Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Podsumowanie

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Streszczenie

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDO) powinny być przedklinicznym modelem raka o lepszej odtwarzalności choroby niż tradycyjne modele hodowli komórkowych. PDO zostały z powodzeniem wygenerowane z różnych ludzkich nowotworów, aby dokładnie i skutecznie odtworzyć architekturę i funkcję tkanki nowotworowej. Jednak PDO nie nadają się do wysokoprzepustowego systemu testów in vitro (HTS) lub analizy komórek przy użyciu płytek 96-dołkowych lub 384-dołkowych podczas oceny leków przeciwnowotworowych, ponieważ są niejednorodne pod względem wielkości i tworzą duże skupiska w hodowli. Te hodowle i testy wykorzystują matryce zewnątrzkomórkowe, takie jak Matrigel, do tworzenia rusztowań tkanki nowotworowej. W związku z tym PDO charakteryzują się niską przepustowością i wysokimi kosztami, a opracowanie odpowiedniego systemu oznaczania było trudne. Aby rozwiązać ten problem, stworzono prostszy i dokładniejszy HTS przy użyciu PDO do oceny siły działania leków przeciwnowotworowych i immunoterapii. Stworzono HTS in vitro, który wykorzystuje PDO utworzone z guzów litych hodowanych na płytkach 384-dołkowych. Opracowano również HTS do oceny zależnej od przeciwciał aktywności cytotoksyczności komórkowej w celu odzwierciedlenia odpowiedzi immunologicznej przy użyciu PDO hodowanych na 96-dołkowych płytkach.

Wprowadzenie

Ludzkie linie komórkowe raka są powszechnie akceptowane do badania biologii raka i oceny środków przeciwnowotworowych. Jednak te linie komórkowe niekoniecznie zachowują oryginalne cechy swojej tkanki źródłowej, ponieważ ich morfologia, mutacja genów i profil ekspresji genów mogą zmieniać się podczas hodowli przez długi czas. Co więcej, większość z tych linii komórkowych jest hodowana w monowarstwie lub używana jako mysie ksenoprzeszczepy, z których żaden fizycznie nie reprezentuje tkanki nowotworowej^1,2. W związku z tym skuteczność kliniczna środków przeciwnowotworowych może nie być taka sama, jak obserwowana w liniach komórek rakowych. W związku z tym opracowano systemy in vitro, takie jak testy ex vivo z wykorzystaniem ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjenta lub organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO) oraz modeli sferoidalnych guza, które dokładnie odtwarzają strukturę i funkcję tkanek nowotworowych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że modele te przewidują reakcję pacjentów na leki przeciwnowotworowe, ponieważ są bezpośrednio porównywalne z odpowiadającą im tkanką nowotworową. Te systemy in vitro zostały stworzone dla różnych typów tkanek nowotworowych, a także opracowano związane z nimi wysokoprzepustowe systemy testowe (HTS) do badań przesiewowych leków^3,4,5,6,7. Heterogeniczne hodowle organoidowe ex vivo guzów pierwotnych uzyskanych od pacjentów lub ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów zyskały w ostatnich latach znaczną popularność ze względu na łatwość hodowli i zdolność do utrzymania złożoności komórek w tkance zrębu^8,9,10. Oczekuje się, że modele te przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii nowotworów i ułatwią ocenę skuteczności leków in vitro.

Niedawno stworzono serię nowych PDO z różnych typów tkanek nowotworowych, oznaczonych jako F-PDO, w ramach Projektu Badań Translacyjnych w Fukushimie. ChNP tworzą duże skupiska komórek o morfologii podobnej do morfologii guza źródłowego i mogą być hodowane przez ponad sześć miesięcy¹¹. Histologia porównawcza i kompleksowe analizy ekspresji genów wykazały, że cechy PDO są zbliżone do cech ich źródłowych tkanek nowotworowych, nawet po długotrwałym wzroście w warunkach hodowli. Ponadto ustalono odpowiedni HTS dla każdego rodzaju ChNP w płytkach 96-dołkowych i 384-dołkowych. Testy te wykorzystano do oceny kilku ukierunkowanych molekularnych środków i przeciwciał. W tym przypadku standardowe chemioterapeutyki (paklitaksel i karboplatyna) stosowane w raku endometrium oceniano przy użyciu F-PDO pochodzących od pacjentki, która nie zareagowała na paklitaksel i karboplatynę. W związku z tym działanie hamujące wzrost komórek paklitakselu i karboplatyny wobec tej PDO było słabe (IC₅₀: >10 μM). Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że wrażliwość niektórych F-PDO na chemioterapeutyki i molekularne środki ukierunkowane jest zgodna ze skutecznością kliniczną^11,12,13. Na koniec, zmiany w strukturze wyższego rzędu PDO spowodowane przez czynniki przeciwnowotworowe analizowano za pomocą trójwymiarowego systemu analizy komórek^12,13. Wyniki oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu HTS opartego na PDO są porównywalne z wynikami klinicznymi uzyskanymi dla tych leków. W tym miejscu przedstawiono protokół prostszego i dokładniejszego HTS, który można wykorzystać do oceny siły działania leków przeciwnowotworowych i immunoterapii przy użyciu modeli PDO.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem materiałów pochodzenia ludzkiego zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone z wyprzedzeniem przez komisję etyki Uniwersytetu Medycznego w Fukushimie (numery zatwierdzenia 1953 i 2192; daty zatwierdzenia odpowiednio 18 marca 2020 r. i 26 maja 2016 r.). Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów, którzy dostarczyli próbki kliniczne wykorzystane w tym badaniu.

1. Kultura ChNP

UWAGA: F-PDO tworzą klastry komórek, które wykazują różnorodność heterogenicznych morfologii i rosną w kulturze zawiesinowej (Rysunek 1). Co więcej, F-PDO mogą być hodowane przez ponad 6 miesięcy i mogą być kriokonserwowane do wykorzystania w przyszłości.

1. Rozmrażanie przechowywanych ChNP (dzień 0)
   1. Rozmrozić i wysadzić PDO (np. RLUN007, gruczolakorak płuc) w dniu 0 (Rysunek 1). Najpierw dodaj 15 ml pożywki do PDO (patrz tabela materiałów) zawierającej 1% suplementu B-27 i 30 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   2. Po wyjęciu zamrożonej fiolki z magazynu ciekłego azotu, delikatnie mieszać ChNP w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Następnie wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, przetrzeć fiolkę 70% etanolem, a następnie przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
   3. Przenieść zawartość fiolki do probówki zawierającej 15 ml pożywki dla ChNP. Wymieszaj PDO i pożywkę, delikatnie pipetując pięć razy w górę i w dół za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml. Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 3 minuty w temperaturze ~25 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad ChNP w 5 ml świeżej pożywki i przenieść do kolby o średnicy 25^cm2 (patrz Tabela Materiałów) z delikatnym pipetowaniem. Na koniec należy wyhodować ChNP w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .}
2. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu (dni 3-7). Odwirować zawiesinę ChNP, aby wytrącić skupiska komórek, i zastąpić 4 ml pożywki (80% objętości). Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce.
   UWAGA: Większość z RLUN007 wygląda jak skupiska komórek o średnicy 100-500 μm. Gdy kolor czerwieni fenolowej w pożywce zmieni się na żółty, jak pokazano na Rysunek 1A, wymieniaj podłoże częściej. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty następnego dnia po wymianie, a każde skupisko komórek połączy się, tworząc większe skupiska o średnicy >500 μm, przejdź w stosunku podziału 1:2.
3. Subkultura (dni 8-28) ChNP
   UWAGA: Biorąc pod uwagę trudność w faktycznym zmierzeniu liczby pojedynczych komórek, czas przejścia jest określany na podstawie odpowiedniej gęstości skupisk komórek i wielkości osadu PDO po odwirowaniu (Rysunek 1B). W przypadku RLUN007 objętość granulatu PDO osiąga 30 μL (gęstość nasycona w kolbach 25^cm2) po około 2 tygodniach od rozmrożenia.
   1. W celu przeniesienia z jednej kolby o średnicy 25^cm2 do dwóch kolb o średnicy 25^cm2 (P1), zawiesinę ChNP należy przenieść do probówki wirówkowej i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze około 25 °C. Oszacować objętość osadu ChNP i odrzucić supernatant. Zawiesić osad ChNP za pomocą pipety o pojemności 5 ml w 5 ml świeżego podłoża. Delikatnie pipetować pięć razy w górę i w dół przy niskiej prędkości. Następnie przenieść połowę objętości zawiesiny ChNP (2,5 ml) do dwóch kolb i dodać 2,5 ml świeżej pożywki do każdej kolby. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   2. W celu przeniesienia z dwóch kolb o średnicy 2 cm do jednej kolby o średnicy 75^cm2 (P2), należy przenieść zawiesinę ChNP z dwóch kolb do dwóch probówek wirówkowych i odwirować ChNP przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze około 25 °C. Następnie oszacuj objętość osadu PDO i ponownie zawieś osad w 2,5 ml świeżego podłoża (na probówkę). Następnie połączyć zawiesinę ChNP w jednej probówce z zawiesiną w drugiej probówce i przenieść ją do kolby o długości 75^cm2 zawierającej 10 ml świeżej pożywki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ . Przenieść subkulturowane PDO z dwóch kolb o średnicy 2 cm do jednej kolby o średnicy 2 cm² około 1 tygodnia po pierwszym pasażu (Rysunek 1C).

2. Hamowanie wzrostu HTS

UWAGA: Aktywność hamująca wzrost środków przeciwnowotworowych przeciwko PDO jest oceniana poprzez pomiar wewnątrzkomórkowej zawartości ATP, jak pokazano w Rysunek 2. Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania żywotności komórek (patrz tabela materiałów).

1. W dniu 0 należy przeprowadzić hodowlę ChNP (np. RLUN007) w kolbach do momentu, aż dostępna będzie odpowiednia liczba skupisk komórek do testu. Na jeden dzień przed wysiewem przenieść zawiesinę ChNP z kolby o średnicy 75^cm2 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w celu zmierzenia objętości granulatu PDO. Następnie ponownie zawiesić granulki ChNP w 15 ml świeżej pożywki i przenieść je z powrotem do kolby o długości^{75 cm2}. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO₂,
   UWAGA: Wymagana objętość granulek PDO zależy od stopnia rozcieńczenia każdej ChNP i liczby 384-dołkowych płytek użytych do testu. W przypadku RLUN007 do wysiewu na dziesięć płytek 384-dołkowych niezbędne jest 200 μl objętości osadu komórkowego.
2. W dniu 1 (24 godziny po zmianie pożywki) zmielić ChNP za pomocą sprzętu do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz tabela materiałów) z uchwytem filtra zawierającym filtr siatkowy o wielkości 70 μm. Następnie rozcieńczyć 15 ml zawiesiny ChNP 10x. Wysiewać 40 μl zawiesiny ChNP na 384-dołkowe mikropłytki sferoidalne (okrągłodenne) o bardzo niskim przyleganiu (patrz Tabela materiałów) za pomocą dozownika zawiesiny komórek (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Do mielenia klastrów komórek zaleca się stosowanie dostępnych na rynku urządzeń do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz Tabela materiałów).
3. Po 24 godzinach od wysiewu (dzień 2) należy potraktować PDO 0,04 μl roztworów badanego czynnika w końcowym zakresie stężeń od 20 μM do 1,0 nM (10 seryjnych rozcieńczeń) przy użyciu płynu (patrz tabela materiałów).
4. W dniu 8 (144 godziny po poddaniu działaniu substancji badanej) dodać wewnątrzkomórkowy odczynnik pomiarowy ATP do studzienek testowych. Wymieszać płytki za pomocą mieszadła i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Zmierzyć wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako luminescencję za pomocą czytnika płytek (patrz Tabela materiałów).
5. Aby obliczyć żywotność komórek, należy podzielić ilość ATP w studzienkach testowych przez ilość w studzienkach kontrolnych zawierających nośnik, odejmując tło. Aby obliczyć szybkość wzrostu w ciągu 6 dni, należy podzielić ilość ATP w studzienkach kontrolnych pojazdu przez ilość w studzienkach kontrolnych pojazdu 24 godziny po wysiewie.
6. Obliczyć 50% stężenie hamujące (IC₅₀) i wartości pola pod krzywą (AUC) na podstawie krzywych dawka-odpowiedź, korzystając z oprogramowania do analizy danych biologicznych (patrz tabela materiałów). Współczynnik Z jest parametrem bezwymiarowym, który mieści się w zakresie od 1 (nieskończona separacja) do <0, zdefiniowanym jako Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, gdzie σc+, σc-, μc+ i μc- są odchyleniami standardowymi (σ) i średnimi (μ) kontrolek wysokich (c+) i niskich (c−)14, odpowiednio.

3. HTS z systemem pobierania i obrazowania komórek do hamowania wzrostu

UWAGA: Jeśli występuje duże odchylenie (gdy współczynnik zmienności [CV] w teście jest większy niż 20%) w danych przy użyciu protokołu 2, PDO o wybranym rozmiarze mogą zostać wysiane na płytki 96-dołkowe lub 384-dołkowe za pomocą systemu pobierania i obrazowania komórek (Rysunek 2). Protokół jest taki sam, jak opisany w krokach 2.1 i 2.2 w poprzedniej sekcji. Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku systemu pobierania i obrazowania komórek (patrz Tabela materiałów).

1. W dniu 1 umieść 384-dołkową mikropłytkę sferoidalną o bardzo niskim przyczepie z 40 μl pożywki/dołka jako płytkę docelową w systemie pobierania i obrazowania komórek.
2. Napełnić komorę pobierania (patrz Tabela Materiałów) 6 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Dodać ChNP zawieszone w pożywce (objętość granulek PDO, 4 μL) do komory przebierczej i umieścić w systemie.
3. Odstawić komorę na co najmniej 1 minutę, po czym nastąpi dyspersja, tak aby skupiska komórek osiadły na dnie komory; następnie wykonaj skanowanie komory.
4. Ustaw rozmiar pobrania na 140-160 μm (obszar 15 386-20 000 μm²) w systemie, aby automatycznie wybierać klastry komórek. Następnie sprawdź jakość wybranych klastrów komórek na zeskanowanych obrazach i przenieś dziesięć klastrów komórek na studzienkę za pomocą wskazówek do pobierania (patrz Tabela materiałów) na płytkę docelową.
5. Wykonaj kroki protokołu począwszy od kroku 2.3.

4. HTS dla cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał

UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą dostępnego na rynku systemu (patrz Tabela Materiałów), który jest przyrządem do pomiaru impedancji elektrycznej. Służy do oceny cytolizy PDO za pomocą cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) z przeciwciałami monoklonalnymi i komórkami NK (Rycina 3). Komórki NK są wytwarzane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu zestawu do produkcji komórek NK (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.

1. Pomiar aktywności ADCC
   1. W dniu 0 pokryć 96-dołkową płytkę (patrz Tabela materiałów) 50 μl 10 μg/ml roztworu fibronektyny (0,5 μg/basenik) w temperaturze 4 °C przez noc.
   2. W pierwszym dniu, po usunięciu roztworu fibronektyny, dodaj 50 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka, aby zmierzyć impedancję tła.
   3. Przed wysiewem dodać 5 ml odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych (patrz tabela materiałów) do PDO (RLUN007: 100 μl osadu ChNP w kolbie^{o średnicy 75 cm2}) i inkubować w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu rozproszenia PDO. Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 5 ml pożywki, odwiruj i usuń odczynnik dysocjacyjny. Przepłukać PDO świeżą pożywką i przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm (patrz tabela materiałów).
   4. Policz liczbę komórek za pomocą analizatora żywotności komórek (patrz Tabela materiałów).
   5. Przenieść zawiesinę ChNP do zbiornika i wymieszać za pomocą pipetora wielokanałowego. Dodać zawiesinę PDO do studzienek o wymiarach 5 x 10⁴ komórek/studzienkę na 96-dołkowej płytce. Każda studzienka zawiera końcową objętość 100 μl. Następnie umieścić płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze około 25 °C na 30 minut.
   6. Przenieść płytkę do przyrządu w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C. Rejestruj zmiany w sygnałach impedancji co 15 minut jako indeks komórki.
   7. Rozmrozić komórki NK w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C tego samego dnia, w którym dokonano wysiewu PDO. Przenieść komórki z fiolki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki dla komórek NK (patrz tabela materiałów) i odwirować przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml świeżej pożywki. Po zliczeniu komórek dostosować gęstość komórek do 1 x 10⁶ komórek/ml i przenieść do kolby o średnicy 75^cm2. Hodować komórki NK w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
   8. W dniu 2 przygotuj roztwory przeciwciał (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) o stężeniu 10-krotnym od końcowego na sterylnych 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V.
   9. Usunąć 60 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 10 μl roztworu trastuzumabu lub cetuksymabu (10 μg/ml, 1 μg/ml i 0,1 μg/ml) do PDO. Przenieś płytki z powrotem do urządzenia w inkubatorze i zapisuj indeks komórek przez 1 godzinę.
   10. Przenieś zawiesinę komórek NK do probówki o pojemności 50 ml i policz liczbę komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i dostosować gęstość komórek NK do 1 x 10 6 komórek/ml i 2 x 10⁶ komórek/ml z pożywką dla PDO.
   11. Dodać 50 μl zawiesiny komórek NK do komórek efektorowych (NK) w stosunku komórek docelowych (RLUN007) 1:1 lub 2:1. Końcowe stężenia przeciwciał wynoszą 1 μg/ml, 0,1 μg/ml i 0,01 μg/ml. Utrzymuj płytkę w temperaturze około 25 °C przez 15 minut i włóż płytki z powrotem do urządzenia.
2. Gromadzenie i analiza danych
   1. Przelicz indeks komórki na procentowe wartości cytolizy za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów).
   2. Procentowa cytoliza odnosi się do procentu komórek docelowych zabitych przez komórki NK w porównaniu z samymi komórkami docelowymi (PDO) jako kontrolą. Odejmij indeksy komórkowe studzienek zawierających tylko komórki NK od indeksu studzienek na próbki w każdym punkcie czasowym. Znormalizuj każdą wartość do indeksu komórkowego bezpośrednio przed dodaniem przeciwciał. Przelicz znormalizowany indeks komórek na procentową cytolizę, używając następującego równania: % cytolizy = (1 - znormalizowany indeks komórek [dołki próbki]) / znormalizowany indeks komórek (dołki docelowe) x 100.

Wyniki

Opracowano wysoce dokładny system HTS z wykorzystaniem PDO oraz mikropłytek 384-dołkowych do oceny leków przeciwnowotworowych; opracowanie HTS dla każdego PDO zostało opisane we wcześniejszych doniesieniach^10,11,12,13. Wydajność HTS oceniono poprzez obliczenie wartości CV oraz współczynnika Z'. Współczynnik Z' jest powszechnie akceptowaną metodą walidacji jakości i wydajności testu, a test uznaje się za odpowiedni do HTS, jeśli wartość ta jest >0,5¹⁴. Punkty danych kontrolnych w teście na płytce 384-dołkowej z użyciem RLUN007 wykazały niewielką zmienność, przy wartościach CV wynoszących 5,8% i obliczonych współczynnikach Z' równych 0,83, co przedstawiono na Rysunku 4. Wyniki te wskazują, że test ten charakteryzuje się wysoką wydajnością w zastosowaniach HTS. Aby zbadać wrażliwość PDO na leki przeciwnowotworowe za pomocą HTS, oceniono hamowanie wzrostu w RLUN007 traktowanym ośmioma lekami przeciwnowotworowymi, a konkretnie inhibitorami receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) (afatynibem, erlotynibem, gefitynibem, lapatynibem, ozymertynibem i rociletynibem) oraz paklitakselem, które stanowią standardowe leczenie kliniczne niedrobnokomórkowego raka płuca, oraz mitycyną C jako kontrolą pozytywną. Wartości IC₅₀ i AUC leków przeciwnowotworowych dla każdego PDO przedstawiono na Rysunku 4. RLUN007 wykazał wysoką wrażliwość (IC₅₀ < 2 µM, AUC < 282) na wszystkie inhibitory EGFR oraz pozostałe leki przeciwnowotworowe. Krzywe sigmoidalne obliczone dla wszystkich danych wskazały, że aktywność hamującą wzrost leków przeciwnowotworowych można było precyzyjnie zmierzyć.

System selekcji i obrazowania komórek jest wykorzystywany w przypadkach, gdy dane znacząco różnią się przy zastosowaniu powyższej metodologii. System selekcji i obrazowania komórek, który precyzyjnie wybiera skupiska komórek bez ich uszkadzania, umożliwia dokładne analizy HTS poprzez dostosowanie rozmiaru skupisk komórek w celu wyeliminowania z systemu analizy resztek komórkowych. Gdy system nie był używany, wartość CV wynosiła 26,0%, a wartość czynnika Z' wynosiła 0,23 (dane nie zostały przedstawione). Jednakże, przy zastosowaniu systemu wartości CV i czynnika Z' uległy poprawie, wynosząc odpowiednio 6,4% oraz 0,81.

Aby zbadać cytolizę PDO z aktywnością ADCC przy użyciu urządzenia do pomiaru impedancji elektrycznej, które monitoruje liczbę, morfologię i przywieranie komórek przez długi czas, oceniono zmiany sygnałów impedancji w przypadku RLUN007 traktowanych przeciwciałami (trastuzumabem i cetuksymabem) oraz komórkami NK jako komórkami efektorowymi w płytce 96-dołkowej. W porównaniu z kontrolą składającą się z samych komórek docelowych, procent cytolizy wzrastał wraz z czasem. Po 6 h osiągnął on 45% lub 75% przy stosunku E:T 1:1 (Rysunek 5A,C) lub 2:1 (Rysunek 5B,D) bez przeciwciał. Cytoliza pośredniczona przez komórki NK z użyciem trastuzumabu wyniosła odpowiednio około 60% i 90% przy stosunku 1:1 (Rysunek 5A, 1 µg/mL) i 2:1 (Rysunek 5B, 1 µg/mL) po 6 h. W przeciwieństwie do tego, cetuksymab miał zależny od dawki wpływ na cytolizę pośredniczoną przez komórki NK (Rysunek 5C,D). Przy najwyższym stężeniu cetuksymabu komórki RLUN007 zostały zniszczone w 90% i 100% przy stosunku 1:1 i 2:1, odpowiednio (Rysunek 5C,D). Efekt trastuzumabu był słabszy niż w przypadku cetuksymabu, wykazując jedynie 60% cytotoksyczności. Wyniki te wskazują, że system analizy PDO może służyć do oceny aktywności ADCC z wykorzystaniem technologii impedancyjnej w czasie rzeczywistym.

Rysunek 1: Kluczowe punkty hodowli PDO. (A) Zmiana barwy medium. (B) Pomiar ilości PDO na podstawie wielkości osadu poprzez dopasowanie probówki wirówkowej zawierającej PDO do probówek z oznaczeniami poziomów 50-200 µL. (C) Gęstość PDO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Podsumowanie protokołu wykorzystanego do stworzenia wysokoprzepustowego systemu testowego z użyciem mikropłytek 384-dołkowych. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 3: Podsumowanie protokołu wysokoprzepustowego testu aktywności ADCC. ADCC, cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał; NK, komórki natural killer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: System analizy wysokoprzepustowej w celu oceny hamowania wzrostu przez środki przeciwnowotworowe. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki RLUN007 w odpowiedzi na środki przeciwnowotworowe. Rozdrobnione PDO wysiano na płytki 384-dołkowe. Przez 6 dni poddano je działaniu dziesięciu różnych stężeń środków przeciwnowotworowych (od 10 µM do 1,5 nM). Dane przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wysokoprzepustowy test aktywności ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuksymab. (A,C) Stosunek komórek RLUN007 do komórek efektorowych 1:1. (B,D) Cytoliza przy stosunku komórek RLUN007 do komórek efektorowych 1:2. Aktywność zmierzono 12 h po dodaniu komórek efektorowych. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe z trzech próbek powtórzonych. ADCC, przeciwciałozależna cytotoksyczność komórkowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Unikalną cechą ChNP jest to, że nie są one enzymatycznie rozdzielane na pojedyncze komórki podczas hodowli lub testu i utrzymują klastry komórek w hodowli. Dlatego liczby komórek nie można dokładnie policzyć pod mikroskopem. Aby rozwiązać ten problem, liczbę komórek określa się wizualnie poprzez wyłożenie probówki wirówkowej zawierającej komórki probówkami oznaczonymi poziomami dla 50-200 μl (rysunek 1B). Ponadto, ponieważ trudno jest wizualnie zmierzyć objętość osadów w klastrach komórek hodowanych w kolbie o średnicy 25^cm2, czas przejścia określono na podstawie zmiany koloru podłoża z czerwonego na żółty i zauważalnego wzrostu w pojedynczych komórkach lub szczątkach w porównaniu z czasem pasażowania jako wskaźników (Rysunek 1A,C). Taki jest sens passpassingu dla PDO. Ilość granulek PDO jest mierzona wizualnie po odwirowaniu przy każdej zmianie pożywki. Gdy objętość osadu przestaje się zwiększać, a podłoże żółknie następnego dnia po wymianie pożywki, uważa się, że podłoże jest nasycone gęstością i przeprowadza się pasażowanie. Objętość granulek jest definiowana dla każdej ChNP. Jeżeli ChNP nie rozprzestrzeniają się, ilość pożywki zmienia się z 80% do 50% w momencie wymiany pożywki, a gęstość ChNP w kulturze wzrasta.

Opracowano HTS odpowiedni dla PDO. Jego przepustowość wynosi co najmniej dziesięć do dwudziestu płytek 384-dołkowych wykonywanych przy użyciu jednej kolby ChNP o długości 75^cm2 , a liczba płytek przetwarzanych dziennie wynosi co najmniej 50. Ponadto przedstawiono już wyniki oceny różnych leków przeciwnowotworowych przez HTS przy użyciu ChNP.

Podczas wykonywania HTS zatkanie filtra siatkowego spowodowane rozdrobnieniem F-PDO za pomocą sprzętu do fragmentacji i dyspersji komórek jest początkowo rozwiązywane poprzez zmianę rozmiaru siatki filtra na 100 μm. Kolejnym krokiem jest zmniejszenie objętości zawiesiny ChNP nakładanej na szklane naczynie. Podczas przygotowywania roztworów substancji badanych dla HTS, związki o niskiej masie cząsteczkowej są zwykle rozpuszczane w dimetylosulfotlenku, a przeciwciała rozpuszcza się w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Jako substancję badaną stosuje się odpowiedni rozpuszczalnik, a dane kontrolne uzyskuje się z użytego rozpuszczalnika.

Poniżej znajduje się opis sposobu radzenia sobie ze zmiennością danych testowych. Jeżeli występują duże różnice w danych w badaniu przy użyciu płytek 384-dołkowych, płytkę testową należy zmienić na formę płytki 96-dołkowej. Współczynnik rozcieńczenia PDO (liczba wysianych skupisk komórek) jest również badany po wysianiu płytki. Wreszcie, system pobierania i obrazowania komórek może być wykorzystany do wybrania rozmiaru PDO do testu. Przed dodaniem ChNP do komory, pojedyncze komórki i małe grupy komórek powinny zostać usunięte przez wirowanie na niskiej prędkości, aby móc prawidłowo rozpoznać ChNP. Jeśli po dodaniu PDO do komory widoczne są pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek, można przeprowadzić wiele dyspersji w celu usunięcia pojedynczych komórek. Następnie, chociaż system pobierania i obrazowania komórek ma funkcję, która pozwala na utrzymanie ciepła płytki, funkcja ta nie jest używana ze względu na parowanie pożywki hodowlanej, gdy system pracuje przez długi czas. Wreszcie, objętość klastrów komórek jest nieznana, ponieważ jest rozpoznawana przez obraz płaski. Ponadto, jeżeli dwie lub więcej ChNP nakłada się na siebie, nie można prawidłowo rozpoznać pojedynczej ChNP. Możliwe jest jednak usunięcie niechcianych PDO za pomocą funkcji usuwania, sprawdzając je na zeskanowanym obrazie po przeniesieniu.

Przyrząd do pomiaru impedancji elektrycznej jest zwykle używany do przylegających docelowych komórek rakowych do monitorowania zmian impedancji podczas proliferacji komórek. W związku z tym nie wykrywa się zmiany indeksu komórkowego nieprzylegających PDO. Próbując rozwiązać ten problem, konieczne jest zbadanie warunków wysiewu, takich jak gęstość PDO i traktowanie enzymatyczne (enzym dysocjacji komórek i czas zabiegu) w zależności od rodzaju ChNP. Studzienki w płytce muszą być również pokryte odpowiednią macierzą zewnątrzkomórkową do wysiewu ChNP. ChNP wysiewa się bez obróbki enzymatycznej, w zależności od rodzaju ChNP. RLUN007 wykorzystano do pomiaru impedancji poprzez wysiewanie PDO na 96-dołkowej płytce po ich dyspersji przez obróbkę enzymatyczną. RLUN007 poddano działaniu odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu rozproszenia komórek i przyłączenia ich do studzienek płytki 96-dołkowej. Biorąc pod uwagę, że zdysocjowane komórki RLUN007 natychmiast tworzą agregaty, pożądane jest wysiewanie na płytkach zaraz po filtracji za pomocą sitka. Po przeniesieniu zawiesiny komórek z probówki do zbiornika, zbiornik był delikatnie przesuwany od prawej do lewej dwa do trzech razy i pipetowany w górę iw dół pięć razy przed wysiewem na płytkę. Zawiesina była również mieszana z każdym dodatkiem do studni. Płytkę umieszczono następnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut (w przypadku PDO) lub 15 minut (w przypadku komórek NK), aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek w studzience. Drugą ważną kwestią jest to, że leczenie przeciwciałami i komórkami NK powinno być zaplanowane tak, aby miało miejsce, zanim indeks komórkowy osiągnie plateau, a wartość nie będzie mniejsza niż 0,5. W przypadku RLUN007 optymalny czas na rozpoczęcie testu to 20-22 godziny po posiewie, a liczba komórek do wysiewu to 5 x 10⁴ komórki/dołek.

Ogólnie rzecz biorąc, hodowla i testy organoidów nowotworowych wykorzystują matryce zewnątrzkomórkowe, takie jak Matrigel, do tworzenia rusztowań tkanki nowotworowej lub enzymów, takich jak trypsyna i kolagenaza, do rozbijania organoidów 3,4,5,6,7. Zaletą tej metody jest to, że podczas hodowli i oznaczania nie jest wymagana matryca zewnątrzkomórkowa ani obróbka enzymatyczna (z wyjątkiem testów z użyciem przyrządu do pomiaru impedancji elektrycznej), co znacznie zmniejsza zapotrzebowanie na pracę i koszty. Co więcej, metoda ta jest stosunkowo łatwa do dostosowania do systemów testowych HTS i różnych systemów pomiarowych. Jednak zastosowanie macierzy zewnątrzkomórkowej jest pożądane do niektórych celów badawczych, ponieważ może ona działać jako rusztowanie dla komórek i wpływać na morfogenezę, różnicowanie i homeostazę tkanek.

W tym badaniu do oceny inhibitorów EGFR wykorzystano PDO (RLUN007) z mutacją EGFR (L858R), która jest klinicznie wrażliwa na inhibitory EGFR i wysoką ekspresją genu EGFR (dane nie pokazane). Wykazano, że wrażliwość RLUN007 na inhibitory EGFR była wyższa niż w przypadku innych F-PDO pochodzących z raka płuc¹³ (Figura 4). W związku z tym HTS wykorzystujący PDO, które zachowują cechy tkanki nowotworowej, jest lepszy do oceny potencjalnych środków przeciwnowotworowych i stwarza możliwości oceny leków i postępów w medycynie spersonalizowanej. Chociaż HTS nadaje się do wstępnych badań przesiewowych środków, nie odtwarza mikrośrodowiska guza, a zatem nie może ocenić skuteczności leków in vivo. W związku z tym obecnie opracowywany jest system in vitro , który może naśladować ludzką tkankę nowotworową in vivo poprzez wspólną hodowlę z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i innymi komórkami zrębu lub technologią narządów na chipie w przypadku braku modeli zwierzęcych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
384-dołkowa sferoidalna mikropłytka o bardzo niskim nasadce	Płytki Corning	4516	do HTS
40-µ m Sitko do komórek	Corning	352340
Zestaw AdoptCell-NK	Kohjin Bio	16030400	do produkcji komórek NK
Media do ekspansji komórek rakowych plus	Fujifilm Wako Pure Chemical	032-25745	Podłoże dla F-PDO
ALyS505N-175	Cell Science & Instytut Technologiczny	10217P10	Pożywka dla komórek NK
CELL HANDLER	Yamaha System	pobierania i obrazowania	Motor-Cell
CellPet FT	JTEC-Sprzęt		fragmentacji i dyspersji komórek
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D	Promega	G9683	Test luminescencyjny żywotności komórek, wewnątrzkomórkowy odczynnik do pomiaru ATP
Echo 555	Labcyte	-	Płyn do obsługi
EnSpire	PerkinElmer-Czytnik		płytek
E-plate VIEW 96	Agilent	300601020	Płytki są specjalnie zaprojektowane do wykonywania testów komórkowych za pomocą systemu xCELLigence RTCA
Roztwór fibronektyny	Fujifilm Wako Pure Chemical	063-05591	Powłoka płytkowa do systemu xCELLigence RTCA
F-PDO	Fujifilm Wako Pure Chemical lub Summit Pharmaceuticals International	-	F-PDO można kupić w Fujifilm Wako Pure Chemicals lub Summit Pharmaceuticals International
Oprogramowanie Morphit, wersja 6.0	The Edge Software Consultancy		Oprogramowanie do analizy danych biologicznych
Multidrop Combi	ThermoFisher Scientific	5840300	Dozownik zawiesiny komórek
Precision Chamber	Yamaha Motor	JLE9M65W230	Chamber do pobierania klastrów komórkowych za pomocą CELL HANDLER
Precision Tip	Yamaha Motor	JLE9M65W300	Micro końcówka do pobierania klastrów komórkowych za pomocą CELL HANDLER
RLUN007	Fujifilm Wako Pure Chemical lub Summit Pharmaceuticals International		Hodowla komórek F-PDO TrypLE Express
	ThermoFisher Scientific	12604021	Hodowla komórkowa odczynnik dysocjacyjny
Ultra-Low Attachment 25 cm² Kolba	Corning	4616	Kolba hodowlana do nasadki PDO
Ultra-Low 75 cm² Kolba	Corning	3814	Kolba hodowlana do
systemu analizatora żywotności komórek PDO Vi-CELL XR Analizator żywotności komórek	Beckman coulter-Cell
Oprogramowanie do immunoterapii xCELLigence, wersja 2.3	analityczne ACEA Bioscience		dla systemu xCELLigence RTCA
System xCELLigence RTCA ACEA	Bioscience-Przyrząd		do pomiaru impedancji elektrycznej dla cytoliza

Zestaw do Oprogramowanie