-VIVO 15 z L-glutaminą; bez gentamycyny i czerwieni fenolowejLonza04-744QPożywka makrofagowa wolna od czerwieni fenolowej, do stosowania w fagocytozie bez dodatków i czynników wzrostu
jednokanałowedziałaniu kultur tkankowychkomórekstołowastołowa CellProfiler Komora gazowa CO EVOS FL Auto EVOS przepływowyanalityczneWielokanałowa pipeta kultur tkankowych T75

Bibliografia

  1. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748(2013).
  2. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
  3. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  4. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790(2019).
  5. Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
  6. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  7. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
  8. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  9. Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380(2020).
  10. Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136(2020).
  11. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  12. Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684(2019).
  13. Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
  14. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
  15. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  16. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  17. Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).
  18. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  19. Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
  20. Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).
  21. Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
  22. Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
  23. Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
  24. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  25. Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
  26. Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
  27. Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49(2018).
  28. Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
  29. Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  30. Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test fagocytozyobrazowanie wysokotre cioweeferecytoza mikroglejumikroskopia kom rek utrwalonychekspozycja fosfatydyloserynyscreening ma ych cz steczekobrazowanie ywych kom rekznakowanie barwnikami fluorescencyjnymi
Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.