Ten artykuł przedstawia częściowy protokół heterotopowego przeszczepu płata kostno-skórnego u szczurów i jego potencjalne wyniki w obserwacji średnioterminowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Częściowy heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych u szczurów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Unaczynione allotransplantacje kompozytowe (VCA) stanowią najbardziej zaawansowaną opcję rekonstrukcji dla pacjentów bez autologicznych możliwości chirurgicznych po złożonym ubytku tkankowym. Przeszczepy twarzy i ręki zmieniły życie zniekształconych pacjentów, dając im nowy estetyczny i funkcjonalny narząd społeczny. Pomimo obiecujących wyników, VCA jest nadal niedostatecznie efektywny z powodu współistniejących chorób immunosupresyjnych i powikłań infekcyjnych przez całe życie. Szczur jest idealnym modelem zwierzęcym do badań in vivo badających szlaki immunologiczne i mechanizmy odrzucania przeszczepu. Szczury są również szeroko stosowane w nowatorskich technikach konserwacji przeszczepów tkanek kompozytowych, w tym w badaniach perfuzji i kriokonserwacji. Modele stosowane do VCA u szczurów muszą być powtarzalne, niezawodne i wydajne, a ich zachorowalność i śmiertelność pooperacyjna muszą być niskie. Heterotopowe zabiegi transplantacji kończyn spełniają te kryteria i są łatwiejsze do wykonania niż ortotopowe przeszczepy kończyn. Opanowanie modeli mikrochirurgicznych gryzoni wymaga solidnego doświadczenia w mikrochirurgii i opiece nad zwierzętami. W niniejszym artykule przedstawiono wiarygodny i powtarzalny model częściowego heterotopowego przeszczepu płata kostno-mięśniowo-skórnego u szczurów, wyniki pooperacyjne oraz sposoby zapobiegania potencjalnym powikłaniom.
Wprowadzenie
W ciągu ostatnich dwóch dekad VCA ewoluowało jako rewolucyjne leczenie dla pacjentów, którzy cierpią na poważne zniekształcenia, w tym face1, amputacje kończyn górnych2, penile3, oraz inne złożone wady tkanek4,5. Jednak konsekwencje immunosupresji trwającej całe życie nadal utrudniają szersze zastosowanie tych złożonych operacji rekonstrukcyjnych. Badania podstawowe mają kluczowe znaczenie dla poprawy strategii przeciwdziałania odrzuceniu. Wydłużenie czasu przechowywania VCA jest również niezbędne do poprawy logistyki przeszczepów i zwiększenia puli dawców (ponieważ dawcy VCA muszą spełniać więcej kryteriów niż dawcy narządów litych, w tym odcień skóry, rozmiar anatomiczny, płeć). W tym kontekście, przeszczepy kończyn szczurów są szeroko stosowane w badaniach nad odrzuceniem immunologicznym przeszczepów allogenowych6,7, nowatorskie protokoły indukcji tolerancji8, oraz badania konserwatorskie9,10,11. W związku z tym te modele VCA są kluczowym elementem, który należy opanować w badaniach translacyjnych VCA.
Płaty kostno-skórne zostały opisane w literaturze jako wiarygodne modele do badania VCA u szczurów8,12,13,14. Chociaż ortotopowe przeszczepy całych kończyn pozwalają na długoterminową ocenę funkcji przeszczepu, jest to czasochłonna procedura związana z wyższymi wskaźnikami zachorowalności i śmiertelności pooperacyjnej14. Natomiast heterotopowe modele przeszczepiania kończyn są niefunkcjonalne, ale umożliwiają powtarzalne badania VCA. Wyniki pooperacyjne można wiarygodnie przewidzieć przed rozpoczęciem badania przeszczepu VCA u szczurów. Badanie to przedstawia częściowy heterotopowy model przeszczepu płata kostno-skórnego u szczura, który obejmuje częste możliwe wyniki i powikłania, które mogą wystąpić śródoperacyjnie i pooperacyjnie w okresie obserwacji wynoszącym trzy tygodnie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były traktowane w sposób humanitarny, zgodnie z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protokół 2017N000184) oraz Animal Care and Use Review Office (ACURO). Do wszystkich eksperymentów wykorzystano inbredowe samce szczurów szczepu Lewis (250-400 g).
1. Operacja
- Zanieść szczury linii Lewis w narkozę za pomocą inhalacji izofluranem. Indukcję znieczulenia przeprowadzić przy użyciu 5% izofluranu w komorze indukcyjnej, a następnie podtrzymać znieczulenie inhalacyjne stężeniem 1,5-3% izofluranu poprzez stożek oddechowy.
- W procedurach przeżywalności przed operacją zastosować lubrykant do oczu. Ogolić miejsce operacyjne, potraktować kremem depilacyjnym, oczyścić skórę i przykryć sterylnymi obłożeniami.
- Przed nacięciem oraz regularnie w trakcie zabiegu potwierdzić pełną głębokość znieczulenia za pomocą testu uszczypnięcia palca. Przez cały czas trwania procedury monitorować częstotliwość akcji serca i oddechów. Podczas wszystkich operacji zachować warunki steryleności, używając sterylnych narzędzi, materiałów, obłożenii i rękawiczek. Listę narzędzi wykorzystywanych w procedurach można znaleźć w Tabeli Materiałów.
2. Pozyskiwanie prawej części kończyny tylnej dawcy
- Wykonaj okrężne nacięcie skóry powyżej kostki w dystalnej jednej trzeciej podudzia.
- Wypreparuj i wypal tętnicę żyłową oraz gałąź końcową tętnicy podkolanowej, używając kleszczy bipolarnych. Wypal i odetnij mięśnie brzuchaty łydki, płaszczowaty, piszczelowy przedni oraz dwugłowy uda, aż do odsłonięcia kości piszczelowej.
- Wykonaj nacięcie o długości 2,5 cm w prawym zagięciu pachwinowym. Wypreparuj podskórną tkankę tłuszczową pachwiny i odsunie ją dystalnie, aby odsłonić naczynia udowe. Użyj retraktora typu „fishhook” do uchwycenia więzadła pachwinowego oraz kleszczy zaciskowych do odsunięcia tkanki tłuszczowej pachwiny w kierunku dystalnym.
UWAGA: Tkanka tłuszczowa pachwiny jest uwzględniana podczas pobierania części kończyny. - Wypreparuj naczynia udowe, wyodrębnij gałęzie Murphy’ego (głębokie kolaterale mięśniowe, zazwyczaj zlokalizowane w połowie odległości między więzadłem pachwinowym a gałęzią nadbrzuszną) i podwiąż je szwami nylonowymi 8-0.
- Podaj szczurowi dawcy heparynę w dawce 100 IU/kg, wstrzykując ją do grzbietowej żyły prącia za pomocą igły 27,5 G.
- Dopełnij nacięcie skóry wokół biodra.
- Wypal mięsień dwugłowy uda oraz mięsień pośladkowy powierzchowny, używając kleszczy bipolarnych. Wypal i przetnij nerw kulszowy na poziomie połowy uda. Odsłoń kość udową proksymalnie na poziomie tylnej grzebieni uda.
UWAGA: Mięśnie przywodziciele i mięsień czworogłowy uda nie są obejmowane pobraniem. Pień miedniczny pozostaje zachowany. - Podwiąż naczynia udowe szwami nylonowymi 8/0 na poziomie więzadła pachwinowego. Wykonaj arteriotomię tętnicy udowej tuż poniżej podwiązania i rozszerz naczynie, aby umożliwić wprowadzenie cewnika angiograficznego 24 G.
- Wypal i odetnij pozostałe mięśnie pod pniem, odsłaniając przednią stronę kości udowej.
- Przetnij kość piszczelową i udową za pomocą przecinaka do kości tak proksymalnie i dystalnie, jak to możliwe (na poziomie połowy długości).
- Przepłucz fragment kończyny tylnej 2 mL soli fizjologicznej z heparyną (100 IU/mL), aby uzyskać przejrzysty odpływ żylny. Przechowuj w lodzie w sterylnej gazie do momentu transferu mikro naczyniowego (Rycina 1).
- Podczas gdy zwierzę znajduje się pod narkozą ogólną, wykonaj eutanazję poprzez upuszczenie krwi. Potwierdź zgon poprzez brak ruchów oddechowych i bicia serca.
Rysunek 1: Pobrana część kończyny tylnej szczura. W tętnicę udową wprowadzono kaniulę angiokateter 24 G, przygotowaną do heterotopowego transferu mikro naczyniowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Operacja biorcy
- Przed wykonaniem nacięcia ogolić kark i podać buprenorfinę w dawce 0,01-0,05 mg/kg podskórnie. Umieścić szczura w pozycji tyłem na podkładce grzewczej.
- Wykonać nacięcie o długości 2,5 cm w prawym zgięciu pachwinowym. Wydzielić podskórną tkankę tłuszczową pachwiny i odsunąć ją dystalnie, aby odsłonić naczynia udowe. Użyć haczyka do odsunięcia więzadła pachwinowego oraz kleszczyków zaciskowych do przytrzymania tkanki tłuszczowej pachwiny dystalnie.
- Wydzielić naczynia udowe, wyizolować gałęzie Murphy’ego i podwiązać je nicią nylonową 8/0.
- Podwiązać oba naczynia powyżej naczyń nadbrzusznych za pomocą nici nylonowych 8/0. Umieścić kleszczyki przybliżające proksymalnie i rozszerzyć końce naczyń; przepłukać roztworem soli fizjologicznej z heparyną.
- Wykonać nacięcie na lewym boku powyżej biodra i stworzyć kieszeń podskórną z tunelem podskórnym prowadzącym do zgięcia pachwinowego.
UWAGA: Nacięcie miejsca wszczepienia wykonuje się powyżej zakresu ruchu biodra, aby zapewnić zwierzęciu prawidłową ruchomość kończyny tylnej. Ponadto pozostawienie mostka skórnego między miejscem wszczepienia przeszczepu a miejscem transferu mikro naczyniowego pozwala na lepszą stabilizację przeszczepu (Rycina 2). - Przez tunel podskórny wprowadzić proksymalną część fragmentu kończyny oraz tkankę tłuszczową pachwiny w celu transferu mikronaczyniowego. Wykonać anastomozy żylne i tętnicze za pomocą szwów nylonowych 10/0. Usunąć oba kleszczyki przybliżające i zaobserwować rewaskularyzację kończyny. Przeprowadzić „test wyżymania” (milking test) obu naczyń, aby ocenić drożność każdej anastomozy.
UWAGA: Do anastomozy żylnej zazwyczaj potrzeba od ośmiu do dziewięciu szwów, a do anastomozy tętniczej średnio 6 szwów. - Wykonać podłużne nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej przeszczepionej kończyny i wprowadzić przeszczep. Usunąć nadmiar skóry przeszczepu i zamknąć ranę za pomocą osobnych szwów oraz szwu ciągłego, używając wchłanialnych nici 4/0.
- Zszyć ze sobą tkankę tłuszczową pachwiny przeszczepionej kończyny i biorcy za pomocą dwóch osobnych szwów wchłanialnych, a na koniec zamknąć zgięcie pachwinowe po końcowej kontroli anastomoz mikronaczyniowych.
UWAGA: Tkanki tłuszczowe pachwiny zszywa się ściśle, aby stworzyć ochronną warstwę tłuszczu nad anastomozami i zapewnić stabilne położenie przeszczepu oraz jego szypuły. Staranne zamknięcie rany sprzyja gojeniu; zapobiega również resztkowemu krwawieniu z rany i zmniejsza ryzyko automutilacji. - Uzupełnić ubytki płynów podskórnie, podając 1-3 mL soli fizjologicznej w zależności od ilości krwawienia okołoperacyjnego.
- Założyć kołnierz elżbietański na szyję zwierzęcia i nanieść 2 luźne szwy na skórę, aby utrzymać go w prawidłowej pozycji.
- Zaprzestać podawania izofluranu drogą wziewną i monitorować zwierzę nieprzerwanie na podkładce grzewczej aż do pełnego odzyskania przytomności i zdolności do poruszania się.
Rysunek 2: Obraz okołoperacyjny przed wszczepieniem płata kostno-mięśniowo-skórnego kończyny. Zachowano skórny mostek o szerokości około 1 cm pomiędzy nacięciem w fałdzie pachwinowym a miejscem wszczepienia płata powyżej biodra. Płat jest umieszczony pod mostkiem, co zapewnia jego stabilność podczas transferu mikro naczyniowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Opieka pooperacyjna
- Monitoruj zwierzę dwa razy dziennie przez 72 godziny, następnie raz dziennie do 7. dnia po operacji (POD), a potem dwa razy w tygodniu.
UWAGA: Monitorowanie musi być dostosowane do stanu zwierzęcia i przeszczepu (blade oczy mogą wymagać dodatkowych płynów, barwienie porfiryną jako wskaźnik bólu zwierzęcia, nieprawidłowy kolor/temperatura przeszczepu), a dalszą opiekę należy omówić z lekarzem weterynarii. Wymagane jest pojedyncze kwaterowanie szczurów biorców podczas całego okresu badania, aby zapobiec uszkodzeniu przeszczepu. - Zastosuj leki przeciwbólowe poprzez podskórny zastrzyk buprenorfiny i/lub niesteroidowy lek przeciwzapalny zgodnie z wytycznymi IACUC.
- Oceniaj przeszczep i codziennie przeprowadzaj badanie fizykalne, wykonując zdjęcia tym samym urządzeniem.
UWAGA: Użycie kremu do depilacji na skórze przeszczepu pomaga lepiej ocenić kolor skóry transplantatu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej badaniu przeprowadzonym przez jednego operatora wykonano 30 syngeneicznych heterotopowych częściowych przeszczepów kończyn. Sukces zdefiniowano w 21. dniu po operacji jako brak odrzutu VCA lub powikłań wymagających eutanazji. Prawidłowy rozwój przeszczepu przedstawiono na Rysunku 3. Średni czas pobrania części kończyny i wszczepienia przeszczepu biorcy wynosił odpowiednio 35 i 105 min; średni czas niedokrwienia wynosił 105 min. Podczas obserwacji wystąpiły dwa rodzaje powikłań (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ortotopowe modele transplantacji kończyn u gryzoni opisano w piśmiennictwie 16,17,18; Wymagają jednak naprawy nerwów, ponownego przyczepienia mięśni i doskonałej osteosyntezy kości udowej, co może być bardzo trudnym krokiem. Modele te są również związane z wyższą zachorowalnością i śmiertelnością u gryzoni14, zwłaszcza w krótkoterminowej obserwacji, ponieważ przywrócenie normalnej funkcji przeszczepionej ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Kongresowo Kierowany Program Badań Medycznych pod numerem nagrody W81XWH-17-1-0680. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autorów i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24 GA angiocewnik | BD Insyte Autoguard | 381412 | |
| szew 4-0 monofilamentowy niewchłanialny szew | Ethicon | 1667 | Służy do szycia E-collar z tyłu szyi |
| Szew 4-0 Powlekany Vicryl Plus Antibacterial | Ethicon | VCP496 | |
| Kleszczyki do tkanek Adson, 11 cm, 1 x 2 zęby z platformą wiążącą | ASSI | ASSI. | |
| Sznury bipolarne | ASSI | 228000C | |
| Poliamid Monofilament USP 10-0, 4 mm 3/8c | AROSurgical | T04A10N07-13 | Służy do wykonywania zespoleń mikronaczyniowych |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Kleszcze rozszerzające | Narzędzia do precyzyjnej nauki (FST) | 18131-12 | |
| Nożyczki preparacyjne 15 cm, okrągła rękojeść o średnicy 8 mm, proste, smukłe, stożkowe ostrze 7 mm, wzór Lipshultz | ASSI | ASSI. | |
| Podwójne mikrozaciski 5,5 x 1,5 mm | Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST) | 18040-22 | |
| Obroża elżbietańska | Kleszcze Braintree Scientific | EC-R1 | |
| o długości 13,5 cm, płaska rękojeść, szerokość 9 mm Proste końcówki o średnicy 0,1 mm (x2) | ASSI | ASSI. JFL31 | |
| Halsey Micro Needle | Holder Narzędzia do precyzyjnej nauki (FST) | 12500-12 | |
| Heparyna Lock Roztwór do spłukiwania, USP, 100 jednostek/ml | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jubilerzy Kleszcze bipolarne nieprzywierające 11 cm, końcówka z prostym szpiczastym końcem, średnica końcówki 0,25 mm | ASSI | ASSI. | |
| Lone Star Elastyczne podpory | CooperSurgical | 3314-8G | Służy do cofania więzadła pachwinowego do rozwarstwiania naczyń udowych |
| Retraktory samozabezpieczające Lone Star | CooperSurgical | 3301G | |
| Hemostatyki mikrokomarów | Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST) | 13010-12 | Służy do dystalnego |
| chowania pachwinowej poduszeczki tłuszczowejUchwyt igły, 15 cm okrągła rękojeść, średnica 8 mm, bardzo finezyjna zakrzywiona szczęka o średnicy końcówki 0,2 mm, bez | blokady ASSI | ASSI. B1582 | |
| Szew nylonowy Monolfilament 8-0, 6,5 mm 3/8c | Ethilon | 2808G | Służy do podwiązywania gałęzi pobocznych na naczyniach udowych |
| Obcęgi kostne offsetowe | Narzędzia do precyzyjnego uczenia się (FST) | 16101-10 | |
| S& T Zaciski naczyniowe 5,5 x 1,5 mm | Narzędzia do precyzyjnej nauki (FST) | 00398-02 | |
| Nożyczki Walton | Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST) | 14077-09 |
Bibliografia
- Lanteiri, L., et al. Feasibility, reproducibility, risks and benefits of face transplantation: a prospective study of outcomes. American Journal of Transplantation. 11 (2), 367-378 (2011).
- Park, S. H., Eun, S. C., Kwon, S. T. Hand transplantation: current status and immunologic obstacles. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (1), 97-104 (2019).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: first US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Grajek, M., et al. First complex allotransplantation of neck organs: larynx, trachea, pharynx, esophagus, thyroid, parathyroid glands, and anterior cervical wall: a case report. Annals of Surgery. 266 (2), 19-24 (2017).
- Pribaz, J. J., Caterson, E. J. Evolution and limitations of conventional autologous reconstruction of the head and neck. Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 99-107 (2013).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. I. Results with syngeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 293-299 (1983).
- Lipson, R. A., et al. Vascularized limb transplantation in the rat. II. Results with allogeneic grafts. Transplantation. 35 (4), 300-304 (1983).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Arav, A., Friedman, O., Natan, Y., Gur, E., Shani, N. Rat hindlimb cryopreservation and transplantation: a step toward "organ banking". American Journal of Transplantation. 17 (11), 2820-2828 (2017).
- Gok, E., et al. Development of an ex-situ limb perfusion system for a rodent model. ASAIO Journal. 65 (2), 167-172 (2019).
- Gok, E., Rojas-Pena, A., Bartlett, R. H., Ozer, K. Rodent skeletal muscle metabolomic changes associated with static cold storage. Transplantation Proceedings. 51 (3), 979-986 (2019).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Fleissig, Y., et al. Modified heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap model in the rat for translational vascularized composite allotransplantation research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59458(2019).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Jang, Y., Park, Y. E., Yun, C. W., Kim, D. H., Chung, H. The vest-collar as a rodent collar to prevent licking and scratching during experiments. Lab Anim. 50 (4), 296-304 (2016).
- Kern, B., et al. A novel rodent orthotopic forelimb transplantation model that allows for reliable assessment of functional recovery resulting from nerve regeneration. American Journal of Transplantation. 17 (3), 622-634 (2017).
- Perez-Abadia, G., et al. Low-dose immunosuppression in a rat hind-limb transplantation model. Transplant International. 16 (12), 835-842 (2003).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022(2010).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 2050312120968721(2020).
- Lindboe, C. F., Presthus, J. Effects of denervation, immobilization and cachexia on fibre size in the anterior tibial muscle of the rat. Acta Neuropathologica. 66 (1), 42-51 (1985).
- Nazzal, J. A., Johnson, T. S., Gordon, C. R., Randolph, M. A., Lee, W. P. Heterotopic limb allotransplantation model to study skin rejection in the rat. Microsurgery. 24 (6), 448-453 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
