Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62868

⸱

30 września 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Minia University, 2National Institute for Health Research Birmingham Liver Biomedical Research Unit and Centre for Liver and Gastrointestinal Research, Institute of Immunology and Immunotherapy, University of Birmingham, 3Newcastle Fibrosis Research Group, Biosciences Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 4Newcastle University Translational and Clinical Research Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 5The Liver Unit, Department of Medicine, Freeman Hospital, Newcastle-upon-Tyne Hospitals NHS Foundation Trust

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Streszczenie

Agresywność i brak dobrze tolerowanych i szeroko skutecznych metod leczenia zaawansowanego raka wątrobowokomórkowego (HCC), dominującej formy raka wątroby, racjonalizują jego rangę jako drugiej najczęstszej przyczyny zgonów związanych z rakiem. Modele przedkliniczne muszą zostać dostosowane w celu podsumowania warunków panujących u ludzi, aby wybrać najlepszych kandydatów terapeutycznych do rozwoju klinicznego i wspomóc dostarczanie medycyny spersonalizowanej. Trójwymiarowe (3D) komórkowe modele sferoidalne są obiecujące jako wyłaniająca się alternatywa in vitro dla dwuwymiarowych (2D) kultur jednowarstwowych. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowy model sferoidalny guza, który wykorzystuje zdolność pojedynczych komórek do agregacji, gdy jest utrzymywany w wiszących kropelkach i jest bardziej reprezentatywny dla środowiska in vivo niż standardowe monowarstwy. Co więcej, sferoidy 3D mogą być wytwarzane przez łączenie komórek homotypowych lub heterotypowych, co lepiej odzwierciedla heterogeniczność komórkową in vivo, potencjalnie umożliwiając badanie interakcji środowiskowych, które mogą wpływać na progresję i reakcje na leczenie. Obecne badania zoptymalizowały gęstość komórek w celu utworzenia homotypowych i heterotypowych sferoid guza 3D poprzez unieruchomienie zawiesin komórkowych na pokrywkach standardowych 10 cm3 szalek Petriego. Przeprowadzono analizę podłużną w celu wygenerowania krzywych wzrostu dla sferoidów homotypowego i heterotypowego guza/fibroblastów. Na koniec zbadano proliferacyjny wpływ fibroblastów (komórek COS7) i miofibroblastów wątroby (LX2) na sferoidy guza homotypowego (Hep3B). Gęstość wysiewu wynosząca 3,000 komórek (w pożywce 20 μl) z powodzeniem dała heterotypowe sferoidy Huh7 / COS7, które wykazywały stały wzrost wielkości do 8 dnia hodowli, po którym nastąpiło opóźnienie wzrostu. Odkrycie to zostało potwierdzone przy użyciu homotypowych sferoidów Hep3B hodowanych w pożywce kondycjonowanej LX2 (ludzka linia komórek gwiaździstych wątroby) (CM). LX2 CM wyzwalał proliferację sferoid Hep3B w porównaniu ze sferoidami kontrolnymi guza. Podsumowując, protokół ten wykazał, że sferoidy guza 3D mogą być używane jako proste, ekonomiczne i preprzesiewowe narzędzie in vitro do bardziej kompleksowego badania interakcji guz-zręb.

Wprowadzenie

Globalna częstość występowania i śmiertelność z powodu raka wątroby nadal rośnie, pomimo postępów w leczeniu chorób wątroby i większości innych rodzajów raka. W 2018 roku rak wątroby wyprzedził raka jelita grubego i żołądka, stając się drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie1. W 2020 roku odnotowano ponad 9 000 000 nowych diagnoz, co stanowi 4,7% wszystkich przypadków raka na całym świecie1. Jest to szczególnie rozczarowujące, biorąc pod uwagę, że istotne czynniki ryzyka rozwoju HCC, najczęstszej postaci raka wątroby, są dobrze scharakteryzowane2. Marskość wątroby jest najczęstszym czynnikiem ryzyka rozwoju HCC, przy czym 80% przypadków rozwija się na tle ustalonej marskości wątroby2. Przewlekłe choroby wątroby, które prowadzą do marskości wątroby, a w konsekwencji HCC, obejmują wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), alkoholową chorobę wątroby (ARLD), niealkoholowe stłuszczeniowe choroby wątroby (NAFLD) - te ostatnie przypisywane otyłości i cukrzycy typu 2 (T2DM)2,3. Obecne protokoły postępowania w HCC są zależne od stadium zaawansowania i ograniczone dla osób z zaawansowanym rakiem, które najczęściej mają słabe wyniki4. Nastąpił znaczny postęp w stosowaniu inhibitorów kinaz, a ostatnio leczenia immunoonkologicznego, chociaż realistycznie rzecz biorąc, przynosi korzyści tylko mniejszości pacjentów z zaawansowanym rakiem wątroby5. Co więcej, istnieje obawa, że HCC powstające u pacjentów z NAFLD - najszybciej rozwijającą się przyczyną leżącą u podstaw, odpowiadającą za ponad 50% nowo zdiagnozowanych przypadków HCC w krajach zachodnich, mogą być bardziej odporne na terapię inhibitorem punktów kontrolnych Programmed death 1 (PD1) 6.

Dokonano ogromnych inwestycji w badania kliniczne dla pacjentów z HCC, w tym znaczące ulepszenia w badaniach klinicznych i ich punktach końcowych7. Po dekadzie niepowodzeń inwestycje te zaczęły zmieniać możliwości dla pacjentów. Jednak rzeczywistość jest taka, że ogólny odsetek pacjentów, u których uzyskano odpowiedź na leczenie, pozostaje stosunkowo niski, a pacjenci rekrutowani do badań często słabo reprezentują tych, którymi opiekują się kliniki. Niebezpieczeństwo polega na tym, że zaliczki są kosztowne i przynoszą korzyści nielicznym, a nie wielu. W miarę pojawiania się coraz większej liczby potencjalnych terapii do jednorazowego użytku lub skojarzonej, niezbędne jest posiadanie modeli przedklinicznych, które lepiej przewidują odpowiedzi in vivo. Prawdopodobnie będą to modele, które uwzględniają dodatkowe czynniki przyczyniające się do zmienności obserwowanej w odpowiedziach pacjentów, które lepiej odzwierciedlają ludzką heterogeniczność HCC i patologiczną złożoność8. Systemy, które odtwarzają stany patofizjologiczne HCC in vivo, są potrzebne, aby pomóc zrozumieć biologię ewolucji, wzrostu i progresji guza. Istniejące eksperymentalne modele przewlekłych chorób wątroby i HCC zwykle dzielą się na trzy główne kategorie: modele zwierzęce in vivo (przejrzane w9), hodowle in vitro10 i ex vivo11,12 modele. Podejścia oparte na zwierzętach są szeroko stosowane do badania przewlekłych chorób wątroby, w tym HCC; Jednak zmienność genetyczna, wysokie koszty eksploatacji i różne układy odpornościowe między gatunkami należą do głównych ograniczeń w stosowaniu takich modeli9. Podczas gdy niektóre modele ex vivo stanowią doskonałe narzędzie do skupienia się na tkankach ludzkich w porównaniu z innymi modelami linii komórkowych in vitro, dostępność tkanek i ograniczony czas trwania eksperymentu utrudniają ich wykorzystanie na dużą skalę.

Z drugiej strony, modele linii komórkowych in vitro pozostają dobrym wyborem dla naukowców pracujących z ograniczonymi zasobami, z mniejszą potrzebą stałego dopływu świeżych tkanek ludzkich10. Modele te stanowią również narzędzie, które można wykorzystać jako pierwsze badanie przesiewowe, aby pomóc w docelowej walidacji wyboru leku przed przejściem do bardziej złożonych modeli in vivo. Niedawna modyfikacja tradycyjnych kultur jednowarstwowych 2D w hodowle 3D poprawiła skuteczność tych modeli in vitro13,14.

Modele in vitro 3D mogą podsumować krytyczne cechy obserwowane w normalnych i patologicznych stanach człowieka. W warunkach fizjologicznych transdukcja sygnału jest inicjowana poprzez przesłuch komórkowy i interakcję z innymi cząsteczkami tkanki łącznej, a mianowicie białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc sieć interakcji 3D15,16. Guz ewoluuje w formie sferycznej 3D podczas złośliwej transformacji, dla której tlen i składniki odżywcze są łatwo obfite w interfazę bez guza / guza. W tym samym czasie w rdzeniu guza dominują warunki niedotlenienia. Ta niejednorodność w dostępności składników odżywczych powoduje aktywację przestrzennie odrębnych szlaków sygnałowych i metabolicznych, które regulują nowotworzenie Warunki te są słabo podsumowane w konwencjonalnych kulturach jednowarstwowych 2D14, w których komórki rosną na sztywnym plastiku hodowlanym w fizjologicznie nieistotny sposób. Komórki rakowe komunikują się również z innymi komórkami niemiąższowymi, które są głównym źródłem ECM, sygnalizacji wzrostu i inwazji w mikrośrodowisku guza. W przeciwieństwie do kultur 2D, modele 3D in vitro mogą stanowić bardziej odpowiednią platformę do badania tej interakcji guz-zręb17.

modele 3D są szeroko stosowane w dziedzinie HCC i różnią się sposobem tworzenia mikrotkanek18,19,20,21,22,23. Większość z tych modeli używała płyt o bardzo niskim wiązaniu18,19,20,21,22 lub trans-wells23 w procesie tworzenia sferoidów. Opisany protokół przedstawia technikę wiszących kropel jako alternatywny, wolny od plastiku i opłacalny model sferoidalny guza 3D in vitro. Może to ułatwić ocenę parakrynnej i autokrynnej roli fibroblastów w proliferacji komórek nowotworowych w formacie 3D.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w warunkach sterylnych w laminarnym dygestorium mikrobiologicznym klasy II (patrz Tabela materiałów).
    1. Włączyć dygestorium i odczekać do ustabilizowania przepływu powietrza.
    2. Dokładnie spryskać wewnętrzne powierzchnie dygestorium 70% etanolem, aby wyeliminować ewentualne zanieczyszczenia pozostawione przez poprzednich użytkowników.
    3. Przygotować 5% roztwór dezynfekujący w zlewce szklanej o pojemności 500 mL. Do roztworu należy wrzucać supernatant komórkowy lub szczątki komórkowe.
    4. Dokładnie oczyścić wszystkie mikropipety i pudełka z końcówkami 70% etanolem.
  2. Przygotować świeże podłoża do hodowli komórkowej poprzez uzupełnienie podłoża DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z wysoką zawartością glukozy o 10% dezaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (100 unit/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny) oraz 2 mM L-glutaminy. W przypadku linii komórek gwiaździstych wątroby LX2 należy zmniejszyć stężenie dodatku FBS do 2%.
  3. Podgrzać podłoża hodowlane przed rozpoczęciem eksperymentu.
  4. Wyjąć linie komórek nowotworowych HCC Huh7 i Hep3B oraz linie fibroblastów COS7 i LX2 z regału do przechowywania w ciekłym azocie. Szybko rozmrozić kriokonserwowane komórki.
  5. Rozcieńczyć rozmrożone komórki 2 mL świeżego podłoża hodowlanego. Wirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 mL świeżego, ciepłego podłoża hodowlanego.
  6. Zasiać komórki w kolbie do hodowli komórkowej T75. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przy 95% wilgotności do momentu osiągnięcia przez komórki 60%-70% konfluencji.

2. Zbieranie komórek

  1. Odssać pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć komórki roztworem PBS (phosphate buffer saline).
  2. Dodać 2 mL uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odłączyć komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 min.
  3. Zneutralizować trypsynę, dodając 4 mL pełnej pożywki hodowlanej. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Odlać nadsącz i resuspendować komórki w 4 mL świeżej pożywki hodowlanej.

3. Liczenie komórek

  1. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową na wortexie, aby zapewnić jednorodny rozkład komórek w probówce do wirowania.
  2. Za pomocą pipety 10 µL wymieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu trypanu. Delikatnie pipetuj mieszaninę w górę i w dół cztery razy, aby zapewnić całkowite zabarwienie zewnętrznej powierzchni komórek barwnikiem.
  3. Policz liczbę komórek przy użyciu hemocytometru.
    1. Najpierw nałóż szkiełko nakrywkowe na obszar zliczania hemocytometru przed naniesieniem zabarwionej zawiesiny komórkowej.
    2. Umieść końcówkę pipety z zawiesiną komórkową w rowku V hemocytometru. Delikatnie wprowadź zawartość końcówki na szkiełko do zliczania.
    3. Pozostaw zawiesinę na kilka minut, aby osiadła, przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu w celu zliczenia komórek.
      UWAGA: Aby uniknąć podwójnego liczenia, zliczaj komórki znajdujące się tylko przy dwóch krawędziach dużego kwadratu.
    4. Wliczaj komórki nakładające się na górną lub prawą linię siatki, a pomijaj te nakładające się na dolną lub lewą linię.
  4. Oblicz całkowitą liczbę komórek.
    UWAGA: Liczba komórek na ml = Obliczanie formuły zliczania komórek; równanie ilustrujące analizę rozcieńczenia i stężenia próbki.

4. Pobieranie pożywki warunkowanej (CM) z fibroblastów

  1. Odssać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki LX2 roztworem PBS.
  2. Dodaj 2 ml uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odkleić komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubuj kolbę w 37 °C w inkubatorze przez 4 min.
  3. Inaktywuj trypsynę, dodając 4 ml pełnej pożywki hodowlanej. Zbierz zawiesinę komórkową i odwiruj komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Policz komórki zgodnie z krokiem 3.
  4. Wysiać 1 x 106 komórki LX2 w naczyniu 10 cm3 szalki przez 48 h w temperaturze 37 °C.
  5. Zebrać medium warunkujące (CM) fibroblastów po 48 h. Wirować przy 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej, aby odwirować pływające komórki. Pożywkę CM przefiltruj sterylnie za pomocą 0.22 µm filtr zamocowany na końcówce strzykawek o pojemności 20 ml.
  6. Zebrać nadsącz CM. Rozdzielić CM na aalikwoty do probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać przez 6 miesięcy w temperaturze -80 °C.

5. Walidacja gęstości komórek w celu uzyskania idealnych sferoidów

  1. Odssać pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć linie komórkowe HCC buforem PBS.
  2. Dodać 2 mL uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odkleić komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 min.
  3. Zneutralizować trypsynę poprzez dodanie 4 mL pełnej pożywki hodowlanej. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  4. Policzyć komórki zgodnie z krokiem 3.
  5. Nanieść pipetą różne gęstości komórek z linii nowotworowych (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 i 125 komórek) w 20 µL pożywki na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego o rozmiarze 10 cm3.
  6. Dodać 10 mL sterylnego PBS na dno szalki, aby zapewnić wilgotne warunki dla procesu tworzenia sferoidów.
  7. Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, tak aby pożywka wraz z zawiesiną komórkową zwisała nad wilgotnym środowiskiem. Pozostawić zwisające krople na 3 dni.
  8. Wykonać zdjęcia sferoidów przy powiększeniu 50x za pomocą mikroskopu odwróconego 3 dni po naniosieniu pierwotnych kropli.

6. Heterotypowe sferoidy guzowe/stromalne

  1. Zawiesić 1500 komórek HCC Huh7 wraz z 1500 komórkami fibroblastów ssaczych COS7 (stosunek 1:1) w kroplach wiszących w celu sformowania sferoidów. Do dna naczynia dodać 10 ml sterylnego PBS, aby zapewnić wilgotne warunki dla sferoidów.
  2. Odwróć pokrywkę naczynia o średnicy 10 cm3 szalkę, aby pożywka wraz z zawiesiną komórek mogła zwisać nad wilgotnym środowiskiem. Pozostaw zwisające krople na 3 dni.
  3. Wykonuj zdjęcia sferoidów za pomocą mikroskopu odwróconego od 3. do 10. dnia hodowli.
    1. Umieść 10 cm3 szalkę na stoliku mikroskopu. Dla wszystkich sferoidów ustaw powiększenie mikroskopu na 50x.
    2. Uruchom oprogramowanie mikroskopu na podłączonym komputerze i dostrój ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz każdego sferoidu. Użyj Narzędzie do rejestracji danych w oprogramowaniu mikroskopu, aby zapisać pozyskane obrazy.

7. Homotypowe sferoidy Hep3B w CM z komórek LX2

  1. Zawiesić 3000 komórek HCC Hep3B w wiszących kroplach w celu utworzenia sferoidów. Do dna szalki dodać 10 mL sterylnego PBS, aby zapewnić warunki wilgotnościowe dla sferoidów.
  2. Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, aby medium, w tym zawiesina komórek, zwisało nad wilgotnym środowiskiem. Pozostawić wiszące krople na 3 dni.
  3. Przenieść sferoidy Hep3B do 20 µL świeżego CM z komórek LX2 w wiszących kroplach.
    UWAGA: W procesie przenoszenia sferoidów należy używać sterylnych, autoklawowanych, niefiltrowanych końcówek do pipet o objętości 200 µL, aby uniknąć rozbicia lub uszkodzenia utworzonych sferoidów. Służy to również wyeliminowaniu wszelkich pozostałych komórek, które nie przyłączyły się do głównego, pojedynczego sferoidu.
    1. Do procesu przenoszenia użyć autoklawowanej pipety 20 µL. Ustawić objętość pipety na 2 µL. Zamocować końcówkę do pipety.
    2. Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, na której utworzono sferoidy. Umocować pokrywkę na stoliku mikroskopu świetlnego. Dostroić ostrość mikroskopu, aby każdy sferoid był widoczny.
    3. Ostrożnie usunąć powietrze z mikropipety, naciskając tłok. Włożyć końcówkę pipety do kropli zawierającej sferoid przeznaczony do przeniesienia. Zbliżyć się bardzo blisko sferoidu, nie dotykając go końcówką.
    4. Delikatnie zwolnić nacisk na tłok, aby zassać sferoid do końcówki mikropipety w 2 µL medium.
    5. Przenieść sferoid do nowej kropli zwisającej z nowej szalki 10 cm3, zawierającej nowe medium/medium kondycjonowane/substancję leczniczą.
      UWAGA: Używając mikroskopu świetlnego, upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały pomyślnie przeniesione do nowej szalki 10 cm3.
  4. Wykonaj zdjęcia sferoidów przy powiększeniu 50x przy użyciu mikroskopu odwróconego, począwszy od dnia przeniesienia (dzień 3) aż do 7. dnia hodowli w LX2 CM.

8. Obliczanie objętości sferoidu

  1. Przypisz unikalny identyfikator numeryczny do każdego sferoidu, aby umożliwić codzienne obrazowanie tych samych obiektów.
  2. Przeanalizuj obrazy rosnących sferoidów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    1. Otwórz obraz każdego sferoidu w programie. Użyj narzędzia zaznaczania Freehand i obrysuj każdy sferoid. Z menu rozwijanego Analysis wybierz Set Measurement, a następnie Area. Zatwierdź przyciskiem OK.
    2. Ręcznie narysuj okrąg wokół każdego sferoidu. Po obrysowaniu sferoidu naciśnij Ctrl + M , aby program obliczył powierzchnię sferoidu w pikselach. Przelicz powierzchnię sferoidu na objętość.
      UWAGA: Objętość sferoidumm3 = 0,09403 × Schemat wzoru na powierzchnię sferoidu; (Spheroid area_pixel x 0.28)/1000^1.5 dla biologii obliczeniowej.
    3. Oblicz zmianę objętości sferoidu w stosunku do jego objętości z pierwszego dnia obrazowania.
      UWAGA: Służy to normalizacji objętości sferoidu do objętości początkowej i zwiększeniu dokładności, uwzględniając naturalne różnice w rozmiarze początkowym.

Wyniki

Komórki hodowane w wielowarstwowym formacie 3D dokładniej odzwierciedlają złożoność mikrośrodowiska guza niż konwencjonalne hodowle 2D24,25. Wcześniej w wielu badaniach media hodowlane sferoidów uzupełniano różnymi mitogenami i czynnikami wzrostu26, aby zainicjować tworzenie sferoidów. W niniejszym badaniu dodatek fibroblastów lub ich CM dostarcza niezbędnych mitogenów i czynników wzrostu w celu przyspieszenia wzrostu sferoidów.

Rysunek 1 przedstawia dane z badania pilotażowego, w którym ludzkie komórki HCC Huh7 wysiano z malejącą gęstością, zaczynając od 12 000 aż do 125 komórek w 20 µL świeżego medium przez 3 dni. Gęstość wysiewu 12 000 komórek doprowadziła do powstania sferoidów o asymetrycznym kształcie, który nie uległ poprawie nawet po zmniejszeniu gęstości wysiewu komórek o połowę. Jednakże sferoidy utworzone z 3000 komórek wydawały się bardziej okrągłe (Rysunek 1, górny rząd). Dalsza redukcja stężenia komórek nie pozwoliła ani na sformowanie pojedynczych sfer (sfery o gęstości 125, 250 i 500 komórek), ani nie zapewniła regularnego, sferycznego wyglądu (sferoidy o gęstości 1000 i 1500 komórek). Warto wspomnieć, że przy gęstości 500 komórek nowotworowych powstało wiele małych sfer; jednak przy powiększeniu 50x uchwycono tylko jeden mały sferoid (Rysunek 1, górny rząd). Ten sam zoptymalizowany protokół zastosowano do linii komórkowej fibroblastów nerkowych naczelnych COS7 (Rysunek 1, środkowy rząd). Zawieszenie 125, 250 i 500 fibroblastów COS7 w 20 µL wiszących kropli zaowocowało powstaniem jednego okrągłego sferoidu z wieloma mniejszymi sferoidami, podczas gdy wyższe gęstości komórek (1000, 1500 i 3000) tworzyły pojedyncze, półokrągłe sferoidy. Podobnie jak w przypadku sferoidów nowotworowych Huh7, większe zawiesiny komórkowe (6 000 i 12 000 komórek/sferę) prowadziły do tworzenia nieregularnych agregatów komórkowych, w związku z czym wyższe stężenia komórek odrzucono (Rysunek 1, środkowy rząd). Niskie gęstości heterotypowych zawiesin komórkowych Huh7/COS7 (125, 250 i 500 komórek/sferę) generowały pojedynczy sferoid z wieloma pływającymi lub częściowo przylegającymi sferoidami (Rysunek 1, dolny rząd). Sferoidy heterotypowe złożone z 1000 i 1500 komórek były półokrągłe, podczas gdy gęstość wysiewu 3000 komórek (1500 na typ komórki) dała okrągły sferoid 3D. Jak wspomniano wcześniej, wyższe gęstości komórek prowadziły do tworzenia agregatów, a nie wyraźnie zdefiniowanych sferoidów (Rysunek 1, dolny rząd). Podsumowując, sferoidy o gęstości 3000 komórek były okrągłe, podobnie jak ludzkie guzy HCC, i zostały przyjęte do dalszych eksperymentów. Hodowanie zawiesin komórkowych w formie wiszących kropli przez 3 dni było wystarczające do promowania formowania sferoidów.

Po zoptymalizowaniu najlepszego stężenia komórek i punktu czasowego dla formowania sferoidów w bieżącym kontekście, podłużnie oceniono wpływ proliferacyjny współhodowli linii komórkowych guza i fibroblastów. Rysunki 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają heterotypowe sferoidy Huh7/COS7 (łącznie 3000 komórek na sferoid) monitorowane od dnia 3. do dnia 10. Sferoidy homotypowe Huh7 i COS7 (po 1500 komórek każda) posłużyły jako kontrole. Od 4. dnia sferoidy heterotypowe rosły, przyjmując idealny, okrągły kształt w porównaniu do sferoidów homotypowych (Rysunek 2). Początkowa objętość sferoidu heterotypowego była większa niż objętość każdego ze sferoidów homotypowych. Przyrost sferoidów obliczono jako zmianę ich objętości w stosunku do objętości początkowej w dniu formowania sferoidów, aby uniknąć normalnych różnic w objętości sferoidów (dzień 3, Rysunek 3). Sferoidy heterotypowe wykazały początkowo fazę szybkiego wzrostu od 4. do 7. dnia, po której nastąpiła wolniejsza faza wzrostu w 8. dniu (Rysunki 2, górny rząd, oraz Rysunek 3). Objętość sferoidów zmniejszyła się w 9. i 10. dniu, co prawdopodobnie odzwierciedla wyczerpanie składników odżywczych, powstanie niedotlenionego rdzenia lub śmierć komórek.

W przeciwieństwie do nich, homotypowe sferoidy Huh7 i COS7 rosły w znacznie wolniejszym tempie (Rysunek 2, środkowy i dolny rządek; Rysunek 3). Sferoidy homotypowe wykazywały relatywnie statyczną krzywą wzrostu aż do piątego dnia hodowli (dwóch dni po utworzeniu sferoidów). Od 6. dnia sferoidy homotypowe zaczęły wykazywać stopniowy wzrost krzywej wzrostu, choć w tempie znacznie niższym niż w przypadku sferoidów heterotypowych (Rysunek 3). Podsumowując, heterotypowe sferoidy nowotwór/fibroblast rosną w szybszym tempie niż sferoidy homotypowe, co sugeruje, że bezpośredni kontakt komórek nowotworowych i fibroblastów zwiększa rozmiar sferoidów nowotworowych.

Na koniec, aby zweryfikować powyższe ustalenia i zbadać wpływ parakrynny komórek mezenchymalnych na proliferację sferoidów HCC w kontekście wątrobowym, 3-dniowe homotypowe sferoidy HCC Hep3B hodowano w zwykłej świeżej pożywce lub w CM z hepatycznych komórek gwiaździstych LX2 (Rysunek 4 i Rysunek 5) przez kolejne 4 dni. Z pierwszej obserwacji wynikało, że 3000 komórek Hep3B utworzyło idealnie okrągłe sferoidy po 3 dniach (Rysunek 4). Sferoidy Hep3B wykazywały ciągłą proliferację w świeżej pożywce od 3. do 7. dnia (Rysunek 4, górny rząd). Tempo wzrostu wzrosło, gdy sferoidy Hep3B utrzymywano w CM LX2 (Rysunek 4, dolny rząd). Ta zależna od pożywki zmiana w tempie wzrostu sferoidów Hep3B wykazywała istotność statystyczną od 4. dnia aż do końca eksperymentu (Rysunek 5), co sugeruje indukowaną przez fibroblasty proliferację sferoidów nowotworowych.

Podsumowując, w niniejszym badaniu pomyślnie zmodyfikowano istniejące hodowle sferoidów 3D, aby wykorzystać wzajemne oddziaływania między komórkami nowotworu HCC a różnymi liniami komórkowymi fibroblastów oraz zbadać znaczenie proliferacyjne tej bezpośredniej i pośredniej interakcji komórkowej (Rycina 6). Dalsza charakterystyka utworzonych sferoidów jest niezbędna, aby usprawnić sposób, w jaki komórki nowotworowe oddziałują z otaczającym je mikrośrodowiskiem.

Obrazy mikroskopowe zmienności gęstości komórek w sferoidach Huh7, Cos7 oraz Huh7/Cos7.
Rycina 1: Optymalizacja optymalnej gęstości komórek dla formowania sferoidów. Kolumny reprezentują różne gęstości wysiewu komórek, a wiersze reprezentują sferoidy utworzone z komórek Huh7 (górny wiersz), komórek COS7 (środkowy wiersz) oraz heterotypowych komórek Huh7/COS7 (dolny wiersz). Obrazy przedstawiają sferoidy utworzone po zawieszeniu 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 i 12000 komórek (od lewej do prawej) w 20 µL medium przez 3 dni. Badanie pilotażowe obejmowało dwa sferoidy na warunek, a obrazy wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost sferoidów Huh7/COS7 w ciągu 10 dni, obraz mikroskopowy, porównanie rozwoju sferoidów.
Rycina 2: Wzrost sferoidów heterotypowych w porównaniu do homotypowych. Kolumny reprezentują dzień, w którym wykonano zdjęcia sferoidów, a wiersze przedstawiają reprezentatywne obrazy sferoidów utworzonych z komórek Huh7 (górny wiersz), komórek COS7 (środkowy wiersz) oraz komórek Huh7/COS7 (dolny wiersz). Obrazy przedstawiają sferoidy utworzone po zawieszeniu 3000 komórek dla każdego wariantu (homotypowe Huh7, COS7 lub heterotypowe Huh7/COS7) w różnych punktach czasowych, od lewej do prawej. Eksperyment obejmował 10 sferoidów na wariant, a zdjęcia wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres zmiany objętości sferoidów; sferoidy Huh7, Cos7, heterotypowe; badanie 10-dniowe, istotność statystyczna.
Rycina 3: Analiza podłużna wzrostu sferoidów heterotypowych w porównaniu do homotypowych. Wykres przedstawia krzywą wzrostu heterotypowych sferoidów Huh7/COS7 w porównaniu do homotypowych sferoidów Huh7 i COS7. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m; n = 10 niezależnych sferoidów. ** p < 0.01; ****p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu sferoidów Hep3B, hodowla w pożywce standardowej vs. pożywce LX2, w ciągu 7 dni; analiza obrazów mikroskopowych.
Rycina 4: Wzrost homotypowych sferoidów Hep3B w pożywce LX2 CM. Kolumny reprezentują dzień, w którym wykonano zdjęcia sferoidów, a wiersze przedstawiają reprezentatywne obrazy sferoidów Hep3B hodowanych w świeżej pożywce DMEM (górny wiersz) lub w pożywce LX2 CM (dolny wiersz). W eksperymencie zastosowano siedem sferoidów na każdą warunek (świeża pożywka lub LX2 CM), a zdjęcia wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wzrost sferoidów, porównawczy wykres liniowy; świeża pożywka hodowlana vs. LX2 CM w ciągu 3–7 dni, zmiana objętości.
Rycina 5: Analiza podłużna wzrostu homotypowych sferoidów Hep3B. Wykres przedstawia krzywą wzrostu sferoidów Hep3B w świeżej pożywce DMEM lub w LX2 CM. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m; n = 7 niezależnych sferoidów. ****p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tworzenie sferoidów nowotworowych, konfiguracja mikroskopowa, analiza komórek, wykres zmiany objętości sferoidów w czasie.
Rysunek 6: Schematyczne przedstawienie procesu tworzenia sferoidów. Zawiesinę komórek pipetuje się na wewnętrzną stronę pokrywy szalki Petriego o objętości 10 cm3. Pokrywę odwraca się i pozostawia na 3 dni, aby umożliwić tworzenie sferoidów homotypowych lub heterotypowych. Zdjęcia sferoidów wykonuje się przy 50-krotnym powiększeniu. Rysunek został stworzony przy użyciu internetowego narzędzia do ilustracji naukowej (patrz Tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kontekst, w którym rosną eksperymentalne linie komórkowe, wpływa na ich profil ekspresji genów, analizę szlaku i kryteria funkcjonalne. Na przykład w komórkach raka piersi koordynacja między różnymi szlakami onkogennymi jest zachowana tylko wtedy, gdy komórki rakowe są hodowane w konformacji3D 27. Rozregulowane geny w sferoidach czerniaka 3D i raka piersi, ale nie w komórkach jednowarstwowych, są bardziej istotne dla ludzkiego guza in vivo 28,29. Na przykład poziomy integryny β1 w komórkach nabłonka sutka i odpowiednikach nowotworowych były niższe niż poziomy wyhodowane w formacie2D 29. Co więcej, fibroblasty w strukturach 3D mają tendencję do wyraźnej migracji pod względem morfologii i szybkości w porównaniu z tymi hodowanymi na plastiku30. Ponadto sztywność mechaniczna substratu wzrostu aktywuje specyficzne szlaki, które sprzyjają złośliwej transformacji normalnych komórek nabłonka poprzez deregulację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) / Rho w komórkach nabłonkowych31. Czynniki te sprzyjają przejściu od konwencjonalnej hodowli 2D do modeli sferoidalnych 3D, ponieważ kultury 3D są bardziej zgodne z chorobami ludzkimi.

W obecnym badaniu wykorzystano konwencjonalne narzędzia i materiały laboratoryjne do stworzenia trójwymiarowego modelu sferoidalnego guza. Powstałe sferoidy reagowały na sygnały proliferacji pochodzące z fibroblastów, o czym świadczy ich znacznie zwiększony wzrost. Model ten należy do kategorii sferoid guzów wielokomórkowych. Istnieją trzy inne kategorie sferoid guza 3D, w tym guzy32, sfery nowotworowe pochodzenia tkankowego 33,34 i organotypowe sferoidy wielokomórkowe35. W wielokomórkowych sferoidach nowotworowych komórki nowotworowe są zawieszone w warunkach niskiej adhezji, aby umożliwić im agregację w kule bez dotykania dna naczynia hodowlanego36. Zastosowano kilka podejść, aby zapewnić tę niezależność od zakotwienia, począwszy od systemów obrotowych, technik nakładania płynów i niepowlekanych płyt w kształcie litery U o bardzo niskim mocowaniu37. W HCC większość kultur sferoidalnych in vitro wykorzystuje 24- lub 96-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu do tworzenia zaokrąglonych sferoid 18,19,20,21,22. Technika ta nie jest jednak opłacalna i nie wyklucza przypadkowego kontaktu komórki z plastikiem. Inne systemy wykorzystują trans-studzienki23 lub plastry wątroby12 do produkcji mikrotkanek wątroby. Wykorzystanie tkanek ludzkich w pracach translacyjnych jest złotym standardem, ale nie zawsze dostępnym lub dostępnym dla wielu grup badawczych. Obecne podejście opierało się na teorii wiszących kropel. Zawiesinę komórkową dodaje się tak, że sferoidy guza są formowane w dostępnym interfejsie ciecz-powietrze, tworząc pojedyncze zaokrąglone kule38. Zaletami stosowania tej techniki są brak jakiegokolwiek kontaktu komórka-plastik oraz łatwość badania przesłuchów autokrynnych i parakrynnych między komórkami nowotworowymi a komórkami fibroblastów. Model ten został następnie zweryfikowany w innym badaniu rozszyfrowującym znaczenie niemiąższowego TREM2 w ochronie wątroby przed rozwojemHCC 39. Praca ta wykazała, że objętość zarówno sferoid Hep3B, jak i PLC/PRF5 była wyższa w kontrolnej LX2 CM w porównaniu z nadekspresją TREM2 LX2 CM w sposób zależny od Wnt39.

W obecnym badaniu fibroblasty zmieszano z komórkami nowotworowymi przed utworzeniem sferoidów, aby zbadać proliferacyjny wpływ tej kokultury. Inni dodali fibroblasty, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe z zawiesiną komórek nowotworowych po utworzeniu sferoidy guza w celu zbadania migracji komórek zrębu do guza 40,41. Obecny heterotypowy model sferoidalny wykazywał podobny wzorzec wzrostu do wcześniej opisanych modeli i oryginalnego guza in vivo; Sferoidy wykazują wykładniczy wzrost, po którym następuje opóźniona faza wzrostu, najprawdopodobniej z powodu wyczerpania składników odżywczych i powiększenia nekrotycznego rdzenia42. Zamiast dodawać czynniki wzrostu i mitogeny, aby pomóc w tworzeniu sferoidów, w badaniu zastosowano bardziej fizjologiczne podejście, polegające na tym, że te czynniki wzrostu pochodzą z bezpośredniego kontaktu z fibroblastami lub ich sekretomem w fibroblastach CM. Należy wspomnieć, że komórki LX2 mogą być dalej aktywowane przez leczenie TGFβ1 lub PDGF43. Komórki LX2 traktowano 10 ng / ml TGFβ1 przez 48 godzin przed usunięciem pożywki do różnych warunków eksperymentalnych. Komórki LX2 przemyto trzykrotnie PBS (aby wykluczyć bezpośredni efekt TGFβ1), a następnie dodano świeże podłoże na kolejne 24 godziny przed pobraniem CM. CM zebrany z LX2 stymulowanego TGFβ1 indukował wzrost sferoid Hep3B w szybszym tempie niż CM z kontrolnego LX2 (dane nie pokazane). Ten elastyczny system może nadawać się do kohodowli różnych komórek nowotworowych plus/minus fibroblastów, a także linii pochodzących od pacjentów. Może również zaoferować średnioprzepustowy test przesiewowy dla leków, który można szybko zaadoptować i wprowadzić do procesu odkrywania leków translacyjnych w celu informowania o dawkowaniu w badaniach in vivo.

Ograniczeniem obecnego badania jest wykorzystanie unieśmiertelnionych linii komórkowych w tworzeniu sferoidów, a nie świeżo wyizolowanych komórek nowotworowych HCC i fibroblastów związanych z rakiem. Innym ograniczeniem jest porównanie wzrostu homotypowej sferoidy Hep3B między CM z LX2 a świeżymi pożywkami, a nie CM z innych linii komórkowych niebędących fibroblastami. To ostatnie ograniczenie można rozwiązać poprzez genetyczną modyfikację interesującego genu w fibroblastach, a następnie zastosowanie CM z typu dzikiego w porównaniu z genetycznie modyfikowanymi fibroblastami do homotypowych sferoidów.

Oświadczenia

FO jest dyrektorem i udziałowcem Fibrofind Limited.

Podziękowania

MYWZ jest finansowany przez Sekretarza Stanu ds. Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej oraz Nagrodę Newtona 2020 jako część brytyjskiej Oficjalnej Pomocy Rozwojowej "ODA" i funduszu Newton. SS jest wspierany przez stypendium Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist C53575/A29959. SS, FO i HR otrzymują fundusze w ramach projektu HUNTER, finansowanego dzięki partnerstwu między Cancer Research UK, Fondazione AIRC i Fundación Cientifica de la Asociación Española Contra el Cancer.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x probówki TrypsinSigma Aldrich59429C
2 mlEppendorf
BiorenderBiorender.comOnline
Okap z przepływem laminarnym klasy II BioMAT2Medair Technologies
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)BioseraM-D1107
Excel sofwareMicrosoft office 365
Graphpad prism sofwareOprogramowanie
Dezaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)life tech105000064
Image J oprogramowanieFidżi
L-glutaminaSigma AldrichG7513-100ml
Penicylina/streptomycyna (100 jednostek/ml penicyliny i 100 μ g/ml streptomycyny)Sigma AldrichP0781-100ml
szalka Petriego 90 mm, potrójnie wentylowanaGreiner633175
Trypan niebieskiSigma AldrichT8154
Virkon™ Środek dezynfekujący o szerokim spektrum działania, wiadro 5 kgRely+On™SCI-129999
Mikroskop odwrócony Ziess
GraphPad

Bibliografia

  1. Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6(2021).
  3. Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
  4. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  5. Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
  6. Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
  7. Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).
  8. Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
  9. Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
  10. Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120(2018).
  11. Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
  12. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  13. Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903(2020).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
  16. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  17. Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
  18. Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660(2020).
  19. Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750(2016).
  20. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  21. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297(2018).
  22. Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  23. Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954(2016).
  24. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  25. Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
  26. Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
  27. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
  28. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  29. Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
  30. Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  33. Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
  34. Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
  35. Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39(2014).
  36. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  37. Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
  38. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  39. Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
  40. Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
  41. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  42. Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
  43. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowe sferoidy nowotworoweformowanie sferoid wmetoda wisz cych kroplisferoidy heterotypowesferoidy homotypowemedium warunkowanemikro rodowisko nowotworuanaliza obrazu
Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.