Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Podsumowanie

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Streszczenie

Testy przesunięcia termicznego (TSA) badają, jak zmienia się temperatura topnienia (T_m) docelowego białka w odpowiedzi na zmiany w jego otoczeniu (np. skład buforu). Użyteczność TSA, a w szczególności nano-różnicowej fluorymetrii skaningowej (nano-DSF), została ustalona na przestrzeni lat, zarówno w celu znalezienia warunków, które pomagają ustabilizować określone białko, jak i w celu przyjrzenia się wiązaniu ligandów poprzez monitorowanie zmian w pozornym_TM. W artykule przedstawiono efektywne badanie przesiewowe biblioteki fragmentów Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 związków) za pomocą nano-DSF, monitorując T_m w celu identyfikacji potencjalnego wiązania fragmentów. Pokrótce przedstawiono warunki wstępne dotyczące jakości i stężenia białka do przeprowadzania eksperymentów nano-DSF, a następnie przedstawiono protokół krok po kroku, który wykorzystuje nanolitrowy automatyczny dozownik powszechnie używany w laboratoriach biologii strukturalnej do przygotowywania wymaganych próbek na 96-dołkowych płytkach. Protokół opisuje, w jaki sposób mieszaniny odczynników są przenoszone do kapilar potrzebnych do pomiarów nano-DSF. Ponadto w artykule przedstawiono protokoły pomiaru denaturacji termicznej (monitorowanie wewnętrznej fluorescencji tryptofanu) i agregacji (monitorowanie rozpraszania wstecznego światła) oraz kolejne etapy przesyłania i analizy danych. Na koniec omówiono eksperymenty przesiewowe z trzema różnymi docelowymi białkami, aby zilustrować zastosowanie tej procedury w kontekście kampanii odkrywania potencjalnych klientów. Ogólna zasada opisanej metody może być łatwo przeniesiona do innych bibliotek fragmentów lub dostosowana do innych instrumentów.

Wprowadzenie

Programy odkrywania leków często zaczynają się od badania związków chemicznych pod kątem ich zdolności do interakcji i/lub modyfikacji funkcji celów leków, najczęściej białek. Tak zwane "trafienia", które znajdują się na takich ekranach, stanowią podstawę do odkrycia nowych tropów i kandydatów do rozwoju, a także dla większości nowych leków, które są obecnie licencjonowane. Dostępność metod o wysokiej przepustowości jest zatem niezbędna do przesiewania ogromnej liczby dostępnych celów za pomocą ogromnej liczby różnych związków w celu szybkiego zidentyfikowania ich ścisłego wiązania lub zdolności do modulowania określonej funkcji celu. Po zidentyfikowaniu trafień, najbardziej obiecujące kombinacje trafienia-celu są wprowadzane do obszernego procesu opracowywania leków przy użyciu innych, często kosztownych i czasochłonnych technologii, aby zrozumieć "zależności między strukturą a aktywnością" (SAR).

Podejścia do biologii strukturalnej, takie jak te oferowane przez finansowane przez UE programy dostępu "Infrastruktura dla NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) i jego obecnego następcy iNEXT-Discovery, są często używane do badania interakcji wielu związków w ekstremalnych szczegółach, jednocześnie poprawiając powinowactwo i właściwości farmakologiczne początkowych uderzeń przez zazwyczaj kilka rund chemii syntetycznej¹. Związki ołowiu, które powstają w wyniku tych kampanii "od trafienia do ołowiu", stają się kandydatami do rozwoju i wchodzą do badań przedklinicznych. Dobrze rozwiniętą metodologię molekularnych badań przesiewowych można z grubsza podzielić na dwa podejścia, a mianowicie odkrywanie ołowiu oparte na ligandach (LBLD) i odkrywanie ołowiu oparte na fragmentach (FBLD). W kampaniach LBLD receptory białkowe są badane za pomocą kilku tysięcy ręcznie wybranych ligandów (w oparciu o strukturę naturalnych ligandów lub strukturę celu) lub za pomocą wielu dziesiątek tysięcy związków w bibliotekach ligandów podobnych do leków, które pokrywają dużą część przestrzeni chemicznej.

Zazwyczaj, związki są testowane pod kątem ich aktywności hamującej w teście aktywności, zazwyczaj monitorując funkcję enzymatyczną. W kampaniach FBLD^2,3,4,5, jednak kilkaset związków, które są zwykle mniejsze niż leki (100-200 daltonów), jest testowanych pod kątem ich zdolności do bezpośredniego wiązania celu, bez użycia testu aktywności. To wiązanie może zakłócać aktywność celu i może być mierzone za pomocą wielu metod biofizycznych, które bezpośrednio informują o zdolności fragmentów do wiązania się z celem, lub za pomocą metod strukturalnych, takich jak krystalografia rentgenowska⁶ i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego⁷, a ostatnio także mikroskopia krioelektronowa. Kiedy fragmenty wiążą się w różnych miejscach, które są blisko siebie na białku, różne, zwykle o niskim powinowactwie fragmenty wiążące można racjonalnie połączyć chemicznie, aby stworzyć mały zestaw przewodów, który można badać bardziej szczegółowo. Często prowadzi to do powstania silniejszych związków o wyższym powinowactwie, a ta metodologia zaczęła prowadzić do uzyskania ważnych cząsteczek o potencjale klinicznym. Wybór "idealnej" biblioteki fragmentów, która efektywnie wykorzystuje grupy chemiczne, był aktywnym obszarem badań od wielu lat^8,9,10.

Podczas gdy początkowo nacisk kładziono na pokrycie pełnej przestrzeni chemicznej, późniejsza uwaga skupiła się na umożliwieniu dalszego chemicznego łączenia uderzeń fragmentów w celu wytworzenia związków ołowiu. Takie badania doprowadziły do powstania tak zwanych "opanowanych" bibliotek. Zawierają one fragmenty z co najmniej jedną grupą funkcyjną, które umożliwiają szybką, tanią kontynuację chemii syntetycznej w celu skutecznego postępu w badaniu SAR. Jednym z działań zainicjowanych w ramach projektu iNEXT była aktualizacja biblioteki opracowanej przez naukowców z konsorcjum Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Ten wspólny wysiłek zaowocował powstaniem biblioteki DSi-Poised¹¹, która została również zweryfikowana w iNEXT¹². Później biblioteka ta została dostosowana do dostępności związków w REAL Database firmy Enamine Ltd., organizacji zajmującej się badaniami chemicznymi i producenta dużych zbiorów bloków budulcowych i bibliotek związków do badań przesiewowych. DSi-Poised jest teraz dostępny do zakupu dla każdego, ale jest również dostępny w wielu laboratoriach partnerskich iNEXT-Discovery dla wspieranych projektów badań przesiewowych fragmentów.

Zaawansowane technologie krystalografii rentgenowskiej i biologii strukturalnej NMR mają swoje zalety i wady dla FBLD. Oba wymagają izolowanych próbek docelowych i dają szczegóły atomowe o wysokiej rozdzielczości, które są wymagane dla FBLD. Jednak kryształy są niezbędne do krystalografii rentgenowskiej, a fragmenty wiążą się z wnękami w dobrze uporządkowanych regionach białkowych, które nie są zaangażowane w budowę trójwymiarowej sieci krystalicznej. NMR w roztworze często daje inne wyniki niż krystalografia rentgenowska, ponieważ nie ma na niego wpływu środowisko krystaliczne i jest dobry w wykrywaniu wiązania również w częściowo uporządkowanych regionach białka. Jednakże, chociaż eksperymenty NMR oparte na ligandach są stosunkowo szybkie, nadal wymagają znacznej ilości czasu i materiału i można je rutynowo wykonywać tylko dla stosunkowo małych celów białkowych lub domen. W celu priorytetyzacji związków do eksperymentów krystalograficznych lub NMR zastosowano podejścia biofizyczne^13,14,15.

Ponieważ najnowsze oprzyrządowanie i protokoły obliczeniowe pozwalają na efektywne krystalograficzne badania przesiewowe FBLD poprzez bardzo efektywne określanie struktur i analizowanie ~1,000 fragmentów, ta priorytetyzacja stała się mniej istotna w badaniach opartych na promieniowaniu rentgenowskim. Jednak w przypadku NMR pożądane jest stosowanie tańszych i szybszych eksperymentów, aby nadać priorytet selekcji bibliotek i zaoszczędzić czas na sprzęcie najwyższej klasy. Jednocześnie, zastosowanie kombinacji zasadniczo różnych technologii może zapewnić niezależne potwierdzenie zdarzeń wiązania, a nawet dodatkowe trafienia, które nie są wychwytywane przy użyciu wyłącznie metody krystalograficznej lub NMR. Zarówno techniki krystalograficzne, jak i NMR wymagają bardzo drogiego sprzętu i często można je wykonać tylko w dedykowanych obiektach zewnętrznych z pomocą lokalnych, wysoko wykwalifikowanych ekspertów. Ponadto właściwa analiza wyników również wymaga wysokiej wiedzy specjalistycznej. Podczas gdy programy takie jak iNEXT i iNEXT-Discovery demokratyzują dostęp do takich obiektów¹⁶, uznano, że tanie, szybkie i wysokowydajne badania przesiewowe FBLD innymi metodami mogą zachęcić do programów badań przesiewowych leków w znacznie szerszym zakresie laboratoriów. Takie wyniki mogą być następnie wykorzystane jako wskazówka do nawiązania współpracy z chemikami medycznymi oraz do nadania priorytetu najdroższym eksperymentom przesiewowym w stosunku do najbardziej obiecujących związków, jeśli NMR i urządzenia krystalograficzne nałożą ograniczenia na liczbę związków, które można poddać badaniom przesiewowym.

TSA tworzy szybką, efektywną i stosunkowo tanią i dostępną metodę biofizyczną¹⁷, która może być wykorzystana do badań przesiewowych FBLD. Był używany w wielu sytuacjach, od pomocy w znalezieniu stabilnych warunków białkowych do prób krystalizacji¹⁸, po znajdowanie związków, które wiążą się z określonymi celami w komórkach¹⁹. TSA są również używane do pomiaru stałych dysocjacji ligandów wiążących białka docelowe, ponieważ wiązanie ligandów często prowadzi do zmian w stabilności termicznej. We wszystkich TSA zmiana temperatury denaturacji białka (jego stabilności) jest mierzona jako funkcja powolnego wzrostu temperatury. Skutecznym sposobem śledzenia denaturacji białek po podgrzaniu jest DSF lub Thermofluor, który określa ilościowo wygaszanie fluorescencji barwnika hydrofobowego (zwykle Sypro Orange) po interakcji z odsłoniętymi hydrofobowymi regionami białka, które rozwijają się pod wpływem wzrostu temperatury.

Nano-DSF zazwyczaj odnosi się do pomiaru stabilności termicznej białka przy braku zewnętrznych barwników. Jednym z pierwszych instrumentów, który oferował taką możliwość, był OPTIM1000, który mierzy szerokie spektrum natężenia światła, a także rozpraszania światła próbki. Maszyna ta pozwoliła na jednoczesny pomiar fałdowania białek (zwykle po fluorescencji tryptofanu) i agregacji białek (ponieważ powstałe nanocząstki powodują wzrost rozpraszania światła przy ~400 nm). Później Prometheus wprowadził zastosowanie odbicia wstecznego do pomiaru agregacji i czułego wykrywania sygnału fluorescencji, co pozwoliło na badanie przesiewowe niskich stężeń białek z dobrą czułością²⁰. W poniższej sekcji opisano, w jaki sposób Prometheus został wykorzystany do zademonstrowania protokołu badania przesiewowego fragmentów w celu wykrywania trafień dla różnych celów białkowych. Po krótkim wprowadzeniu na temat oczekiwanej jakości i ilości białka następuje protokół krok po kroku dotyczący przygotowania, przeprowadzenia i analizy eksperymentów przesiewowych fragmentów. Wyniki badań przesiewowych dla trzech białek przedstawiono jako przykładowe dane uzyskane w ramach współpracy w ramach projektu iNEXT-Discovery.

Protokół

UWAGA: Białka używane w eksperymentach nano-DSF powinny być czyste (>95%) i jednorodne, jak ocenia elektroforeza w żelu dodecylosiarczanowym sodu. Przed wykonaniem badania przesiewowego fragmentów należy określić stabilność białek w różnych warunkach buforowych. Należy stosować bufor o niskiej sile jonowej i niskiej zawartości soli, który w minimalnym stopniu ingeruje w białko, aby nie wpływać na jego bezpośrednią interakcję z fragmentami. zwykle używane w tym protokole do sprawdzania stabilności przedstawiono w >tabeli uzupełniającej S1. Stężenie białka, które należy użyć w tym eksperymencie jako roztwór podstawowy, wynosi zwykle 0,2 mg ^mL-1. Do badań przesiewowych całej biblioteki DSi-Poised (768 związków) potrzeba łącznie ~12 ml białka o tym stężeniu, w sumie ~2,5 mg. Biblioteka DSi-Poised używana w tych eksperymentach została dostarczona w formacie 96-dołkowym (Rysunek 1). Stężenie fragmentów dostosowano do 100 mM w 20% v/v dimetylosulfotlenku (DMSO). Należy zauważyć, że opisany tutaj protokół mieszania skutkuje niskimi końcowymi stężeniami DMSO wynoszącymi 0,4% v/v; chociaż jest bardzo mało prawdopodobne, aby wpłynęło to na stabilność białka, działanie DMSO powinno być sprawdzane dla każdego nowego białka.

Rysunek 1: Rodzaje płytek używanych do tych eksperymentów. (A) Płyta dolna w kształcie litery U. (B) Płytka 96-dołkowa. (C) Zbliżenie na 96-dołkową płytkę pokazującą studzienkę podwodną 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie talerza

1. Wyjmij płytkę z odłamkami z zamrażarki -20 °C/-80 °C i pozwól jej rozmrozić się w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając na wytrząsarce stołowej. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 30 s, aby zebrać krople przyklejające się do boku studzienek.
   UWAGA: Ponieważ biblioteka fragmentów jest dostępna rozpuszczona w DMSO-d₆ (temperatura topnienia 19 °C), ważne jest, aby upewnić się, że każdy związek jest całkowicie rozmrożony i rozpuszczony.
2. Weź 2-dołkową płytkę krystalizacyjną MRC (Rysunek 1A) i odpipetuj 14,7 μl podstawowego roztworu białka do każdej podstudzienki. Aby to zrobić w sposób efektywny czasowo, przechowuj białko w zbiorniku odczynnika (Tabela materiałów) i użyj pipety wielokanałowej do dozowania (Rysunek 2A,B).
   UWAGA: W przypadku biblioteki DSi-Poised, w zależności od formatu, nie wszystkie studzienki płytki 96-dołkowej zawierają związki. Zazwyczaj wiersze A, H i kolumny 1, 12 są wypełnione DMSO. W związku z tym wiersze A, H i kolumny 1, 12 nie mogą być wypełnione białkiem, ponieważ studzienki te nie będą zawierały żadnych fragmentów na końcu następnego etapu; tylko DMSO zostanie tam przeniesione przez robota. Należy pamiętać, że puste wiersze i kolumny różnią się w niektórych tabliczkach.

Rysunek 2: Zarys procedury badania fragmentów. (A) Użycie wielokanałowej pipety i zbiornika na odczynnik do dozowania białka. (B) Dozowanie białka do płytki 96-dołkowej. (C) Dozowanie fragmentów przez robota dozującego. (D) Ładowanie białka do naczyń włosowatych. (E) Szuflada z uchwytem kapilarnym. (F) Zbliżenie na uchwyt kapilarny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przegląd sprzętu używanego w tych eksperymentach. (A) Robot nanodozujący używany do dozowania fragmentów. Pozycje płyt są wskazywane. (B) Interfejs programu do definiowania nowej płyty. (C) Interfejs programu dozowania. (D) Program dozowania używany do dozowania fragmentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Nano-dozowanie fragmentów przez robota Mosquito

1. Sprawdź rodzaj płyty, w której dostarczane są fragmenty (Tabela Materiałów).
2. Sprawdź definicje fragmentów i płytek białkowych na Mosquito.
   1. Włącz nanodozownik (Rysunek 3A). Upewnij się, że wokół ruchomych elementów nie ma żadnych przeszkód.
   2. Otwórz graficzny interfejs użytkownika, kliknij w zakładkę Setup i w sekcji Deck Configuration sprawdź, czy rodzaj płytki, w której dostarczane są związki oraz ta, w której przeniesiono białko w sekcji 1, są już obecne na liście Dostępnych płytek. Jeśli nie, kliknij Opcje|Blachy i utwórz nową definicję płyty, wypełniając poprawne wartości dla typu właściwości (Rysunek 3B).
      UWAGA: Te wartości dla płytki 2-dołkowej MRC i płytki 96-dołkowej użytej w tym eksperymencie są pokazane odpowiednio w tabeli uzupełniającej S2 i tabeli uzupełniającej S3.
3. Program dozowania
   1. Na karcie Setup (Ustawienia) określ pozycje blach w obszarze Deck Configuration.
      UWAGA: Mosquito użyty w tym eksperymencie ma dwie pozycje płyt na pokładzie. Pozycja 1 jest zdefiniowana jako blacha źródłowa, a pozycja 2 jest blachą docelową.
   2. Korzystając z menu rozwijanego, wybierz dolną płytkę Greiner U dla pozycji 1 i płytkę 2-dołkową MRC dla pozycji 2 (Rysunek 2C). Zapisz protokół.
4. Dozowanie fragmentów
   1. Umieść płytkę fragmentacyjną w pozycji 1, a płytkę białkową w pozycji 2 pokładu (Rysunek 3A).
   2. Na karcie Protokół (Rysunek 3D) kliknij na Plik i wybierz protokół zapisany w sekcji 2.3 do dozowania fragmentów. Określ objętość fragmentów, które mają być dozowane; użyć 0,3 μl. W przypadku typowej blachy, w której kolumny 1 i 12 nie zawierają fragmentów, zdefiniuj położenie początkowe na kolumnę 2 i położenie końcowe na kolumnę 11. W przypadku niektórych tablic, jeśli kolumny 2 lub 11 są puste, należy użyć kolumn 3 i 10 odpowiednio jako wartości początkowej i końcowej.
      UWAGA: Ze względu na konfigurację Mosquito można pomijać tylko kolumny, a nie wiersze; w przypadku rzędów komar będzie pipetował DMSO. Upewnij się, że opcja Zmiana końcówki jest zaznaczona jako Zawsze, aby nie spowodować zanieczyszczenia krzyżowego biblioteki fragmentów.
   3. Kliknij Uruchom, aby uruchomić program. Po zakończeniu dozowania, które trwa ~2 min, należy usunąć płytki białkowe i fragmentaryczne z robota i uszczelnić je z powrotem samoprzylepną folią uszczelniającą. Krótko odwirować płytkę białkową (500 × g, 30 s), aby zebrać wszelkie krople przyklejające się do boków studzienek przed przejściem do następnego kroku.

3. Pomiar nano-DSF

UWAGA: Szczegółowy opis wykonywania TSA za pomocą Prometheus NT.48 został opublikowany wcześniej²⁰. Wymienione są tutaj ważne punkty w kontekście screeningu fragmentów.

1. Kontrola płytki przed pomiarem
   1. Sprawdź wzrokowo studzienki płytki białkowej pod kątem wytrąceń, które mogły wystąpić w wyniku dodania fragmentów. Jeśli w wielu studniach zaobserwuje się opady, zmniejsz stężenie fragmentów i powtórz eksperyment.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie płytki białkowej w temperaturze pokojowej; Fragmenty mają tendencję do stawania się nierozpuszczalnymi w niższych temperaturach.
2. Przygotowanie Prometeusza
   1. Włącz instrument Prometheus. Na ekranie dotykowym naciśnij Otwórz szufladę, aby uzyskać dostęp do modułu ładowania kapilarnego instrumentu. Zdejmij pasek magnetyczny z modułu ładującego i wyczyść lustro etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu.
3. Przenieść z płytki z fragmentami białka do naczyń włosowatych
   UWAGA: Ten etap polega na przeniesieniu zmieszanej próbki białka/fragmentu z każdej studzienki w płytce białkowej do naczyń włosowatych w celu użycia z Prometheusem. W tym celu, mimo że zwykle stosuje się standardowy typ kapilarny, możliwe jest użycie kapilar o wysokiej czułości dla bardzo niskich stężeń białka.
   1. Umieść płytkę białkową i kapilary obok instrumentu, aby mieć łatwy dostęp do modułu ładowania kapilarnego.
   2. Weź jedną kapilarę, przytrzymaj ją na jednym końcu i dotknij roztworu w płytce białkowej drugim końcem kapilary, aby przenieść próbkę przez działanie kapilarne. Zawsze noś rękawiczki i uważaj, aby nie dotykać kapilary pośrodku, ponieważ zanieczyszczenia (np. cząsteczki kurzu) z rękawic wpłynęłyby na pomiar.
   3. Umieść kapilarnę w wyznaczonej pozycji uchwytu, upewniając się, że jest prawidłowo wyrównana i wyśrodkowana.
   4. Powtórzyć kroki 3.3.2 i 3.3.3, wypełniając w ten sposób wszystkie pozycje w module załadowczym. Załaduj wszystkie naczynia włosowate potrzebne do pomiaru.
      UWAGA: Na pojedynczy przebieg można załadować maksymalnie 48 kapilarn.
   5. Na koniec umieść pasek magnetyczny na kapilarnach, aby utrzymać je na miejscu, i naciśnij Zamknij szufladę, aby rozpocząć eksperyment.
4. Wykonaj eksperyment nano-DSF
   1. Badanie fluorescencyjne
      1. Otwórz żądanie ściągnięcia aplikacji Prometheus. ThermControl i utwórz nowy projekt, klikając Rozpocznij nową sesję, używając nazwy ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Najpierw wykonaj skanowanie Discovery, aby wykryć fluorescencję próbek.
         UWAGA: Poziomy fluorescencji powinny w idealnym przypadku przekraczać 3,000 zliczeń dla każdej próbki. Próbki o fluorescencji powyżej limitu nasycenia przyrządu (20 000 zliczeń) nie będą mierzone.
      2. Zmień sygnał fluorescencji próbek, dostosowując moc wzbudzenia lasera ( Rysunek 4).
   2. Denaturacja termiczna
      1. Kliknij zakładkę Skanowanie topnienia. Aby przeprowadzić eksperyment, ustaw temperaturę początkową na 20 °C, temperaturę końcową na 95 °C, a nachylenie temperatury na 1 °C ^min-1. Kliknij Rozpocznij pomiar.
   3. Dodawanie adnotacji do eksperymentu
      1. Po rozpoczęciu eksperymentów kliknij zakładkę Adnotacja i wyniki. Opisz każdą kapilarę, nadając jej unikalny numer płytki i studzienki.
         UWAGA: Na przykład kapilara 1B2 odpowiadałaby płytce 1 i basenowi B2. W tej zakładce można dodać dodatkowe kolumny do eksperymentu, np. nazwę białka, bufor, stężenie białka. Po zakończeniu eksperymentu wyniki są również wyświetlane na tej karcie. To dobry czas na przerwę pod koniec dnia; Eksperymenty odbywają się w nocy, wyniki można odebrać następnego dnia.
   4. Wizualizacja i eksport danych
      1. Po zakończeniu eksperymentu kliknij zakładkę Skanowanie topnienia, aby wyświetlić krzywe topnienia i rozpraszania próbek. Aby wyeksportować wyniki do arkusza kalkulacyjnego, kliknij kartę Melting Scan, kliknij Eksportuj i wybierz Eksportuj przetworzone dane z menu rozwijanego.

Rysunek 4: Regulacja mocy wzbudzenia i sygnału fluorescencji. (A) Przy 80% mocy wzbudzenia, sygnał fluorescencji dla większości próbek przekracza limit nasycenia. (B) Sygnał fluorescencji jest redukowany do mierzalnych poziomów poprzez zmniejszenie mocy wzbudzenia do 60%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Iteracja

1. Powtórz kroki 1-3, aby wykonać 16 przebiegów na całej bibliotece Enaminy zawierającej 768 związków (16 × 48 = 768).
2. Ponieważ pomiar każdej płytki trwa ~1,5 godziny, zakończ adnotację (3.4.3) i przygotuj następną płytkę z fragmentami białka, powtarzając kroki w sekcjach 1 i 2,
   UWAGA: W typowy dzień pracy można zmierzyć od 4 do 6 płytek, w zależności od doświadczenia. Projekcja całej biblioteki DSi może zostać zakończona w sumie w ciągu 3-4 dni.

5. Analiza danych

1. Badanie wygenerowanych danych
   1. Po zakończeniu każdego uruchomienia kliknij kartę Adnotacje i wyniki, aby wyświetlić wyniki. Dla każdej próbki skoncentruj się na dwóch obliczonych wartościach, które są najważniejsze w tym przeglądzie: 1) Temperatura początku rozpraszania (Początek #1 dla rozpraszania), która wskazuje temperaturę na początku zwiększonych zdarzeń rozpraszania próbki i jest charakterystyczna dla agregacji; 2) wartość T_m (Punkt przegięcia #1 dla stosunku) uzyskana ze stosunku między zdarzeniami fluorescencji przy wartościach 330 i 350 nm, które zwykle odpowiadają maksymalnym zmianom fluorescencji tryptofanu po zmianach w jego środowisku.
   2. Pamiętaj, aby sprawdzić krzywe rozpraszania i topnienia dla każdej kapilary na karcie Skanowanie topnienia, aby upewnić się, że te wartości są wiarygodne.
2. Eksport i inspekcja do arkusza kalkulacyjnego
   1. Eksportuj dane ze wszystkich różnych przebiegów w celu kontroli do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, zgodnie z opisem w 3.4.4, oraz w celu utworzenia tabel przeglądowych i wykresów. Kliknij różne arkusze w pliku arkusza kalkulacyjnego, aby zanotować informacje w każdym arkuszu.
      1. Zwróć uwagę, że w arkuszu Przegląd każdy wiersz odpowiada jednemu eksperymentowi. Wraz z przeglądem parametrów (np. temperatura początkowa i końcowa), należy obserwować obliczone wartości dla T_m i początku rozpraszania (patrz 5.1 powyżej dla nazw i wyjaśnień oraz pliki uzupełniające 1 i 2 dla przykładu). Ponieważ oprogramowanie oblicza dwie lub więcej wartości T_m (punkt przegięcia #1 i #2 dla stosunku) dla niektórych próbek, spójrz na krzywą przejścia topnienia, aby określić, która z wartości T_m jest prawidłowa.
      2. W arkuszu Współczynnik zwróć uwagę, że każda kolumna odpowiada próbce, a każdy wiersz danym odczytanym na każdym kroku temperatury. Obserwuj wartości zliczania fluorescencji odpowiadające każdemu krokowi temperatury i użyj ich do wykreślenia krzywych topnienia dla określonych próbek, wykreślając kolumnę temperatury w stosunku do kolumny zliczania fluorescencji. Należy zauważyć, że dane w Stosunku (pierwsza pochodna), 330 nm, 330 nm (pierwsza pochodna), 350 nm, 350 nm (pierwsza pochodna) są wykorzystywane do obliczenia stosunku i jego pierwszej pochodnej (która ma maksimum przy maksymalnej szybkości zmian) w podobnym formacie.
      3. Podobne dane dotyczące rozpraszania można obserwować w arkuszu Rozpraszanie. Wygeneruj krzywą rozpraszania dla każdej próbki, wykreślając kolumnę temperatury względem kolumny rozpraszającej. Poszukaj arkusza dla pierwszej pochodnej rozpraszającej.
3. Tworzenie i sprawdzanie poprawności globalnego przeglądu dla wszystkich fragmentów
   1. Po sprawdzeniu poprawnych wartości T_m dla fragmentów, połącz kolumny Sample ID i Infcestion Point of 330/350 nm ratio (T_m) ze wszystkich przebiegów w jednym nowym pliku wynikowym, kopiując te kolumny z każdego przebiegu.
   2. Użyć średniej wartości T_m białka natywnego (zwykle obliczanej w dziesięciu seriach) i odjąć ją od wartości T_m każdej próbki, aby uzyskać ΔT_m. Posortuj wyniki według ΔT_m w porządku malejącym, aby zidentyfikować próbki, które powodują największe przesunięcie.
   3. Podziel fragmenty na pojemniki w zależności od przesunięcia ΔT_m i wygeneruj tabelę częstości dla całej biblioteki, wykreślając ΔT_m dla każdego pojemnika w stosunku do liczby fragmentów (Rysunek 5). Dla wygody pokaż oś reprezentującą liczbę fragmentów w skali logarytmicznej. Podziel próbkę na kategorię za pomocą ΔT_m ±1 i dostosuj pozostałe pojemniki do każdego przebiegu, aby empirycznie dostosować liczbę wartości odstających.

Wyniki

Pełny ekran biblioteki DSi-Poised (768 fragmentów) został przeprowadzony na trzech białkach o znaczeniu medycznym, a mianowicie: zewnętrznym białku o wysokiej ekspresji w raku 1 (Hec1 lub Ndc80), regulacyjnym powtórzeniu tetrarykopeptydowym (TPR) domeny monopolarnej kinazy wrzecionowej 1 (Mps1) oraz proteazy podobnej do SARS-CoV-2 3C, Nsp5, która odcina C-koniec poliproteiny replikowanej w 11 miejscach. Warunki buforowe wybrane dla każdego białka, jak również stężenie białka i T_m białek są przedstawione w tabeli uzupełniającej S4.

Rysunek 5: Rozkład częstotliwości zmiany temperatury topnienia (ΔT_m) dla trzech białek, Hec1, Mps1 i Nsp5, przedstawionych w tym badaniu jako reprezentatywne wyniki. Skróty: Hec1 = Wysoka ekspresja w białku Cancer 1; Mps1 = kinaza wrzeciona monopolarnego 1; Nsp5 = proteaza podobna do SARS-CoV-2 3C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki trzech badań przesiewowych z użyciem protokołu opisanego powyżej, wyświetlane jako rozkład częstotliwości zmiany T_m w stosunku do liczby fragmentów, są pokazane w Rysunek 5. Wykresy te zostały wygenerowane w sposób opisany w sekcji 5.3 protokołu, przedstawiając częstotliwość obserwowanej zmiany w_{T m}. Znaczenie zmiany musi być zdefiniowane w sposób subiektywny dla każdego innego projektu, jak opisano w sekcji dyskusji poniżej. Wartości ujemne wskazują na obniżenie temperatury topnienia w obecności fragmentu, wartość dodatnia na wzrost T_m. Na podstawie takich wykresów łatwo zaobserwować, że dla Nsp5 wszystkie fragmenty mają działanie destabilizujące, podczas gdy dla Hec1 i Mps1 obserwuje się zarówno trafienia stabilizujące, jak i destabilizujące. Można się tego spodziewać i zostanie to omówione.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę o średniej lub wysokiej przepustowości do przesiewania bibliotek fragmentów przy użyciu niektórych popularnych urządzeń robotycznych i pomiarowych. Badania przesiewowe, takie jak te opisane w tym protokole, mogą być rutynowo wykonywane przez NKI Protein Facility w Amsterdamie, na przykład jako usługa iNEXT-Discovery, często nawet za darmo dla użytkowników po złożeniu wniosku i wzajemnej ocenie. W takich przypadkach biblioteka DSi-Poised może być dostarczana przez placówkę, ale korzystanie z innych bibliotek może być również omawiane w kontekście każdej innej aplikacji użytkownika i umowy o świadczenie usług. Wybór instrumentów w tym protokole stanowi praktyczne rozwiązanie dla wielu laboratoriów, ale nie powinien być traktowany jako złoty standard. Do pomiaru stabilności termicznej białka docelowego do badania przesiewowego fragmentów zaleca się metody bezznacznikowe, a nie metody wykorzystujące etykiety wrażliwe na środowisko do wykrywania rozwijania się w termocyklerze reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Metody bezznacznikowe, takie jak ta przedstawiona tutaj przy użyciu instrumentu Prometheus, mają pewne zalety: wykorzystują niewielkie ilości białka, często o kilka rzędów wielkości mniej; mogą być używane do jednoczesnego pomiaru rozpraszania próbki, a tym samym agregacji; Etykiety używane do wykrywania rozwijania się w innych podejściach mogą wchodzić w różne interakcje z każdym fragmentem, co skutkuje artefaktami pomiarowymi. Protokół ten został opisany w kontekście robota Mosquito, który umożliwia pipetowanie bardzo małej objętości próbki (0,3 μL), czego nie można wykonać ręcznie. Mosquito jest popularnym robotem, obecnym w wielu laboratoriach pracujących nad biologią strukturalną i projektami odkrywania leków; W protokole można jednak wyraźnie stosować alternatywne podejścia do pipetowania małych objętości.

Biblioteki fragmentów zawierają związki rozpuszczone w DMSO. Jednym z początkowych wyzwań jest znalezienie optymalnego stężenia DMSO, przy którym białko pozostaje stabilne, a związki pozostają rozpuszczalne. Polega to na wykonaniu pomiarów przy różnych stężeniach DMSO w celu określenia optymalnych warunków do badań przesiewowych. Zastosowane tutaj rozcieńczenie białka do fragmentacji daje stężenie DMSO na poziomie 0,2%; Większość białek jest dość stabilna w tych warunkach. Ilość białka potrzebna do przeprowadzenia badań przesiewowych dla biblioteki 768 związków wynosi łącznie ~2-3 mg, ponieważ pomiary są zwykle przeprowadzane przy niskich stężeniach białka (0,2 mg ^mL-1). Praca z tak stosunkowo niskimi stężeniami białka nie tylko obniża koszty produkcji białka, ale także zmniejsza szanse na wytrącanie się białka. Niskie stężenie białka nie wpływa na wykrywanie wiązania fragmentów, ponieważ stężenie fragmentów w eksperymencie wynosi ~2 mM, co pozwala na identyfikację również słabych spoiw.

Ponieważ wykrywanie przejścia topnienia w tych eksperymentach opiera się na intensywności fluorescencji, krytycznym aspektem jest określenie mocy wzbudzenia lasera, przy którym należy przeprowadzić pomiary. Interakcja związków z białkiem może (i) nie mieć wpływu na jego wewnętrzną fluorescencję, (ii) powodować wygaszanie lub (iii) zwiększać jego wewnętrzną fluorescencję. Ponadto praca z niskimi stężeniami białka oznacza, że liczba fluorescencji białka natywnego byłaby niska. W związku z tym moc wzbudzenia musi być dostosowana w taki sposób, aby można było zmierzyć większość próbek. Profil rozpraszania każdego przebiegu dostarcza ważnych informacji o efektach agregacji, które mogą zostać wywołane przez dodanie dowolnego fragmentu. Ponadto wpływ temperatury na rozpuszczalność związków można również zaobserwować w profilu rozpraszania.

Nieoczekiwanie dla wielu związków zaobserwowano, że rozpraszanie faktycznie zmniejszało się wraz ze wzrostem temperatury (ryc. 6). Dlatego ważne jest, aby przyjrzeć się zarówno krzywej przejściowej topnienia, jak i towarzyszącemu jej profilu rozpraszania, aby zdecydować o wiarygodności każdego eksperymentu, szczególnie w przypadku tych fragmentów, które są uważane za kandydatów do bardziej wymagających pomiarów za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR, a nawet uważane za trafienia dla chemii uzupełniającej. Jednym ze szczególnych ograniczeń metody do celów przesiewowych fragmentów jest to, że wiele fragmentów w bibliotece DSi-Poised ma znaczną fluorescencję wewnętrzną, czasami nawet przekraczającą granicę nasycenia detektora, a zatem nie mogą one być odpowiednio przesiewane pod kątem wiązania celu nawet przy niskiej mocy wzbudzenia. Inną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę w przypadku tej metody, jest to, że można ją stosować tylko z białkami zawierającymi reszty tryptofanu.

Rysunek 6: Wpływ temperatury na rozpuszczalność związku. Krzywa przejściowa topnienia i profil rozpraszania Hec1 z dwoma różnymi związkami. (A) Profil rozpraszania pokazuje, że w przypadku tej próbki temperatura nie ma wpływu na rozpuszczalność. (B) Profil rozpraszania pokazuje, że rozpuszczalność tej próbki wzrasta wraz ze wzrostem temperatury. Krzywa przejściowa topnienia w tym przypadku nie jest zatem wiarygodna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Otwartym pytaniem jest, co należy uznać za znaczącą zmianę w_{T m}, nie z matematycznego punktu widzenia, ale z praktycznego punktu widzenia: jaka zmiana T_m jest ważna do rozważenia jako wskazująca na wiązanie liganda z białkiem? W tych przykładach przesunięcia mniejsze niż 1 °C są widoczne dla 74% fragmentów wiążących Hec1, 66% dla Mps1 i 53% dla Nsp5. Uznanie 1 °C za "znaczącą zmianę" nie dostarczyłoby trafień, które są warte dążenia za chemią następczą. Na wykresach poglądowych (rysunek 5) uwzględniono przedziały o przesunięciu T_m o 1, 2, 5 lub więcej niż 5 stopni, dodatnie lub ujemne. Wymaga to modyfikacji w zależności od konkretnego przypadku, aby dać dobry przegląd i umożliwić świadome podejmowanie decyzji, określając następny krok. Warto zauważyć, że w przypadku niektórych białek zaobserwowano zarówno stabilizację, jak i destabilizację celu w zależności od rozważanych fragmentów. Oba zdarzenia są interesujące, ponieważ oba mogą być wynikiem wiązania fragmentów i oba mogą prowadzić do dobrej cząsteczki uzupełniającej do manipulowania zachowaniem białka.

Pozostaje ostatnie pytanie, a mianowicie "co definiuje użyteczne trafienie?". W rzeczywistości odpowiedź zależy od konkretnej sytuacji. Na przykład w przypadku Hec1 wszystkie fragmenty, które stabilizują białko o więcej niż 2 stopnie lub destabilizują je o więcej niż 5 stopni, zostały przekazane naszym współpracownikom z chemii, którzy zaprojektowali nowe cząsteczki na podstawie tych trafień. Jednak w przypadku Nsp5 najbardziej destabilizujące trafienia zostały przekazane naszym współpracownikom z NMR, aby potwierdzić trafienia pochodzące z nanoDSF za pomocą eksperymentów NMR. Innymi słowy, wyniki badań przesiewowych uzyskane za pomocą tego protokołu powinny być analizowane z ostrożnością i w sposób zależny od kontekstu, podejmując świadome decyzje w oparciu o konkretne pytanie i otaczającą go metodologię. W każdym razie opisana tutaj metoda jest podejściem uzupełniającym do istniejących metodologii, takich jak badania przesiewowe oparte na promieniowaniu rentgenowskim i NMR, które mogą mieć na celu potwierdzenie, ustalenie priorytetów lub dostarczenie nowych pomysłów na kampanie chemiczne.

Tabela uzupełniająca S1: Wykaz stosowanych do badań przesiewowych białek. Skróty: HEPES = kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; DTT = ditiotreitol; MOBS = kwas 4-(N-morfolino)butanosulfonowy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S2: Właściwości płytki 2-dołkowej MRC do użytku z robotem nanodozownikiem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S3: Właściwości 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V do użytku z robotem nanodozownikiem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca S4: Bufor , stężenie białka i T_m białek omówionych w reprezentatywnych wynikach. Skróty: DTT = ditiotreitol; Hec1 = Wysoka ekspresja w białku Cancer 1; Mps1 = kinaza wrzeciona monopolarnego 1; Nsp5 = proteaza podobna do SARS-CoV-2 3C. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Parametry ogólne - przykładowe dane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Wartości T_m i ΔT_m dla 406 fragmentów - dane przykładowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Arkusze ClearVue		molekularne	samoprzylepna folia uszczelniająca do płytki białkowej
Aluminiowa taśma uszczelniająca CORNING 6570	Samoprzylepna folia uszczelniająca CORNING
Biblioteka DSi Poised	Biblioteka fragmentów enaminy		zawierająca 768 związków użytych w tym badaniu
Elisa Reservior	ThermoFisher Scientific	15075	Rezerwator odczynnika używany do pipetowania
okrągłych (U) płytek dolnych białka Greiner Cat		. Nie.  650201	Fragmenty dostarczane w tych płytkach
Mosquito typ X1	sptlabtech	Nr części- 3019-0003	Dozownik nanolitrów
MRC 2-dołkowa płytka		MRC96T-PS
Zbiorniki odczynników Pierce ELISA	Kapilary Pierce
Prometheus o wysokiej czułości	Katalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF	Nanotemper	Katalog nr PR001 (+ Optyka detekcji agregacji, nr katalogowy PR-AGO)	nanoDSF i rozpraszanie wsteczne
światła Prometheus Standardowy typ kapilarny	Katalog PR-C002
TX-1000	Wirówka termologiczna	do płytek