Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroby mitochondrialne stanowią największą klasę wrodzonych wad metabolizmu i są obecnie nieuleczalne. Choroby te powodują wady neurorozwojowe, których mechanizmy leżące u podstaw pozostają do wyjaśnienia. Główną przeszkodą jest brak skutecznych modeli podsumowujących wczesne upośledzenie neuronów obserwowane u pacjentów. Postępy w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwiają generowanie trójwymiarowych (3D) organoidów mózgowych, które można wykorzystać do badania wpływu chorób na rozwój i organizację układu nerwowego. Naukowcy, w tym ci autorzy, wprowadzili niedawno organoidy ludzkiego mózgu do modelowania zaburzeń mitochondrialnych. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół solidnego generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich wykorzystania w mitochondrialnym profilowaniu bioenergetycznym i analizach obrazowych. Eksperymenty te pozwolą na wykorzystanie organoidów mózgowych do badania dysfunkcji metabolicznych i rozwojowych oraz mogą dostarczyć kluczowych informacji do analizy patologii neuronalnej chorób mitochondrialnych.
Wprowadzenie
Choroby mitochondrialne reprezentują największą klasę wrodzonych wad metabolizmu1. Są one spowodowane mutacjami genetycznymi zakłócającymi różne procesy mitochondrialne, w tym fosforylację oksydacyjną (OXPHOS)2, tworzenie łańcucha oddechowego, dynamikę mitochondriów oraz transkrypcję lub replikację mitochondrialnego DNA3. Tkanki o zapotrzebowaniu na energię są szczególnie dotknięte dysfunkcją mitochondriów4. W związku z tym u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi zazwyczaj rozwijają się wczesne objawy neurologiczne.
Obecnie nie ma dostępnych me....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Użycie ludzkich iPSC może wymagać zgody etycznej. iPSC użyte w tym badaniu pochodziły od zdrowych osób kontrolnych po lokalnej aprobacie etycznej (#2019-681). Wszystkie procedury hodowli komórkowej muszą być wykonywane pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych, dokładnie dezynfekując wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne przed przeniesieniem pod kaptur. Ludzkie iPSC wykorzystywane do różnicowania powinny mieć liczbę pasaży poniżej 50, aby uniknąć potencjalnych aberracji genomowych, które mogą wystąpić podczas ekstensywnej hodowli. Stan pluripotencjalny komórek powinien zostać zweryfikowany przed generacją organoidów, na przykład poprzez monitorowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwia stabilną generację okrągłych organoidów (Rysunek 1A). Wygenerowane organoidy zawierają dojrzałe neurony, które można zwizualizować przy użyciu markerów białkowych specyficznych dla aksonów (SMI312) i dendrytów (białko MAP2 - microtubule-associated protein 2) (Rysunek 1B). Dojrzałe organoidy zawierają nie tylko komórki neuronalne (MAP2-dodatnie), ale również kom.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano powtarzalne wytwarzanie ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich zastosowanie do modelowania chorób mitochondrialnych. Opisany tu protokół jest modyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej pracy20. Jedną z głównych zalet obecnego protokołu jest to, że nie wymaga on ręcznego osadzania każdego organoidu w matrycy rusztowania. W rzeczywistości roztwór matrycy jest po prostu rozpuszczany w pożywce do hodowli komórkowych. Co więcej, nie ma potrzeby stosowania drog.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Miriam Bünning za wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 do A.P.), Spark i Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH) (fundusze walidacyjne BIH dla A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (grant Leigh Syndrome International Consortium dla A.P.), Szpitala Uniwersyteckiego w Düsseldorfie (Forschungskommission UKD to A.P.) oraz niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (e: Grant dla młodego badacza AZ 031L0211 dla A.P.). Prace w laboratorium C.R.R. były wspierane przez DFG (FOR 2795 "Synapsy w stresie", Ro 2327/13-1).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Oprogramowanie do układu; Edytor grafiki wektorowej | |
| Alexa Fluor 488 osioł anty-świnka | morska Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 osioł anty-myszy | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antymycyna A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anty-β-Tubulina III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Laser argonowy | Melles Griot | Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 488 też jest w porządku | |
| Kwas askorbinowy | Sigma | A92902 | |
| B-27 z witaminą A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% w PBS, przechowuj roztwór w temperaturze -20 & stopni; C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star hodowla komórkowa 6-dołkowa płytka | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy | Gibco | 11905031 | |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy C1 | Nikon Microscope Solutions | Modułowy mikroskop konfokalny System | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, bez czerwieni fenolu, bez LDEV | Składnik Corning | 356231 | Matrix |
| Zestaw do oznaczania proliferacji komórek | CyQUANT Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Anty-kozy Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Osioł anty-mysz Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Osioł anty-królik Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc | Nikon Microscope Solutions | ||
| Pionowy mikroskop szerokokątny Eclipse 90i | Nikon Microscope Solutions | ||
| Mikroskop pionowy Eclipse E 600FN | Nikon Microscope Solutions | ||
| Mikroskop odwrócony Eclipse Ts2 | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Oprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Surowica bydlęca | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Szklana pipeta Pasteura | Marka | 747715 | Odwrócony |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Laser helowo-neonowy | Melles Griot | Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 594 jest w porządku, też | |
| Heparyna | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Inkubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Obraz J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Oprogramowanie do przetwarzania obrazu | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Zamiennik serum do nokautu | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Koherentny | Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 407 też jest w porządku | |
| Systemy synaptyczne | Map2 | nr 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Wirówka | Thermo Scientific | 10325804 | |
| Zestaw do wykrywania MycoAlert MycoAlert | Lonza | # LT07-218 | |
| Suplement N2 | Gibco | 17502-048 | |
| Igła do jednorazowego użytku (23G x 1" TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Oprogramowanie do obrazowania | |
| Oligomycyna A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Wytrząsarka orbitalna Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | Do rysowania bariery hydrofobowej na szkiełkach. |
| Zestaw systemu dysocjacji papainy | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyd | Merck | 818715 | 4% w PBS, roztwór do przechowywania w temperaturze -20 stopni; C |
| Pipeta Pasteura 7 ml | VWR | 612-1681 | z podziałką do 3 ml |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0,75 air DIC N2 ∞/0,17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Suchy mikroskop | |
| Obiektyw Plan Apo VC 60x / 1,40 olej DIC N2 ∞/0,17 WD 0,13 | Nikon Microscope Solutions | Mikroskop immersyjny olejowy Obiektyw | |
| Polistyrenowa szalka Petriego (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polistyrenowa rurka okrągłodenna z nasadką sitkową (5 ml) | Falcon | 352235 | |
| Chlorek potasu | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Jakościowa bibuła filtracyjna | VWR | 516-0813 | |
| Inhibitor skał | Merck | SCM075 | |
| Rotenon | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Ostrza skalpela | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Wodorowęglan sodu | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Chlorek sodu | Roth | 3957 | |
| Sód Podanie diwodorofosforanu | 131965 | ||
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro Accutase | Odczynnik do A1110501 Gibco/StemPro | ||
| Glue Gel | UHU | 63261 | żel adhezyjny |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Strzykawka jednorazowego użytku (1 ml) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| 6-dołkowa | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| ThermoFisher | 51032711 | ||
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0,5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Produkcja zakończona, każdy inny regulowany mikrotom też jest w porządku. | |
| Vibratome Wilkinson Klasyczna żyletka | Wilkinson Miecz Wilkinsona | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 analizator strumienia zewnątrzkomórkowego | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| Test XF DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-dołkowa mikropłytka) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Bibliografia
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
