Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

21 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Streszczenie

Choroby mitochondrialne stanowią największą klasę wrodzonych wad metabolizmu i są obecnie nieuleczalne. Choroby te powodują wady neurorozwojowe, których mechanizmy leżące u podstaw pozostają do wyjaśnienia. Główną przeszkodą jest brak skutecznych modeli podsumowujących wczesne upośledzenie neuronów obserwowane u pacjentów. Postępy w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwiają generowanie trójwymiarowych (3D) organoidów mózgowych, które można wykorzystać do badania wpływu chorób na rozwój i organizację układu nerwowego. Naukowcy, w tym ci autorzy, wprowadzili niedawno organoidy ludzkiego mózgu do modelowania zaburzeń mitochondrialnych. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół solidnego generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich wykorzystania w mitochondrialnym profilowaniu bioenergetycznym i analizach obrazowych. Eksperymenty te pozwolą na wykorzystanie organoidów mózgowych do badania dysfunkcji metabolicznych i rozwojowych oraz mogą dostarczyć kluczowych informacji do analizy patologii neuronalnej chorób mitochondrialnych.

Wprowadzenie

Choroby mitochondrialne reprezentują największą klasę wrodzonych wad metabolizmu1. Są one spowodowane mutacjami genetycznymi zakłócającymi różne procesy mitochondrialne, w tym fosforylację oksydacyjną (OXPHOS)2, tworzenie łańcucha oddechowego, dynamikę mitochondriów oraz transkrypcję lub replikację mitochondrialnego DNA3. Tkanki o zapotrzebowaniu na energię są szczególnie dotknięte dysfunkcją mitochondriów4. W związku z tym u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi zazwyczaj rozwijają się wczesne objawy neurologiczne.

Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia dla dzieci dotkniętych chorobami mitochondrialnymi5. Główną przeszkodą w opracowywaniu leków na choroby mitochondrialne jest brak skutecznych modeli podsumowujących przebieg choroby u ludzi6. Kilka z obecnie badanych modeli zwierzęcych nie wykazuje wad neurologicznych obecnych u pacjentów7. W związku z tym mechanizmy leżące u podstaw patologii neuronalnej chorób mitochondrialnych nadal nie są w pełni poznane.

Ostatnie badania wygenerowały iPSC od pacjentów dotkniętych chorobami mitochondrialnymi i wykorzystały te komórki do uzyskania komórek neuronalnych specyficznych dla pacjenta. Na przykład stwierdzono, że defekty genetyczne związane z chorobą mitochondrialną, zespołem Leigha, powodują aberracje w bioenergetyce komórkowej8,9, synteza białek10 i homeostaza wapnia9,11. Raporty te dostarczyły ważnych wskazówek mechanistycznych na temat upośledzenia neuronów występującego w chorobach mitochondrialnych, torując drogę do odkrycia leków na te nieuleczalne choroby12.

Dwuwymiarowe (2D) kultury jednak nie umożliwiają badania złożoności architektonicznej i regionalnej organizacji organów 3D13. W tym celu wykorzystanie trójwymiarowych organoidów mózgowych pochodzących z specyficznych dla pacjenta iPSCs14 może pozwolić naukowcom na uzyskanie dodatkowych ważnych informacji, a tym samym pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób choroby mitochondrialne wpływają na rozwój i funkcję układu nerwowego15. Badania wykorzystujące organoidy mózgowe pochodzące z iPSC do badania chorób mitochondrialnych zaczynają odkrywać neurorozwojowe komponenty chorób mitochondrialnych.

Organoidy rdzenia kręgowego przenoszące mutacje związane z chorobą mitochondrialną, encefalopatią mitochondrialną, kwasicą mleczanową i zespołem epizodów podobnych do udaru (MELAS), wykazywały wadliwą neurogenezę i opóźnione różnicowanie neuronów ruchowych16. Organoidy korowe pochodzące od pacjentów z chorobą mitochondrialną, zespołem Leigha, wykazywały zmniejszony rozmiar, defekty w wytwarzaniu pączków nabłonka nerwowego i utratę architektury korowej17. Organoidy mózgowe od pacjentów z zespołem Leigha wykazały, że defekty choroby rozpoczynają się na poziomie nerwowych komórek progenitorowych, które nie mogą zaangażować się w metabolizm mitochondrialny, powodując nieprawidłowe rozgałęzienia neuronów i morfogenezę18. W związku z tym neuronalne komórki progenitorowe mogą stanowić komórkowy cel terapeutyczny dla chorób mitochondrialnych, a strategie promujące ich funkcję mitochondrialną mogą wspierać funkcjonalny rozwój układu nerwowego.

Użycie organoidów mózgowych może pomóc odkryć neurorozwojowe składniki chorób mitochondrialnych. Choroby mitochondrialne są głównie uważane za neurodegenerację o wczesnym początku5. Jednak wady neurorozwojowe występują również u pacjentów dotkniętych chorobami mitochondrialnymi, w tym opóźnieniem rozwoju i upośledzeniem funkcji poznawczych19. Specyficzne dla pacjenta organoidy mózgowe mogą pomóc w rozwiązaniu tych aspektów i wyjaśnić, w jaki sposób choroby mitochondrialne mogą wpływać na rozwój ludzkiego mózgu. Dysfunkcja mitochondriów może również odgrywać rolę patogenetyczną w innych, bardziej powszechnych chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona4. W związku z tym wyjaśnienie wpływu defektów mitochondrialnych na rozwój neurologiczny za pomocą organoidów mózgowych może być również pomocne w badaniu tych chorób. W artykule opisano szczegółowy protokół generowania powtarzalnych organoidów mózgowych, które można wykorzystać do prowadzenia modelowania chorób mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Użycie ludzkich iPSC może wymagać zgody etycznej. iPSC użyte w tym badaniu pochodziły od zdrowych osób kontrolnych po lokalnej aprobacie etycznej (#2019-681). Wszystkie procedury hodowli komórkowej muszą być wykonywane pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych, dokładnie dezynfekując wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne przed przeniesieniem pod kaptur. Ludzkie iPSC wykorzystywane do różnicowania powinny mieć liczbę pasaży poniżej 50, aby uniknąć potencjalnych aberracji genomowych, które mogą wystąpić podczas ekstensywnej hodowli. Stan pluripotencjalny komórek powinien zostać zweryfikowany przed generacją organoidów, na przykład poprzez monitorowanie ekspresji markerów związanych z pluripotencją, takich jak NANOG lub OCT4. Testy na obecność mykoplazmy powinny być wykonywane co tydzień, aby upewnić się, że hodowle są wolne od mykoplazmy.

1. Generowanie organoidów mózgowych

  1. Posiew ludzkich komórek iPS
    1. Hodowla ludzkich komórek iPS w warunkach wolnych od karmienia w pożywce iPSC (patrz tabela materiałów) na powlekanych płytkach 6-dołkowych i przechowywanie ich w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Przenoszenie komórek zasilających może utrudniać różnicowanie organoidów. Przejdź komórki co najmniej raz w warunkach bez karmienia.
    2. Przejście iPSC przy 80% konfluencji przy użyciu bezenzymatycznego podłoża detagencyjnego w proporcjach od 1:4 do 1:12. Aby zwiększyć przeżywalność komórek, dodaj 10 μM inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (Y27632) po każdym rozszczepieniu.
  2. Dysocjacja iPSC (80% zbiegu) - Dzień 0.
    1. Przygotować pożywkę do różnicowania kory mózgowej I (CDMI) (Tabela 1). Podgrzej pożywkę CDMI w temperaturze pokojowej (22-25 °C) przed dodaniem jej do komórek.
    2. Umyj studzienki zawierające iPSC solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń.
    3. Dodać 500 μl wstępnie podgrzanego odczynnika A (tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki się oderwały.
    4. Dodaj 1 ml pożywki iPSC do rozcieńczenia odczynnika A, aby zneutralizować jego aktywność.
    5. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl rozdzielić komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    6. Delikatnie odwirować iPSC przy sile 125 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
    7. Ostrożnie zassać supernatant, aby uniknąć zakłócenia osadu komórkowego.
    8. Zawiesić osad w 1 ml CDMI w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i policzyć liczbę komórek.
    9. Przygotować podłoże wysiewające z 9 000 iPSC na 100 μL w CDMI uzupełnionym 20 μM inhibitorem ROCK, 3 μM inhibitorem WNT-kateniny (IWR1) i 5 μM SB431542.
    10. Dodać 100 μl podłoża siewnego na dołek do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
    11. Przechowywać płytkę w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Generowanie neurosfery
    1. W pierwszym dniu obserwuj, że tworzą się okrągłe agregaty komórkowe (neurosfery) z określonymi gładkimi granicami. Zwróć uwagę na martwe komórki wokół agregatów. Kontynuować hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. W dniu 3 porusz płytkę, stukając trzykrotnie w boki, aby odłączyć martwe komórki.
    3. Do każdego dołka dodać 100 μl CDMI uzupełnionego 20 μM inhibitorem ROCK, 3 μM IWR1 i 5 μM SB431542.
    4. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. W dniu 6 ostrożnie usunąć 80 μl pożywki sklarowanej nad osadem z każdej studzienki. Unikaj dotykania dna studni.
    6. Do każdej studzienki dodać 100 μl CDMI uzupełnionego 3 μM IWR1 i 5 μM SB431542. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    7. Powtarzaj kroki 5 i 6 co 3 dni aż do 18 dnia.
  4. Transfer neurosfer
    1. W dniu 18 przygotuj pożywkę do różnicowania kory mózgowej II (CDMII) (Tabela 1) i dodaj 10 ml do 100-milimetrowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie.
    2. Użyj pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką, aby przenieść okrągłe neurosfery z płytki 96-dołkowej na 100-milimetrową płytkę do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie.
      UWAGA: Bądź delikatny, aby uniknąć uszkodzenia neurosfer, upewniając się, że otwór końcówki jest wystarczająco szeroki i że agregaty nie są zasysane zbyt szybko.
    3. Usunąć 5 ml pożywki z płytki zawierającej neurosfery i dodać 5 ml świeżego CDMII.
      UWAGA: Ta procedura pomaga zmniejszyć ilość pożywki CDMI, która mogła zostać przeniesiona z transferu neurosfer.
    4. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Następnego dnia należy przeprowadzić oględziny neurosfer. Zwiększ prędkość wytrząsarki orbitalnej, jeśli neurosfery są zlepione ze sobą lub przymocowane do dna płytki.
    5. Co 3 dni ostrożnie odsysać pożywkę sklarowaną nad osadem i zastąpić ją świeżą CDMII. Pozostaw niewielką ilość podłoża, aby zapobiec wysychaniu neurosfer.
    6. W 35 dniu należy przygotować podłoże do różnicowania kory mózgowej III (CDMIII) (Tabela 1).
      UWAGA: Składnik matrycy należy rozpuścić w zimnym CDMIII.
    7. Odessać pożywkę z płytki i dodać 10 ml zimnego CDMIII.
      UWAGA: Bardziej efektywne jest użycie zimnego podłoża, aby składnik matrycy mógł pokryć organoidy bez tworzenia grudek.
    8. Po zmianie pożywki umieścić płytkę z powrotem na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Zmieniaj podłoże co 3-5 dni w zależności od tempa wzrostu, na co wskazuje kolor podłoża.
    10. W 70 dniu należy przygotować IV ośrodek różnicowania korowego (CDMIV) (Tabela 1). Używaj pożywki CDMIV aż do osiągnięcia pożądanego wieku organoidów. W tym okresie należy przechowywać płytkę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 70 obr./min w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C i 5% CO2 ).
    11. Zmieniaj podłoże co 3-5 dni, w zależności od tempa wzrostu.

2. Barwienie immunologiczne organoidów mózgowych

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) i umieścić go pod kapturem bezpieczeństwa.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić środki ochrony osobistej.
    2. Zbierz organoidy mózgowe i delikatnie przenieś je końcówką plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml na 6-dołkową płytkę wypełnioną PFA.
      UWAGA: Użyj organoidów starszych niż 40 dni, aby umożliwić wizualizację struktur o większej złożoności komórkowej.
    3. Przechowywać organoidy w roztworze PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie usunąć PFA za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml i trzykrotnie umyć utrwalone organoidy za pomocą PBS.
    5. Utrwalone organoidy należy przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS do czasu dalszego użycia.
  2. Przygotowanie wycinków organoidów mózgowych
    1. Przygotuj 3% roztwór agaru i powoli podgrzewaj, aż do upłynnienia.
    2. Umieść formę (odcięty koniec strzykawki o pojemności 10 ml) na kawałku chłonnej bibuły filtracyjnej (gładką stroną do góry). Umieść na nim kroplę agaru.
    3. Szybko wyjmij pojedynczy organoid z płytki 6-dołkowej za pomocą szpatułki i usuń nadmiar PBS za pomocą bibuły filtracyjnej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać organoidu bezpośrednio bibułą filtracyjną.
    4. Umieść organoid na kropelce agaru.
    5. Powtórz tę procedurę z maksymalnie trzema organoidami.
      UWAGA: Pracuj szybko, aby uniknąć zestalenia się agaru na tym etapie.
    6. Ponownie napełnij formę agarem, aż wszystkie organoidy zostaną całkowicie pokryte.
    7. Poczekaj, aż agar zacznie krzepnąć, a następnie delikatnie przenieś całą formę zawierającą organoidy, w tym chłonną bibułę filtracyjną, na element chłodzący.
      UWAGA: Jeśli element chłodzący jest niedostępny, należy przechowywać organoidy przez kilka minut w lodówce w temperaturze 4 °C.
    8. W międzyczasie przygotuj się do procedury krojenia: umieść żyletkę (oczyszczoną acetonem i umytą wodą podwójnie destylowaną) w uchwycie wibratomu, zamontuj na wannie i napełnij ją PBS.
    9. Usuń formę z (zestalonego) agaru i za pomocą skalpela przytnij ją, aby uformować kostkę.
    10. Połączyć kostkę agarową zawierającą organoidy na płytce nośnej wibratomu za pomocą żelu adhezyjnego (patrz Tabela Materiałów) i umieścić ją w kąpieli zawierającej PBS.
    11. Dostosuj wibratom (patrz Tabela materiałów), aby ciąć plastry o grubości 150 μm.
      UWAGA: Ustawienia wibratomu (odpowiedni kąt, amplituda, częstotliwość i prędkość ostrza) mogą być podobne do tych używanych do krojenia utrwalonej tkanki mózgowej pochodzącej od wczesnych zwierząt postnatalnych. Jednak idealne ustawienia zależą w dużej mierze od rodzaju wibratomu i muszą być określone w pierwszym kroku, aby zapobiec zniekształceniu, a nawet rozerwaniu tkanki podczas cięcia.
    12. Rozpocznij procedurę cięcia. Użyj szklanej pipety lub szpatułki, aby delikatnie przenieść każdy świeżo pokrojony plasterek do 24-dołkowej płytki wypełnionej PBS.
    13. Przechowywać płytkę zawierającą plastry w temperaturze 4 °C (do kilku dni) do czasu dalszej obróbki.
    14. Przenieść plastry z płytki za pomocą szklanej pipety lub szpatułki na szkiełka mikroskopowe. Użyj co najmniej 2 plasterków na szkiełko.
    15. Ostrożnie usunąć agar i nadmiar PBS za pomocą strzykawki.
    16. Pozostaw plastry do wyschnięcia, aż przylgną do szkiełek.
      UWAGA: Chociaż szkiełka mikroskopowe mogą być przechowywane w plastikowych komorach wypełnionych PBS w temperaturze 4 °C, należy je zabarwić jak najszybciej po procedurze krojenia.
  3. Barwienie immunohistochemiczne
    1. Przygotować roztwór blokujący (Tabela 1).
    2. Użyj pisaka PAP, aby narysować hydrofobową obwódkę wokół plasterków na szkiełku, aby pomóc utrzymać wszystkie roztwory na szkiełkach.
    3. Ostrożnie dodać roztwór blokujący na szkiełko i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (22-25 °C). Aby uniknąć zniszczenia tkanki, nie dodawaj roztworu bezpośrednio na plastry.
    4. Odessać roztwór blokujący i zastosować pożądane przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym.
    5. Inkubować szkiełko przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C.
    6. Przepłukać szkiełko trzykrotnie 1x PBS przez 10 minut każde.
    7. Inkubować plastry ze specyficznym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym i wykonywać barwienie Hoechsta (1:2,500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Pamiętaj o przeprowadzeniu kontroli ujemnych w celu potwierdzenia, że nie ma niespecyficznego wiązania lub autofluorescencji.
    8. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 10 minut w ciemności.
    9. Dodaj jedną kroplę podłoża montażowego do plasterka, umieść szkiełko nakrywkowe na krawędzi kropli i powoli połóż szkiełko nakrywkowe w kierunku plasterka, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
    10. Pozostaw szkiełko na noc w temperaturze pokojowej. Nałóż lakier do paznokci na brzeg szkiełka nakrywkowego, aby dodatkowo uszczelnić szkiełko. W przypadku długotrwałego przechowywania przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Dokumentacja barwienia
    1. Aby zeskanować duże obrazy w celu zszycia, użyj zmotoryzowanego, pionowego mikroskopu szerokokątnego, wyposażonego w (szczegółowe informacje znajduje się w tabeli materiałów) wysokiej jakości obiektyw; zestaw filtrów DAPI (np. wzbudzenie (EX): 340-380 nm, zwierciadło dichroiczne (DM): 400 nm, filtr barierowy (BA): 435-485 nm); zestaw filtrów izotiocyjanianu fluoresceiny (np. EX: 465–495 nm, DM: 505 nm, BA: 515–555 nm); Zestaw filtrów Alexa594 (np. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); aparat cyfrowy; Wysokowydajne oprogramowanie do akwizycji pozwalające na automatyzację ściegów i operacji układania w stosy.
    2. Do obsługi obrazu należy użyć programu do przetwarzania obrazu, który może generować 8-bitowe pliki tif, przycinać ściegi, dostosowywać kontrast i jasność, scalać kanały (np. niebieski, zielony i czerwony) oraz dodawać paski skali.
    3. Do skanowania szczegółów należy użyć zmotoryzowanego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w wysokiej jakości obiektyw, laser UV (np. 408 nm), laser argonowy (np.: 488 nm), laser helowo-neonowy (np.: 543), oprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego.
    4. Do obsługi szczegółów obrazu należy użyć programu do przetwarzania obrazu, który może generować projekcje konfokalnych stosów z o maksymalnej intensywności (np. przekroje optyczne po 0,6 μm każdy), generować 8-bitowe pliki tif, dostosowywać kontrast i jasność, łączyć kanały (np. niebieski, zielony i czerwony), dodawać paski skali.
    5. Użyj edytora graficznego, aby ułożyć figury.

3. Bioenergetyczne profilowanie organoidów mózgowych

  1. Przygotowanie organoidów do profilowania bioenergetycznego
    1. Przygotować roztwór papainy i DNazy zgodnie z protokołem producenta.
    2. Przenieś 3-5 organoidów na płytkę 6-dołkową. Umyj je dwa razy podgrzanym PBS.
    3. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego aktywowanego roztworu papainy zawierającego DNazę. Za pomocą ostrza pokrój organoidy na małe kawałki.
    4. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 27 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C, 5% CO2 ) i inkubować przez 15-20 min.
      UWAGA: Czas inkubacji zależy od stadium organoidu. Organoidy we wczesnym stadium mogą być używane w takiej postaci, w jakiej są. W przypadku organoidów starszych niż 3 miesiące zaleca się pokrojenie organoidów na 2-3 części przed dysocjacją i inkubację kawałków z prędkością kołysania ustawioną na 27 obr./min przez 15-20 min w temperaturze 37 °C. Ta procedura może pomóc w usunięciu tkanki martwiczej, która może być obecna w organoidach w późniejszym stadium.
    5. Zebrać strawione tkanki do probówki o pojemności 15 ml i dodać 5 ml pożywki do hodowli organoidów CDMIV (Tabela 1).
    6. Rozetnij tkankę plastikową pipetą o pojemności 10 ml, pipetując w górę i w dół 10-15 razy. Pozwól, aby niezdysocjowana tkanka osiadła na dnie probówki.
    7. Ostrożnie przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml, unikając wszelkich kawałków niezdysocjowanej tkanki. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm (np. polistyrenowe rurki okrągłodenne z nasadkami do sitka komórkowego).
    8. Granulować komórki, odwirowując przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Oceń liczbę komórek i jakość za pomocą błękitu trypanowego.
    10. Umieść żądaną liczbę komórek (~ 20 000 / dołek) na powlekanych 96-dołkowych mikropłytkach. Zmień pożywkę 6-8 godzin po posiewie na pożywkę neuronalną (Tabela 1).
    11. Inkubować powlekaną 96-dołkową mikropłytkę w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ) przez 4 dni.
  2. Profilowanie bioenergetyczne
    1. W 3 dniu po ponownym posianiu zdysocjowanych komórek dodaj 200 μl roztworu kalibracyjnego do każdej studzienki dolnej części 96-dołkowej mikropłytki i umieść górny zielony wkład czujnika na uwodnionej mikropłytce.
      UWAGA: Umieść wkład czujnika na wierzchu mikropłytki we właściwej orientacji i upewnij się, że roztwór kalibru obejmuje wszystkie czujniki.
    2. Uwodnioną 96-dołkową mikropłytkę inkubować w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Włączyć analizator, aby przyrząd ustabilizował się w temperaturze 37 °C przez noc.
    4. W 4 dniu po ponownym posiewie należy sprawdzić oddzieloną kulturę organoidów na 96-dołkowej mikropłytce pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki wyglądają jak zlewająca się monowarstwa.
    5. Przygotować pożywkę do oznaczania (tabela 1).
    6. Usuń pożywkę neuronalną ze wszystkich studzienek za pomocą pipety, nie dotykając dna studzienki, aby zapobiec uszkodzeniu komórek. Alternatywnie ostrożnie odwróć całą płytkę, a następnie wysusz ją na czystym papierze. Pracuj szybko, aby uniknąć śmierci komórki.
    7. Umyj komórki dwukrotnie podgrzanymi 200 μl pożywki testowej. Dodać pożywkę testową do końcowej objętości 180 μl na studzienkę. Inkubować 96-dołkową mikropłytkę w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    8. Przygotować 10 μM roztwory inhibitorów mitochondriów w pożywce testowej. Należy pamiętać, że końcowe stężenie po wstrzyknięciu wynosi 1 μM.
    9. Załaduj wkład czujnika umieszczony w uwodnionej mikropłytce 10 x roztworami inhibitorów mitochondriów.
      1. Dodać 18 μl inhibitora mitochondriów 1 do portu A.
      2. Dodać 19,8 μl inhibitora mitochondrialnego 2 do portu B.
      3. Dodaj 21,6 μl inhibitora mitochondriów 2 do portu C.
      4. Dodać 23,4 μl inhibitora mitochondrialnego 3 do portu D.
    10. Umieścić załadowany wkład na uwodnioną mikropłytkę w inkubatorze niezawierającymCO2 w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia testu.
    11. Skonfiguruj uruchomiony protokół w oprogramowaniu urządzenia (Tabela 2).
    12. Naciśnij przycisk START. Wyjmij załadowany wkład z inkubatora bezCO2 i umieść go w analizatorze w celu kalibracji.
      UWAGA: Upewnij się, że płytka jest włożona we właściwej orientacji i bez pokrywy.
    13. Po zakończeniu etapu kalibracji wyjmij płytkę kalibracyjną. Pobrać 96-dołkową mikropłytkę z inkubatora innego niż CO2 i umieścić ją w analizatorze. Kliknij KONTYNUUJ, aby rozpocząć pomiary.
    14. Po zakończeniu cyklu należy wyjąć z analizatora 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórkowej i zebrać pożywkę ze wszystkich studzienek, nie naruszając komórek.
      UWAGA: Pożywka może być przechowywana w temperaturze -20 °C i wykorzystana później do pomiaru ilości mleczanu uwalnianego przez komórki w pożywce przy użyciu odpowiedniego zestawu do oznaczania mleczanu.
    15. Umyj komórki 200 μl 1x PBS w każdym dołku.
    16. Po wyjęciu PBS zamrozić płytkę w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zamrożona płytka może być używana do ilościowego oznaczania komórek, białek lub DNA w każdym dołku mikropłytki. Ta kwantyfikacja będzie potrzebna do normalizacji uzyskanych wskaźników bioenergetycznych. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi testów ilościowych komórek, białek lub DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwia stabilną generację okrągłych organoidów (Rysunek 1A). Wygenerowane organoidy zawierają dojrzałe neurony, które można zwizualizować przy użyciu markerów białkowych specyficznych dla aksonów (SMI312) i dendrytów (białko MAP2 - microtubule-associated protein 2) (Rysunek 1B). Dojrzałe organoidy zawierają nie tylko komórki neuronalne (MAP2-dodatnie), ale również kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano powtarzalne wytwarzanie ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich zastosowanie do modelowania chorób mitochondrialnych. Opisany tu protokół jest modyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej pracy20. Jedną z głównych zalet obecnego protokołu jest to, że nie wymaga on ręcznego osadzania każdego organoidu w matrycy rusztowania. W rzeczywistości roztwór matrycy jest po prostu rozpuszczany w pożywce do hodowli komórkowych. Co więcej, nie ma potrzeby stosowania drog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Miriam Bünning za wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 do A.P.), Spark i Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH) (fundusze walidacyjne BIH dla A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (grant Leigh Syndrome International Consortium dla A.P.), Szpitala Uniwersyteckiego w Düsseldorfie (Forschungskommission UKD to A.P.) oraz niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (e: Grant dla młodego badacza AZ 031L0211 dla A.P.). Prace w laboratorium C.R.R. były wspierane przez DFG (FOR 2795 "Synapsy w stresie", Ro 2327/13-1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdOprogramowanie do układu; Edytor grafiki wektorowej
Alexa Fluor 488 osioł anty-świnkamorska Sigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 osioł anty-myszyThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antymycyna ASigma Aldrich1397-94-0
Anty-β-Tubulina III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Laser argonowyMelles GriotKażdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 488 też jest w porządku
Kwas askorbinowySigmaA92902
B-27 z witaminą AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% w PBS, przechowuj roztwór w temperaturze -20 & stopni; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star hodowla komórkowa 6-dołkowa płytkaGreiner-Bio-One657160
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyGibco11905031
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy C1Nikon Microscope SolutionsModułowy mikroskop konfokalny System
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, bez czerwieni fenolu, bez LDEVSkładnik Corning356231Matrix
Zestaw do oznaczania proliferacji komórekCyQUANT Thermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Anty-kozy Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Osioł anty-mysz Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Osioł anty-królik Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1McNikon Microscope Solutions
Pionowy mikroskop szerokokątny Eclipse 90iNikon Microscope Solutions
Mikroskop pionowy Eclipse E 600FNNikon Microscope Solutions
Mikroskop odwrócony Eclipse Ts2Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsOprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Surowica bydlęcaGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Szklana pipeta PasteuraMarka747715Odwrócony
GlutamaxGibco35050-061
Laser helowo-neonowyMelles GriotKażdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 594 jest w porządku, też
HeparynaMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 InkubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Obraz J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthOprogramowanie do przetwarzania obrazu
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Zamiennik serum do nokautuGibco10828010
Laser (407 nm)KoherentnyKażdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 407 też jest w porządku
Systemy synaptyczneMap2nr 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC medium
Multifuge X3R WirówkaThermo Scientific10325804
Zestaw do wykrywania MycoAlert MycoAlertLonza# LT07-218
Suplement N2Gibco17502-048
Igła do jednorazowego użytku (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonOprogramowanie do obrazowania
Oligomycyna ASigma Aldrich75351
Wytrząsarka orbitalna Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EADo rysowania bariery hydrofobowej na szkiełkach.
Zestaw systemu dysocjacji papainyWorthingtonLK003150
ParaformaldehydMerck8187154% w PBS, roztwór do przechowywania w temperaturze -20 stopni; C
Pipeta Pasteura 7 mlVWR612-1681z podziałką do 3 ml
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0,75 air DIC N2  ∞/0,17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsSuchy mikroskop
Obiektyw Plan Apo VC 60x / 1,40 olej DIC N2 ∞/0,17 WD 0,13Nikon Microscope SolutionsMikroskop immersyjny olejowy Obiektyw
Polistyrenowa szalka Petriego (100 mm)Greiner Bio-One664161
Polistyrenowa rurka okrągłodenna z nasadką sitkową (5 ml)Falcon352235
Chlorek potasuRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Jakościowa bibuła filtracyjnaVWR516-0813
Inhibitor skałMerckSCM075
RotenonSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Ostrza skalpelaHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Wodorowęglan soduMerck/Sigma31437-1kg-M
Chlorek soduRoth3957
Sód Podanie diwodorofosforanu131965
Pirogronian soduGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro AccutaseOdczynnik do A1110501 Gibco/StemPro
Glue GelUHU63261żel adhezyjny
SuperFrost PlusVWR631-0108
Strzykawka jednorazowego użytku (1 ml)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
6-dołkowaSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
ThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0,5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProdukcja zakończona, każdy inny regulowany mikrotom też jest w porządku.
Vibratome Wilkinson Klasyczna żyletkaWilkinson Miecz Wilkinsona70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonist IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 analizator strumienia zewnątrzkomórkowegoSeahorse Bioscience100737-101
Test XF DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96-dołkowa mikropłytka)Seahorse Bioscience102416-100
płodu Super TC Plate 24-dołkowa Sarstedt 83.3922 TC Płytka Kaptur do hodowli tkankowych

Bibliografia

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie iPSCgenerowanie organoidówróżnicowanie korowetworzenie neurosferprofilowanie bioenergetyczneobrazowanie konfokalnetempo zużycia tlenumetabolizm mitochondrialny
Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.