Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM) umożliwia wizualizację ruchu, podziału i śmierci komórki w rozdzielczości pojedynczej komórki. IVM poprzez chirurgicznie wstawione okienka obrazowania jest szczególnie skuteczne, ponieważ umożliwia obserwację podłużną tej samej tkanki przez kilka dni lub tygodni. Typowe okienka obrazowania składają się ze szklanego szkiełka nakrywkowego w biokompatybilnej metalowej ramce przyszytej do skóry myszy. Okna te mogą zakłócać swobodny ruch myszy, wywoływać silną reakcję zapalną i zawodzić z powodu potłuczonego szkła lub rozdartych szwów, z których każde może wymagać eutanazji. Aby rozwiązać te problemy, opracowano okna do długoterminowego obrazowania narządów jamy brzusznej i gruczołu sutkowego z cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS), optycznie przezroczystego polimeru silikonowego używanego wcześniej do obrazowania czaszki. Okienka te można przykleić bezpośrednio do tkanek, co skraca czas potrzebny na wprowadzenie. PDMS jest elastyczny, co przyczynia się do jego trwałości u myszy w czasie - przetestowano do 35 dni. Obrazowanie podłużne to obrazowanie tego samego obszaru tkanki podczas oddzielnych sesji. Siatka ze stali nierdzewnej została osadzona w oknach, aby zlokalizować ten sam region, umożliwiając wizualizację dynamicznych procesów (takich jak inwolucja gruczołu sutkowego) w tych samych miejscach, w odstępie kilku dni. To silikonowe okienko umożliwiło również monitorowanie pojedynczych rozsianych komórek nowotworowych, które z czasem przekształcają się w mikroprzerzuty. Okna silikonowe użyte w tym badaniu są łatwiejsze do włożenia niż okna szklane z metalową ramą i powodują ograniczone stan zapalny obrazowanych tkanek. Co więcej, wbudowane siatki pozwalają na proste śledzenie tego samego regionu tkanki w powtarzających się sesjach obrazowania.
Wprowadzenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM), obrazowanie tkanek u znieczulonych zwierząt, oferuje wgląd w dynamikę fizjologicznych i patologicznych zdarzeń w rozdzielczości komórkowej w nienaruszonych tkankach. Zastosowania tej techniki są bardzo różne, ale IVM odegrał kluczową rolę w dziedzinie biologii nowotworów, pomagając wyjaśnić, w jaki sposób komórki rakowe atakują tkanki i dają przerzuty, wchodzą w interakcje z otaczającym mikrośrodowiskiem i reagują na leki1,2,3. Ponadto IVM odegrało kluczową rolę w pogłębieniu wiedzy na temat złożonych mechanizmów rządzących reakcją immunologiczn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi chirurgicznymi laboratorium Cold Spring Harbor i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Cold Spring Harbor.
1. Odlewanie okna silikonowego
- Przygotować polimer silikonowy (PDMS), mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v).
- Odlej okno, umieszczając niewielką ilość PDMS na sterylnej, gładkiej powierzchni i dostosuj stosunek objętości do powierzchni do żądanej grubości.
UWAGA: Użycie 200 mg roztworu polimeru do uzyskania okręgu o średnicy 22 mm na pokrywi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazowanie intravitalne za pomocą okien obrazujących może być wykorzystywane do obserwacji, śledzenia i ilościowego określania szerokiego zakresu zdarzeń komórkowych i molekularnych z rozdzielczością pojedynczych komórek w okresie od kilku godzin do kilku tygodni. Idealne cechy okna obrazującego obejmują: a) ograniczony wpływ na dobrostan myszy i fizjologię tkanki; b) trwałość; c) prostotę implantacji; oraz d) wyraźne punkty orientacyjne umożliwiające powtarzalne obrazowanie tego samego obszaru. Wynikiem jest wszechstro.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Okienka obrazowania przyżyciowego są ważnymi narzędziami do bezpośredniej wizualizacji procesów fizjologicznych i patologicznych w rozdzielczości komórkowej w miarę ich rozwoju w czasie. Nowatorska procedura opisana w przypadku odlewania i wstawiania elastycznych, silikonowych okienek obrazowania u myszy przezwycięża niektóre z najczęstszych problemów związanych z obecnie stosowanymi okienkami obrazowania (wysięk, pękanie i zakłócenia normalnej mobilności), zapewnia dodatkowe bezpieczeństwo myszy i zwiększa dostępność te.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
M.E. jest członkiem rady doradczej ds. badań nad brensocatibem w firmie Insmed, Inc.; członek naukowej rady doradczej Vividion Therapeutics, Inc.; konsultant dla Protalix, Inc.; i posiada udziały w Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. jest współzałożycielem Mestag Therapeutics, zasiada w naukowej radzie doradczej i posiada udziały w Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology i Cygnal Therapeutics. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Robowi Eifertowi za pomoc w projektowaniu i optymalizacji wycinanych laserowo siatek ze stali nierdzewnej. Praca ta była wspierana przez CSHL Cancer Center (P30-CA045508) oraz fundusze na M.E. z National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 i 5P01CA013106-49); CSHL i Northwell Health; Fundacja Rodziny Thompsonów; Przepłyń Amerykę; oraz grant Fundacji Simonsa dla CSHL. M.S. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) oraz National Cancer Institute of the NIH pod numerem nagrody 1F30CA253993-01. L.M. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Fundacji Jamesa S. Mc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Taśma chirurgiczna 3M Medipore Soft Cloth | 3M | 70200770819 | |
| Szew jedwabny 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | Myszy N267H | |
| ACTB-ECFP | Jackson Laboratory | 22974 | |
| Zestaw substratów AEC, peroksydaza (HRP), (3-amino-9-etylokarbazol) | Laboratoria wektorowe | SK-4200 | |
| Waciki nasączone alkoholem | BD | ||
| System anestezjologiczny | Produkty do obrazowania molekularnego Co. | ||
| Oprogramowanie i czujniki Acqknowledge | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine w sprayu | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) myszy | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J myszy | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Przeciwciało monoklonalne (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Przeciwciało | Abcam | ab125212 | |
| Gąbki z gazy Curity | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Osioł Anty-Królik IgG H& L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Osioł Anty-Szczurzy IgG H& L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silikonowa kapsułka Przezroczysta | mikroskopia elektronowa Sciences | 24236-10 | Dwuskładnikowa, proporcje mieszania 10:1 |
| Okrągłe szkło osłonowe, średnica 8 mm, grubość # 1,5 | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72296-08 | |
| Drukarka 3D Ender-3 Pro | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Podgrzewany koc dalekiej podczerwieni | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Bloker receptora Fc | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Pakiet | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Karboksylan FluoroSpheres, 0,04 i mikro; m, żółto-zielony (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| System bramkowania: | BIOPAC Systems Inc. | Komponenty razem umożliwiają monitorowanie parametrów życiowych myszy podczas obrazowania i bramkowania akwizycji obrazu podczas oddychania myszy. Wszystkie zostały pozyskane z systemów BIOPAC. | |
| Oprogramowanie Acqknowledge | ACK100W, ACK100M | ||
| Moduł wzmacniacza różnicowego, seria C | DA100C | ||
| Podwójny system bramkowania dla małych zwierząt | DTU200 | ||
| MP160 dla Windows - System | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V; Numer katalogowy: 015000 | ||
| Podkładka dociskowa | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Wchłanialna gąbka żelatynowa |
| Hartowane drobne nożyczki | Fine Science Tools | 14090-11 | Dwie pary; stal nierdzewna, ostro końcówki, końcówka prosta, krawędź tnąca 26 mm , długość 11 cm |
| Ludzka/mysz Myeloperoksydaza/przeciwciało MPO | R& D Systems | AF3667 | |
| Sterylizator gorących kulek | Fine Science Tools | 18000-45 | Włącz około 30 min przed użyciem; sterylizuj narzędzia w >200 ° C dla 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Strzykawki insulinowe z ultracienką igłą BD 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP myszy | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Mikrokleszcze preparacyjne | Roboz | RS-5135 | Ząbkowane, lekka krzywizna, szerokość końcówki 0,8 mm; długość 4" |
| Mikro kleszczyki preparacyjne | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 zęby, lekka krzywa, 0,8 mm szerokość końcówki , długość 4" |
| MTS Systemy MTS MiniBionix II 808 | MTS | Serwohydrauliczna maszyna do badania materiałów | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST sonda | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. (Ogólne zaopatrzenie spawalnicze tlenu) | ||
| Filament kwasu polimlekowego | Hatchbox | o średnicy 1,75 mm | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Maść okulistyczna Puralube | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Klipsy do nawijania Reflex 7 | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Siatka ze stali nierdzewnej | Siatka Fotofab | One ma średnicę 0,200 cala, w sumie 52 pojedyncze kwadraty siatki o wymiarach 0,016 x 0,016 cala. Między każdym kwadratem jest 0,003 cala przestrzeni. | |
| Sterylne płytki do hodowli tkankowych poddane obróbce powierzchniowej | Fisher Scientific | FB012929 | Pokrywka używana jako powierzchnia utwardzająca do okien obrazowania |
| Mikroskop wielofotonowy Trim Scope | LaVision BioTec | wykonano na pionowym mikroskopie 2-fotonowym (Trimscope, LaVision BioTec) wyposażonym w dwa lasery Ti:Sapphire (Mai Tai i InSight, Spectra-Physics) oraz optyczny oscylator parametryczny. Następujące długoprzepustowe dichroiczne rozdzielacze wiązki (Chroma) zostały użyte do skierowania sygnału w kierunku czterech lamp fotomultiplerowych: T560LP T665LPXXR T495lxpr | |
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR Micro cover glass | VWR | 48404-453 |
Bibliografia
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
