Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62626

⸱

22 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Streszczenie

Od 1996 roku, wirusy H5 wysoce zjadliwej grypy ptaków (HPAI) linii A/goose/Guangdong/1/96 powodują epidemie grypy u drobiu i dzikiego ptactwa. Zdarza się, że ofiarą padają również ludzie, co skutkuje wysoką śmiertelnością. Niemniej jednak badania nad wirusem HPAI są często utrudnione, biorąc pod uwagę, że muszą one być prowadzone w laboratoriach o 3 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Aby rozwiązać ten problem, pseudowirusy są przyjmowane jako alternatywa dla wirusów typu dzikiego w niektórych eksperymentach w badaniach HPAI H5. Pseudowirusy okazują się idealnymi narzędziami do badania przeciwciał neutralizujących przeciwko wirusom H5 HPAI. Protokół ten opisuje procedury i krytyczne etapy preparatów pseudowirusa H5 HPAI i testów neutralizacji pseudowirusów. Omówiono również rozwiązywanie problemów, ograniczenia i modyfikacje tych testów.

Wprowadzenie

Od 1996 roku, wirusy H5 wysoce zjadliwej grypy ptaków (HPAI) linii A/goose/Guangdong/1/96-line powodują ciągłe epidemie grypy u drobiu i dzikiego ptactwa, powodując ogromne straty społeczno-ekonomiczne w światowym przemyśle drobiarskim. Czasami ludzie również się nim zarażają, co wiąże się z wysoką śmiertelnością1,2. Badania nad wirusem wysoce zjadliwej grypy ptaków są jednak często utrudnione, ponieważ nie można się nim zajmować poza laboratoriami o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Aby rozwiązać ten problem, pseudowirusy są przyjmowane jako alternatywa dla wirusów typu dzikiego w niektórych eksperymentach w badaniach HPAI H5. Pseudowirusy są wystarczająco bezpieczne, aby ćwiczyć je w laboratoriach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.

H5 Pseudowirusy HPAI należą do wirusów chimerycznych składających się z zastępczych rdzeni wirusów, otoczek lipidowych z powierzchniowymi glikoproteinami wirusów grypy i genów reporterowych. Rdzenie pseudowirusów zwykle pochodzą z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), retrowirusów, takich jak wirus białaczki myszy (MLV) i wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV)3. W szczególności system pakowania HIV-1 jest szeroko stosowany do produkcji pseudowirusa grypy, w którym podstawowymi genami są gag i pol. Gen HIV gag ulega ekspresji białek rdzeniowych. Gen pol wyraża integrazę i odwrotną transkryptazę, które są niezbędne do ekspresji genu reporterowego w transdukowanych komórkach. Naśladując genom wirusa zastępczego, gen reporterowy jest objęty rdzeniem pseudowirusa w postaci RNA. Gen reporterowy będzie wyrażał białko w komórkach gospodarza. Poziomy ekspresji genów reporterowych mogą być wykorzystane do pomiaru skuteczności infekcji pseudowirusem3,4. Głównym reporterem jest lucyferazy świetlika do pomiaru względnych jednostek luminescencji (RLU) lub względnej aktywności lucyferazy (RLA) w transdukowanych komórkach. Inne reportery, takie jak lacZ, Gaussia i lucyferazy Renilla, są również używane, tylko w mniejszym stopniu5.

Pseudowirusy są idealnymi narzędziami do badania przeciwciał neutralizujących przeciwko wirusom H5 HATI. Do pomiaru siły działania przeciwciał neutralizujących stosuje się testy neutralizacji pseudowirusa (PN) 6. Hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA) są glikoproteinami na powierzchni wirusa grypy typu A7,8. HA składa się z globularnej domeny głowy do wiązania receptora i domeny macierzystej do fuzji błonowej. Białko NA wykazuje aktywność sialidazy, która ułatwia uwalnianie wirusa7,8. Test PN może mierzyć przeciwciała neutralizujące skierowane do białek HA. Przeciwciała neutralizujące skierowane do obszaru głowy i łodygi HA można również wykryć za pomocą testów przyczepiania i wnikania wirusa. W porównaniu z wirusami typu dzikiego, eksperymenty neutralizacji pseudowirusów mają bardziej czułe wartości wykrywania, mogą być bezpiecznie przeprowadzane w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 i są ogólnie łatwiejsze do przeprowadzenia w praktyce.

Ten protokół szczegółowo przedstawia procedury i kluczowe etapy preparatów pseudowirusa H5 HPAI i testów PN. Omówiono również rozwiązywanie problemów, ograniczenia i modyfikacje tych testów. W tym badaniu jako przykład wykorzystano szczep A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) wirusa HPAI H5N1. Aby uzyskać surowice odpornościowe stosowane w testach, w protokole tym wybrano białko HA pochodzące ze szczepu TH jako immunogen do uodparniania myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymentalne operacje związane z pseudowirusami zostały przeprowadzone w warunkach ABSL2 w Instytucie Pasteura Chińskiej Akademii Nauk w Szanghaju (IPS, CAS). Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w oparciu o zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt protokoły na zwierzętach IPS, CAS.

1. Opakowanie pseudowirusa z transfekcją wapniowo-fosforanową

  1. Wykonać zawiesiny jednokomórkowe HEK293FT komórek (9 x 105 na ml) w kompletnym podłożu DMEM (Tabela 1). Dodać 10 ml zawiesiny jednokomórkowej do kolby T75, inkubować komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla (CO2) w temperaturze 37 °C przez 20 godzin przed transfekcją.
    UWAGA: HEK293FT zalecany jest niski korytarz (<20 przejść). Upewnij się, że monowarstwa komórek jest zlewająca się w 80-90%.
  2. Zastąp pożywkę 10 ml świeżej, kompletnej pożywki zawierającej chlorochinę (100 μM) na 2 godziny przed transfekcją.
  3. Wymieszaj odczynniki i plazmidowe DNA, jak pokazano w Tabeli 2 i Rysunek 1: ddH2O, pCMV / R-HA, pCMV / R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2 i 2x bufor HEPES. Delikatnie pipetować w górę i w dół 5 razy, inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
  4. Przenieść mieszaninę do pożywki nad komórkami i delikatnie kołysać kolbą. Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym przez 15 godzin.
  5. Zastąp pożywkę 15 ml świeżej, kompletnej pożywki DMEM. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 65 h.
    UWAGA: Kolor pożywki będzie jasnopomarańczowy lub lekko żółty, a co najmniej 80% komórki powinno wykazywać efekt cytopatyczny (CPE) pod mikroskopem światła odwróconego.
  6. Zebrać supernatant i odwirować go w temperaturze 2095 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Wykrywanie ekspresji białka HA, NA i HIV-1 p24 pseudowirusa grypy

  1. Wykryj ekspresję białka HA za pomocą testu hemaglutyniny (HA).
    1. Dodać 50 μl PBS do kolumn 2-12, rzędów A, B i C 96-dołkowej płytki okrągłodennej.
      UWAGA: Wiersze A, B i C należą do 3 niezależnych testów replikacji, a kolumna 12 służy jako kontrola ujemna.
    2. Dodać 100 μl pseudowirusa do studzienek w kolumnie 1. Przenieść 50 μl z kolumny 1 do kolumny 2, dobrze wymieszać pipetując 5 razy w górę i w dół, przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenia do ostatniej kolumny 11 i wyrzucić dodatkowe 50 μl z kolumny 11.
    3. Dodaj 50 μl 0,5% erytrocytów do każdej studzienki, delikatnie pipetuj w górę i w dół dwa razy. Inkubować płytkę przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy erytrocyty kontroli ujemnej utworzą regularne plamki na dnie studzienki.
    4. Obserwuj i zapisuj miana HA pseudowirusa.
      UWAGA: Jednostka HA pseudowirusów jest najwyższym współczynnikiem rozcieńczenia wirusa, który może powodować 100% hemaglutynację czerwonych krwinek.
  2. Wykrywanie ekspresji białek HA i NA za pomocą testu western blot.
    UWAGA: Wszystkie kroki western-blot są wykonywane zgodnie z podręcznikiem klonowania molekularnego (wydanie 4).
  3. Wykryj ekspresję białka p24 HIV-1 za pomocą zestawu ELISA HIV-1 p24 (tabela materiałów).
    1. Dodać 50 μl buforu do lizy do 450 μl próbki pseudowirusa. Dokładnie wymieszaj.
    2. Dodać 300 μl buforu do przemywania do każdego dołka mikropłytki. Uderz płytkę do góry nogami, aby całkowicie usunąć bufor myjący. Powtórz pranie 5 razy.
    3. Dodać 200 μl wzorca i próbki do każdej studzienki osobno. Inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc lub przez 2 godziny.
    4. Odessać zawartość płytki i umyć płytkę zgodnie z opisem w kroku 2.3.2.
      UWAGA: Pozostaw jedną studzienkę płytki testowej pustą, aby użyć jej jako ślepej próby podłoża.
    5. Dodaj 200 μl przeciwciał detektora p24 do każdej studzienki. Inkubować je w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odessać i umyć płytkę zgodnie z opisem w kroku 2.3.2.
    6. Dodać 100 μl roztworu roboczego peroksydazy streptawidyny do każdej studzienki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Odessać i umyć płytkę zgodnie z opisem w kroku 2.3.2.
    7. Dodać 100 μl roztworu roboczego do każdej studzienki, łącznie z dołkiem ślepej próby substratu, i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: W studzienkach rozwinie się niebieski kolor.
    8. Dodać 100 μl buforu zatrzymującego do każdej studzienki.
      UWAGA: Kolor niebieski natychmiast zmieni się na żółty.
    9. Odczytać gęstość optyczną przy 450 nm w ciągu 15 minut. Zapisz miana p24 pseudowirusa

3. Miareczkowanie pseudowirusa

  1. Wykonać jednokomórkowe zawiesiny komórek MDCK (5 x 104 na ml) w kompletnym pożywce DMEM, dodać 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 i 40000 komórek do różnych dołków 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 godzin.
  2. Wyjmij pseudowirusa z lodówki o temperaturze -80 °C, rozmroź go na lodzie i wymieszaj pseudowirusa.
  3. Dodaj 6 pseudowirusów HAU (6x jednostki HA) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki okrągłodennej i uzupełnij każdą studzienkę kompletnym DMEM do 120 μL.
  4. Pipetuj mieszaninę w górę i w dół 5 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować płytkę mieszaniny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5 % CO2 przez 1 godzinę.
  5. Przenieść 100 μl mieszaniny do komórek w płytce 96-dołkowej. Umieść płytkę z kulturą komórkową z powrotem w inkubatorze na 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu wirusem.
  6. Wyjąć płytkę z inkubatora i przeprowadzić test lucyferazy (tabela materiałów).
  7. Ostrożnie usuń pożywkę z dołków płytki. Przepłukać komórki 200 μl PBS i usunąć PBS tak bardzo, jak to możliwe.
    UWAGA: Odwróć płytkę i wyrzuć supernatant, uderzając go wstecz o papier chłonny. Jeśli linia komórkowa do testowania nie może się mocno przymocować do dna, ostrożnie wyjmij aspirację pożywki.
  8. Dodaj 50 μl buforu do lizy do każdej studzienki i kilkakrotnie wstrząsnij płytką hodowlaną. Przechowywać płytkę w temperaturze -80 °C przez noc.
    UWAGA: Wymieszaj 1 objętość 5x buforu do lizy z 4 objętościami wody, aby uzyskać 1x bufor do lizy. Przed użyciem zrównoważyć 1x bufor do lizy do RT. Rozbujaj płytkę, aby upewnić się, że komórki są całkowicie pokryte buforem do lizy. Pojedynczy proces zamrażania i rozmrażania może pomóc w całkowitej lizie komórki.
  9. Wyjąć płytkę, zrównoważyć w temperaturze RT przez 2 h.
    UWAGA: Komórka powinna być całkowicie zlizowana.
  10. Delikatnie kołysz płytką kilka razy i przenieś wszystkie lizaty komórkowe na nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe.
  11. Do każdej studzienki dodać 50 μl substratu, kilkakrotnie delikatnie rozkołysać płytkę i dokładnie wymieszać substrat i bufor do lizy.
  12. Zmierz wytworzone światło w ciągu 5 minut za pomocą luminometru. Zapisz miana lucyferazy pseudowirusa.
    UWAGA: Po dodaniu odpowiedniego substratu światło jest emitowane jako produkt uboczny w wyniku reakcji chemicznej, w której lucyferyna jest przekształcana w oksylucyferynę przez enzym lucyferazy. Ilość wytwarzanego światła jest proporcjonalna do ilości enzymu lucyferazy.

4. Preparat surowic odpornościowych

UWAGA: Surowica immunologiczna będzie używana do eksperymentów związanych z komórkami, a operacja eksperymentalna powinna być przeprowadzana w warunkach aseptycznych.

  1. Przygotuj 12 ośmiotygodniowych samic myszy BALB/c. Podziel równo myszy na dwie grupy.
    UWAGA: Jedna grupa była grupą DDV, a druga grupą kontrolną negatywną.
  2. Szczepienie grupowe DDV: Dwukrotnie podać domięśniowo 100 μg zoptymalizowanego pod kątem kodonu plazmidu DNA kodującego białko HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) w 0. i 3. tygodniu i raz dootrzewnowo za pomocą 512 cząstek wirusopodobnych HAU TH (VLP) w 6. tygodniu.
  3. Szczepienie grupy kontrolnej: Dwukrotnie domięśniowo zaszczepić 100 μg pustego plazmidowego wektorowego DNA w 0. i 3. tygodniu oraz raz dootrzewnowo za pomocą HIV-1 gag VLP w 6. tygodniu.
  4. Krew myszy należy pobrać 2 tygodnie po ostatnim szczepieniu.
    UWAGA: W tym przypadku myszy zostały znieczulone pentobarbitalem sodu (65 mg / kg) w momencie pobierania krwi. Po pobraniu krwi z żyły podżuchwowej myszy zostały natychmiast poddane eutanazji za pomocą CO2 .
  5. Utrzymuj krew w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie 4 °C przez noc. Wirować przy 900 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Dezaktywować surowicę, umieszczając ją w temperaturze 56 °C na 30 minut.
  6. Surowice odpornościowe należy przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Patrz Rysunek Uzupełniający 1, aby zapoznać się ze schematem blokowym opisującym główne procedury immunizacji myszy.

5. Test neutralizacji pseudowirusa (PN)

  1. Wykonać jednokomórkowe zawiesiny komórek MDCK (5 x 104 na ml) w kompletnym pożywce DMEM i dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki płaskodennej. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 godzin.
  2. Wyjmij pseudowirusa i surowice z lodówki w temperaturze -80 °C, rozmrozić je na lodzie i dokładnie zwirować.
  3. Rozcieńczyć surowicę w kompletnym podłożu 20 razy i dodać 100 μl kompletnej pożywki DMEM do studzienek 96-dołkowej płytki okrągłodennej z kolumn 2-10.
  4. Dodać 200 μl rozcieńczonych surowic do studzienek w kolumnie 2, przenieść 100 μl z kolumny 2 do kolumny 3, rozcieńczyć surowice w stosunku 1:20, 1:40, 1:80 itd., kolejno do 1:10240 z kolumny 2 do kolumny 10 i wyrzucić 100 μl z kolumny 10.
  5. Dodać 100 μl kompletnej pożywki DMEM do studzienek kolumny 11 jako kontrolę ujemną.
  6. Dodać 100 μl pseudowirusów do każdej studzienki, dokładnie pipetować mieszaninę w górę i w dół 5 razy i inkubować płytkę mieszaniny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę.
  7. Przenieść 100 μl mieszaniny z 96-dołkowej płytki okrągłodennej do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 60 godzin.
  8. Wyjąć płytkę z inkubatora. Wykonaj test lucyferazy zgodnie z opisem w krokach 3.7-3.12.

6. Test przyłączenia pseudowirusa

  1. Wykonać jednokomórkowe zawiesiny komórek MDCK (4 x 104 na ml) w kompletnym podłożu DMEM i dodać 100 μl zawiesin komórek do każdej studzienki w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 godzin.
  2. Inkubować pseudowirusa z surowicami w DMEM zawierającym 1% BSA w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Objętość mieszaniny wynosi 100 μL.
  3. Zablokować komórki MDCK 100 μl na studzienkę DMEM zawierającą 1% BSA w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  4. Zaszczepić mieszaninę pseudowirusa i surowicy (100 μl) na monowarstwę MDCK i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  5. Umyć płytkę komórkową 4 razy PBS zawierającym 1% BSA w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych wirusów.
  6. Lizować komórki za pomocą 100 μl buforu do lizy lucyferazy w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  7. Określić ilościowo ilość związanego wirusa na komórkach za pomocą zestawu ELISA HIV-1 p24, jak opisano powyżej (sekcja 2.3).

7. Ocena wniknięcia wirusa

  1. Wykonać jednokomórkowe zawiesiny komórek MDCK (5 x 104 na ml) w kompletnym pożywce DMEM i dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki płaskodennej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 godzin przed badaniem.
  2. Inokulować pseudowirusa (100 μl) na monowarstwie MDCK na 96-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C przez 6 godzin.
  3. Umyć płytkę komórkową 4 razy PBS zawierającym 1% BSA w celu usunięcia niezwiązanych pseudowirusów.
  4. Dodać 100 μl seryjnie rozcieńczonych surowic odpornościowych lub surowic od myszy szczepiących pozorowanych w DMEM zawierających 1% BSA do monowarstwy i inkubować komórkę w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  5. Usunąć supernatant komórkowy i przemyć płytkę do hodowli komórkowej 4 razy PBS zawierającym 1% BSA.
  6. Dodać świeży DMEM do komórek i inkubować przez 60 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Zmierz względną aktywność lucyferazy (RLA) komórek, jak opisano w krokach 3.7-3.12.
    UWAGA: Wejście wirusa, jak wskazano przez RLA, zostało wyrażone jako procent odczytu uzyskanego przy braku surowicy, który ustalono na 100%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja białek HA, NA i p24 HIV-1 pseudowirusa grypy
W celu określenia wydajności pakowania wirusa, w zapasach pseudowirusa grypy najpierw wykryto jednostki HA za pomocą testu HA (Rycina 2A). Liczba jednostek HA na mililitr pseudowirusów grypy wyniosła 643 (Tabela 3). Do badania ekspresji białek HA, NA i p24 HIV-1 wykorzystano analizę Western-blot oraz testy ELISA metodą kanapkową. Następnie obliczono stosunek jednostek HA do ilości białka gag p24 dla ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki HEK293FT są zwykle używane jako komórki pakujące do produkcji pseudowirusów. Regularne wykrywanie mykoplazmy jest niezbędne podczas hodowli komórkowej. Zakażenie mykoplazmą może drastycznie zmniejszyć wydajność pseudowirusa, a czasami nawet zbliżyć się do zera. W porównaniu z innymi zanieczyszczeniami, zanieczyszczenia mykoplazmą nie prowadzą do zmian wartości pH ani zmętnienia pożywki do hodowli komórkowych. Nawet wysokie stężenie mykoplazmy nie jest widoczne gołym okiem ani pod mikroskopem. Trzy popularne metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Projektu Budowania Potencjału Innowacyjnego prowincji Jiangsu (BM2020019), Projektu Naukowego i Technologicznego Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDB29030103), Projekt Naukowo-Technologiczny Guangdong (nr 2020B1111340076) oraz Otwarty Program Badawczy Laboratorium Zatoki Shenzhen (nr 2020B1111340076) oraz Otwarty Program Badawczy Laboratorium Zatoki Shenzhen (nr 2020B1111340076) oraz Otwarty Program Badawczy Laboratorium Zatoki Shenzhen (nr 2020B1111340076) oraz Otwarty Program Badawczy Laboratorium Zatoki Shenzhen (nr 2020B1111340076) oraz Otwarty Program Badawczy Laboratorium Zatoki Shen SZBL202002271003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Chiken ErythrocyteBio-channelBC-RBC-C001Odczynnik
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (płaskie dno)Materiał eksploatacyjnyThermo fisher scientific167008
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (okrągłe dno)Thermo fisher scientific163320eksploatacyjny
Allegra X-15RRedlica Beckmana--Sprzęt/Wirówka
Strzykawki insulinowe BD324910materiał eksploatacyjny
Chlorek wapnia BezwodnyAMRESCO1B1110-500GOdczynnik
Difosforan chlorochinyOdczynnik SelleckS4157
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Gibco12100-046Odczynnik
Płodowa surowica bydlęcaGibco16000-044Odczynnik
HEK293FTGibcoR700-07Linia komórkowa
HEPES FREE ACIDAMRESCO0511-250GOdczynnik
HIV-1 p24 Antygen ELISAZeptoMetrix801111Zestaw odczynników
testów lucyferazy Zamrażarka ZestawodczynnikówPromegaE4530
MDCK.1ATCCCRL-2935Probówki
mikrowirówek linii komórkowej 1,5 mlThermo fisher scientific509-GRD-QMateriały eksploatacyjne
Stożkowe probówki wirówkowe Nunc 15 mlMateriał eksploatacyjnyThermo fisher scientific339650
Stożkowe probówki wirówkowe Nunc 50 mlThermo fisher scientific339652materiał eksploatacyjny
Nunc EasYFlask 75 cm2Thermofisher naukowymateriałeksploatacyjny
156499 Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122Odczynnik
Końcówki do pipet (10 μ L)Materiał eksploatacyjnyThermo fisher scientificTF102-10-Q
Końcówki do pipet (100 μ L)Materiał eksploatacyjnyThermo fisher scientificTF113-100-Q
Końcówki do pipet (1000 μ L)Materiał eksploatacyjnyThermo fisher scientificTF112-1000-Q
Pipety serologiczne (5 ml)Thermo fisher scientific170355Neksploatacyjne
Pipety serologiczne (10 ml)eksploatacyjnyThermo fisher scientific170356N
Trypsyna/EDTAGibco25200-072Odczynnik
Varioskan FlashThermo fisher naukowy--Sprzęt / Czytnik mikropłytek
Inkubator z płaszczem wodnymThermo fisher scientific3111Sprzęt / Inkubator komórkowy
Sól sodowa PentobarbitalSigma57-33-0Odczynnik
materiał System do Materiały Materiał

Bibliografia

  1. Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
  2. Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854(2017).
  3. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).
  4. Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311(2020).
  5. Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
  6. Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
  7. Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
  8. Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
  9. Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
  10. Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
  11. Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
  13. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).
  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

pseudowirus H5wirus grypy ptakówtest neutralizacji pseudowirusatest hemaglutyninytest lucyferazykomórki MDCKWestern blotpoziom bezpieczeństwa biologicznego
Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.