Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM) umożliwia wizualizację ruchu, podziału i śmierci komórki w rozdzielczości pojedynczej komórki. IVM poprzez chirurgicznie wstawione okienka obrazowania jest szczególnie skuteczne, ponieważ umożliwia obserwację podłużną tej samej tkanki przez kilka dni lub tygodni. Typowe okienka obrazowania składają się ze szklanego szkiełka nakrywkowego w biokompatybilnej metalowej ramce przyszytej do skóry myszy. Okna te mogą zakłócać swobodny ruch myszy, wywoływać silną reakcję zapalną i zawodzić z powodu potłuczonego szkła lub rozdartych szwów, z których każde może wymagać eutanazji. Aby rozwiązać te problemy, opracowano okna do długoterminowego obrazowania narządów jamy brzusznej i gruczołu sutkowego z cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS), optycznie przezroczystego polimeru silikonowego używanego wcześniej do obrazowania czaszki. Okienka te można przykleić bezpośrednio do tkanek, co skraca czas potrzebny na wprowadzenie. PDMS jest elastyczny, co przyczynia się do jego trwałości u myszy w czasie - przetestowano do 35 dni. Obrazowanie podłużne to obrazowanie tego samego obszaru tkanki podczas oddzielnych sesji. Siatka ze stali nierdzewnej została osadzona w oknach, aby zlokalizować ten sam region, umożliwiając wizualizację dynamicznych procesów (takich jak inwolucja gruczołu sutkowego) w tych samych miejscach, w odstępie kilku dni. To silikonowe okienko umożliwiło również monitorowanie pojedynczych rozsianych komórek nowotworowych, które z czasem przekształcają się w mikroprzerzuty. Okna silikonowe użyte w tym badaniu są łatwiejsze do włożenia niż okna szklane z metalową ramą i powodują ograniczone stan zapalny obrazowanych tkanek. Co więcej, wbudowane siatki pozwalają na proste śledzenie tego samego regionu tkanki w powtarzających się sesjach obrazowania.
Wprowadzenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM), obrazowanie tkanek u znieczulonych zwierząt, oferuje wgląd w dynamikę fizjologicznych i patologicznych zdarzeń w rozdzielczości komórkowej w nienaruszonych tkankach. Zastosowania tej techniki są bardzo różne, ale IVM odegrał kluczową rolę w dziedzinie biologii nowotworów, pomagając wyjaśnić, w jaki sposób komórki rakowe atakują tkanki i dają przerzuty, wchodzą w interakcje z otaczającym mikrośrodowiskiem i reagują na leki1,2,3. Ponadto IVM odegrało kluczową rolę w pogłębieniu wiedzy na temat złożonych mechanizmów rządzących reakcją immunologiczną poprzez dostarczenie informacji uzupełniających podejścia do profilowania ex vivo (np. cytometrii przepływowej). Na przykład eksperymenty z obrazowaniem przyżyciowym ujawniły szczegóły dotyczące funkcji immunologicznych w odniesieniu do migracji komórek i kontaktu komórka-komórka, a także zaoferowały platformę do ilościowego określania dynamiki czasoprzestrzennej w odpowiedzi na uraz lub infekcję4,5,6,7. Wiele z tych procesów można również badać za pomocą barwienia histologicznego, ale tylko IVM pozwala na śledzenie dynamicznych zmian. W rzeczywistości, podczas gdy sekcja histologiczna oferuje migawkę tkanki w danym momencie, obrazowanie przyżyciowe może śledzić zdarzenia międzykomórkowe i subkomórkowe w tej samej tkance w czasie. W szczególności postęp w znakowaniu fluorescencyjnym i rozwój reporterów molekularnych pozwoliły na skorelowanie zdarzeń molekularnych z zachowaniami komórkowymi, takimi jak proliferacja, śmierć, ruchliwość i interakcja z innymi komórkami lub macierzą zewnątrzkomórkową. Większość technik IVM opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, która ze względu na rozpraszanie światła sprawia, że obrazowanie głębszych tkanek jest trudne. W związku z tym tkanka będąca przedmiotem zainteresowania często musi zostać poddana chirurgicznej odsłonie za pomocą często inwazyjnego i terminalnego zabiegu. Tak więc, w zależności od miejsca narządu, tkanka może być obrazowana w sposób ciągły przez okres od kilku do 40 h8. Alternatywnie, chirurgiczne wstawienie stałego okienka obrazowania pozwala na sekwencyjne obrazowanie tej samej tkanki w okresie od kilku dni do tygodni7,9.
Rozwój nowych okien obrazowania został podkreślony jako technologiczna potrzeba dalszego ulepszania metod obrazowania przyżyciowego10. Prototypowe okienko obrazowania przyżyciowego to metalowy pierścień zawierający szklane szkiełko nakrywkowe przymocowane do skóry za pomocą szwów11. Zakłócenia w swobodnym poruszaniu się, gromadzenie się wysięku i uszkodzenie szkiełka nakrywkowego to częste problemy związane z użytkowaniem takich okien. Co więcej, prototypowe okno wymaga specjalistycznej produkcji, a zabieg chirurgiczny może wymagać intensywnego szkolenia. Aby rozwiązać te problemy, polidimetylosiloksan (PDMS), polimer silikonowy, który wcześniej był stosowany w oknach czaszkowych do długoterminowego obrazowania w mózgu12, został zaadaptowany do stosowania w obrazowaniu narządów jamy brzusznej i gruczołu piersiowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę generowania okien silikonowych na bazie PDMS, w tym sposób odlewania okna wokół siatki ze stali nierdzewnej, aby zapewnić punkty orientacyjne do wielokrotnego obrazowania tych samych obszarów tkanki. Ponadto opisano prostą, bezszwową procedurę chirurgiczną polegającą na wprowadzeniu okienka nad narządami jamy brzusznej lub gruczołem sutkowym. To nowe podejście pozwala przezwyciężyć niektóre z najczęstszych problemów związanych z obecnie stosowanymi oknami obrazowania i zwiększa dostępność podłużnego obrazowania przyżyciowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi chirurgicznymi laboratorium Cold Spring Harbor i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Cold Spring Harbor.
1. Odlewanie okna silikonowego
- Przygotować polimer silikonowy (PDMS), mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v).
- Odlej okno, umieszczając niewielką ilość PDMS na sterylnej, gładkiej powierzchni i dostosuj stosunek objętości do powierzchni do żądanej grubości.
UWAGA: Użycie 200 mg roztworu polimeru do uzyskania okręgu o średnicy 22 mm na pokrywie pokrywy z 24-dołkową płytką zapewnia dobry kompromis między wytrzymałością okna a przejrzystością optyczną. - Opcjonalnie: Aby zapewnić punkty orientacyjne do wielokrotnego obrazowania tych samych obszarów tkanki, delikatnie wciśnij siatkę ze stali nierdzewnej w silikon po tym, jak PDMS znajdzie się na żądanej powierzchni odlewu.
- Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy umieścić pokrytą powierzchnię w eksykatorze próżniowym na 45 minut w celu odgazowania polimeru.
- Utwardzać silikonowe okienka w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 45 min.
- Naciąć polimer na krawędziach formy i delikatnie oderwać utwardzone okienka od powierzchni używanej do odlewania kleszczykami.
- Przed zabiegiem wysterylizuj okna przez autoklawowanie.
2. Przygotowanie myszy do włożenia silikonowego okienka
- Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej przy użyciu 4% (v/v) izofluranu. Przenieś mysz na podkładkę rozgrzewającą na stole operacyjnym, umieść mysz w anestezjologicznej masce na nos i obniż stężenie izofluranu do 2% w celu utrzymania przez cały czas trwania operacji.
- Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palce kończyn tylnych. Nie kontynuuj, dopóki mysz nie będzie nieaktywna i nie będzie reagować na odruch szczypania palców.
- Nałóż lubrykant okulistyczny na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu i zapobiec urazom.
- Analgezję zapobiegawczą (buprenorfina 0,05 mg/kg) należy podawać podskórnie.
- Ogol miejsce operacji i całkowicie usuń włosy za pomocą kremu do depilacji.
- Stosować kolejno roztwór jodu powidonu (10% v/v) i etanolu (70% v/v), aby zapobiec zakażeniu miejsca operowanego.
3. Wprowadzenie okienka brzusznego do obrazowania w wątrobie; możliwość adaptacji do innych narządów jamy brzusznej (Rysunek 1)
- Umieść mysz w pozycji leżącej.
- Wykonaj nacięcie 10 mm, zaczynając 3 mm w dół od wyrostka mieczykowatego za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
- Usuń 1–1,5cm2 odcinek skóry wzdłuż linii środkowej.
- Użyj drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy, aby usunąć fragment otrzewnej nieco mniejszy niż fragment skóry.
- Opcjonalnie: Aby uwidocznić większą część wątroby, użyj sterylnych wacików zwilżonych sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby wypchnąć wątrobę w dół od przepony, odsłaniając więzadło falciowate łączące wątrobę z przeponą. Przeciąć więzadło, uważając, aby nie przeciąć żyły głównej dolnej.
- Pobrać klej chirurgiczny za pomocą strzykawki 31 G, nanieść niewielką jego ilość na powierzchnię wątroby wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany. Klej ten tworzy okrągłe uszczelnienie, pozostawiając nienaruszony obszar środkowy do obrazowania.
UWAGA: Ogranicz klej do małych kropelek tworzących okrągły wzór wokół obszaru obrazowania. Tkanka bezpośrednio stykająca się z klejem nie może być zobrazowana. Nie ma potrzeby suszenia chusteczki przed nałożeniem kleju.
UWAGA: Do tej procedury można z powodzeniem stosować dowolne kleje na bazie cyjanoakrylanu. Klej chirurgiczny zapewnia sterylność. W przypadku zabiegów terminalnych dobre wyniki dają uniwersalne super kleje. - Ustaw okienko za pomocą kleszczy i mocno przyciśnij je do wątroby, aż klej wyschnie (~2 min).
- Złóż krawędzie okna pod otrzewną.
- Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okna, które znajdują się teraz pod otrzewną. Dociśnij otrzewną kleszczami, aby przymocować ją do okna.
- Podobnie, nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na otrzewną, a następnie naciśnij skórę kleszczami, aby przymocować go do otrzewnej.
UWAGA: Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, okrągły obszar tkanki wątroby powinien być teraz widoczny przez okno. - Nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które zapobiegnie odrastaniu skóry nad oknem.
UWAGA: Jeśli zabieg jest przeprowadzany przy użyciu sterylnych technik chirurgicznych, a okienko jest sterylizowane przed włożeniem, wystarczy uszczelnić ranę klejem chirurgicznym, aby uniknąć infekcji. Jednak nieprzestrzeganie odpowiednich technik aseptyki podczas chirurgicznego wprowadzania lub niedoskonałe zamknięcie może prowadzić do jawnej lub subklinicznej infekcji i wysuszenia tkanki.
4. Wstawienie bocznego okienka do obrazowania w wątrobie; kompatybilne z równoczesnym wstrzykiwaniem komórek rakowych do żyły wrotnej (Rysunek 2)
- Umieść mysz w lewej bocznej pozycji odleżynowej
- Wykonaj 10 mm nacięcie na prawym boku 3 mm poniżej łuku żebrowego za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
- Usuń 1cm2 fragment skóry.
- Użyj drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy, aby usunąć fragment otrzewnej nieco mniejszy niż fragment skóry.
- Pobrać klej chirurgiczny za pomocą strzykawki 31 G, nanieść niewielką jego ilość na powierzchnię wątroby wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany.
UWAGA: Ogranicz klej do małych kropelek tworzących okrągły wzór wokół obszaru obrazowania. Nie można obrazować tkanki bezpośrednio stykającej się z klejem.
UWAGA: Do tej procedury można z powodzeniem stosować dowolne kleje na bazie cyjanoakrylanu. Klej chirurgiczny zapewnia sterylność. W przypadku zabiegów terminalnych dobre wyniki dają uniwersalne super kleje. - Ustaw okienko za pomocą kleszczy i mocno przyciśnij je do wątroby, aż klej wyschnie (~2 min).
- Złóż krawędzie okna pod otrzewną.
- Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okna, które znajdują się teraz pod otrzewną. Dociśnij otrzewną kleszczami, aby przymocować ją do okna.
- Podobnie, nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na otrzewną, a następnie naciśnij skórę kleszczami, aby przymocować go do otrzewnej.
UWAGA: Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, okrągły obszar tkanki wątroby powinien być teraz widoczny przez okno. - Nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które pomoże zapobiec odrastaniu skóry nad oknem.
- Jeśli wymagane jest wstrzyknięcie żyły wrotnej:
- Umieść mysz w pozycji leżącej.
- Wykonaj nacięcie 10 mm, zaczynając w dół od wyrostka mieczykowatego w skórze.
- Za pomocą drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj 10 mm nacięcie w otrzewnej.
- Zanurz dwa bawełniane waciki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
- Za pomocą bawełnianych wacików delikatnie naciągnij jelito na sterylną gazę zwilżoną sterylną solą fizjologiczną, uważając, aby nie skręcić ani w inny sposób nie zakłócić orientacji.
- Kontynuuj przemieszczanie jelita z jamy brzusznej, aż żyła wrotna będzie widoczna po prawej stronie brzucha.
- Włóż igłę 31–33 G 5–7 mm ogonową do punktu wejścia żyły wrotnej do wątroby, upewniając się, że przechodzi ona w obrębie naczynia krwionośnego, a nie przez nie.
- Powoli wstrzyknąć komórki rakowe (zawieszone w 100 μl sterylnego PBS).
UWAGA: W tym eksperymencie linię komórkową amurynowego raka trzustki (np. KPC-BL / 6-1199) można hodować w kompletnych pożywkach DMEM i wstrzykiwać 1 x 105 komórek w 100 μl sterylnego PBS. - Aby zapobiec krwawieniu, natychmiast po wyjęciu igły należy delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia małym kawałkiem gąbki chirurgicznej przez 1–2 minuty.
- Po zwolnieniu ciśnienia monitoruj miejsce przez 1-2 minuty, aby zapewnić hemostazę.
- Za pomocą zwilżonych wacików cofnij jelito do jamy brzusznej zgodnie z fizjologiczną orientacją narządu.
- Za pomocą sterylnych kleszczy włóż okienko bezpośrednio pod otrzewną, po lewej stronie jamy brzusznej myszy.
- Zszyj jedwabnymi szwami 4-0 i zszyj nacięcie linii środkowej za pomocą 7 mm klipsów ze stali nierdzewnej.
- Przesuń mysz do lewej bocznej pozycji odleżynowej
- Wykonaj 10 mm nacięcie na prawym boku, 3 mm pod łukiem żebrowym przez skórę za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
- Usuń 1cm2 odcinek skóry wokół nacięcia.
- Użyj drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy, aby usunąć fragment otrzewnej nieco mniejszy niż fragment skóry.
- Pociągnij okienko na miejsce nad wątrobą przed przyklejeniem go na miejscu, jak opisano w krokach 4.8–4.10.
5. Wstawianie okienka do obrazowania w trzustce (Rysunek 3)
- Umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowa.
- Wykonaj 10 mm nacięcie na lewym boku 3 mm poniżej łuku żebrowego za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
- Usuń 1cm2 odcinek skóry wokół nacięcia.
- Użyj drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy, aby usunąć fragment otrzewnej nieco mniejszy niż fragment skóry.
- Za pomocą sterylnych wacików nasączonych sterylną solą fizjologiczną delikatnie pociągnij za śledzionę, aby uwidocznić trzustkę. Przystąp do zmiany położenia trzustki za pomocą zwilżonych wacików, aby większa powierzchnia była widoczna przez nacięcie.
UWAGA: W tym momencie komórki raka trzustki mogą być ortotopowo wstrzykiwane do trzustki, jeśli jest to część projektu eksperymentalnego. - Pobrać klej chirurgiczny za pomocą strzykawki 31 G, nanieść niewielką jego ilość na powierzchnię trzustki wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany.
UWAGA: Ogranicz klej do małych kropelek tworzących okrągły wzór wokół obszaru obrazowania. Tkanka bezpośrednio stykająca się z klejem nie może być zobrazowana. - Ustaw okienko za pomocą kleszczyków i mocno przyciśnij je do trzustki, aż klej wyschnie (~2 min).
- Złóż krawędzie okna pod otrzewną.
- Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okna, które znajdują się teraz pod otrzewną. Dociśnij otrzewną kleszczami, aby przymocować ją do okna.
- Podobnie, nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na otrzewną, a następnie naciśnij skórę kleszczami, aby przymocować go do otrzewnej.
UWAGA: Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, okrągły obszar tkanki trzustki powinien być teraz widoczny przez okno. - Nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które pomoże zapobiec odrastaniu skóry nad oknem.
6. Wstawianie okienka do obrazowania w gruczole sutkowym (Rysunek 4)
- Umieść mysz w pozycji leżącej.
- Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie przyśrodkowe do jednego z sutków pachwinowych za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
- Usuń 0,5cm2 odcinek skóry powyżej gruczołu sutkowego.
- Użyj drugiej pary sterylnych nożyczek, aby ostrożnie oddzielić gruczoł sutkowy od skóry, rozkładając nożyczki między dwiema powierzchniami, aby zakłócić przyleganie.
UWAGA: Aby ułatwić obrazowanie okolicy pachwinowej gruczołu sutkowego, należy uważać, aby wypreparować część skóry powyżej gruczołu sutkowego, ale powyżej tylnej nogi, aby okienko nie ograniczało ruchomości myszy. - Pobrać klej chirurgiczny za pomocą strzykawki 31 G, nanieść niewielką jego ilość na powierzchnię gruczołu sutkowego wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany.
UWAGA: Ogranicz klej do małych kropelek tworzących okrągły wzór wokół obszaru obrazowania. Tkanka bezpośrednio stykająca się z klejem nie może być zobrazowana. - Ustaw okno za pomocą kleszczy i mocno przyciśnij je do gruczołu mlekowego, aż klej wyschnie (~2 min).
UWAGA: Okrągły obszar tkanki gruczołu sutkowego powinien być teraz widoczny przez okno, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. - Złóż krawędzie okna pod skórą.
- Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okienka, które znajdują się teraz pod skórą. Dociśnij skórę kleszczami, aby przymocować skórę do okna.
- Nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które pomoże zapobiec odrastaniu skóry nad oknem.
7. Rekonwalescencja pooperacyjna
- Umieść mysz w czystej klatce odzyskiwania z dużą ilością materiału do zagnieżdżania, upewniając się, że część klatki spoczywa na poduszce grzewczej.
- Monitoruj mysz w sposób ciągły, aż stanie się przytomna i mobilna.
- W razie potrzeby należy podać dodatkową dawkę leku przeciwbólowego 12 godzin po dawce wyprzedzającej.
UWAGA: Dodatkowa analgezja jest na ogół niepotrzebna, ale skonsultuj się z weterynarzem, jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju (takie jak zgarbione plecy, zaniedbane futro lub utrata zainteresowania jedzeniem). Monitoruj mysz codziennie przez pierwsze 3 dni po zabiegu pod kątem oznak infekcji lub innych działań niepożądanych. Mniej niż 2% myszy wymaga pomocy weterynaryjnej lub eutanazji, zwykle z powodu częściowego oderwania okna. Ważne jest, aby pamiętać, że w przypadku samców myszy z brzusznymi oknami obrazowania wątroby, walka między myszami może spowodować oderwanie okien. Można tego uniknąć, trzymając myszy oddzielnie.
8. Obrazowanie przez okno
- Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej przy użyciu 4% (v/v) izofluranu.
- Nałóż lubrykant okulistyczny na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu i zapobiec urazom.
- Przesuń mysz z komory indukcyjnej do stolika mikroskopu. Umieść mysz w anestezjologicznej masce na nos i zmniejsz stężenie izofluranu do około 1-1,5% w celu znieczulenia podtrzymującego przez cały czas trwania procedury obrazowania.
- Umieść czujnik podkładki uciskowej pod myszą, aby monitorować częstość oddechów i przymocuj mysz do sceny za pomocą miękkiej taśmy chirurgicznej.
- Włóż termometr doodbytniczy, aby monitorować temperaturę ciała przez całą sesję obrazowania.
- Włącz podgrzewaną podkładkę, uważnie monitorując mysz, aby upewnić się, że temperatura ciała nie przekracza 37 °C.
- Wykorzystaj oprogramowanie do monitorowania częstości oddechów myszy. Optymalna szybkość to ~1 oddech/sekundę. Dostosuj znieczulenie zgodnie z wymaganiami.
- Przed każdą sesją obrazowania oczyść okienko z resztek medium zanurzeniowego w soczewce i zanieczyszczeń, delikatnie przecierając je bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% etanolu (v/v).
- Korzystając z soczewki zanurzonej w wodzie, nałóż żel ultradźwiękowy na okno, unikając pęcherzyków.
UWAGA: Można również użyć wody destylowanej, ale może to wymagać ponownego nałożenia podczas obrazowania. - Aby znaleźć optymalną głębokość obrazowania, najpierw zlokalizuj siatkę i umieść ją w ostrości.
- Określ przybliżoną głębokość obrazowania tkanki, ustawiając dolną część siatki na 0. Informacje te są niezbędne do zlokalizowania odpowiedniej płaszczyzny z w kolejnych sesjach obrazowania.
- Aby zidentyfikować tę samą lokalizację w wielu sesjach obrazowania, użyj kwadratów na siatce jako punktu odniesienia. Podczas obrazowania należy zwrócić uwagę na orientację siatki i położenie w siatce każdego obrazowanego pola widzenia (np. 2. rząd od góry, 4. kwadrat od lewej).
- Podczas kolejnych sesji obrazowania należy używać siatki do nawigacji z powrotem do określonych obszarów siatki - a tym samym pól obrazowania.
- Po każdej sesji obrazowania usuń wszelkie resztki medium zanurzeniowego w soczewce i zanieczyszczenia, delikatnie przecierając okienko bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% etanolu (v/v).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazowanie intravitalne za pomocą okien obrazujących może być wykorzystywane do obserwacji, śledzenia i ilościowego określania szerokiego zakresu zdarzeń komórkowych i molekularnych z rozdzielczością pojedynczych komórek w okresie od kilku godzin do kilku tygodni. Idealne cechy okna obrazującego obejmują: a) ograniczony wpływ na dobrostan myszy i fizjologię tkanki; b) trwałość; c) prostotę implantacji; oraz d) wyraźne punkty orientacyjne umożliwiające powtarzalne obrazowanie tego samego obszaru. Wynikiem jest wszechstro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Okienka obrazowania przyżyciowego są ważnymi narzędziami do bezpośredniej wizualizacji procesów fizjologicznych i patologicznych w rozdzielczości komórkowej w miarę ich rozwoju w czasie. Nowatorska procedura opisana w przypadku odlewania i wstawiania elastycznych, silikonowych okienek obrazowania u myszy przezwycięża niektóre z najczęstszych problemów związanych z obecnie stosowanymi okienkami obrazowania (wysięk, pękanie i zakłócenia normalnej mobilności), zapewnia dodatkowe bezpieczeństwo myszy i zwiększa dostępność te...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
M.E. jest członkiem rady doradczej ds. badań nad brensocatibem w firmie Insmed, Inc.; członek naukowej rady doradczej Vividion Therapeutics, Inc.; konsultant dla Protalix, Inc.; i posiada udziały w Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. jest współzałożycielem Mestag Therapeutics, zasiada w naukowej radzie doradczej i posiada udziały w Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology i Cygnal Therapeutics. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Robowi Eifertowi za pomoc w projektowaniu i optymalizacji wycinanych laserowo siatek ze stali nierdzewnej. Praca ta była wspierana przez CSHL Cancer Center (P30-CA045508) oraz fundusze na M.E. z National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 i 5P01CA013106-49); CSHL i Northwell Health; Fundacja Rodziny Thompsonów; Przepłyń Amerykę; oraz grant Fundacji Simonsa dla CSHL. M.S. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) oraz National Cancer Institute of the NIH pod numerem nagrody 1F30CA253993-01. L.M. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Fundacji Jamesa S. McDonnella. J.M.A. jest laureatem stypendium podoktorskiego Cancer Research Institute/Irvington (CRI Award #3435). D.A.T. jest wspierany przez Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research oraz Thompson Family Foundation. Kreskówki zostały stworzone z Biorender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Taśma chirurgiczna 3M Medipore Soft Cloth | 3M | 70200770819 | |
| Szew jedwabny 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | Myszy N267H | |
| ACTB-ECFP | Jackson Laboratory | 22974 | |
| Zestaw substratów AEC, peroksydaza (HRP), (3-amino-9-etylokarbazol) | Laboratoria wektorowe | SK-4200 | |
| Waciki nasączone alkoholem | BD | ||
| System anestezjologiczny | Produkty do obrazowania molekularnego Co. | ||
| Oprogramowanie i czujniki Acqknowledge | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine w sprayu | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) myszy | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J myszy | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Przeciwciało monoklonalne (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Przeciwciało | Abcam | ab125212 | |
| Gąbki z gazy Curity | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Osioł Anty-Królik IgG H& L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Osioł Anty-Szczurzy IgG H& L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silikonowa kapsułka Przezroczysta | mikroskopia elektronowa Sciences | 24236-10 | Dwuskładnikowa, proporcje mieszania 10:1 |
| Okrągłe szkło osłonowe, średnica 8 mm, grubość # 1,5 | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72296-08 | |
| Drukarka 3D Ender-3 Pro | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Podgrzewany koc dalekiej podczerwieni | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Bloker receptora Fc | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Pakiet | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Karboksylan FluoroSpheres, 0,04 i mikro; m, żółto-zielony (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| System bramkowania: | BIOPAC Systems Inc. | Komponenty razem umożliwiają monitorowanie parametrów życiowych myszy podczas obrazowania i bramkowania akwizycji obrazu podczas oddychania myszy. Wszystkie zostały pozyskane z systemów BIOPAC. | |
| Oprogramowanie Acqknowledge | ACK100W, ACK100M | ||
| Moduł wzmacniacza różnicowego, seria C | DA100C | ||
| Podwójny system bramkowania dla małych zwierząt | DTU200 | ||
| MP160 dla Windows - System | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V; Numer katalogowy: 015000 | ||
| Podkładka dociskowa | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Wchłanialna gąbka żelatynowa |
| Hartowane drobne nożyczki | Fine Science Tools | 14090-11 | Dwie pary; stal nierdzewna, ostro końcówki, końcówka prosta, krawędź tnąca 26 mm , długość 11 cm |
| Ludzka/mysz Myeloperoksydaza/przeciwciało MPO | R& D Systems | AF3667 | |
| Sterylizator gorących kulek | Fine Science Tools | 18000-45 | Włącz około 30 min przed użyciem; sterylizuj narzędzia w >200 ° C dla 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Strzykawki insulinowe z ultracienką igłą BD 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP myszy | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Mikrokleszcze preparacyjne | Roboz | RS-5135 | Ząbkowane, lekka krzywizna, szerokość końcówki 0,8 mm; długość 4" |
| Mikro kleszczyki preparacyjne | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 zęby, lekka krzywa, 0,8 mm szerokość końcówki , długość 4" |
| MTS Systemy MTS MiniBionix II 808 | MTS | Serwohydrauliczna maszyna do badania materiałów | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST sonda | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. (Ogólne zaopatrzenie spawalnicze tlenu) | ||
| Filament kwasu polimlekowego | Hatchbox | o średnicy 1,75 mm | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Maść okulistyczna Puralube | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Klipsy do nawijania Reflex 7 | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Siatka ze stali nierdzewnej | Siatka Fotofab | One ma średnicę 0,200 cala, w sumie 52 pojedyncze kwadraty siatki o wymiarach 0,016 x 0,016 cala. Między każdym kwadratem jest 0,003 cala przestrzeni. | |
| Sterylne płytki do hodowli tkankowych poddane obróbce powierzchniowej | Fisher Scientific | FB012929 | Pokrywka używana jako powierzchnia utwardzająca do okien obrazowania |
| Mikroskop wielofotonowy Trim Scope | LaVision BioTec | wykonano na pionowym mikroskopie 2-fotonowym (Trimscope, LaVision BioTec) wyposażonym w dwa lasery Ti:Sapphire (Mai Tai i InSight, Spectra-Physics) oraz optyczny oscylator parametryczny. Następujące długoprzepustowe dichroiczne rozdzielacze wiązki (Chroma) zostały użyte do skierowania sygnału w kierunku czterech lamp fotomultiplerowych: T560LP T665LPXXR T495lxpr | |
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR Micro cover glass | VWR | 48404-453 |
Bibliografia
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
- Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
