Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model przeszczepu płuc szczura uszkodzenia cieplnego niedokrwienia/reperfuzji: optymalizacje w celu poprawy wyników

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62445

⸱

28 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery Division of Cardiac Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Laboratory, The Ohio State University College of Medicine, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University, 4Comprehensive Transplant Center, The Ohio State University Wexner Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy optymalizacje modelu przeszczepu płuc szczurów, które służą poprawie wyników. Zapewniamy przewodnik po rozmiarach mankietów w oparciu o masę ciała, strategię pomiaru w celu ustalenia 4. przestrzeni międzyżebrowej oraz metody zamykania ran i pobierania płynu BAL (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i tkanek.

Streszczenie

Z naszego doświadczenia z przeszczepem płuc szczurów, znaleźliśmy kilka obszarów wymagających poprawy. Informacje w istniejącej literaturze dotyczące metod doboru odpowiednich rozmiarów mankietów dla żyły płucnej (PV), tętnicy płucnej (PA) lub oskrzeli (Br) są zróżnicowane, co sprawia, że określenie właściwego rozmiaru mankietu podczas przeszczepu płuc szczura jest ćwiczeniem prób i błędów. Standaryzując technikę mankietowania w celu użycia najmniejszego skutecznego mankietu odpowiedniego do wielkości naczynia lub oskrzela, można sprawić, że procedura przeszczepu będzie bezpieczniejsza, szybsza i bardziej skuteczna. Ponieważ średnice PV, PA i Br są związane z masą ciała szczura, przedstawiamy strategię wyboru odpowiedniego rozmiaru za pomocą przewodnika opartego na wadze. Ponieważ objętość płuc jest również związana z masą ciała, zalecamy, aby ta zależność była również brana pod uwagę przy wyborze odpowiedniej objętości powietrza do napompowania płuc dawcy podczas ciepłego niedokrwienia, a także do odpowiedniej objętości PBS, która ma być wkroplona podczas zbierania płynu z płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL). Opisano również metody rozwarstwienia 4przestrzeni międzyżebrowej, zamykania ran i pobierania próbek zarówno z płatów natywnych, jak i przeszczepionych.

Wprowadzenie

Przez ponad trzy dekady badacze modyfikowali i ulepszali modele przeszczepów płuc szczurów, tak aby generowane dane były bardziej spójne i lepiej odzwierciedlały rzeczywisty stan kliniczny. W czasie, gdy nasze laboratorium wykonuje ten model, określiliśmy cztery obszary poprawy: techniki zakładania zespoleń, identyfikacja 4 przestrzeni międzyżebrowej biorcy, nadmuchiwanie płuc i zamykanie rany podczas zabiegu biorcy oraz pobieranie próbek do analizy.

Modyfikacje techniki zakładania kajdanek dla zespoleń mogą usprawnić całą procedurę przeszczepu poprzez skrócenie czasu obsługi płuca dawcy1,2,3,4,5,6 oraz dzięki temu, że procedura zespolenia jest szybsza i technicznie łatwiejsza dla mikrochirurga. Chociaż bardzo ważne jest stosowanie mankietów o odpowiednim rozmiarze, aby zapewnić niezbędny przepływ krwi i powietrza do przeszczepionego płuca, istnieją ograniczone wytyczne dotyczące wyboru rozmiaru mankietów dla żyły płucnej (PV), tętnicy płucnej (PA) lub oskrzeli (Br)5,7,8,9. Ponieważ średnice PV, PA i Br są związane z masą ciała szczurów dawcy i biorcy, proponujemy, aby rozmiar mankietu był oparty na masie ciała. Niniejszy raport zawiera przewodnik po rozmiarach mankietów oparty na masie ciała szczura (od 180 g do ponad 270 g), który służy optymalizacji dopływu krwi i powietrza do przeszczepionego płuca (Tabela 1).

Podczas gdy nowszy mikrochirurg może z powodzeniem i łatwo pozyskać płuco dawcy podczas procedury dawcy, przeszczepienie płuca podczas procedury biorcy jest bardziej skomplikowane i zależy od doświadczenia mikrochirurga. Próby odnalezienia czwartejprzestrzeni międzyżebrowej w celu uzyskania dostępu do lewego płuca biorcy są jednym z trudniejszych kroków, który ma pewien subiektywizm i może wydłużyć czas zabiegu. Dlatego wprowadzamy prostą i obiektywną metodę, która pomaga w identyfikacji czwartego położenia przestrzeni międzyżebrowej za pomocą pomiarów klatki piersiowej i kołatania serca serca, aby znaleźć właściwy obszar ściany klatki piersiowej do sekcji4,5,6,10,11,12.

Proponujemy również poprawę inflacji płuc dawcy, która jest potencjalnym źródłem uszkodzenia narządu. Płuco dawcy jest opróżniane do momentu rozpoczęcia reperfuzji. Podczas szycia 4przestrzeni międzyżebrowej płuco dawcy jest zwykle napompowane poprzez zwiększenie PEEP z 2 cmH2O do 6 cmH2O. Aby zminimalizować uszkodzenia płuc spowodowane nadmiernym napompowaniem, proponujemy technikę, w której trzy nylonowe szwy 6-0 są umieszczane wokół 4. żebra dolnego do 5. żebra za pomocą prostych podwójnych węzłów. Kiedy nadejdzie czas na zamknięcie rany, końce trzech szwów są trzymane hemostatami w obu rękach, rana jest zamykana od razu, pociągając z każdej strony, a PEEP jest natychmiast zmniejszany do 2 cmH2O. W ten sposób płuco może się rozszerzać przez jak najkrótszy czas10.

Na zakończenie eksperymentu, badacz często chce zebrać wiele rodzajów próbek do wielu rodzajów analiz z każdego przeszczepu. Na przykład zamrożona tkanka, tkanka utrwalona w formalinie, stosunek tkanki do masy mokrej do suchej w celu określenia obrzęku płuc oraz płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzowego (BAL) mogą być wykorzystane do oceny, jak dobrze przebiegł przeszczep. Tradycyjna metoda pobierania płynu BAL pozwala na uzyskanie mieszanej próbki zbiorczej zarówno z rodzimych płatów biorcy, jak i z przeszczepionego płata dawcy13,14,15. Aby temu zaradzić, przedstawiamy metodę zaciskania obszarów wnękowych, która może zapewnić bardziej precyzyjny wgląd w stan przeszczepionych i rodzimych płuc. Ponadto należy wziąć pod uwagę objętość PBS używaną do zbierania płynu BAL z każdej strony płuc, ponieważ płyn BAL zawiera wiele rozpuszczalnych czynników, takich jak cytokiny i chemokiny, które są mierzone za pomocą stężenia. Normalizacja objętości wkraplanego płynu do szacowanej objętości pojemności płuc może pomóc w porównaniu. Z czterema płatami po prawej stronie i jednym płatem po lewej stronie, każdy z pięciu płatów szczura ma inną objętość i powierzchnię16. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami dotyczącymi pomiaru objętości płatów płuc przeprowadzonym przez Backera i wsp., z całkowitej objętości całego płuca objętość prawych płatów wynosi 63% (4400 mm3), a lewego płata 37% (2500 mm3). Dlatego zalecamy, aby objętość PBS używaną do zbierania płynu BAL była obliczana jako dwukrotność objętości oddechowej (7,2 ml/kg) pomnożona przez 63% dla prawego płuca i 37% dla lewego płuca. Korzystając z tego podejścia, można lepiej kontrolować zmienne, takie jak masa ciała i czas10,16.

W sumie, w tym raporcie zademonstrujemy kilka modyfikacji standardowego eksperymentalnego modelu przeszczepu płuc szczurów, które mogą uczynić procedurę bardziej efektywną i zwiększyć zdolność do generowania dokładniejszych i obfitszych danych z każdego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Samce szczurów Sprague-Dawley (180-270 g masy ciała) zostały zakupione komercyjnie (np. Envigo) i trzymane w warunkach wolnych od patogenów w Ośrodku dla Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w sposób humanitarny zgodnie z NIH i Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Komitetu ds. Instytucjonalnej Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (Protokół IACUC # 2012A00000135-R2).

1. Wstępna konfiguracja

  1. Konfiguracja urządzeń chirurgicznych.
    UWAGA: Jest to operacja niezapewniająca przeżycia. Jeśli ma zostać przeprowadzona operacja przeżycia, konieczne byłoby podjęcie sterylnych narzędzi i środków ostrożności barierowych.
    1. Włącz sprzęt do monitorowania tętna/saturacji tlenem i płytę rozgrzewającą do 42 °C.
    2. Włącz maszynę do wentylacji i znieczulenia, aby wstępnie ogrzać parownik izofluranu.
      UWAGA: Użyj objętości oddechowej (Td) 7.2 ml/kg, dodatniego końcowego ciśnienia wydechowego (PEEP) 2 cmH2O i częstości oddechów 80 uderzeń na minutę.
    3. Napełnij strzykawkę anestezjoterapeutyczną 10 ml płynnego izofluranu i zamontuj strzykawkę na urządzeniu do wentylacji i znieczulenia.
    4. Włącz mikroskop zabiegowy z wysokością i ostrością dostosowaną do preferencji mikrochirurga.
    5. Włącz urządzenie do elektrokoagulacji.
  2. Przygotuj i rozłóż narzędzia chirurgiczne (Rysunek 1).
    UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne były sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
  3. Zbieraj i rejestruj masę ciała szczurów dawców i biorców.
  4. Skorzystaj z Tabeli 1 i masy ciała szczura, aby określić prawidłową grubość cewnika naczynio-naczyniowego (20, 18, 16, 14 lub 12 G) do wykonania mankietów.
  5. Przygotuj mankiety na tętnicę płucną (PA), oskrzela (Br) i żyłę płucną (PV), korzystając z przewodnika rozmiarów opartego na masie ciała (Tabela 1 i Rysunek 2).
    1. Umieść angiocewnik o rozmiarach 20 G, 18 G, 16 G, 14 G lub 12 G (Rysunek 2A-E) na sterylnej powierzchni pod mikroskopem operacyjnym.
    2. Następnie użyj ostrza chirurgicznego z żebrowanym grzbietem #11 (Rysunek 2F), aby przeciąć angio-cewnik pod kątem 90 °, aby utworzyć korpus mankietu o długości 2 mm z zakładką 1 mm X 1 mm (szerokość x wysokość) w górnej części korpusu mankietu (Rysunek 2G).
    3. Mankiety należy przechowywać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aż będą gotowe do użycia.
  6. Przygotuj rozwiązania.
    1. Przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w sterylnej fiolce do wstrzykiwań, dodając 1 ml ksylazyny (100 mg/ml) do 10 ml ketaminy (100 mg/ml).
      UWAGA: Data ważności tego koktajlu to ustalona na podstawie najwcześniejszej daty ważności użytych komponentów.
    2. Pobrać do strzykawek odpowiednią dawkę dla szczurów (0,1 ml mieszaniny ketaminy/ksylazyny na 100 g masy ciała szczura; np. dla szczura o wadze 200 g dostarczone zostanie 0,2 ml mieszaniny ketaminy/ksylazyny).
      UWAGA: Ta dawka dostarczy szczurowi 91 mg / kg ketaminy i 9,1 mg / kg ksylazyny i powinna utrzymać szczura w sedacji przez 60-80 minut.
    3. Przygotuj heparynę, która będzie podawana w dawce 1 000 U/kg.
    4. Sól fizjologiczną, PBS i roztwór konserwujący należy przechowywać na lodzie (tabela materiałów).

2. Przygotowanie szczura-dawcy

  1. Wywołaj znieczulenie u szczura dawcy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny i odczekanie ~ 10 minut na rozwinięcie się chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, którą można ocenić na podstawie braku odpowiedzi na szczypanie palca.
  2. Ogol obszar nacięcia za pomocą elektronicznych maszynek do strzyżenia.
  3. Umieść szczura-dawcę w pozycji leżącej na chirurgicznej desce rozgrzewającej i przetrzyj miejsce nacięcia sterylną gazą nasączoną betadyną. Następnie przetrzyj obszar wacikiem nasączonym 70% alkoholem izopropylowym. Powtórz 3 razy.
  4. Wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej od 3 do 4 cm w połowie szyi za pomocą nożyczek i ostrożnie wypreparuj tkanki podskórne i mięśnie za pomocą kleszczy (zamiast nożyczek, aby uniknąć krwawienia).
  5. W przypadku intubacji dotchawiczej nawlecz jedwabny szew 4-0 wokół tchawicy i wprowadź do tchawicy cewnik naczynio-naczyniowy 16 G. Zawiąż mocno szew wokół tchawicy podwójnym węzłem, a następnie zakończ pojedynczym węzłem, aby utrzymać cewnik naczynio-naczyniowy na miejscu.
  6. Podłączyć angiocewnik do respiratora i utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia u szczura za pomocą 1-2% izofluranu.
  7. Wykonaj laparo-sternotomię jako połączone nacięcie linii środkowej i poprzecznej za pomocą nożyczek.
  8. Wstrzyknąć heparynę (1 000 j./kg) za pomocą strzykawki insulinowej przez żyłę główną dolną (IVC) i odczekać 10 minut na krążenie ogólnoustrojowe.
    UWAGA: Takie podawanie heparyny zapobiega zakrzepom krwi w płucach dawcy.
  9. Ostrożnie wypreparuj przeponę, przecinając wzdłuż łuku piersiowego, a następnie odsłoń klatkę piersiową, podążając za mostkiem do szyi.

3. Niedokrwienie ciepła płuc dawcy i pobieranie

  1. Poddaj eutanazji szczura-dawcę, przecinając IVC.
  2. Podczas gdy płuca są nadal wentylowane, przeciąć zarówno prawe, jak i lewe małżowiny uszne za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparowania i przepłukać grawitacyjnie płuca 20 ml roztworu konserwującego w strzykawce zawieszonej na 28 cmH2O grawitacyjnie podłączonej do rurki i cewnika naczyniościennego 18 G, który wprowadza się bezpośrednio przez tętnicę płucną.
  3. Odłączyć respirator od rurki dotchawiczej i podłączyć go do strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej odpowiednią ilością powietrza w zależności od masy ciała.
    UWAGA: Objętość powietrza do nadmuchania płuc można obliczyć jako dwukrotność objętości oddechowej (Td = 7,2 ml / kg), np. szczur o wadze 200 g miałby Td 1,44 ml, a pomnożenie go przez 2 równałoby się 2,88 ml powietrza potrzebnego do napompowania płuc.
  4. Napompuj płuca dawcy.
  5. Umieść zacisk Yasargil na tchawicy, aby utrzymać płuca napompowane, a płuca i serce przykryj sterylną bawełnianą gazą. Nawilż gazę solą fizjologiczną, owiń szczura-dawcę podkładką i pozostaw na rozgrzewającej desce chirurgicznej na 1 godzinę, aby wywołać ciepłe niedokrwienie w płucach (Ryc. 3).
  6. Po 1 godzinie ciepłego niedokrwienia wyciąć blok płuco-serce za pomocą mikro sprężynowych nożyczek preparacyjnych i kleszczyków i umieścić na sterylnej gazie zwilżonej lodowatym PBS na sterylnej szalce Petriego na lodzie.
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki powinny wystąpić, gdy płuca znajdują się na szalce Petriego na lodzie.
  7. Ostrożnie naciąć więzadła płucne mikropreparacyjnymi nożyczkami sprężynowymi, aby oddzielić lewe płuco od przełyku i płata zakwadźniczego.
  8. Ostrożnie przytnij lewy obszar wnęki płuca nożyczkami sprężynowymi Vannas-Tubingen i zaopatrz się w lewe PV, PA i Br.
  9. Umieść mankiety na PV, PA lub Br (Rysunek 4A-C).
    1. Użyj hemostatu komara, aby chwycić zakładkę mankietu.
    2. Użyj cienkich kleszczy, aby chwycić dystalny koniec PV, PA lub Br przez odpowiedni korpus mankietu, odczep dodatkową tkankę wokół mankietu i zabezpiecz za pomocą 8-0 szew nylonowy. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen, aby przyciąć dodatkową tkankę i mankiet wokół korpusu mankietu.
  10. Utrzymuj płuco dawcy przykryte gazą zwilżoną solą fizjologiczną na szalce Petriego na lodzie, aż będzie gotowe do przeszczepienia szczurowi biorcy (Ryc. 4D).
    UWAGA: Średni czas zimnego niedokrwienia wynosi 84 min ± 11 min SD

4. Przygotowanie szczura odbiorcy

  1. Wywołać znieczulenie u szczura biorcy w taki sam sposób, jak u szczura dawcy, wstrzykując dootrzewnowo mieszaninę ketaminy i ksylazyny (0,1 ml na 100 g szczura) i czekając 10 minut na rozwinięcie się chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, którą można ocenić na podstawie braku odpowiedzi na szczypanie palca.
  2. Ogolić obszar nacięcia za pomocą elektronicznych maszynek do strzyżenia.
  3. Umieść szczura dawcę w pozycji leżącej na plecach i przetrzyj miejsce nacięcia sterylną gazą nasączoną betadyną. Następnie przetrzyj obszar wacikiem nasączonym 70% alkoholem izopropylowym. Powtórz 3 razy.
  4. Zanim szczur zostanie przymocowany do maszyny wentylacyjnej, narysuj linie na klatce piersiowej szczura, przygotowując się do znalezienia 4. przestrzeni międzyżebrowej.
    1. Zmierz klatkę piersiową od wcięcia nadmostkowego do wyrostka mieczykowatego i narysuj linię (Ryc. 5A).
    2. Na środku tej linii narysuj linię po lewej stronie klatki piersiowej, która mierzy połowę pomiaru od wcięcia nadmostkowego do wyrostka mieczykowatego (Ryc. 5A i B).
  5. Zaintubować biorcę za pomocą angiocewnika 16 G za pomocą wizualizacji za pomocą światłowodowego podłączonego do światła LED z zestawu do intubacji dotchawiczej.
  6. Podłączyć angiocewnik do respiratora i utrzymywać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia za pomocą 1-2% izofluranu.
    7. Aby znaleźć czwartą przestrzeń międzyżebrową, znajdź obszar ściany klatki piersiowej, w którym można wyczuć silny, wyczuwalny impuls sercowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5C, czerwone kółko).
  7. W tym miejscu naciąć skórę nożyczkami, a mięsień nożyczkami sprężynowymi do mikropreparowania i użyć retraktora, aby jak najszerzej otworzyć 4. przestrzeń międzyżebrową (Rysunek 5D i E).
  8. UWAGA: Użyj kauteryzacji elektrycznej, aby uniknąć lub zatrzymać krwawienie podczas sekcji mięśni.
  9. Po szerokim otwarciu przestrzeni międzyżebrowej należy ostrożnie wyciąć więzadła wokół lewego płuca biorcy za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen i wyciągnąć płuco z obszaru klatki piersiowej za pomocą sterylnych wacików i kleszczy.
  10. Umieść sterylną gazę wokół lewego płuca i przytrzymaj ją za pomocą zacisku buldoga Dieffenbacha.
  11. Założyć zacisk Yasargil na lewy obszar wnęki płuca tak proksymalnie, jak to możliwe.

5. Zespolenia

  1. Zespolenie żyły płucnej (PV)
    1. Umieść nylonowy szew 7-0 wokół PV biorcy.
    2. Naciąć PV biorcy za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen, przecinając poprzecznie górne i dolne żyły segmentowe tak dystalnie, jak to możliwe, i wypłukać krew 0,2 ml heparynizowanego soli fizjologicznej (1 U/ml) za pomocą strzykawki insulinowej.
    3. Umieścić płuco dawcy owinięte lodowatą mokrą, sterylną gazą w jamie klatki piersiowej.
    4. Włóż mankiet PV dawcy do PV biorcy, a następnie zabezpiecz wstępnie ustawionym nylonowym szwem 7-0 (Rysunek 6).
  2. Zespolenie oskrzelowe (Br)
    1. Umieść nylonowy szew 7-0 wokół Br biorcy.
    2. Naciąć Br biorcy, przecinając górne i dolne drogi oddechowe segmentu poprzecznie tak dystalnie, jak to możliwe, za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen.
    3. Włóż mankiet Br dawcy do Br biorcy i zabezpiecz wstępnie ustawionym nylonowym szwem 7-0 (Rysunek 6).
  3. Zespolenie tętnicy płucnej (PA):
    1. Umieść nylonowy szew 7-0 wokół PA biorcy.
    2. Naciąć PA biorcy z osłonki przybyszowej, naciąć połowę obwodu naczynia nożyczkami sprężynowymi Vannas-Tubingen, a następnie wypłukać krew w PA za pomocą 0,2 ml heparynizowanego soli fizjologicznej (1 U/ml) za pomocą strzykawki insulinowej.
    3. Włóż mankiet PA dawcy do PA biorcy i zabezpiecz wstępnie założonym nylonowym szwem 7-0 (Rysunek 6).

6. Reperfuzja

  1. Zdejmij zacisk Yasargil na wnęce, aby umożliwić reperfuzję i wentylację przeszczepionego płuca dawcy (Ryc. 7).
  2. Wypreparuj rodzime lewe płuco biorcy za pomocą mikro nożyczek sprężynowych i kleszczy.
  3. Ostrożnie przenieś przeszczepione lewe płuco do klatki piersiowej biorcy.
  4. Zamknij nacięcie torakotomii za pomocą nylonowego szwu 6-0.
      Umieść trzy nylonowe szwy 6-0 z prostymi podwójnymi węzłami wokół żeber powyżej 4. żebra i niższe od 5. żebra ( klasa="xfig">Ryc. 8A).
    2. Użyj hemostatów, aby zebrać trzy szwy razem (Rysunek 8B).
    3. Zwiększ PEEP do 6 cmH2O w ustawieniach wentylacji.
    4. Zwiąż ze sobą wszystkie trzy węzły w tym samym czasie, odciągając, aby zamknąć ranę (Rysunek 8C).
    5. Natychmiast zmniejszyć PEEP do 2 cmH2O.
    6. Zamknij skórę za pomocą nylonowego szwu 6-0.
      UWAGA: Nasze laboratorium bada ostrą fazę po przeszczepie, więc szczur biorca w tym modelu przeżywa 3 godziny po przeszczepie pod wentylacją i znieczuleniem, a następnie pobierane są próbki.

7. Zbiór próbek eksperymentalnych (osocze, tkanka płucna)

  1. W przypadku próbek kontrolnych należy pobrać prawe płaty dawcy po rozpoczęciu 3-godzinnego okresu reperfuzji.
    1. Zamroź płat górny i płat zakawałowy do analiz ekspresji białka lub RNA, zachowaj płat środkowy do histologii i użyj płata dolnego do stosunku masy mokrej do suchej (Rysunek 9A).
  2. Na 10 minut przed końcem 3-godzinnego czasu reperfuzji należy przygotować się do pobrania próbek biorcy, wstrzykując heparynę (1 000 j./kg) za pomocą strzykawki insulinowej do żyły szyjnej.
    UWAGA: Takie podawanie heparyny zapobiega powstawaniu zakrzepów krwi w płucach i pozwala na dokładniejsze płukanie w momencie pobrania.
  3. Pobieranie osocza
    1. Pod koniec 3-godzinnego okresu reperfuzji należy pobrać 1 ml krwi za pomocą strzykawki przez IVC.
    2. Przechowywać na lodzie, a następnie odwirowywać przy 2 000 x g przez 10 minut w celu zebrania osocza.
  4. Poddaj eutanazji szczura biorcę, przecinając IVC, aby umożliwić wykrwawienie.
  5. Wypreparuj przeponę wzdłuż łuku piersiowego i odsłoń jamę piersiową, wycinając klatkę piersiową.
  6. W razie potrzeby pobrać płyn BAL z płuc natywnych lub przeszczepionych (opcjonalnie).
    UWAGA: Jeśli w płucach wykonywany jest stosunek mokrej masy do suchej lub histologia, nie należy wykonywać pobierania płynu BAL, ponieważ może to wpłynąć na wyniki.
    1. Nawlecz jedwabny szew 4-0 wokół tchawicy i zawiąż ciasny podwójny węzeł wokół tchawicy i rurki intubacyjnej, aby zapobiec wyciekowi płynu.
    2. Oblicz ilość lodowatego PBS do zbierania płynu BAL z prawego i lewego płata.
      UWAGA: Stosunek objętości dla prawego płuca wynosi 63%, podczas gdy stosunek objętości dla lewego płuca wynosi 37%16. Dlatego, aby określić ilość PBS do wkroplenia do każdej strony, objętość należy obliczyć jako dwukrotność objętości oddechowej (Td = 7,2 ml/kg) pomnożoną przez 63% dla prawego płuca i 37% dla lewego płuca.
    3. Umieść zacisk Yasargil na lewym obszarze wnęki płuca (Rysunek 10A) i za pomocą strzykawki podłączonej do cewnika naczynionośnego wkraść obliczoną ilość lodowatego PBS do prawego płuca (natywne płaty biorcy) i zbierz płyn BAL, delikatnie pociągając w górę tłok strzykawki. Wykonaj dwukrotnie.
      UWAGA: Należy spodziewać się 70-80% odzysku wkroplonego płynu.
    4. Zdejmij zacisk Yasargil na lewym płucu i umieść zacisk na prawej okolicy wnęki płuca (Rysunek 10B).
    5. Pobrać płyn BAL z przeszczepionego lewego płata w taki sam sposób, w jaki został pobrany dla prawego płata, a następnie usunąć zacisk z okolicy wnęki prawego płuca.
  7. Przeciąć prawe i lewe małżowiny uszne za pomocą mikropreparacyjnych nożyczek sprężynowych i przepłukać płuca grawitacyjnie przez PA za pomocą 18 G angiocewnika przymocowanego do rurki i strzykawki z 20 ml wstępnie schłodzonego roztworu konserwującego, wiszącej na 28 cmH2O.
  8. Pobrać próbki z płuc biorcy.
    1. Zamroź płat górny i płat zadolny do analiz ekspresji białka lub RNA, zachowaj płat środkowy do histologii i użyj płata dolnego do stosunku masy mokrej do suchej) (Rysunek 9A).
    2. Podziel lewy przeszczepiony lewy płat na trzy części: górny obszar zebrany do zamrożenia, środkowy obszar do histologii i dolny obszar do stosunku masy mokrej do suchej (Rysunek 9B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu pomiaru obrzęku płuc obliczono stosunek masy mokrej do masy suchej. Płat natywny dawcy, płat przeszczepiony oraz płat natywny biorcy pobrano zgodnie z opisem w protokole i zważono natychmiast w celu ustalenia masy mokrej, a następnie suszono w temperaturze 60 °C przez 48 h i zważono ponownie w celu ustalenia masy suchej. Zwiększony stosunek masy mokrej do suchej świadczyłby o wystąpieniu obrzęku płuc. Nasze wyniki wskazują, że w płacie przeszczepionym odnotowano istotny wzrost stosunku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie interweniowaliśmy na kilku krytycznych etapach protokołu przeszczepu płuc szczurów, aby zoptymalizować procedurę. Podczas gdy opisano różne techniki zakładania kajdanek do przeszczepu płuc szczurów 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

BAW, YGL i JLK są wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH) R01HL143000. BAW jest wspierany przez Departament Obrony (DOD) w ramach grantu W81XWH1810787. SMB jest wspierany przez R01DK123475 grantów NIH. JM jest wspierany przez granty NIH AR061385, AR070752, DK106394 i AG056919, a także przez grant DOD W81XWH-18-1-0787.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik naczynio-cewnik o rozmiarze 12BD382277
14 Cewnik naczynio-cewnik. Braun4251717-02
16 Cewnik naczynio-cewnikB. Braun4252586-02
18 Cewnik naczynio-cewnikB. Braun4251679-02
Cewnik naczynio-kątowy o rozmiarze 20B. Braun4252527-02
Szewjedwabny 4-0Specjalizacje chirurgiczne Corp.SP116
6-0 szew nylonowyAD Chirurgicznynylonowy S-N618R13
7-0AD ChirurgicznyS-N718SP13
8-0AD ChirurgicznyXXS-N807T6
Betadine w sprayuAvrio Health L.PUPC
Maszynki do strzyżeniaVWRMSPP-023326
Castroviejo micro nożyczki sprężynowe do preparowaniaRoboz Surgical Instrument CoRS-5668
Dumont #5 - Drobne kleszczeFine Science Tools11254-20
ElektrokoagulacjaMacanMV-7A
Zestaw do intubacji dotchawiczejKent ScientificETI-MSE
Kleszcze Fine Science Tools11027-12
Hemostat komara HalstedRoboz Surgical Instrument CoRS-7112
HeparynaFresnius Opieka medycznaC504701
Strzykawka insulinowaLife TechnologiesB328446
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Waciki z alkoholem izopropylowymBD326895
KetaminaHikma Pharmaceuticals PLCNDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog ClampWorld Precision InstrumentsWPI14117
Uchwyt igły/kleszcze, zakrzywioneMicrinsMI1542
Uchwyt na igłę/kleszcze, prosteMicrinsMI1540
Perfadex Plus (roztwór do konserwacji narządów)XVIVO Perfusion ABREF# 19950
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RTSłuży do sprawdzania SpO2 i
retraktoraRoboz Surgical Instrument CoRS-6560
SalinePP Pharmaceuticals LLCNDC 63323-186-10
NożyczkiFine Science Tools14090-11
System anestezjologiczny dla małych zwierząt SomnoSuiteKent ScientificSS-MVG-Module
Sterylny  Bawełniana gaziczkaFisherbrand22-415-469
Mikroskop chirurgicznyLeicaM500-N ze
5 mlBD309646
Vannas-Tubingen Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki o nauce15008-08
XylazineKorn Pharmaceuticals CorpNDC 59399-110-20
Zacisk YasargilAesculap, IncFT351TSłuży do zaciskania oskrzeli
Yasargil ClampAesculap, IncFT261TSłuży do zaciskania hilum
Yasargil Clamp ApplicatorAesculap, IncFT484T
B szew szew nylonowy 367618160039 bicia serca strzykawką OHS

Bibliografia

  1. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
  2. Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
  3. Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
  4. Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1(2013).
  5. Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407(2020).
  6. Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
  7. Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
  8. Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
  9. Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
  10. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  11. Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  12. Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  13. Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
  15. Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
  16. De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
  17. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309(2015).
  18. Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947(2012).
  19. Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387(2014).
  20. Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
  21. Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
  22. Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika zaciskania (cuffing)tętnica płucnażyła płucnapłukanie oskrzelowo-pęcherzykowepreparowanie przestrzeni międzyżebrowychpomiar obrzęku płucmikroskop chirurgiczny
Model przeszczepu płuc szczura uszkodzenia cieplnego niedokrwienia/reperfuzji: optymalizacje w celu poprawy wyników
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.