Artykuł metodologiczny

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) umożliwia wizualizację ruchu, podziału i śmierci komórki w rozdzielczości pojedynczej komórki. IVM poprzez chirurgicznie wstawione okienka obrazowania jest szczególnie skuteczne, ponieważ umożliwia obserwację podłużną tej samej tkanki przez kilka dni lub tygodni. Typowe okienka obrazowania składają się ze szklanego szkiełka nakrywkowego w biokompatybilnej metalowej ramce przyszytej do skóry myszy. Okna te mogą zakłócać swobodny ruch myszy, wywoływać silną reakcję zapalną i zawodzić z powodu potłuczonego szkła lub rozdartych szwów, z których każde może wymagać eutanazji. Aby rozwiązać te problemy, opracowano okna do długoterminowego obrazowania narządów jamy brzusznej i gruczołu sutkowego z cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS), optycznie przezroczystego polimeru silikonowego używanego wcześniej do obrazowania czaszki. Okienka te można przykleić bezpośrednio do tkanek, co skraca czas potrzebny na wprowadzenie. PDMS jest elastyczny, co przyczynia się do jego trwałości u myszy w czasie - przetestowano do 35 dni. Obrazowanie podłużne to obrazowanie tego samego obszaru tkanki podczas oddzielnych sesji. Siatka ze stali nierdzewnej została osadzona w oknach, aby zlokalizować ten sam region, umożliwiając wizualizację dynamicznych procesów (takich jak inwolucja gruczołu sutkowego) w tych samych miejscach, w odstępie kilku dni. To silikonowe okienko umożliwiło również monitorowanie pojedynczych rozsianych komórek nowotworowych, które z czasem przekształcają się w mikroprzerzuty. Okna silikonowe użyte w tym badaniu są łatwiejsze do włożenia niż okna szklane z metalową ramą i powodują ograniczone stan zapalny obrazowanych tkanek. Co więcej, wbudowane siatki pozwalają na proste śledzenie tego samego regionu tkanki w powtarzających się sesjach obrazowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia przyżyciowa (IVM), obrazowanie tkanek u znieczulonych zwierząt, oferuje wgląd w dynamikę fizjologicznych i patologicznych zdarzeń w rozdzielczości komórkowej w nienaruszonych tkankach. Zastosowania tej techniki są bardzo różne, ale IVM odegrał kluczową rolę w dziedzinie biologii nowotworów, pomagając wyjaśnić, w jaki sposób komórki rakowe atakują tkanki i dają przerzuty, wchodzą w interakcje z otaczającym mikrośrodowiskiem i reagują na leki1,2,3. Ponadto IVM odegrało kluczową rolę w pogłębieniu wiedzy na temat złożonych mechanizmów rządzących reakcją immunologiczn....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi chirurgicznymi laboratorium Cold Spring Harbor i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Cold Spring Harbor.

1. Odlewanie okna silikonowego

  1. Przygotować polimer silikonowy (PDMS), mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v).
  2. Odlej okno, umieszczając niewielką ilość PDMS na sterylnej, gładkiej powierzchni i dostosuj stosunek objętości do powierzchni do żądanej grubości.
    UWAGA: Użycie 200 mg roztworu polimeru do uzyskania okręgu o średnicy 22 mm na pokrywi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie przyżyciowe za pomocą okien obrazowania może być używane do obserwacji, śledzenia i ilościowego określania szerokiego wachlarza zdarzeń komórkowych i molekularnych w rozdzielczości pojedynczej komórki przez okres od kilku godzin do tygodni. Idealne cechy okna obrazowania obejmują: a) ograniczony wpływ na samopoczucie myszy i fizjologię tkanki; b) trwałość; c) prostota wstawiania; oraz d) wyraźne punkty orientacyjne do wielokrotnego obrazowania tego samego regionu. Rezultatem jest wszechstronne, obojętne silik.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okienka obrazowania przyżyciowego są ważnymi narzędziami do bezpośredniej wizualizacji procesów fizjologicznych i patologicznych w rozdzielczości komórkowej w miarę ich rozwoju w czasie. Nowatorska procedura opisana w przypadku odlewania i wstawiania elastycznych, silikonowych okienek obrazowania u myszy przezwycięża niektóre z najczęstszych problemów związanych z obecnie stosowanymi okienkami obrazowania (wysięk, pękanie i zakłócenia normalnej mobilności), zapewnia dodatkowe bezpieczeństwo myszy i zwiększa dostępność te.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. jest członkiem rady doradczej ds. badań nad brensocatibem w firmie Insmed, Inc.; członek naukowej rady doradczej Vividion Therapeutics, Inc.; konsultant dla Protalix, Inc.; i posiada udziały w Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. jest współzałożycielem Mestag Therapeutics, zasiada w naukowej radzie doradczej i posiada udziały w Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology i Cygnal Therapeutics. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Robowi Eifertowi za pomoc w projektowaniu i optymalizacji wycinanych laserowo siatek ze stali nierdzewnej. Praca ta była wspierana przez CSHL Cancer Center (P30-CA045508) oraz fundusze na M.E. z National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 i 5P01CA013106-49); CSHL i Northwell Health; Fundacja Rodziny Thompsonów; Przepłyń Amerykę; oraz grant Fundacji Simonsa dla CSHL. M.S. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) oraz National Cancer Institute of the NIH pod numerem nagrody 1F30CA253993-01. L.M. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Fundacji Jamesa S. Mc....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taśma chirurgiczna 3M Medipore Soft Cloth3M70200770819
Szew jedwabny 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon Myszy N267H
ACTB-ECFPJackson Laboratory22974
Zestaw substratów AEC, peroksydaza (HRP), (3-amino-9-etylokarbazol)Laboratoria wektorowe SK-4200
Waciki nasączone alkoholemBD 
System anestezjologicznyProdukty do obrazowania molekularnego Co.
Oprogramowanie i czujniki Acqknowledge BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine w sprayu LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) myszyJackson Laboratory18549
C57BL/6J myszyJackson Laboratory664
CD45 Przeciwciało monoklonalne (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 PrzeciwciałoAbcamab125212
Gąbki z gazy Curity Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Osioł Anty-Królik IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Osioł Anty-Szczurzy IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silikonowa kapsułka Przezroczystamikroskopia elektronowa Sciences24236-10Dwuskładnikowa, proporcje mieszania 10:1
Okrągłe szkło osłonowe, średnica 8 mm, grubość # 1,5 Mikroskopia elektronowa Nauki72296-08
Drukarka 3D Ender-3 ProShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Podgrzewany koc dalekiej podczerwieniKent ScientificRT-0520
Bloker receptora FcInnovex BiosciencesNB309
Pakiethttps://imagej.net/software/fiji/
Karboksylan FluoroSpheres, 0,04 i mikro; m, żółto-zielony (505/515)InvitrogenF8795
System bramkowania:BIOPAC Systems Inc.Komponenty razem umożliwiają monitorowanie parametrów życiowych myszy podczas obrazowania i bramkowania akwizycji obrazu podczas oddychania myszy. Wszystkie zostały pozyskane z systemów BIOPAC.
Oprogramowanie Acqknowledge ACK100W, ACK100M
Moduł wzmacniacza różnicowego, seria C DA100C
Podwójny system bramkowania dla małych zwierzątDTU200 
MP160 dla Windows - SystemMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; Numer katalogowy: 015000 
Podkładka dociskowa TSD110 
GelfoamPfizer9031508Wchłanialna gąbka żelatynowa
Hartowane drobne nożyczkiFine Science Tools14090-11Dwie pary; stal nierdzewna, ostro
końcówki, końcówka prosta, krawędź tnąca 26 mm
, długość 11 cm
Ludzka/mysz Myeloperoksydaza/przeciwciało MPOR& D SystemsAF3667
Sterylizator gorących kulekFine Science Tools18000-45Włącz około 30 min
przed użyciem; sterylizuj narzędzia w >200
° C dla 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Strzykawki insulinowe z ultracienką igłą BD 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurane (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP myszywww.mmrrc.org012039-MU
Mikrokleszcze preparacyjneRobozRS-5135Ząbkowane, lekka krzywizna, szerokość końcówki 0,8 mm; długość 4"
Mikro kleszczyki preparacyjneRobozRS-51531 x 2 zęby, lekka krzywa, 0,8 mm szerokość końcówki
, długość 4"
MTS Systemy MTS MiniBionix II 808MTSSerwohydrauliczna maszyna do badania materiałów
Neutrophil Elastase 680 FAST sondaPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
OxygenGeneral Welding Supply Corp. (Ogólne zaopatrzenie spawalnicze tlenu)
Filament kwasu polimlekowegoHatchboxo średnicy 1,75 mm
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Maść okulistyczna PuralubeDechra NDC17033-211-38
Klipsy do nawijania Reflex 7Roboz SurgicalRS-9255
Siatka ze stali nierdzewnejSiatka FotofabOne ma średnicę 0,200 cala, w sumie 52 pojedyncze kwadraty siatki o wymiarach 0,016 x 0,016 cala. Między każdym kwadratem jest 0,003 cala przestrzeni.   
Sterylne płytki do hodowli tkankowych poddane obróbce powierzchniowejFisher ScientificFB012929Pokrywka używana jako powierzchnia utwardzająca do okien obrazowania
Mikroskop wielofotonowy Trim Scope LaVision BioTecwykonano na pionowym mikroskopie 2-fotonowym (Trimscope, LaVision BioTec) wyposażonym w dwa lasery Ti:Sapphire (Mai Tai i InSight, Spectra-Physics) oraz optyczny oscylator parametryczny. Następujące długoprzepustowe dichroiczne rozdzielacze wiązki (Chroma) zostały użyte do skierowania sygnału w kierunku czterech lamp fotomultiplerowych:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR Micro cover glassVWR48404-453
326895 przetwarzania obrazowania Fidżi analiz Obrazowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia witalnasilikonowe okno obrazuj ceobrazowanie pod u neokno z polidimetylosiloksanuobrazowanie gruczo u piersiowegoobrazowanie narz d w brzusznychledzenie kom rek odporno ciowychobrazowanie kom rek nowotworowychchirurgiczne wszczepienie oknawizualizacja tkanek

Powiązane artykuły