Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół heterotopowego przeszczepu serca u świń w celu dostarczenia leków do alloprzeszczepu serca

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63114

⸱

14 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Department of Surgery, Duke University, 2Perfusion Services, Duke University, 3Division of Surgical Sciences, Department of Surgery, Duke University, 4Division of Laboratory Animal Resources, Duke University, 5Gift of Hope Organ and Tissue Donor Network, 6College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, 7TransMedics, Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół wykorzystania normotermicznego systemu perfuzji krwi ex vivo do dostarczania środków terapeutycznych do całego alloprzeszczepu serca w heterotopowym modelu przeszczepu serca u świń.

Streszczenie

Transplantacja serca jest złotym standardem leczenia schyłkowej niewydolności serca. Pozostaje jednak ograniczony liczbą dostępnych serc dawców i powikłaniami, takimi jak pierwotna dysfunkcja przeszczepu i odrzucenie przeszczepu. Niedawne zastosowanie kliniczne urządzenia do perfuzji ex vivo w transplantacji serca stwarza wyjątkową okazję do leczenia alloprzeszczepów serca interwencjami terapeutycznymi w celu poprawy funkcji i uniknięcia szkodliwych reakcji biorcy. Stworzenie translacyjnego, dużego modelu zwierzęcego do dostarczania terapeutycznego do całego przeszczepu alloidalnego ma zasadnicze znaczenie dla testowania nowych podejść terapeutycznych w transplantacji serca. Heterotopowy model przeszczepu serca u świń w pozycji wewnątrzbrzusznej służy jako doskonały model do oceny efektów nowych interwencji i immunopatologii odrzucania przeszczepu. Model ten dodatkowo zapewnia świni długoterminowe przeżycie, biorąc pod uwagę, że przeszczep nie jest wymagany do utrzymania krążenia biorcy. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnego i solidnego podejścia do osiągnięcia ex vivo dostarczania leku do całego alloprzeszczepu serca przed przeszczepem oraz dostarczenie szczegółów technicznych umożliwiających przeprowadzenie przeżycia heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex vivo.

Wprowadzenie

Niewydolność serca to stan, który dotyka około 6 milionów dorosłych w Stanach Zjednoczonych i przewiduje się, że wzrośnie do 8 milionów dorosłych do roku 20301. Przeszczep serca jest złotym standardem leczenia schyłkowej niewydolności serca. Nie jest to jednak pozbawione ograniczeń i komplikacji. Pozostaje ograniczony przez liczbę dostępnych serc dawców, pierwotną dysfunkcję przeszczepu, odrzucenie serca i skutki uboczne długotrwałej immunosupresji2. Ograniczenia te są szczególnie ważne u młodych biorców, u których może wystąpić niewydolność przeszczepu alloidalnego i wymagać późniejszego ponownego przeszczepu w celu osiągnięcia normalnej oczekiwanej długości życia.

Idealną interwencją do pokonania tych ograniczeń byłoby leczenie całych alloprzeszczepów serca terapiami przed implantacją do biorcy, które mogą poprawić żywotność alloprzeszczepu i zapewnić "kardioprotekcję". Takie interwencje byłyby stosowane profilaktycznie w celu zminimalizowania występowania urazów niedokrwiennych, odrzucenia alloprzeszczepu serca, waskulopatii alloprzeszczepu serca, a nawet naprawy alloprzeszczepów brzeżnych. Badania translacyjne mające na celu opracowanie tego typu interwencji wymagają dużego modelu przeszczepu serca na zwierzętach, aby umożliwić długoterminowy nadzór nad przeszczepem serca. Heterotopowy model przeszczepu serca u świń w pozycji wewnątrzbrzusznej okazał się idealny do tego celu. Przeszczep serca w tej pozycji pozwala na testowanie efektów nowatorskich terapii i ocenę immunopatologii odrzucenia przeszczepu. Dodatkowo, model heterotopowy jest korzystniejszy w stosunku do modelu ortotopowego ze względu na lepsze całkowite przeżycie biorcy, brak konieczności stosowania krążenia pozaustrojowego i brak wymogu przeszczepu w celu utrzymania krążenia biorcy3.

Skuteczne dostarczanie interwencji terapeutycznych do serca, takich jak terapia genowa, komórkowa lub immunologiczna, stanowi istotną barierę dla zastosowania klinicznego4,5. Technologia wprowadzona przez urządzenia do perfuzji ex vivo pozwala na ciągłą perfuzję przeszczepów, utrzymując je w stanie niedziałającym, ale aktywnym metabolicznie6,7,8,9. Daje to wyjątkową okazję do leczenia całego serca zaawansowanymi terapiami przy jednoczesnym zminimalizowaniu potencjalnych skutków ubocznych podawania ogólnoustrojowego10,11,12,13. Kolejną zaletą stosowania urządzeń perfuzyjnych ex vivo do dostarczania terapeutycznego jest to, że umożliwiają one podawanie leków do krążenia wieńcowego przez dłuższy czas, co nie jest możliwe przy użyciu tradycyjnych metod przechowywania w niskiej temperaturze. Pozwala to na bardziej globalne dostarczanie środków terapeutycznych do klasy graft14. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, z powodzeniem dostarczyliśmy gen lucyferazy świetlika do przeszczepu serca całej świni przy użyciu wektorów adenowirusowych15. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnego i solidnego podejścia do dostarczania leku do całego przeszczepu allogenicznego serca przed przeszczepem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wybrano dwie samice świni z Jukatanu, z których jedna została wyznaczona na dawcę przeszczepu serca, a druga na biorcę. Zaleca się świnie w wieku 6-8 miesięcy, o wadze około 30 kg i posiadające zgodne grupy krwi. Przegląd protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Pomieszczenia i zabiegi lecznicze dla świń są wykonywane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Medycznego Uniwersytetu Duke'a.

1. Przygotowanie urządzenia do perfuzji ex vivo

  1. Przygotować urządzenie do perfuzji ex vivo i urządzenie do oszczędzania komórek do użycia zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Przygotuj skrzynkę stymulacji i defibrylator i skonfiguruj je.
  3. Miej pod ręką urządzenie do testowania w miejscu opieki nad pacjentem (POC), aby sprawdzić pełną morfologię krwi (CBC), podstawowy panel metaboliczny (BMP) i gazometrię krwi tętniczej (ABG).
  4. Do roztworu perfuzyjnego dostarczonego przez producenta, jeśli nie jest on jeszcze obecny w roztworze perfuzyjnym producenta, należy dodać następujące leki: 100 ml 25% albuminy, 10 ml 200 mg/100 ml cyprofloksacyny, 1 g cefazoliny sodowej, dwie fiolki po 5 ml multiwitaminowego wstrzykiwań, 250 mg metyloprednizolonu, 10 000 j.m. heparyny, i 50 j.m. insuliny.
    1. Przeprowadzić badanie POC roztworu gruntowego urządzenia ex vivo, aby upewnić się, że poziomy elektrolitów mieszczą się w normalnym zakresie fizjologicznym. Jeśli nie, należy odpowiednio podać glukonian wapnia, dekstrozę i/lub wodorowęglan sodu, aby uzupełnić wszelkie subterapeutyczne poziomy elektrolitów lub glukozy.
  5. Aby dodać roztwór gruntujący z dodanymi lekami, należy zwiększyć roztwór i odwietrzyć przewód dostarczający roztwór do urządzenia do perfuzji ex vivo.
    UWAGA: Przejdź do sekcji 6, aby uzyskać instrukcje dotyczące zalewania urządzenia do perfuzji ex vivo.

2. Rozpoczęcie znieczulenia i dostępu dożylnego u świni dawcy

  1. Po poszczeniu świni przez 8-12 godzin należy ją premedykować ketaminą (5-33 mg/kg, domięśniowo) i midazolamem (0,2-0,5 mg/kg, domięśniowo) i podawać izofluran (1-4%) za pomocą maski na twarz.
  2. Ułóż świnię w pozycji leżącej na plecach i zaintubuj rurką dotchawiczą (ETT) (średnica wewnętrzna 5,5-6,5 mm) w celu ochrony dróg oddechowych. Zabezpiecz ETT, przywiązując go do pyska świni. Ustaw kończyny za pomocą ciężkich opasek przymocowanych do stołu.
  3. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  4. Umieścić cewnik dożylny (IV) (20-22 G) w żyle usznej.
  5. Rozpocząć podtrzymywanie płynów dożylnych (roztwór Ringera z mleczanami w stężeniu 10 ml·(kg·h)-1).
  6. Podawać domięśniowo (IM) buprenorfinę 0,005-0,01 mg/kg w celu znieczulenia.

3. Parametry życiowe i ustawienia linii centralnej

  1. Wentylację mechaniczną należy rozpocząć przy objętości oddechowej 10 ml·(kg·min)-1 i częstości 10-15 oddechów na minutę z izofluranem (1-3%) utrzymywanym przez cały zabieg tak, aby odruchy były nieobecne, a tętno (>60 uderzeń na minutę, <100 uderzeń na minutę) i ciśnienie krwi (skurczowe ciśnienie krwi >90 mmHg, <130 mmHg) pozostawały w zakresie fizjologicznym.
    UWAGA: Dodanie paralityka jest opcjonalne.
  2. Stale monitoruj saturację tlenem i tętno przez cały czas trwania operacji.

4. Mediana sternotomii świni dawcy

  1. Zbadaj palpacyjnie mostek od manubrium do mieczykowatego. Zaznacz linię środkową za pomocą sterylnego markera chirurgicznego. Ogol wszystkie włosy z tego miejsca za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i wysterylizuj obszar za pomocą 4% chlorheksydyny, co daje w sumie 3 rundy sterylizacji. Nałożyć sterylną serwetę chirurgiczną wokół bezpośredniego pola operacyjnego.
    UWAGA: Chirurdzy muszą myć ręce i ramiona płynem do mycia na bazie alkoholu lub jodu oraz zakładać sterylne fartuchy i rękawice.
  2. Za pomocą ostrza nr 10 wykonaj nacięcie od manubrium do mieczykowatego, mierząc 20-30 cm, w zależności od wielkości świni.
  3. Użyj elektrokoagulacji, aby podzielić mięsień piersiowy większy w dół od mostka do mieczykowatego, uważając, aby zrobić to wzdłuż linii środkowej mostka. Po zejściu do mostka naciąć linię środkową i rozpocząć sternotomię od mieczykowatego, dzieląc ją ciężkimi nożycami.
  4. Przedłuż głowę sternotomii ciężkimi nożyczkami. Po każdym cięciu tępo oddziel serce od mostka za pomocą machania palcami. W ten sposób zakończ sternotomię przez manubrium.
  5. Po zakończeniu sternotomii osiągnij hemostazę, stosując elektrokoagulację na przecięte krawędzie kości.
  6. Umieść retraktor mostka i otwórz go, aby zoptymalizować ekspozycję pola operacyjnego. Zidentyfikuj i usuń grasicę za pomocą elektrokoagulacji. Wejdź do osierdzia podłużnie od przepony do aorty. Stwórz kołyskę osierdziową za pomocą jedwabnych szwów w rozmiarze 5-6: 2-0.

5. Zatrzymanie akcji serca i kardiektomia świni dawcy

  1. Całkowicie podziel tkankę między aortę a tętnicę płucną (PA) i uwidocznij położenie łuku aorty i pnia ramienno-głowowego, aby ułatwić prawidłowe umieszczenie zacisku krzyżowego aorty.
    UWAGA: Aorta wstępująca jest znacznie krótsza u świni w porównaniu z człowiekiem.
  2. Obwodowo uwolnić żyłę główną górną (SVC) za pomocą nożyczek i rozwarstwienia. Przejście dwa, rozmiar: 0, jedwabne krawaty wokół SVC.
  3. Obwodowo oczyść żyłę główną dolną (IVC) za pomocą nożyczek i rozwarstwienia. Podobnie przełóż dwa jedwabne krawaty 0 wokół IVC.
  4. Na aortę wstępującą nałożyć ścieg w kształcie litery U, rozmiar: 4-0, szew polipropylenowy.
  5. Założyć sznurek do torebki w rozmiarze 4-0 z polipropylenu do prawego przedsionka (RA).
  6. Podawać bolus heparyny dożylnej w dawce początkowej 300 j./kg.
  7. Wprowadzić pediatryczną kaniulę korzenia aorty 4-Fr, zabezpieczoną wcześniej umieszczonym ściegiem U. Odwietrz kaniulę i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą opaski uciskowej Rummel.
  8. Podłącz kaniulę korzenia aorty do rurki kardioplegii po przepłukaniu rurki kardioplegią del Nido. Przepłukać niezbędną ilością, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki.
    UWAGA: Komunikacja z zespołem perfuzyjnym ma w tym momencie kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania zatrzymania krążenia.
    1. Upewnij się, że perfuzjoniści zainstalowali jednorazowe urządzenia do oszczędzania komórek w sterylny sposób, zalali urządzenie zgodnie z zaleceniami producenta (patrz punkt 6) i są gotowi do przetworzenia pobranej krwi.
    2. Upewnij się, że kardiotomia oszczędzająca komórki (plastikowy pojemnik przymocowany do urządzenia oszczędzającego komórki, w którym przechowywana jest krew po umyciu) jest gotowa z 10 000 j. heparyny i że kardiodomia jest podłączona do odsysania, nie przekraczając -150 mmHg ciśnienia.
      UWAGA: Ma to na celu uniknięcie hemolizy czerwonych krwinek.
  9. Wykonaj prawą atiotomię w obrębie wcześniej umieszczonego sznurka torebki, włóż kaniulę żylną 24 Fr żylną do RZS i zabezpiecz opaską uciskową Rummel.
  10. Podłącz kaniulę żylną do sterylnego przewodu ssącego podłączonego do kardiotomii oszczędzającej komórki i zbierz około 1-1,3 l krwi. Następnie załóż zacisk krzyżowy aorty, ostrożnie upewniając się, że zacisk całkowicie zamyka aortę wstępującą. Podaj 500 ml kardioplegii Del Nido do korzenia pod ciśnieniem 100-150 mmHg za pomocą worka ciśnieniowego.
    UWAGA: Serce zblednie i zatrzyma się.
  11. Umieść sterylną lodową breję na sercu.
  12. Po dostarczeniu kardioplegii należy usunąć kaniulę korzenia aorty i kaniulę żylną RA i zawiązać szwy sznurkowe w torebce.
  13. Podziel następujące elementy: IVC, SVC tuż proksymalnie do żyły azygotycznej, aorta na poziomie łuku tuż dystalnie do tętnicy bezimiennej, główny PA w rozwidleniu i lewa żyła azygotyczna, gdy wchodzi do zatoki wieńcowej.
    UWAGA: Świnie mają lewą żyłę azygotyczną, która spływa do zatoki wieńcowej.
  14. Zidentyfikuj żyły płucne i podwiąż je za pomocą rozmiaru: 2-0, jedwabnych krawatów lub dużych klipsów. Pozostaw jedną żyłę płucną otwartą do wprowadzenia odpowietrznika LV.
  15. Wyjmij serce z klatki piersiowej i umieść je w pojemniku ze sterylnym lodem pośniegowym.
  16. Przenieś serce na tylny stół, aby przygotować przeszczep do umieszczenia na urządzeniu do perfuzji ex vivo.

6. Mycie krwi dawcy i przygotowanie urządzenia do perfuzji ex vivo

UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby usunąć wszelkie składniki surowicy dawcy, które mogłyby zneutralizować dostarczanie środka terapeutycznego po jego wprowadzeniu do perfuzatu. Wykonaj ten krok podczas eksplantacji serca dawcy, aby zminimalizować czas niedokrwienia przeszczepu allogenicznego.

  1. Zakończ cykl oszczędzania komórek, zalewania i prania.
    1. Zainstaluj elementy jednorazowego użytku w urządzeniu zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Zalej urządzenie oszczędzające komórki, dodając Plasmalyte A i wybierając funkcję prime w urządzeniu. Dodać tyle osocza A, ile wynosi objętość krwi pobranej od świni dawcy w stosunku 1:1.
      UWAGA: Gdy urządzenie zakończy cykl zalewania, jest gotowe do dodania krwi. Patrz punkty 5.9-5.11, aby dowiedzieć się, jak dodać krew od świni dawcy.
    3. Gdy krew znajdzie się w urządzeniu, wybierz cykl prania w urządzeniu oszczędzającym komórki.
      UWAGA: Podczas tego procesu krew jest odwirowywana, podczas gdy Plasmalyte A jest wprowadzany w celu przepłukania krwi. Ten krok koncentruje i myje krew.
  2. Przenieś umytą krew do worka do pobierania krwi w celu przeniesienia do urządzenia ex vivo.
  3. Dodaj umytą krew do urządzenia do perfuzji ex vivo zgodnie z wytycznymi producenta.
  4. Przygotować roztwór epinefryny, wstrzykując 0,25 mg epinefryny i 30 j.m. insuliny do 500 ml 5% dekstrozy w wodzie podczas zalewania maszyny ex vivo. Zwiększ ilość roztworu i odwietrz linię dostarczającą roztwór do urządzenia ex vivo.
  5. Dodać 10 000 j. heparyny do urządzenia do perfuzji ex vivo.
  6. Dodaj 5% albuminy, aby rozpuścić krew.
    UWAGA: Objętość 5% albuminy dodanej do urządzenia jest równa ilości osocza usuniętego przez urządzenie oszczędzające komórki. Ma to na celu osiągnięcie fizjologicznego ciśnienia onkotycznego i hematokrytu.
  7. Włącz pompę, aby płynęła z prędkością 1-1,5 l/min, aby zalać obwód klarownym roztworem, lekami i krwią podawaną do zbiornika. Po włączeniu przepływu pompy i przepuszczeniu zalewu przez moduł perfuzyjny należy upewnić się, że przewody obwodu są wolne od powietrza.
    UWAGA: Końcowa objętość roztworu podtrzymującego wynosi 1000 ml oprócz objętości przemytej krwi.
  8. Uzyskać podstawowy skład chemiczny perfuzatu POC i mleczanu za pomocą urządzenia testującego POC. W razie potrzeby uzupełnij elektrolity.
    1. Dodaj tyle dekstrozy, aby utrzymać minimalny poziom glukozy 100 mg/dl.
    2. Dodać tyle wodorowęglanu sodu, aby utrzymać minimalne docelowe pH 7,4,4,
      UWAGA: Co ważne, dodanego wodorowęglanu sodu nie można usunąć z perfuzatu. Nadmiar sodu przyczyni się do obrzęku serca i należy go unikać. Należy zachować ostrożność podczas leczenia deficytu podstawowego, ponieważ serce zacznie korygować deficyt podstawowy po reanimacji.
    3. Dodaj tyle glukonianu wapnia, aby utrzymać minimalny poziom zjonizowanego wapnia wynoszący 0,8 mmol/l.
  9. Ustaw temperaturę na 37 °C.
  10. Ustaw natężenie przepływu gazu na 150 ml/min i dostosuj w razie potrzeby, aby osiągnąć fizjologiczny poziom pCO2.
  11. Ustaw docelowe średnie ciśnienie tętnicze (MAP) na 60-70 mmHg.
  12. Zmniejsz przepływ pompy do 0,6 l/min.

7. Przygotowanie serca dawcy i reanimacja serca

  1. Przeszyj SVC. Umieść cztery zastawione szwy polipropylenowe w rozmiarze 4-0 w prosty poziomy materac wokół wewnętrznej strony dystalnej aorty, 5 mm poniżej krawędzi cięcia i przywiąż je.
  2. Trzymając 4, rozmiar: 4-0, zastawione szwy aortalne, włóż łącznik aorty do aorty i zawiąż taśmę pępowinową wokół aorty, aby zabezpieczyć łącznik.
  3. Umieść polipropylenowy sznurek do torebki w rozmiarze: 4-0 wokół dystalnej krawędzi cięcia głównego PA. Włóż kaniulę PA i zawiąż końce sznurka torebki, aby zabezpieczyć kaniulę.
  4. Weź przygotowany przeszczep ze stołu tylnego do urządzenia do perfuzji ex vivo i podłącz łącznik aorty do urządzenia. Pamiętaj, aby odpowietrzyć łącznik aorty/aorty przed przymocowaniem serca do urządzenia.
  5. Uruchom zegar perfuzyjny, utrzymuj przepływ pompy na poziomie około 0,6 l/min i zmniejsz nastawę temperatury do 34 °C.
  6. Uruchom kroplówki z epinefryną i pielęgnacją zgodnie z zaleceniami producenta.
  7. Podłącz kaniulę PA do złącza PA w urządzeniu i zabezpiecz ją opaską.
  8. Umieść odpływ wentylacyjny lewej komory (LV) przez niezawiązaną żyłę płucną do lewego przedsionka i przez zastawkę mitralną do LV. Zabezpiecz odpowietrznik na miejscu za pomocą jednego szwu, aby prawidłowo go zakotwiczyć.
  9. Umieść dwa przewody stymulujące serce na ścianie wolnej od lewej wysokości.
  10. Sprawdzaj mleczan, ABG, CBC i BMP co godzinę. Podawaj potas, 50% dekstrozę i wapń w razie potrzeby, aby utrzymać prawidłowy poziom fizjologiczny.
    UWAGA: Częstsze pobieranie próbek mleczanu może być odpowiednie podczas wczesnej stabilizacji w celu ustalenia odpowiedniej perfuzji na bazie mleczanu.
  11. Jeśli wymagana jest stymulacja, ustaw tempo komorowe na 80 uderzeń na minutę przy 10 mA (stymulacja przedsionkowa zwykle nie jest stosowana).
  12. Jeśli wymagana jest defibrylacja, zacznij od 10 J po osiągnięciu temperatury na urządzeniu 34 °C. Nie przekraczaj 50 J.
    UWAGA: Docelowy całkowity średni przepływ wynosi 600 ml/min, a średni przepływ wieńcowy wynosi 400 ml/min.

8. Podawanie leku

  1. Pobrać lek do strzykawki w sterylny sposób.
  2. Odwietrzyć port kardioplegii za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml w celu pobrania krwi przez port. Podaj lek terapeutyczny do portu kardioplegii (lub równoważnego) w taki sposób, aby lek został wprowadzony bezpośrednio do korzenia aorty.
  3. Przepłucz port objętością zebranej krwi pobraną w kroku 8.2 podczas odpowietrzania portu; należy uważać, aby nie spłukiwać nim powietrza.
    UWAGA: Ma to na celu zapewnienie, że lek jest podawany do korzenia aorty serca.
    UWAGA: Ta sekcja została wcześniej szczegółowo opisana w Bishawi i wsp. Wprowadzenie wektorów wirusowych do ekspresji lucyferazy15.
  4. Przeszczep należy wykonać na urządzeniu przez 2 godziny po wprowadzeniu środka terapeutycznego.

9. Przygotowanie biorcy i laparotomia z ekspozycją naczyniową

  1. Po przymocowaniu alloprzeszczepu serca do urządzenia i wprowadzeniu do obwodu środka terapeutycznego, należy rozpocząć indukcję znieczulenia i przygotowanie przedoperacyjne zgodnie z opisem w sekcji 2 dla świni biorcy.
  2. Rozpocząć infuzję leków immunosupresyjnych: cyklosporyny 50 mg/kg ogółem w postaci powolnej kroplówki przez cały czas trwania zabiegu i metyloprednizolonu 1 g dożylnie bolusa.
  3. Podawać antybiotyki: enrofloksacynę domięśniowo (5 mg/kg) i cefazolinę 1 g dożylnie bolus
    4. .
  4. Wprowadzić cewnik Foleya do pęcherza moczowego.
    UWAGA: Dekompresja pęcherza pomaga w uzyskaniu optymalnej ekspozycji aorty podnerkowej i IVC.
  5. Zaznacz linię środkową brzucha od połowy brzucha do łona za pomocą sterylnego markera chirurgicznego. Ogol wszystkie włosy z tego miejsca za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i wysterylizuj obszar za pomocą 4% chlorheksydyny, co daje w sumie 3 rundy sterylizacji. Nałożyć sterylną serwetę chirurgiczną wokół bezpośredniego pola operacyjnego.
    UWAGA: Chirurdzy muszą myć ręce i ramiona płynem do mycia na bazie alkoholu lub jodu oraz zakładać sterylne fartuchy i rękawice.
  6. Użyj 10 ostrzy, aby naciąć skórę (nacięcie 20-30 cm) i przełącz się na elektrokoagulację, aby przeprowadzić sekcję aż do powięzi.
  7. Za pomocą dwóch zacisków Kocher unieś powięź i otrzewną i ostrożnie wykonaj małe nacięcie (1 cm) w jamie otrzewnej za pomocą nożyczek Metzenbaum.
  8. Rozszerz otwór otrzewnej na całą długość nacięcia za pomocą elektrokoagulacji, umieszczając palec pod spodem, aby chronić leżące poniżej wnętrzności. Umieść zwijacz Balfoura, aby zoptymalizować ekspozycję. Cofnij jelito cienkie czaszkowo i mokrymi ręcznikami.
  9. Otwórz przestrzeń zaotrzewnową poniżej nerek z ostrożnością ukierunkowaną na identyfikację moczowodów i uniknięcie urazu.
  10. Przeprowadź sekcję w dół do aorty brzusznej i IVC. Podwiązuj naczynia limfatyczne za pomocą średnich i dużych klipsów.
  11. Rozetnij naczynia obwodowo i odsłoń wystarczająco duży segment, aby zmieścić duży zacisk Satinsky wokół każdego naczynia. Uważaj, aby nie dopuścić do przerwania gałęzi tętnic lędźwiowych, które wychodzą z tylnej części aorty. Umieść dwie pętle naczyń wokół aorty i IVC na bliższych i dalszych końcach ekspozycji.

10. Ostateczne zatrzymanie i usunięcie serca z urządzenia do perfuzji ex vivo

  1. Po upływie 2 godzin perfuzji ex vivo podłączyć urządzenie nagrzewniczo-chłodnicze do urządzenia ex vivo. Ustaw temperaturę chłodnicy grzejnika na 34 °C.
  2. W sterylny i bezpowietrzny sposób podłączyć odpowietrzoną linię doprowadzającą kardioplegię do urządzenia ex vivo w porcie dostępu do aorty.
  3. Wyłącz nastawę temperatury w urządzeniu ex vivo.
  4. Zmniejsz temperaturę nagrzewnicy-chłodnicy do 24 °C i zmniejsz przepływ pompy, aby utrzymać MAP w zakresie od 60 do 70 mmHg (zwykle zmiana przepływu pompy z 1 l/min do 0,9 l/min).
  5. Gdy odczyt temperatury na urządzeniu do perfuzji ex vivo osiągnie 24-26 °C, należy jeszcze bardziej obniżyć temperaturę grzałki-chłodnicy do 14 °C i zmniejszyć przepływ pompy o 100 ml/min.
  6. Gdy temperatura osiągnie 14-16 °C, odłącz kaniulę PA od portu PA, rozpocznij dostarczanie antegrade del Nido (500 ml), zamknij zawór przewodowy AO, zatrzymaj pompę i szybko zaciśnij przewód odpowietrzający AO.
    UWAGA: Ciśnienie dostarczania kardioplegii musi być miareczkowane, aby utrzymać średnie ciśnienie dostarczania 45-65 mmHg, jak pokazano na monitorze urządzenia ex vivo.
  7. Wyjmij serce z urządzenia do perfuzji ex vivo, odłączając kaniulę PA i łącznik aorty oraz przecinając druty stymulacyjne.
  8. Umieść serce w wiadrze wypełnionym sterylnym błotem pośniegowym.
  9. Na tylnym stole przeszyj żyłę płucną/lewą atiriotomię, w której został wprowadzony otwór wentylacyjny LV. Przyciąć (1 lub 2 mm) dystalną część aorty i PA, gdzie przyczepienie do kaniul mogło zmiażdżyć tkankę.
    UWAGA: Serce jest teraz gotowe do implantacji heterotopowej w jamie brzusznej.

11. Heterotopowa implantacja przeszczepu serca

  1. Przed umieszczeniem klamer Satinsky należy podać świni biorcy 300 j./kg heparyny dożylnej.
  2. Umieść zacisk Satinsky na IVC i wykonaj podłużną janotomię o wymiarach ~1,5 cm za pomocą 11 ostrzy i nożyczek Potta.
  3. Zespoleć przeszczep PA z IVC podnerkowym biorcy w sposób szczegółowy za pomocą biegnącego szwu polipropylenowego o rozmiarze 4-0. Najpierw wykonać wewnętrzną część zespolenia i w razie potrzeby wzmocnić szwami przerywanymi przed wykonaniem zewnętrznej części zespolenia.
    UWAGA: Zespolenie PA do IVC wykonuje się jako pierwsze, a zespolenie aorta-aorta jest wykonywane jako ostatnie, aby skrócić czas niedrożności aorty.
  4. Umieść zacisk Satinsky na aorcie i utwórz aortomię podłużną o wymiarach ~1,5 cm za pomocą 11 ostrzy i nożyczek Potta.
    UWAGA: Uzyskaj ABG przed umieszczeniem zacisku. Sprawdź go ponownie natychmiast po zwolnieniu zacisku i ponownie 15-30 minut później, aby ocenić wszelkie zmiany w hiperkaliemii, hiperlaktatemii lub kwasicy wskazujące na uszkodzenie niedokrwienne u biorcy.
  5. Zespolenie aorty przeszczepu z aortą podnerkową biorcy w sposób szczegółowy za pomocą biegnącego szwu polipropylenowego o rozmiarze 4-0. Najpierw należy wykonać wewnętrzną część zespolenia i w razie potrzeby wzmocnić szwami przerywanymi przed wykonaniem zewnętrznej części zespolenia.
  6. Usuń klamry Satinsky, aby ponownie sperperperować serce; najpierw usuń zacisk IVC, a następnie zacisk aortalny.
  7. Umieścić angiocath 18 G w wierzchołku lewej wysokości przeszczepu w celu odpowietrzenia. Po zakończeniu usuń angiocath i zamknij miejsce zastawionym szwem.
  8. Dokładnie sprawdź, czy w zespoleniach nie występuje krwawienie.
  9. Ostrożnie umieść serce w prawej przestrzeni zaotrzewnowej, tak aby nie było napięcia na zespoleniach i nie było załamań naczyń. Wymień jelito cienkie.

12. Zamknięcie laparotomii

  1. Zamknij powięź za pomocą zapętlonego, rozmiar: 0, szwu Maxon w sposób biegowy, zaczynając od obu końców nacięcia i wiążąc na środku. Uważaj, aby nie dopuścić do obrażeń jelit.
  2. Zamknij głęboką warstwę skóry właściwej o rozmiarze: 2-0, Vicryl w stylu biegowym i skórę o rozmiarze: 4-0, Monocryl w stylu biegowym.
  3. Oczyść nacięcie skóry i nałóż klej do skóry.

13. Leczenie pooperacyjne i eutanazja

  1. Po zakończeniu zabiegu należy wyłączyć przepływ izofluranu i monitorować świnię pod kątem powrotu napięcia mięśniowego i odruchów nerwowo-mięśniowych (odruch rogówkowy, wycofanie się do bolesnych bodźców, połykanie).
  2. Po potwierdzeniu przywrócenia tych funkcji wyłącz wentylację mechaniczną i obserwuj spontaniczny oddech. Jeśli występuje spontaniczne oddychanie, wyjmij rurkę dotchawiczą; Jeśli tak nie jest, ponownie podłącz rurkę dotchawiczą do wentylacji mechanicznej.
  3. Przenieś świnię ze stołu operacyjnego do odizolowanego pomieszczenia, gdzie można ściśle monitorować jej parametry życiowe (temperaturę w odbycie, ciśnienie krwi, tętno). W razie potrzeby użyj lampy grzewczej, aby ogrzać świnię. Podać dożylnie bolus płynowy składający się z 250 ml roztworu Ringera z mleczanami w przypadku niedociśnienia (skurczowe ciśnienie krwi < 100 mmHg). Kontynuuj monitorowanie świni, dopóki nie będzie w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka, a parametry życiowe nie zostaną w pełni znormalizowane.
    UWAGA: Zwierzę nie jest pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności. Ponadto zwierzę nie wraca do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
  4. W celu leczenia bólu należy podać jednorazową dawkę buprenorfiny (o przedłużonym uwalnianiu) we wstrzyknięciu podskórnym 0,12 mg/kg przez 72 godziny znieczulenia.
  5. Pod koniec okresu eksperymentalnego należy poddać świnię eutanazji w celu eksplantacji rodzimego (piersiowego) serca i serca z przeszczepem allogenicznym (brzusznym).
    1. Przygotować świnię zgodnie z opisem w sekcjach 2 i 3 do zabiegu. Przygotuj dwie torebki del Nido i dwie linie kardioplegii do zatrzymania każdego serca.
    2. Odsłonić klatkę piersiową serca zgodnie z opisem w punkcie 4. Po zakończeniu przystąp do wykonania laparotomii zgodnie z opisem w punkcie 9.
    3. Po odsłonięciu zespoleń aortalno-aortalnych i PA-IVC należy założyć zacisk Satinsky na aortę biorcy, a drugi na IVC biorcy, aby odizolować przeszczep allogeniczny od krążenia ogólnoustrojowego.
    4. Wprowadzić pediatryczną kaniulę korzenia aorty 4-Fr do korzenia aorty przeszczepu allogenicznego i podłączyć linię kardioplegii do cewnika. Podaj 500 ml kardioplegii del Nido do korzenia pod ciśnieniem 100-150 mmHg za pomocą worka ciśnieniowego. Po rozpoczęciu infuzji należy za pomocą nożyczek Metzenbauma wykonać 2 cm nacięcie na poziomie zespolenia PA-IVC w celu odpowietrzenia przeszczepu allogenicznego.
    5. Po zatrzymaniu przeszczepu allogenicznego należy przystąpić do eksplantacji przeszczepu za pomocą nożyczek Metzenbauma w celu wycięcia na poziomie zespolenia aortalno-aortalnego i pozostałej części zespolenia PA-IVC. Nie usuwaj żadnego z Satinsky clamps.
    6. Kontynuować usuwanie klatki piersiowej serca zgodnie z opisem w punkcie 5.
      UWAGA: Jedyną istotną różnicą jest to, że żyły płucne nie muszą być starannie podwiązane, a zamiast tego mogą być grubo wycięte za pomocą nożyczek Metzenbauma podczas wykonywania kardiektomii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej grupie pomyślnie przeżyło 9 świń w okresie od 5 do 35 dni po zastosowaniu przedstawionego tutaj protokołu, w zależności od projektu badania. Spośród 10 świń poddanych temu protokołowi tylko jedna padła przedwcześnie z powodu powikłań chirurgicznych, co dało przeżywalność na poziomie 90%. Na Rysunku 2 przedstawiono schemat konfiguracji heterotopowego serca przeszczepionego w pozycji wewnątrzbrzusznej u świni. Podczas wyznaczania miejsca anastomozy allograftu należy wybrać miejsce, które...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podawanie leków podczas perfuzji ex vivo w transplantacji serca oferuje strategię modyfikacji przeszczepu allogenicznego i potencjalnej poprawy wyników przeszczepu. Przedstawiony tutaj protokół obejmuje najnowocześniejsze normotermiczne przechowywanie krwi krwi ex vivo i oferuje obiecujący potencjał do testowania izolowanego dostarczania komórek, genów lub immunoterapii do przeszczepu allogenicznego 11,12,13. D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Paul Lezberg jest zatrudniony przez TransMedics, Inc. Carmelo Milano otrzymał darowiznę finansową od TransMedics, Inc. na sfinansowanie heterotopowych operacji przeszczepu serca. Michelle Mendiola Pla jest wspierana przez T32HL007101. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Duke Large Animal Surgical Core i Duke Perfusion Services za ich pomoc podczas tych zabiegów. Chcielibyśmy również podziękować Paulowi Lezbergowi i TransMedics, Inc. za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0 Pętlowy szew MaxonCovidienGMM-341LSłuży do zamykania powięzi nacięcia laparotomii
0 Jedwabne krawatyMedtronic, IncS346
18 G AngiocathBD381144Służy do odpowietrzania lewej komory serca dawcy po implantacji
20 Fr LV ventMedtronic, Inc12002
2-0 Jedwabne szwyEthicon, Inc.SA11G
2-0 Jedwabne krawatyEthicon, Inc.SA65H
2-0 Szew VicrylEthicon, Inc.J259H
24 Kaniula żylnaMedtronic, Inc68124
3-0 Nici prolenoweEthicon, Inc.8522
4-0 Szew monokrylowyEthicon, Inc.Y469G
4-0 Nici prolenoweEthicon, Inc.8521
Maszynka do strzyżenia sierści zwierzęcejWahl8786-452
Zacisk aortalnyV. MuellerCH6201
Zwijacz Marynarki WojennejV. MuellerSU3660
ATF 40, Jednorazowy zestaw oszczędzający komórkiFresenius Kabi9108494Wkładka do urządzenia oszczędzającego komórki
Zwijacz BalfouraV. MuellerSU3042Używany jako retraktor ściany brzucha
Oszczędzanie komórek C.A.T.SFresenius KabiES0019Urządzenie oszczędzające komórki służące do płukania krwi dawcy
Defibrylator sercaZollserii MDefibrylator serca
Castro uchwyt na igłyV. MuellerCH8589
CG4 iStat wkłady03P85-25Testowanie POC
Wkłady CG8 iStatAbbott03P88-25Testy POC
Kleszcze DeBakeyV. MuellerCH5902
Jednorazowy ołówek do elektrokoagulacjiCovidienE2450H
Kleszcze GeraldaV. MuellerNL1451
Hemotherm 400CE Chłodnica/grzałka z podwójnym zbiornikiemCincinnati Sub-Zero86022Chłodnica grzałki służąca do regulacji temperatury perfuzji na perfuzji ex vivo urządzenie
iSTAT 1Abbott04P75-03Przyrząd do testowania POC
Zacisk KocherV. MuellerSU2790
Aplikator do dużych klipsówSklar50-4300
Klipsy do dużych klipsówTeleflex4200
Duże miękkie zastawyCovidien8886867901
Średni aplikator do klipsówSklar50-4335
Klipsy średnieTeleflex2200
Nożyczki MetzenbaumV. MuellerCH2006-001
Ostrze skalpela nr 10Swann-Mortan301Służy do nacinania skóry
Ostrze skalpela nr 11Kiato Plus18111Służy do nacinania naczyń
Urządzenie OCS z podstawąTransMedics, Inc.Urządzenie do perfuzji ex vivo
OCS jednorazoweTransMedics, Inc.Wkładka do urządzenia do perfuzji ex vivo z zestawami perfuzyjnymi
stymulacyjnyRemington MedicalFL-601-97
Cewnik do kardioplegii dziecięcej (4Fr)Medtronic, Inc10218Służy do dostarczania kardioplegii do korzenia aorty dawcy
Pediatryczny cewnik FoleyaTeleflexRSH170003080Umieszczony przed operacją w celu odbarczenia pęcherza biorcy
Nożyczki PottsV. MuellerCH13038
Worek ciśnieniowy x2 (1,000 ml)NovaplusV4010HSłuży do dostarczania kardioplegii pod ustalonym ciśnieniem
Zacisk SatinskyV. MuellerCH7305Zacisk naczyniowy służy do tworzenia zespoleń między sercem dawcy a naczyniami biorcy
NożyczkiFelcoFELCO 200A-50Służy do wykonywania sternotomii
Małe twarde zastawyCovidien8886867701
Retraktor mostkaV. MuellerCH6950-007
Tymczasowe druty stymulujące serceEthicon, Inc.TPW32
Tymczasowy dwukomorowy rozrusznikserca Medtronic, Inc5388Urządzenie do stymulacji serca
Zestaw opasek uciskowychMedtronic, Inc79005Opaski uciskowe Rummel
Taśma pępowinowaCovidien8886861903
Pętle naczyńCovidien31145686
Abbott

Bibliografia

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
  2. Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
  3. Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
  4. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
  5. Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
  6. Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
  7. Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
  8. Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
  9. Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
  10. Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
  11. Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
  12. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  13. Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239(2019).
  14. Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
  15. Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029(2019).
  16. Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
  17. Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
  18. Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przeszczep serca świniprzeszczep heterotopowyperfuzja ex vivodostarczanie terapeutyczneodrzucenie przeszczepupierwotna dysfunkcja przeszczepumodel dużego zwierzęciadostarczanie wektorów wirusowychodpowiedź immunologiczna
Protokół heterotopowego przeszczepu serca u świń w celu dostarczenia leków do alloprzeszczepu serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.