Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanej metodologii przygotowania tkanek gryzoni po eksperymencie niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz wytyczne dotyczące ustalania oświetlenia i ustawień kamer do akwizycji obrazów o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta ma zastosowanie do wszystkich eksperymentalnych fotografii narządów małych zwierząt.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie serca i tkanki mózgowej gryzoni do cyfrowej makrofotografii po niedokrwieniu reperfuzji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofotografia ma zastosowanie do obrazowania różnych próbek tkanek w dużym powiększeniu w celu przeprowadzenia analiz jakościowych i ilościowych. Przygotowanie tkanek i późniejsze uchwycenie obrazu są etapami wykonywanymi bezpośrednio po eksperymencie niedokrwienno-reperfuzyjnym (IR) i muszą być wykonane w odpowiednim czasie i z odpowiednią starannością. W celu oceny uszkodzeń serca i mózgu wywołanych przez podczerwień, w artykule opisano barwienie na bazie chlorku 2,3,5-trifenylo-2H-tetrazolu (TTC), a następnie makrofotografię. Naukowa makrofotografia wymaga kontrolowanego oświetlenia i odpowiedniej konfiguracji obrazowania. Ustandaryzowana metodologia zapewnia wysokiej jakości, szczegółowe obrazy cyfrowe, nawet w przypadku zastosowania niedrogiego, nowoczesnego aparatu cyfrowego i obiektywu makro. Omówiono prawidłowe techniki i potencjalne błędy w przygotowaniu próbek i pozyskiwaniu obrazów, a także podano przykłady wpływu prawidłowych i nieprawidłowych ustawień na jakość obrazu. Podano szczegółowe wskazówki, jak uniknąć typowych błędów, takich jak nadmierne barwienie, niewłaściwe przechowywanie próbki i nieoptymalne warunki oświetleniowe. W tym artykule przedstawiono odpowiednią metodologię krojenia i barwienia serca i tkanki mózgowej szczura oraz przedstawiono wytyczne dotyczące ustalania ustawień oświetlenia i aparatu oraz technik fotograficznych do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości.
Wprowadzenie
Przez dziesięciolecia fotografowanie i analiza próbek serca i tkanki mózgowej były ważną częścią eksperymentów z zakresu nauk przyrodniczych. Postęp naukowy i innowacyjny napędza rozwój drogich mikroskopów zdolnych do osiągania wysokiej rozdzielczości. Mikrofotografie fotograficzne uzyskuje się w dobrze kontrolowanym środowisku oświetleniowym zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami. Z kolei makrofotografia (w powiększeniu 1:2 lub większym) jest często wykonywana w niekontrolowanym środowisku oświetleniowym przy użyciu nieodpowiednich ustawień obrazowania. Często techniki przygotowania próbek i konfiguracji kamery muszą być znacznie zoptymalizowane. W związku z tym fotografie makro o ograniczonej jakości były szeroko publikowane w czasopismach naukowych. Niewystarczająca rozdzielczość obrazu i kontrast ograniczają możliwości precyzyjnej kwantyfikacji obrazu w badaniach w podczerwieni.
Eksperymentalne procedury zawałów mięśnia sercowego1,2 i brain3,4 zawały zostały szczegółowo opisane. Celem tego badania jest dostarczenie przewodnika krok po kroku, jak skonfigurować system do fotografii i standaryzowanej analizy próbek serca i tkanki mózgowej gryzoni po eksperymentach z zawałem. Obejmuje to krojenie tkanek, barwienie i makrofotografię próbek serca i mózgu. Przygotowanie próbek tkanek jest istotną częścią eksperymentu, a wyniki planimetrycznej analizy obrazu zależą w dużym stopniu od jakości uzyskanych obrazów5.
Te metody są szczególnie przydatne do wykonywania pomiarów i analizy planimetrycznej obrazów w tkankach gryzoni i mogą być przydatne w ogólnej naukowej makrofotografii. Ponadto wysoka jakość i spójność obrazów pozwala na zautomatyzowaną analizę zdjęć cyfrowych, co pomaga zaoszczędzić czas, uniknąć wprowadzania danych przez użytkownika i zminimalizować ryzyko błędów lub stronniczości podczas analizy obrazu. Pozwoli to na uzyskanie solidnych i wiarygodnych danych oraz zwiększy przełożenie odkryć przedklinicznych na nowatorskie terapie przeciwniedokrwienne w klinikach.
Protokół
Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej oraz lokalnymi przepisami i politykami (Dyrektywa 2010/63/EU), a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Służbę Żywności i Weterynarii w Rydze, Łotwa.
1. Barwienie i krojenie serca
UWAGA: Techniki opisane w niniejszym protokole mogą być stosowane zarówno po badaniach modelu izolowanego serca szczura lub myszy perfundowanego metodą Langendorffa6,7, jak i w badaniach urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego (IR) serca szczura in vivo8,9,10,11. W przypadku barwienia po badaniu urazu IR in vivo przyjmuje się, że serce zostaje wyjęte, zamocowane na kaniuli i krótko perfundowane w trybie perfuzji Langendorffa.
- Odłącz kaniulę sercową od strzykawki wypełnionej roztworem Krebsa-Henseleita i podłącz ją do strzykawki wypełnionej ciepłym (37 °Croztwór 0,1% błękitu metylenowego w roztworze Krebsa-Henseleita. W przypadku serc szczurzych należy użyć strzykawki o pojemności 5 ml, a w przypadku serc mysich strzykawki o pojemności 1–2 ml.
UWAGA: Alternatywnym rozwiązaniem jest napełnienie aparatury z kontrolą ciśnienia lub przepływu (np. aparat Langendorffa) roztworem zawierającym niebieski barwnik. Podczas procedury odłączenia i montażu niezbędne jest, aby w kaniuli nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza oraz aby nie poluzować szwu użytego do reokluzji tętnicy wieńcowej. - Następnie należy poddać serca szczurze dalszej perfuzji 4 ml roztworu błękitu metylenowego z prędkością ok. 4 ml/min, a serca mysie perfundować 1 ml roztworu błękitu metylenowego z prędkością ok. 0,5–1 ml/min.
UWAGA: W oparciu o doświadczenie obie techniki są bezpieczne i zapewniają odpowiednie barwienie; jednak zastosowanie pompy z kontrolą ciśnienia/systemu ciśnienia hydrostatycznego jest opcją bardziej czasochłonną, ale bezpieczniejszą w kontekście zapobiegania nadmiernemu barwieniu w przypadku początkujących naukowców. - Odłącz kaniulę od strzykawki i zdejmij serce z kaniuli.
- Usuń nadmiar błękitu metylenowego, delikatnie tocząc serce po papierze ręcznikowym. Poluzuj podwiązkę wokół tętnicy wieńcowej poprzez otwarcie kleszczyków hemostatycznych i usunięcie plastikowej rurki z nici chirurgicznej; czynność tę wykonaj dopiero po usunięciu nadmiaru błękitu metylenowego.
UWAGA: Na tym etapie możliwe jest umieszczenie serca myszy w małej plastikowej torebce lub w mikroprobowce wirówkowej o pojemności 5 ml w zamrażarce (-20 °C) przez maksymalnie 5–10 min. Maksymalny czas mrożenia powinien zostać określony doświadczalnie w każdym laboratorium. Krótkotrwałe zamrożenie serca myszy może pomóc początkującemu badaczowi w pocięciu go na plastry o grubości 1 mm. Mrożenie serc szczura nie jest zalecane. Zbyt długie mrożenie, przekraczające 10 min w temperaturze -20 °C należy unikać. - Umieść zabarwione serce szczura w stalowej matrycy (patrz na Tabela materiałów) do krojenia serca (Rysunek 1ANastępnie należy pociąć komory serca na plastry o grubości 2 mm (docelowo 6-7 plastrów z serca dorosłego szczura). W przypadku serc mysich komory serca należy pociąć na plastry o grubości 1,5 mm (docelowo co najmniej 4 plastry z serca dorosłej myszy).
UWAGA: Należy używać żyletek do cięcia zgodnych z macierzą. Generalnie do krojenia serc szczurzych można stosować odpowiednie żylletki jednostronne (np. o grubości do 0,01 cala (0,254 mm)). Żylletki dwustronne są zazwyczaj stosowane do serc mysich i mają zazwyczaj grubość do 0,004 cala (0,1 mm).
Rysunek 1: Matryce do krojenia serca i mózgu szczura. (A) Serce szczura, (B) mózg szczura. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
- Po pocięciu przenieś plastry do plastikowej probówki o pojemności 15 mL. Do probówki z plastrami serca dodaj 5 mL 1% chlorku trifenylotetrazoliu (TTC) rozpuszczonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) i inkubuj przez 10 min w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji w roztworze TTC przemyj plastry serca co najmniej 2-3 razy przy użyciu PBS i przygotuj je do wykonania zdjęć.
2. Barwienie i krojenie mózgu
- Po eksperymencie z okluzją tętnicy środkowej mózgu3,12, wyjmij mózg wraz z pniem mózgu z czaszki i przemyj go w lodowatym PBS.
- Wybierz odpowiedni rozmiar stalowej matrycy do mózgu (patrz Tabela materiałów) w zależności od masy zwierząt (Rysunek 1B). Umieść mózg stroną brzuszną do góry w matrycy.
UWAGA: Po umieszczeniu w matrycy powierzchnia brzuszna mózgu musi być równoległa do górnej powierzchni formy. - Za pomocą ostrzy ogranicz przednią i tylną część mózgu (po 2 ostrza z każdej strony).
UWAGA: Należy używać ostrzy do cięcia kompatybilnych z matrycą. W przypadku krojenia mózgu szczura można zazwyczaj zastosować kompatybilne, jednostronne ostrze brzytwy (o grubości do 0,01 cala (0,254 mm)). - Wsuń ostrza częściowo (bez całkowitego przecięcia mózgu) do kanałów pomiędzy pierwsze a ostatnie ostrze. Gdy wszystkie ostrza zostaną włożone i ułożone równolegle, dociśnij je jednocześnie dłonią, aby pokroić mózg w 2 mm plastry koronalne.
- Mocno chwyć ostrza po bokach dwoma palcami i wyjmij je wraz z pokrojonym mózgiem z matrycy.
- Ułóż plastry mózgu jeden po drugim w kuwecie (70 mL, 72 x 72 mm). Podczas układania upewnij się, że powierzchnia przednia każdego plastra jest zawsze skierowana do góry.
- Wlej ciepły (+37 °C) 1% roztwór TTC w PBS na plastry mózgu i inkubuj je przez 8 min w 37 °C w ciemności.
UWAGA: Plastry mózgu muszą być całkowicie zanurzone w roztworze TTC podczas inkubacji. - Po inkubacji w 1% roztworze TTC przenieś plastry mózgu do niebieskiej plastikowej kuwety w celu wykonania zdjęć. Ułóż plastry mózgu w kolejności od części przedniej do tylnej i za pomocą skalpela rozdziel półkule w płaszczyźnie strzałkowej.
UWAGA: Powierzchnia kuwety powinna być zmywalna, matowa i mieć kolor kontrastujący z plastrami mózgu (tj. nie może być czerwona, biała ani bladoróżowa).
3. Makrofotografia
- Wykonaj zdjęcia plastrów tkanki natychmiast po barwieniu.
UWAGA: Plastry serca można przechowywać w zimnym PBS (w temperaturze +4 °C) lub w roztworze formaliny do 30 min. Plastry mózgu można przechowywać w formalinie przez dłuższy czas (1-2 tygodnie). - Przygotuj wybrany aparat z naładowaną baterią, kartą pamięci i zamocowanym obiektywem na statywie (Rysunek 2)
UWAGA: Włącz oświetlenie co najmniej 5-10 min przed akwizycją obrazu, aby rozgrzać sprzęt. Lampy LED osiągają pełną jasność w ciągu mikrosekund.
Rysunek 2: Aparat i oświetlenie ustawione do fotografii makro. Aparat znajduje się prostopadle do powierzchni obrazowania, aby zapewnić, że płaszczyzna ostrości aparatu jest równoległa do próbek. Skrót: LED = dioda emitująca światło. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- W zależności od dostępnych źródeł światła należy wybrać odpowiednie ustawienia balansu bieli lub przeprowadzić kalibrację temperatury barwowej zgodnie z instrukcją obsługi aparatu.
UWAGA: Preferowanym źródłem światła jest białe światło LED (temperatura barwowa 6 500 K), aby uniknąć migotania światła charakterystycznego dla żarówek fluorescencyjnych. - Przełącz aparat w tryb w pełni manualny, ustaw ISO 100 oraz przysłonę na f/10 i dostosuj czas naświetlania dla uzyskania optymalnej ekspozycji obrazu. Upewnij się, że płaszczyzna ogniskowa aparatu jest równoległa do powierzchni, na której zostanie umieszczona próbka.
UWAGA: Funkcja histogramu jest przydatna, aby upewnić się, że skrawki tkanek nie są prześwietlone. - Podłącz lub aktywuj przewodowy lub bezprzewodowy wyzwalacz zdalny, aby zapobiec drganiom aparatu podczas zwalniania migawki.
UWAGA: Alternatywą jest włączenie funkcji samowyzwalacza, która opóźni wyzwolenie migawki o 2 lub 10 s po naciśnięciu przycisku spustowego. - Zanurz skrawki serca całkowicie w pojemniku z PBS.
UWAGA: Zanurzone preparaty mają tendencję do odpływania ze swojego miejsca. Aby zminimalizować przesuwanie się skrawków, należy użyć jak najmniejszej tacy, w której zmieszczą się wszystkie skrawki, oraz minimalnej ilości roztworu zanurzeniowego, zapewniając pełne zanurzenie preparatu. Alternatywne metody obejmują umieszczenie skrawków pomiędzy szkiełkami przedmiotowymi lub zastosowanie filtra polaryzacyjnego na obiektywie. Kołowy filtr polaryzacyjny mocuje się do obiektywu i obraca do momentu zniknięcia odbić w podglądzie na żywo (live-view) w aparacie. - Ułóż skrawki mózgu w suchej tacy, bez PBS ani innych cieczy.
UWAGA: Filtr polaryzacyjny jest bardzo wygodny przy przechwytywaniu obrazów skrawków mózgu. - Umieść pojemnik ze skrawkami pod aparatem z obiektywem makro i upewnij się, że wszystkie skrawki w pełni mieszczą się w polu widzenia. Upewnij się, że skrawki znajdują się w tej samej płaszczyźnie, tzn. nie są wygięte ani zwinięte.
- Sprawdź ekspozycję i w razie potrzeby dostosuj ustawienia aparatu.
UWAGA: Po ustawieniu nie zmieniaj ekspozycji ani innych parametrów przez cały czas trwania eksperymentu. - Zapisz numer (lub inny identyfikator) próbki i wykonaj zdjęcie skrawka tkanki za pomocą wyzwalacza zdalnego.
UWAGA: W przypadku konieczności bezwzględnego określenia rozmiaru preparatu, w polu widzenia powinna znaleźć się skala, np. linijka milimetrowa. - Obróć skrawki i wykonaj ich zdjęcia z drugiej strony.
Wyniki
Rysunek 3A przedstawia fotografię przekroju serca barwionego błękitem metylenowym i TTC po zawałach mięśnia sercowego, która zawiera wystarczającą liczbę szczegółów i informacji o kolorze do dalszej analizy planimetrycznej wielkości zawału (Rysunek 3B). Przebadaliśmy, w jaki sposób zamrażanie serca przez 24 h wpływa na integralność tkanek serca (Rysunek 3C). Zamrażanie przez dłuższy czas (>1 h, Rysunek 3C) ogranicza funkcje mitochondriów; w konsekwencji barwienie serca TTC nie jest czerwone, lecz bladoróżowe, a granica między tkankami nekrotycznymi a żywymi jest rozmyta (Rysunek 3C).
Ponadto porównano dwie metody redukcji odbić w preparatach. Imersja jest najskuteczniejszą metodą i pozwala na uzyskanie szczegółowych obrazów o dobrym kontraście (Rysunek 4A). Drugą metodą jest zastosowanie filtra polaryzacyjnego przymocowanego do obiektywu. Filtr polaryzacyjny jest również efektywny; jednakże lekko obniża on rozdzielczość i mikrokontrast obrazu (Rysunek 4B). Przykładowy obraz przekroju serca bez zastosowania imersji lub filtra (Rysunek 4C) zawiera wiele odbić i nie nadaje się do dalszej analizy.
Przetoki mózgu nie są zanurzone ze względu na problemy z ich rozmieszczeniem (pływaniem). W analizie planimetrycznej istotne jest porównanie strony nieobjętej zmianami (zdrowej) mózgu (Rysunek 5A) ze stroną dotkniętą udarem (Rysunek 5B). Przetoki mózgu są łatwiejsze do opanowania na suchej płytce lub tacy, a do usunięcia odblasków stosuje się filtr polaryzacyjny. Do fotografowania przetok mózgu wykorzystuje się tacę z niebieskim tłem (dobór tła opisano wcześniej5).
Aby zapewnić pełną kontrolę nad ekspozycją i balansem bieli, zastosowano ręczne ustawienia aparatu. Ustawienia aparatu należy dostosować przed rozpoczęciem lub na początku eksperymentu, w zależności od dostępnego źródła światła. Zapewnia to optymalną ekspozycję i balans bieli wszystkich obrazów, co umożliwia jednolitą analizę (Rysunek 6A). Automatyczne ustawienia aparatu nie są idealne i mogą prowadzić do zmienności parametrów obrazowania, co skutkuje niewłaściwymi wynikami i wprowadzeniem zmienności między poszczególnymi obrazami.
Rysunek 6 przedstawia przykłady obrazów prześwietlonych (Rysunek 6B) oraz niedoświetlonych (Rysunek 6C) przekrojów serca. Należy poświęcić wystarczającą uwagę prawidłowym ustawieniom balansu bieli kamery, aby dopasować go do konkretnego źródła światła zastosowanego w układzie kamera-oświetlenie. Nieprawidłowe ustawienia balansu bieli mogą spowodować przesunięcie obrazu w stronę odcieni niebieskiego lub żółtego (Rysunek 6D) oraz purpurowego lub zielonego (Rysunek 6E).
Rycina 3: Obrazy przekrojów serca szczura. (A) Świeży przekrój serca został przeanalizowany w oprogramowaniu ImageProPlus 6.3 przy użyciu segmentacji kolorów (B). (C) Barwienie TTC słabo rozróżnia tkankę żywotną od martwiczej w zamrożonym przekroju serca (zamrożonym przez 24 h). Skrót: TTC = chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Techniki redukcji odblasków. Obraz przekroju serca szczura wykonany przy zanurzeniu w PBS (A) oraz z użyciem filtra polaryzacyjnego (B). (C) Przekrój serca z odblaskami, gdy nie zastosowano ani zanurzenia, ani filtra. Skrót: PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Obrazy przekrojów mózgu szczura. Mózg szczura został podzielony na siedem przekrojów i zabarwiony TTC po niedokrwieniu i reperfuzji. Zastosowanie filtru polaryzacyjnego pozwoliło na uzyskanie obrazu wolnego od odbić. (A) Przekroje z nieuszkodzonej półkuli; (B) Przekroje z półkuli objętej udarem. Skrót: TTC = chlorek 2,3,5-trifenylo-2H-tetrazoliu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Obrazy przekrojów serca szczura. Prawidłowo (A) i nieprawidłowo (B-E>) wykonane obrazy przekrojów serca. Nieprawidłowe ustawienia ekspozycji prowadzą do obrazów prześwietlonych (B) oraz niedoświetlonych (C). Nieprawidłowe ustawienia balansu bieli skutkują żółtym (D) lub zielonym zabarwieniem obrazu (E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przygotowanie serca po IR rozpoczyna się od ponownego zamknięcia tętnic sercowych krwi i perfuzji niebieskiego barwnika w celu odróżnienia obszarów zagrożonych od obszarów niezagrożonych. Do tego celu najczęściej stosuje się barwniki błękitu metylenowego lub niebieskiego Evansa2. Ponieważ zbyt wysokie ciśnienie może uszkodzić zastawki serca, a tym samym częściowo lub całkowicie zabarwić zagrożone obszary, lepiej jest wykonać perfuzję serca za pomocą systemu kontrolowanego ciśnieniem, takiego jak aparat Langendorffa lub uproszczona wersja strzykawki lub pompy wyposażonej w system ciśnienia hydrostatycznego. Kontrolowana perfuzja zapewni ciśnienie fizjologiczne, a barwnik zwykle nie dostanie się do niedrożnego obszaru serca. Zarówno techniki kontrolowane prędkością, jak i ciśnieniem przepływu są zabezpieczeniem przed nadmiernym zabrudzeniem.
Jednym z najpoważniejszych błędów w przetwarzaniu tkanek żywotnych jest przechowywanie tkanek w zamrażarce przez dłuższy czas przed barwieniem. Zamrażanie jest stosowane głównie dlatego, że naukowcy chcą przeprowadzić barwienie serca dzień po eksperymencie w podczerwieni lub później. Ponadto zamrażanie służy do ułatwienia cięcia serca. Odkryliśmy, że krótkotrwałe zamrożenie serca na okres do 5-10 minut nieistotnie wpływa na integralność tkanek serca i ułatwia cięcie tkanek (szczególnie w przypadku serc myszy) na cienkie plasterki. Jednak zamrażanie przez dłuższy czas uszkadza błony i zmniejsza żywotność komórek oraz funkcję mitochondriów13. W rezultacie zaburzone jest barwienie TTC funkcjonujących mitochondriów, a granica między tkankami martwiczymi i żywotnymi jest słabo wytyczona (rozmyta). Ogólnie rzecz biorąc, należy unikać zamrażania szczurów i tylko krótkotrwałe zamrażanie serc myszy może być stosowane w celu łatwiejszego cięcia.
Kolejnym krokiem jest barwienie tkanek w 1% roztworze TTC w temperaturze 37 °C14. Roztwór barwiący powinien być wstępnie podgrzany - szczególnie ważne w przypadku barwienia wycinków mózgu. W przypadku stosowania wstępnie podgrzanego roztworu optymalny czas barwienia plastrów serca wynosi 10 minut. Dłuższa inkubacja lub temperatura wyższa niż 37 °C powoduje brązowe zabarwienie tkanek serca. Odpowiednie barwienie próbek i stała intensywność czerwonego koloru są ważne dla dalszej analizy obrazu. W końcowych krokach przed fotografią plastry tkanki są płukane 2-3 razy zimnym PBS lub podobnym buforem w celu usunięcia TTC i nadmiaru błękitu metylenowego z roztworu, aby uniknąć niebieskiego odlewania na zdjęciu. Wycinki serca należy sfotografować wkrótce po barwieniu, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. Barwienie serca pozostaje dobrej jakości, jeśli jest przechowywane do 60 minut w zimnym (+4 °C) PBS. Poplamione wycinki mózgu i tkanki aorty są zwykle przechowywane w 4% neutralnym roztworze formaldehydu i zachowują dobrą jakość przez tydzień. Przechowywanie tkanek mózgowych przez noc w formalinie (+4 °C) nie pogarsza intensywności koloru normalnej tkanki i jest dopuszczalne do uzyskania obrazu. Jednak formalina wywołuje obrzęk i odbarwienie plastrów serca. Dlatego nie zaleca się przechowywania tkanek serca w formalinie.
Kolejnym krokiem jest pozyskanie obrazu. Wiele laboratoriów używa skanerów płaskich jako narzędzia do pozyskiwania obrazów, które ma zastąpić aparat cyfrowy i konfigurację oświetlenia. Ustaliliśmy, że skanowanie wycinków nie zapewnia wystarczającej rozdzielczości obrazu i separacji kolorów, a zatem nie nadaje się do obrazowania wycinków serca. W szczególności rozdzielczość skanera jest niewystarczająca dla serc myszy i zauważyliśmy słabe renderowanie błękitu metylenowego. Natomiast skaner może być alternatywą dla aparatu fotograficznego do obrazowania wycinków mózgu barwionych tylko TTC lub innymi pojedynczymi barwnikami. Do skanowania wycinków tkanek niezbędne jest oprogramowanie skanujące, które zapewnia stałe ustawienia ekspozycji. Ogólnie rzecz biorąc, skaner płaski jest mniej wydajny i nie może zastąpić aparatu cyfrowego w większości zastosowań związanych z obrazowaniem.
Ważne jest również tło za okazami. Idealnie, dno tacy powinno mieć kolor niewystępujący w poplamionej próbce. Na przykład, aby określić ilościowo obszar barwienia błękitem metylenowym i TTC (czerwonym) w sposób automatyczny lub półautomatyczny, należy unikać białego, czerwonego, niebieskiego, żółtego i brązowego tła. Dlatego preferowane byłoby zielone tło. Niemniej jednak wybór kolorów zależy od preferencji operatora, który dokonuje obróbki końcowej obrazu. Wielu naukowców preferuje białe tło, ponieważ białe tło można usunąć w procesie przetwarzania końcowego obrazu i przekształcić w całkowicie białe (kod bieli RGB 255,255,255). Następnie należy wykluczyć całkowicie biały z listy wybranych kolorów używanych do analizy półautomatycznej i policzyć tylko blade obszary martwicze, które nie są całkowicie białe, jeśli nie są prześwietlone. Niebieskie i zielone tła nadają się do fotografowania wycinków mózgu i aort.
Optymalnym narzędziem do obrazowania do fotografii tkankowej jest lustrzanka jednoobiektywowa lub bezlusterkowiec z wymiennymi obiektywami i kompatybilnym obiektywem makro. Uchwycenie bardzo małych obiektów może wymagać połączenia aparatu fotograficznego i mikroskopu; Niemniej jednak obiektyw makro ma zwykle wystarczające powiększenie (co najmniej 1:2), aby uzyskać szczegółowe obrazy serca myszy. Wielu producentów oferuje niedrogie aparaty cyfrowe i obiektywy makro do uzyskiwania zdjęć w wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu. Wszystkie nowoczesne aparaty cyfrowe posiadają cechy i funkcje niezbędne w makrofotografii, w tym możliwość montażu na stojaku, dużą liczbę pikseli (zwykle >20 Mpx), podgląd na żywo, blokadę lustra, funkcje poklatkowe, zdalną migawkę oraz możliwość ręcznego ustawiania parametrów aparatu, zapewniając w ten sposób stały czas otwarcia migawki, przysłonę, balans bieli i ustawienie ISO. Aparaty kompaktowe z wyżej wymienionymi funkcjami i powiększeniem obiektywu co najmniej 1:2 mogą być również używane do makrofotografii. Ze względu na charakterystykę obiektywu, niektóre aparaty kompaktowe powinny być umieszczone w bliskiej odległości od obiektu, a eksperymentator musi upewnić się, że korpus kamery nie wpływa na oświetlenie próbki.
Do makrofotografii z dowolnym typem aparatu z wymiennymi obiektywami wymagany jest obiektyw makro o dużym powiększeniu (1:1-1:2). Sugerujemy stosowanie obiektywów makro o ogniskowej od 50 mm do 100 (120) mm lub odpowiedników z matrycą pełnoklatkową (24 mm x 36 mm). Aparaty z mniejszymi matrycami mają różne rozmiary matryc, a powiększenie powinno zostać odpowiednio przeliczone. W przypadku fotografowania plastrów serca ergonomiczna odległość przedniej soczewki obiektywu makro 100 mm od obiektu wynosi około 150 mm. To ustawienie umożliwia operatorom trzymanie całego sprzętu na stole, z łatwym dostępem do elementów sterujących kamery. Obiektyw makro 50 mm może być brany pod uwagę do fotografowania większych obiektów, takich jak wycinki mózgu, ponieważ szersze pole widzenia jest niezbędne do uzyskania wszystkich wycinków na jednym zdjęciu.
Aby uzyskać ostre obrazy o wysokiej rozdzielczości, aparat fotograficzny powinien być zamontowany na solidnym stojaku, który wraz z lekkim zestawem nazywa się stojakiem fotograficznym. Zamontowanie kamery na statywie i zdalny spust (przewodowy lub bezprzewodowy) eliminuje drgania kamery i zapewnia stałą odległość od celu. Ustawienie oświetlenia kamery z dwoma stałymi źródłami światła z obu stron, ustawionymi pod kątem około 30-60° w stosunku do płaszczyzny obiektu, zapewnia wystarczające oświetlenie preparatów i jednocześnie pomaga uniknąć odbić. Kamera powinna być zamontowana dokładnie tak, aby czujnik był równoległy do płaszczyzny obiektu. Aby równomiernie oświetlić pole obrazu, obie lampy powinny być jednakowo zorientowane i umieszczone w tej samej odległości od obiektu. Źródła światła umieszczone w różnych odległościach od obiektu powodują nierównomierne oświetlenie. Dodatkowo źródła światła są przyczyną różnic w ekspozycji obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, ważne jest, aby dokładnie umieścić kamerę i źródła światła, aby precyzyjnie uzyskać obrazy dobrze oświetlonych okazów.
Próbki tkanek odbijają światło (błyszczą), które na obrazach pojawiają się jako białe plamy. Te plamki odbicia światła nie zawierają użytecznych informacji o kolorach, w związku z czym te części obrazów nie mogą być używane do dokładnej analizy ilościowej obrazów. Odbicia światła od plastrów tkanki można usunąć różnymi metodami. Najbardziej efektywne jest pełne zanurzenie próbek tkanek w pojemniku z roztworem soli fizjologicznej lub PBS. Podobnym podejściem jest wprowadzenie wycinków tkanki poniżej (lub pomiędzy) szklanymi płytkami. Ta metoda jest skuteczna w walce z odbiciami; Jednak rozdzielczość obrazu może być niższa niż w przypadku zdjęć zanurzonych tkanek.
Można również użyć filtra polaryzacyjnego zamontowanego na soczewce, aby wyeliminować odbicia światła. Kołowe filtry polaryzacyjne są powszechnie dostępne, ale różnią się znacznie jakością w zależności od ceny, a tanie filtry mogą znacznie obniżyć rozdzielczość obrazu. Odbite światło można odfiltrować, obracając ruchomą część filtra polaryzacyjnego pod kątem. Na skuteczność filtra polaryzacyjnego mogą mieć wpływ niektóre źródła światła (np. silne światło LED). Ogólnie rzecz biorąc, po usunięciu dodatkowego płynu, filtr polaryzacyjny może wyeliminować wszystkie odbicia od wycinków mózgu; Jednak zanurzenie próbki w roztworze buforowym jest najłatwiejszym i najbardziej opłacalnym podejściem w przypadku plastrów serca.
Ręczne ustawienia czasu otwarcia migawki, przysłony, czułości ISO i balansu bieli są ważne dla zachowania pełnej kontroli nad procesem obrazowania. Próbka, tło i charakterystyka źródła światła wpływają na system pomiaru ekspozycji aparatu w ustawieniach automatycznych; Dlatego ustawienia ręczne są konieczne, aby utrzymać stałą ekspozycję i balans bieli między wieloma zdjęciami podczas eksperymentu. W przypadku makrofotografii sugerowane ustawienie przysłony to od f/8 do f/16. Zmniejszając przysłonę, zwiększa się głębia ostrości, co jest pomocne, jeśli obiekt nie znajduje się w jednej płaszczyźnie. Jednak dyfrakcja ogranicza całkowitą rozdzielczość fotografii w przypadku mniejszych przysłon. Optymalna przysłona dla większości obiektywów to zwykle f/10, ponieważ przy tym ustawieniu spadek rozdzielczości jest znikomy, a głębia ostrości jest wystarczająca. Wartości ISO, które mieszczą się w zakresie od 50 do 400 (im mniej, tym lepiej), są zwykle optymalne, aby zminimalizować artefakty obrazu (szumy). Czas otwarcia migawki pozostaje następnie do zmiany, aby uzyskać prawidłową ekspozycję przy użyciu wspomnianych ustawień przysłony i ISO w istniejących warunkach oświetleniowych. Ustawienia ręczne są ważne dla spójnej analizy obrazu. Ustandaryzowane obrazowanie zapewnia stosowanie tych samych ustawień progów kolorów w każdym badaniu, co wymaga analizy segmentacyjnej. Na przykład półautomatyczna analiza za pomocą oprogramowania ImagePro oparta na pliku segmentacji z predefiniowanymi kolorami niebieskim, czerwonym i białym (+blady róż) może być stosowana przez lata, jeśli obrazy próbek mają spójne kolory, balans bieli i ekspozycję.
Ustawienie balansu bieli należy dostosować w zależności od temperatury barwowej źródła światła, które jest używane do oświetlania próbki. Balans bieli można wybrać z wbudowanych ustawień wstępnych aparatu lub za pomocą ręcznej kalibracji szarego obiektu. Zaletą przechwytywania obrazu w formacie RAW jest to, że balans bieli można regulować podczas programowego przetwarzania końcowego obrazu. Ponieważ pliki RAW zawierają znacznie więcej informacji niż pliki JPEG, przetwarzanie końcowe plików RAW stanowi doskonałą okazję do korekcji balansu kolorów i ekspozycji, a także do uzyskania lepszej rozdzielczości obrazu. Ponieważ większość aparatów może jednocześnie przechwytywać pliki JPEG i RAW, zalecamy przechwycenie pliku RAW i zapisanie go jako kopii zapasowej.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje metodologię krojenia i barwienia serca i tkanki mózgowej szczura oraz zawiera wytyczne dotyczące ustalania ustawień oświetlenia i kamery oraz technik fotograficznych do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości do dalszej analizy. Metoda ta ma zastosowanie do wszystkich eksperymentalnych fotografii narządów małych zwierząt.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Autorzy otrzymali wsparcie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 857394, Projekt FAT4BRAIN.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1 ml | Sagimed | N/A | |
| Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| Strzykawka 5 ml | Sagimed | N/A | |
| Strzykawka 50 ml | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Kaniula aortalna do serca myszy | ADInstruments | SP3787 | |
| Kaniula aortalna do serca szczura | ADInstruments | SP3786 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny, ≥ 99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Kleszcze szklane nakrywkowe, kątowe | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Kleszcze hemostatyczne | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alfa Okrągły filtr polaryzacyjny | Hoya | HOCPA62 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Penta | 16330-31000 | |
| Błękit | metylenowySigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Rurki z tworzywa sztucznego z polietylenu | BD Intramedic | N/A | |
| Chlorek potasu do biochemii | Acros Organics | 418205000 | |
| Fosforan potasu, monozasadowy, ≥ 99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Krajalnica do serca szczura Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Nożyczki zakrzywione z końcami | Agnthos | 14013-15 | |
| Nożyczki do czyszczenia serca | Agnthos | 14058-11 | |
| Żyletki jednoostrzowe | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Wodorowęglan sodu do biochemia, 99,5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Chlorek sodu | Odczynniki Fishera | BP358-10 | |
| Bezlusterkowy aparat cyfrowy Sony Alpha a6000 | ILCE6000 | Może być ponownie zainstalowany przez dowolny nowoczesny aparat cyfrowy | |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Ważne, obiektyw powinien być kompatybilny z aparatem |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Klasa 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Ostrze chirurgiczne | Heinz Herenz Hamburg Niemcy | BS2982 | |
| Wytrząsarka termiczna | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Kleszczyki do tkanek zębatych | Agnthos | 11021-12 | |
| Ząbkowane kleszczyki tkankowe do czyszczenia serca | Agnthos | 11023-10 | |
| Tacka wagowa, 70 ml | Sarsted | 71,99,23,212 |
Bibliografia
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39(2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978(2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069(2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908(2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2464(2011).
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
Przedruki i uprawnienia
