Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

DOI:

10.3791/63151

⸱

21 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Yale School of Medicine, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 4Department of Anesthesiology, Yale School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje potrzeba ulepszonych trójwymiarowych (3D) modeli płuc, które podsumowują architektoniczną i komórkową złożoność rodzimego pęcherzyka płucnego ex vivo. Niedawno opracowane modele organoidów ułatwiły ekspansję i badanie progenitorów nabłonka płuc in vitro, ale platformy te zazwyczaj opierają się na macierzy i/lub surowicy pochodzącej z guza myszy i obejmują tylko jedną lub dwie linie komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokół generowania zmodyfikowanych tkanek płuc (ELT) oparty na wieloliniowej recelularyzacji decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (PCLS). ELT zawierają struktury podobne do pęcherzyków płucnych, obejmujące nabłonek pęcherzyków płucnych, mezenchymę i śródbłonek, w substracie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) bardzo przypominającym natywne płuca. Aby wytworzyć tkanki, płuca szczurów są napompowywane agarozą, krojone w plastry o grubości 450 μm, krojone w paski i decelularizowane. Powstałe w ten sposób bezkomórkowe rusztowania ECM są następnie ponownie wysiewane pierwotnymi komórkami śródbłonka, fibroblastami i komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AEC2). AEC2 mogą być utrzymywane w kulturze ELT przez co najmniej 7 dni przy użyciu chemicznie zdefiniowanej pożywki wzrostowej bez surowicy. W trakcie procesu przygotowania tkanek i hodowli plastry są przycinane w systemie kasetowym, który ułatwia obsługę i standaryzowany wysiew komórek wielu ELT równolegle. Te ELT stanowią organotypową platformę hodowli, która powinna ułatwić badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w zębodole, a także sygnałów biochemicznych regulujących AEC2 i ich niszę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki płucne to funkcjonalne jednostki dystalnego płuca, składające się z siatki przestrzeni powietrznych wymieniających gazy, wyłożonych komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 1 (AEC1) i komórek typu 2 (AEC2). Pod nabłonkiem znajduje się gęsta sieć naczyń włosowatych, a także mezenchyma podtrzymująca, a wszystko to wsparte rusztowaniem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zapewnia zarówno wytrzymałość, jak i elastyczność tym delikatnym workom powietrznym1. Pęcherzyki płucne są również miejscem urazu w licznych patologiach płuc, w tym idiopatycznego zwłóknienia płuc2, zespołu ostrej niewydolności oddechowej3 i ciężkiej chorobie koronawirusowej-19 (COVID-19)4. Chociaż prace prowadzone w ciągu ostatniej dekady ujawniły niezwykłą plastyczność nabłonka płuc, mechanizmy, które umożliwiają naprawę dystalnych płuc w niektórych warunkach - i które uniemożliwiają naprawę w innych - pozostają obszarem intensywnych badań5. Opracowanie ulepszonych platform in vitro do modelowania zębodołu ułatwiłoby badania nad biologią wyrostka zębodołowego, regeneracją i terapią.

AEC2 samoodnawiają się i różnicują w AEC1, a zatem są uważane za główną komórkę macierzystą dystalnego płuca6,7,8. Jednak komórki te stanowią szczególne wyzwanie dla badań in vitro, biorąc pod uwagę trudności związane z hodowlą pierwotnych AEC2 bez utraty fenotypu9. W konwencjonalnej hodowli dwuwymiarowej (2D) AEC2 spłaszczają się i przyjmują pewne cechy komórek podobnych do AEC110. W przeciwieństwie do tego, strategie hodowli 3D, najczęściej organoidy, wspierają utrzymanie zróżnicowanych cech w pierwotnym AEC2s6,11,12 i pozwalają na długoterminową hodowlę pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) pochodzących z AEC2s13,14. Organoidy zostały wykorzystane do modelowania rozwoju dystalnych płuc15, infekcja wirusowa11,15, oraz choroby genetycznej związanej z AEC213,16,17, umożliwiając uzyskanie ważnych informacji na temat biologii i regeneracji AEC2. Jednak te modele hodowli zazwyczaj obejmują tylko jedną lub dwie linie komórkowe i osadzają komórki w matrycach żelowych, które nie są w stanie podsumować ani architektury, ani substratu ECM natywnego zębodołu płucnego.

ECM jest krytycznym regulatorem fenotypu i zachowania komórek poprzez molekularne, topologiczne i mechaniczne wskazówki; stanowi kluczowy składnik specyficznych dla tkanek nisz regulujących los komórek macierzystych; i służy jako rezerwuar, który moduluje dostępność lokalnie wydzielanych czynników wzrostu18,19,20,21. Hodowla komórek na natywnym ECM może zatem zwiększyć zdolność predykcyjną systemów in vitro do modelowania biologii tkanek in vivo. Decelularyzacja – proces, który usuwa materiał komórkowy z tkanek za pomocą detergentów, enzymów lub metod fizycznych lub innych, może w dużej mierze zachować rusztowanie ECM rodzimego narządu, jeśli zostanie starannie przeprowadzone22,23. Takie rusztowania można ponownie zasiedlić komórkami do hodowli biomimetycznej 3D. Jednakże, podczas gdy rusztowania bezkomórkowe są szeroko stosowane w zastosowaniach inżynierii tkankowej, ich zastosowanie do rutynowych hodowli komórkowych jest ograniczone. Kilka wcześniejszych badań donosiło o decelularyzacji i recelularyzacji wycinków płuc lub małych segmentów tkanki płucnej. Oprócz badań potwierdzających słuszność koncepcji24,25,26, do badania adhezji fibroblastów-matrycy wykorzystano ponownie zaludnione wycinki płuc27,28 oraz do zbadania wpływu chorych matryc płuc na fenotyp fibroblastów27,29. Dzięki ulepszonym technologiom generowania precyzyjnie ciętych wycinków tkanek, bezkomórkowe wycinki płuc mogą stanowić wygodną i niewielką platformę do hodowli komórek, przy jednoczesnym zachowaniu podstruktur pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i naczyń krwionośnych. Włączenie wielu typów komórek umożliwiłoby badania interakcji między komórkami w fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Potrzebne są jednak ulepszone strategie, aby ułatwić obchodzenie się z tkankami w całym procesie hodowli oraz zapewnić kontrolowane i powtarzalne wysiewanie tkanek o znanej liczbie komórek.

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zmodyfikowanych tkanek płuc (ELT) poprzez ponowne zaludnienie decelularnych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc (PCLS) pierwotnymi komórkami śródbłonka, AEC2 i fibroblastami. W adaptacji naszego wcześniej opisanego zmodyfikowanego systemu tkanek serca30 oraz strategii decelularyzacji i recelularyzacji całych płuc22,31, opisujemy procedury wycinania PCLS z płuc szczurów i przycinania plastrów do kaset wielokrotnego użytku do hodowli tkankowych, które upraszczają i standaryzują dalsze manipulacje. Przycięte plastry są decelularyzowane w celu utworzenia bezkomórkowych rusztowań ECM, które są ponownie zasiedlane w dostosowanych kąpielach wysiewających. Rusztowania do wycinków płuc zachowują krytyczne komponenty i architekturę ECM oraz wspierają wzrost AEC2 w wieloliniowych strukturach przypominających pęcherzyki płucne przez co najmniej 7 dni. ELT reprezentują nowy system kohodowli pęcherzyków płucnych w fizjologicznie istotnej matrycy 3D, który powinien wspierać rozwój strategii inżynierii tkanki płucnej, ułatwiając jednocześnie podstawowe badania biologiczne AEC2 i pęcherzyka płucnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Yale Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Tworzenie kaset do hodowli tkankowych i kąpieli do wysiewu

UWAGA: Raz wykonane, kasety do hodowli tkankowych i kąpiele do wysiewu mogą być autoklawowane i ponownie używane do wielokrotnych rund hodowli ELT.

  1. Kasety do hodowli tkankowych
    1. Użyj wycinarki laserowej, aby wyciąć ramy kaset i klipsy do hodowli tkankowych z politetrafluoroetylenu (PTFE) o grubości 3/32 cala zgodnie z wzorami podanymi odpowiednio w pliku uzupełniającym 1 i pliku uzupełniającym 2. Użyj wycinarki laserowej, aby wyciąć zakładki kasety z kulturami tkankowymi z PTFE o grubości 1/16 cala zgodnie z plikiem uzupełniającym 3. Wycinaj kontury 3x przy użyciu 80% mocy i 15% prędkości (dla wycinarki laserowej o mocy 30 W).
  2. Kąpiele wysiewne
    1. Użyj plików CAD kąpieli wysiewającej (plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5), aby wydrukować w 3D odpowiednio podstawę i pierścień formy do kąpieli wysiewającej przy użyciu przezroczystej żywicy.
    2. Namocz formy w roztworze 10% poloksamu 407 w wodzie destylowanej na noc przed użyciem, aby pomóc w uwalnianiu PDMS. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, a następnie załóż pierścień na podstawę formy i zawiń w elastyczną folię z tworzywa sztucznego, aby zapobiec wyciekom.
    3. Przygotuj co najmniej 60 g na formę polidimetylosiloksanu (PDMS), mieszając elastomer PDMS w stosunku 10:1 ze środkiem utwardzającym i wlej do formy wydrukowanej w 3D. Odgazowuje PDMS w eksykatorze próżniowym przez 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Kąpiele siewne piec w temperaturze 60 °C przez 8 godzin.

2. Przygotowanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc z płuc szczura

  1. Grabież organów
    1. Przygotuj system podzielonej perfuzji składający się z kończyn napędzanych grawitacyjnie i pompą, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Podłącz kaniulę tętnicy płucnej (PA) do końca rurki, składającej się z kolczastego łącznika Y 1/16 cala przymocowanego do silikonowej rurki LS 14 o długości 1/2 cala i żeńskiego złącza luer-lock 3/32 cala (patrz Rysunek 1). Nie należy w tym momencie podłączać zaworu zwrotnego do kaniuli.
    2. Zalać linie PBS zawierającym 100 U/ml heparyny i 0,01 mg/ml nitroprusydku sodu (SNP) odpowiednio w celu przeciwzakrzepowego i rozszerzenia naczyń krwionośnych. Wstępnie ustaw pompę perfuzyjną na 30 ml/min.
      UWAGA: Dodaj świeży SNP do roztworu heparyny i chroń przed światłem.
    3. Dorosłemu szczurowi (8-12 tygodni, około 300-350 g) należy podać dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 400 j./kg heparyny w celu przeciwdziałania zakrzepliwości, a następnie wstrzyknięcie IP ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) w celu znieczulenia. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak reakcji na szkodliwy bodziec (szczypanie palca).
    4. Przytnij klatkę piersiową i brzuch futra za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Następnie spryskaj 70% etanolem i przetrzyj 3x 10% powidonem-jodem.
    5. Chwyć skórę poniżej poziomu przepony za pomocą kleszczy do zębów szczura. Następnie wykonaj 1/2-calowe poprzeczne nacięcie w skórze drobno zakończonymi nożyczkami. Chwyć odsłoniętą powięź brzuszną kleszczami, wykonaj 1/2 cala poprzeczne nacięcie w powięzi, a następnie przedłuż nacięcie przez skórę i powięź na szerokość górnej części brzucha.
    6. Użyj końcówki cienkich nożyczek, aby wykonać małe nacięcie (nie większe niż 1/8 cala) w środku przedniej przepony, powodując cofnięcie się płuc w klatce piersiowej. Przedłuż nacięcie w przeponie na całej szerokości klatki piersiowej.
    7. Wykonaj dwa pionowe nacięcia na całej wysokości klatki piersiowej w kierunku szyi, uważając, aby nie uszkodzić płuc. Przedłuż nacięcie przez lewe żebra, aby przeciąć obojczyk i wzdłuż boku szyi do poziomu krtani, odsłaniając tchawicę.
    8. Wypreparuj tchawicę z otaczającej tkanki łącznej i przełyku. Wykonaj poprzeczne nacięcie w poprzek przedniej połowy tchawicy między dwoma pierścieniami chrząstki, w pobliżu krtani. Nawlecz szew polipropylenowy 4-0 za tchawicą, poniżej poziomu nacięcia i luźno zawiąż pierwszą połowę węzła chirurgicznego za pomocą dwóch skrętów.
    9. Umieść kaniulę składającą się z kolczastego łącznika Y 1/16 cala podłączonego do jednokierunkowego zaworu zwrotnego i silikonowej rurki LS 14 o długości 1/2 cala z żeńskim złączem luer-lock 3/32 cala (patrz Rysunek 1) do tchawicy, wkładając jedną kończynę łącznika Y do nacięcia tchawicy w kierunku płuc.
    10. Umieść wstępnie zawiązaną pętlę szwów wokół tchawicy na poziomie włożonej kaniuli i zaciśnij wokół włożonego łącznika Y, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu. Dodaj dwa pojedyncze rzuty szwu skrętu, aby zakończyć węzeł.
    11. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml powietrzem i podłącz do luer-lock kaniuli tchawicy.
    12. Zacisnąć żyłę główną dolną w pobliżu przepony za pomocą zakrzywionego hemostatu, a następnie wstrzyknąć do serca heparynę 150 U (1000 U / ml) przez prawą komorę (RV).
    13. Częściowo otworzyć zawór odcinający przewodu grawitacyjnego, aby wytworzyć powolne, ale stałe kapanie PBS/heparyny/SNP z kaniuli PA przygotowanej w kroku 2.1.1.
    14. Nawlecz igłę nici polipropylenowej 4-0 za podstawą PA w miejscu, w którym wychodzi z RV. Użyj pierwszej połowy węzła chirurgicznego, aby wstępnie zawiązać luźną pętlę szwu wokół podstawy PA.
    15. Wykonaj małe nacięcie (nie większe niż 1/8 cala) w RV tuż poniżej i prostopadle do PA za pomocą cienkich nożyczek, a następnie włóż jedną kończynę łącznika Y kaniuli PA do podstawy PA. Zabezpiecz szew wokół PA i włożonego łącznika i dodaj rzut pojedynczego skrętu, aby zakończyć węzeł chirurga.
      UWAGA: Kaniulacja PA pod przepływem zapobiega wprowadzaniu pęcherzyków powietrza do układu krwionośnego, które mogą uniemożliwić odpowiednie oczyszczenie płuc.
    16. Podłącz zastawkę jednokierunkową do drugiego końca złącza Y cewnika PA, a następnie odetnij wierzchołek serca, aby umożliwić przepływ krwi przez lewą komorę.
      UWAGA: Nieodcięcie wierzchołka serca przed perfuzją za pomocą pompy może spowodować uszkodzenie bariery krew-gaz, prowadząc do wycieku płynu do przestrzeni powietrznych.
    17. Przełącz przewód perfuzyjny na stronę pompy za pomocą kranu łączącego dwa przewody, a następnie włącz pompę z prędkością 30 ml/min. Podczas perfuzji płuc przez PA należy ręcznie przewietrzyć płuca za pomocą strzykawki dotchawiczej o pojemności 10 ml z prędkością około 10-15 oddechów/min, aby ułatwić oczyszczenie płuc z krwi. Perfuzję płuc do momentu, aż staną się w większości białe, zwykle wymagając 40 ml PBS/heparyny/SNP lub mniej.
      UWAGA: Nieodpowiednie oczyszczenie płuc z krwi może upośledzać dalszą decelularyzację.
    18. Przeciąć tylną tchawicę tuż nad poziomem kaniuli tchawicy, a następnie wypreparować płuca i serce z całej pozostałej tkanki łącznej i usunąć płuca i serce en bloc.
    19. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 2% agarozą o niskiej temperaturze topnienia w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) bez czerwieni fenolowej, podgrzanym do 42 °C.
      UWAGA: Dokładna wymagana objętość agarozy będzie się różnić w zależności od wielkości płuc. Większe płuca (tj. u szczurów o masie większej niż 400 g) będą wymagały więcej niż 10 ml agarozy.
    20. Ręcznie napompuj pobrane płuca 3 razy 10 ml powietrza (tj. do przybliżonej całkowitej pojemności płuc) za pomocą kaniuli tchawicy, aby pomóc w rekrutacji zapadniętego miąższu.
    21. Natychmiast napompuj płuca za pomocą przygotowanej strzykawki z agarozą, ręcznie wstrzykując agarozę przez kaniulę tchawicy z szybkością około 40 ml / min, tylko do momentu napompowania najbardziej dystalnych końcówek płatów płuc. Jeśli dystalne obszary płuc pozostają zapadnięte, wstrzyknij dodatkowe 1-2 ml agarozy.
    22. Zakryj tchawicę, mocując białą nasadkę z 4-kierunkowego kranu do żeńskiego luer-lock kaniuli tchawicy. Umieścić płuco na szalce Petriego o średnicy 150 mm na lodzie, aby agaroza zastygła.
      UWAGA: Napompowanie płuca wkrótce po ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia równomiernego wypełnienia miąższu płuca, a następnie udanego cięcia tkanki. Jeśli płuco napełnia się bardzo nierównomiernie, nie przystępuj do krojenia płuc, ponieważ jakość plastra będzie niska.
  2. Krojenie płuc
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie dokładnej procedury krojenia w zależności od używanego mikrotomu wibracyjnego (wibratomu); Dodatkowe przykłady przygotowania PCLS za pomocą różnych slicerów tkanek zostały opublikowane wcześniej32,33,34.
    1. Metalowy blok schładzający należy schłodzić w temperaturze -20 °C i przechowywać na lodzie, gdy nie jest używany, przez cały czas trwania procedury krojenia.
    2. Użyj małej kropli kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować ostrze do uchwytu ostrza. Ostrożnie przymocuj uchwyt ostrza do wibratomu za pomocą klucza imbusowego, tak aby zrównał się z końcem rurki na próbkę włożoną do tacki buforowej.
    3. Przygotuj 6-dołkowe płytki z 3 ml na dołek, sterylny, lodowaty HBSS bez czerwieni fenolowej, aby zebrać plastry.
    4. Za pomocą skalpela wytnij kawałek tkanki płucnej około 1-1,5 cm3,
      UWAGA: Tkanka płucna z dolnej i środkowej części lewego płata, a także z prawego środkowego i dolnego płata, najłatwiej daje większe wycinki tkanki, które maksymalizują obszar pęcherzyków płucnych. Jeśli obecne są nienapompowane obszary tkanki lub obszary tkanki łącznej, należy odciąć tę tkankę nożyczkami lub skierować się w dół w kierunku tłoka; Taka tkanka ma tendencję do nieczystego cięcia.
    5. Umieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na tłoku probówki z próbką. Przetrzyj tkankę płucną papierową chusteczką, aby usunąć nadmiar wilgoci, a następnie natychmiast umieść tkankę płucną na tłoku za pomocą kleszczy.
    6. Przesuń metalową rurkę probówki z próbką do poziomu górnej części tkanki i przytrzymaj w miejscu, z cofniętym tłokiem. Pipetą wstępnie podgrzaną 2% agarozy w HBSS do górnej części probówki, aby całkowicie otoczyć tkankę.
    7. Umieść lodowaty blok schładzający wokół tkanki na około 1 minutę, aby agaroza mogła się zestalić.
    8. Włóż probówkę z próbką do tacki buforowej. Napełnij tackę lodowatym PBS do połowy bloku tkanki. Przekręć przełącznik skrzyni silnika do szybkiego przewijania do przodu (FF), aby przesunąć tłok skrzyni silnika tak, aby dotykał podstawy rurki na próbkę.
    9. Ustaw żądane ustawienia grubości plastra, prędkości cięcia i częstotliwości oscylacji, na przykład grubość 450 μm, prędkość 4 i częstotliwość oscylacji 5. Wybierz tryb ciągły, a następnie przestaw przełącznik do pozycji Wł., aby rozpocząć krojenie.
    10. Gdy plastry tkanek wpadną do tacki buforowej, przenieś je na przygotowane płytki 6-dołkowe za pomocą pętli do zaszczepiania lub szpatułki.
    11. Przerwij krojenie, gdy w probówce z próbką pozostanie tkanka o grubości ~2 mm, aby uniknąć uszkodzenia ostrza lub tkanki tnącej zawierającej klej.
    12. Powtórz powyższe kroki, aby pokroić dodatkową tkankę płucną, zgodnie z potrzebami.
    13. Plastry należy natychmiast zdecelularizować w celu przygotowania rusztowania lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 2 miesięcy. Aby zamrozić, przenieś 4-6 plasterków na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i ostrożnie odessaj nadmiar płynu z okolic plastrów. Umieść naczynia w kąpieli z suchym lodem i 100% etanolem w celu natychmiastowego zamrożenia, a następnie zawiń w folię, zamknij w plastikową torbę i przenieś do -80 °C.
      UWAGA: Nie umieszczaj świeżych plastrów bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze -80 °C, ponieważ stosunkowo wolne tempo zamrażania może spowodować tworzenie się kryształków lodu, które mogą uszkodzić tkankę.

3. Przygotowanie rusztowań dla tkanki płucnej

  1. Przygotowanie materiałów i roztworów decelularyzacyjnych
    1. Autoklaw ramek, klipów i zakładek.
    2. Przygotować roztwory decelularyzacyjne zgodnie z tabelą 1.
      UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem dodać nukleazę benzonazy do wstępnie podgrzanego buforu i sterylnego filtra. Przygotować roztwory Triton X-100 i deoksycholanu sodu (SDC) w ciągu 24-48 godzin od zabiegu decelularyzacji. Przygotować wcześniej roztwory antybiotykowe/przeciwgrzybicze i bufor benzonazowy do 30 dni i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Krojenie i przycinanie plastrów płuc
    UWAGA: Podczas gdy cięcie i przycinanie może być wykonywane w sposób niesterylny na blacie stołu, etapy decelularyzacji opisane w sekcji 3.3 i cała późniejsza obsługa rusztowań tkankowych muszą być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Napełnij 100-milimetrową szalkę Petriego około jednej trzeciej PBS. Przenieś kasety (ramki zawierające po dwa klipsy każda) i zakładki na naczynie za pomocą kleszczyków.
    2. Jeśli używasz mrożonych plastrów, rozmrażaj jedno danie na raz, wlewając do naczynia PBS o temperaturze pokojowej, aby przykryć plastry. Pozostałe naczynia przechowuj na suchym lodzie.
    3. Przenieś rozmrożony plasterek na szalkę Petriego o średnicy 150 mm. W razie potrzeby delikatnie rozłóż plasterek za pomocą cienkich kleszczyków, tak aby leżał płasko, a następnie ostrożnie odessaj nadmiar PBS z okolic tkanki.
    4. Za pomocą żyletki z linijką jako prowadnicą odetnij pasek o szerokości 3 mm z plastra, mocno dociskając całą długość ostrza do naczynia i lekko kołysząc nim na boki, trzymając krawędź ostrza na miejscu. Alternatywnie można użyć noża obrotowego wyposażonego w 2 równoległe ostrza oddzielone specjalnie wykonaną przekładką o średnicy 3 mm (np. wykonaną z acetalu [polioksymetylenu]) do cięcia pasków tkanek. Unikaj rozdarć,, dużych dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych lub grubej tkanki łącznej.
      UWAGA: Aby klips się udał, pasek musi mieć co najmniej 9 mm długości.
    5. Za pomocą kleszczy przenieś pasek tkanki na przygotowaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
    6. Przypnij pasek chusteczki do kasety: unieś chusteczkę nad kasetą, centrując tkankę, aby wystawała poza otwory w klipsach na obu końcach. Za pomocą cienkich kleszczyków umieść zakładkę częściowo w otworze na jednym końcu, delikatnie wyprostuj tkankę, a następnie umieść drugą zakładkę. Używając kleszczy w każdej ręce, dociśnij każdą zakładkę do końca, aby zabezpieczyć tkankę.
      UWAGA: Jeśli masz trudności z utrzymaniem tkanki na miejscu przed przycięciem, odessaj trochę PBS z naczynia, aby obniżyć poziom płynu. Uważaj, aby nie rozciągać tkanki podczas zakładania drugiego klipsa, ponieważ może to prowadzić do rozdarcia.
    7. Powtórz procedurę rozmrażania, cięcia i przycinania w krokach 3.2.2-3.2.6 dla dowolnej liczby tkanek.
  3. Decelularyzacja wycinków
    1. Po przycięciu wszystkich plastrów przenieś naczynie o średnicy 100 mm zawierające kasety do okapu z przepływem laminarnym.
    2. Rozpocznij krok 1 protokołu decelularyzacji (patrz Tabela 2): używając zakrzywionego hemostatu do uchwycenia karbowanych boków każdej kasety, przenieś kasety na 6-dołkowe płytki (2 tkanki / dołek) wypełnione 3 ml PBS + jony + antybiotyki/leki przeciwgrzybicze na studzienkę (patrz przepis na roztwór w Tabeli 1).
    3. Umieść płytki studzienkowe na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min na 10 minut.
    4. Kontynuuj krok 2 protokołu decelularyzacji (patrz Tabela 2): zassać płyn z każdej studzienki, a następnie zastąpić jonami 3 ml / studzienkę PBS +, umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min i inkubować przez 5 minut.
    5. Powtórzyć krok 3.3.4 dla każdego z roztworów i odpowiadających im czasów trwania, jak opisano w protokole decelularyzacji w tabeli 2.
    6. Po ostatnim etapie płukania PBS + antybiotyki/leki przeciwgrzybicze (krok 20 w Tabeli 2), przenieść tkanki na sterylne płytki 6-dołkowe ze świeżym PBS + antybiotykami/środkami przeciwgrzybiczymi i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin
      UWAGA: Po sterylizacji antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi, rusztowania tkanki płucnej można natychmiast wysiać lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 dni.

4. Recelularyzacja i hodowla plasterków

UWAGA: Rysunek 2 pokazuje proponowany harmonogram wysiewu tkanek i hodowli, w którym plastry są najpierw wysiewane komórkami mikronaczyniowego śródbłonka płuc szczura i hodowane w pożywce o niskiej surowicy; następnie wysiewane szczurzymi AEC2 i fibroblastami płuc szczurów za pomocą pożywki wzrostowej AEC2 bez surowicy (zaadaptowane z Jacob et al.13 i You et al.35); zob. dodatkowe uwagi na temat źródeł komórkowych wykorzystanych w sekcji Wyniki oraz szczegółowe informacje na temat pożywek hodowlanych w Tabeli 3. W wyniku tej strategii powstają struktury podobne do pęcherzyków płucnych zawierające monowarstwy AEC2.

  1. Przygotowanie rusztowań tkankowych do siewu (dzień -4 lub -3)
    1. W przypadku stosowania rusztowań tkankowych przechowywanych w temperaturze 4 °C, przed wysiewem należy inkubować rusztowania przez noc w temperaturze 37 °C ze świeżym PBS + antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi (10% penicyliny/streptomycyny, 4% amfoterycyny B, 0,4% gentamycyny w PBS).
    2. Przepłukać rusztowania 3x sterylnym PBS (5 ml/studzienkę), po 5 minut każde.
    3. Zbadaj rusztowania pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu, aby wybrać tkanki do wysiewu.
      UWAGA: Najlepsze rusztowania do siewu nie mają rozdarć ani i nie zawierają dużych dróg oddechowych ani naczyń. Podczas gdy rusztowania z tymi cechami mogą być z powodzeniem wysiewane, wzorce ponownego zasiedlania mogą różnić się od tych obserwowanych w obszarach pęcherzyków płucnych.
  2. Wysiewanie komórek śródbłonka (dzień -3)
    1. Policz komórki śródbłonka za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek śródbłonka w podłożu śródbłonkowym (patrz Tabela 3) w dawce 5 x 106 komórek/ml, z wystarczającą ilością komórek do zasiania 500 000 komórek śródbłonka na plaster (np. dla 12 plasterków zawiesić 6 x 106 komórek w pożywce 1,2 ml).
    2. Umieścić autoklawowane kąpiele nasienne na szalkach Petriego o średnicy 100 mm. Przenieś wypłukane rusztowania do góry nogami do kąpieli siewnych: użyj drobno zakrzywionego hemostatu, aby chwycić kasetę za karbowane boki, użyj prostego hemostatu lub kleszczy, aby chwycić jeden koniec kasety (uważając, aby nie dotknąć samej tkanki) i odwróć, a następnie ponownie chwyć kasetę końcami drobno zakrzywionego hemostatu przez otwory wzdłuż karbowanych boków, i dobrze umieścić w kąpieli nasiennej. Powtórz te czynności dla pozostałych kaset.
      UWAGA: Po prawidłowym umieszczeniu rusztowania zostaną wyśrodkowane do góry nogami na dnie każdej studni. W razie potrzeby delikatnie dociśnij róg kasety końcówkami hemostatu, aby upewnić się, że kaseta jest płasko osadzona w studzience. Niewłaściwe osadzenie kasety może prowadzić do słabego wysiewu tkanek. Dopuszczalne jest, jeśli studnia zawiera niewielką ilość PBS.
    3. Delikatnie zamieszaj przygotowaną zawiesinę komórek, aby ją wymieszać, a następnie użyj pipety ręcznej, aby pipetować 100 μl komórek bezpośrednio na każdej tkance u podstawy studzienki, uważając, aby nie uszkodzić tkanki końcówką pipety.
    4. Przenieść wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    5. Po 2 godzinach dodać 900 μl wstępnie podgrzanej pożywki do każdej studzienki za pomocą pipety ręcznej, a następnie wrócić do inkubatora. Jeśli kaseta odczepi się (unosi się) po dodaniu pożywki, delikatnie dociśnij róg kasety końcówką pipety, tak aby leżała płasko w studzience.
    6. Zmień podłoże w dniu -2. Usunąć pożywkę, przechylając szalkę Petriego i ręcznie pipetując końcówką pipety lekko umieszczoną w rogu studzienki, tak aby nie naruszyć kasety. Zastąp 1 ml świeżego podłoża śródbłonkowego na studzienkę.
  3. AEC2 i wysiewanie fibroblastów oraz hodowla tkankowa (dzień 0)
    1. Policz AEC2 i fibroblasty za pomocą hemocytometru. Przygotować zawiesinę komórek 1:1 AEC2 i fibroblastów w pożywce wzrostowej AEC2 (podłoże podstawy nabłonkowej + suplementy AEC2; patrz Tabela 3) przy 5 x 106 całkowitych komórkach/ml, z wystarczającą ilością komórek do zasiania 500 000 komórek (250 000 AEC2 i 250 000 fibroblastów) na plasterek (np. dla 12 plasterków ponownie zawiesić 3 x 106 AEC2 + 3 x 106 fibroblastów razem w 1,2 ml pożywki).
    2. Odpipetować pożywkę z każdej studzienki kąpieli wysiewającej zgodnie z opisem w kroku 4.2.6. Delikatnie zamieszaj przygotowaną zawiesinę komórek, aby wymieszać, a następnie odpipetuj 100 μl komórek bezpośrednio na każdą tkankę u podstawy studzienki.
      UWAGA: Dopuszczalne jest, jeśli niewielka ilość podłoża śródbłonkowego pozostaje w studzience przed wysiewem AEC2/fibroblastów.
    3. Przenieść wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    4. Po 2 godzinach dodać 900 μl wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 do każdej studzienki, a następnie wrócić do inkubatora.
    5. Po 24 godzinach hodowli (dzień 1) przygotować 12-dołkową płytkę z 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 na dołek na kasetę.
    6. Odpipetować 800 μl podłoża z każdej studzienki kąpieli wysiewającej. Wyjmij kasety z kąpieli wysiewającej: chwyć każdą z drobno zakrzywionym hemostatem przez otwory wzdłuż karbowanych boków, przenieś do prostego hemostatu lub kleszczy, aby chwycić kasetę na jednym końcu i odwróć, a następnie użyj zakrzywionego hemostatu, aby chwycić kasetę przez karbowane boki i przenieś prawą stroną do góry, po jednej na dołek, na przygotowaną płytkę 12-dołkową.
    7. Zmieniać pożywkę hodowlaną na 12-dołkowej płytce co drugi dzień do 7 dnia lub na żądaną długość hodowli: użyć szklanej pipety Pasteura, aby zassać pożywkę z każdej studzienki, uważając, aby nie dotknąć tkanki; odpipetować 1 ml świeżej pożywki wzrostowej AEC2 na dołek.
      UWAGA: Stopień ponownego zasiedlenia tkanek można monitorować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu przez cały czas trwania hodowli.

5. Pobieranie tkanek i analiza próbek

  1. Aby utrwalić ELT do barwienia histologicznego i immunofluorescencyjnego, przenieś kasety z kulturami tkankowymi do 10% neutralnie buforowanej formaliny i inkubuj przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku. Wyjmij tkanki z kaset za pomocą końcówki drobno spiczastych kleszczy, aby przeciąć tkankę w miejscu, w którym styka się z zakładkami. Przetwarzaj tkanki zgodnie z rutynowymi metodami zatapiania parafiny i histologii; Nie są wymagane żadne specjalistyczne techniki.
  2. Aby przetworzyć ELT do qRT-PCR, wypłucz tkanki w kasetach w PBS 2x, a następnie wyjmij tkanki i zamroź szybko lub kontynuuj lizę w celu ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Zebranie co najmniej 2 plasterków obsianych 1 x 106 komórkami i hodowanych przez 7 dni powinno dać wystarczającą ilość RNA do dalszej analizy PCR.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd procesu generowania ELT - obejmującego krojenie płuc, obcinanie plastrów i decelularyzację oraz ponowne zasiedlenie rusztowania - jest przedstawiony w Rysunek 3. Przedstawione tutaj ELT zostały wyhodowane przy użyciu pierwotnych komórek mikronaczyniowych śródbłonka płuc szczura (patrz tabela materiałów), AEC2 noworodków szczurów i fibroblastów płuc noworodków szczurów wzbogaconych lipofibroblastami36. AEC2 zostały świeżo wyizolowane za pomocą sortowania magnetycznego opartego na kulkach, jak opisano wcześniej37; Alternatywne protokoły izolacji zostały szczegółowo opisane i omówione w innym miejscu38,39,40. Czystość izolowanych AEC2 szczurów można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej dla specyficznego dla szczura markera powierzchniowego AEC2 RTII-7041 lub poprzez barwienie próbki komórek cytowirowanych pod kątem RTII-70 lub białka pro-powierzchniowo czynnego C (pSPC). Fibroblasty płuc szczurów wyizolowano od szczeniąt szczurów w wieku 7-9 dni po urodzeniu zgodnie z adaptacją opublikowanego protokołu42 i użyto w pasażu 1-2; Alternatywne protokoły izolacji zostały opisane w innym miejscu43,44. Czystość izolowanych fibroblastów można ocenić poprzez barwienie hodowanych lub cytowirowanych komórek na marker mezenchymalny wimentynę, a wzbogacenie lipofibroblastów można ocenić poprzez barwienie dla Oil Red O45.

Gdy tkanka płucna jest równomiernie napełniona agarozą, a fragmenty tkanki strategicznie wybrane i zorientowane do krojenia, tak aby zmaksymalizować całkowitą powierzchnię tkanki i miąższu, jedno płuco szczura może dać tkankę dla >100 pęcherzyków płucnych. Paski PCLS wykazują wystarczającą integralność mechaniczną, aby można je było przypiąć do kaset tkankowych z nielicznymi (<5%) przypadkami rozerwania (Rysunek 3B).

Protokół decelularyzacji wycinków płuc jest ściśle oparty na naszym poprzednio opublikowanym protokole decelularyzacji całych płuc, który za pomocą ilościowej proteomiki wykazał, że zachowuje wiele składników ECM na poziomach nie różniących się znacząco od tych w natywnych płucach22. Bezkomórkowe rusztowania warstwowe zachowują natywną architekturę pęcherzyków płucnych, co można zobaczyć za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) (Rysunek 4A,B) oraz mikroskopia kontrastu fazowego (Rysunek 4C). Zazwyczaj wykluczamy rusztowania zawierające duże drogi oddechowe lub naczynia krwionośne (Ryc. 4D) lub rozdarcia, chociaż te pierwsze mogą być uwzględnione, jeśli są interesujące dla badacza. Decelularyzacja prowadzi do 96% zmniejszenia zawartości DNA w tkance, mierzonej za pomocą testu dla dwuniciowego DNA (patrz tabela materiałów; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg w tkance natywnej i zdecelularizowanej, odpowiednio, średnia ± SEM) (Figura 5A), bez DNA widocznego przez barwienie hematoksyliną (Rysunek 4B). Barwienie histologiczne i immunofluorescencyjne rusztowań zdecelularyzowanych ujawnia utrzymanie białek ECM: kolagenu, elastyny, kolagenu IV i lamininy o architekturze i ilości podobnej do tej w natywnych wycinkach płuc (Figura 5B-E). Należy zauważyć, że jądra tkanek natywnych barwią się na niebiesko/czarno z plamami trichomów (dla kolagenu) i EVG (dla elastyny). Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono w sposób opisany wcześniej, przy użyciu standardowych metod barwienia tkanek37. Zastosowane przeciwciała i ich odpowiednie stężenia wymieniono w tabeli 4.

Udana repopulacja rusztowania prowadzi do powstania wysoce komórkowych ELT po 7 dniach, z wzorcem ponownego zasiedlenia podobnym do pęcherzyka płucnego widocznym przez mikroskopię świetlną (Rysunek 6A-C). W niektórych przypadkach, przy bardzo wysokiej komórkowości, mogą być widoczne struktury typu organoidowego (Rysunek 6A,B). Nieudane wysiewy tkanek można uwidocznić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym podczas hodowli (Rysunek 6C). Po wyhodowaniu rusztowań tkankowych z AEC2, fibroblastami i komórkami śródbłonka, ELT są gęsto zasiedlane strukturami podobnymi do pęcherzyków płucnych obejmującymi wszystkie trzy linie komórkowe (Rysunek 6D, E). W 7 lub 8 dniu AEC2 utrzymują prostopadłościenną morfologię i wyrażają białko powierzchniowo czynne-B (SPB) i białko blaszkowate ciała ABCA3, bez dowodów na znaczące różnicowanie do AEC1 (Figura 6E,F). AEC2 są wysoce proliferacyjne w ELT, jak wykazano przez włączenie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) po 2-godzinnym impulsie przy 10 μM (Rysunek 6G).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat systemu perfuzyjnego do ekstrakcji i oczyszczania płuc. (A) System perfuzyjny składa się z kończyny napędzanej grawitacją, używanej do początkowej kaniulacji tętnicy płucnej w przepływie; oraz kończyna napędzana pompą, używana do skutecznego oczyszczania płuc po początkowej kaniulacji. Linia pompy zawiera "tłumik impulsów", który tłumi skoki ciśnienia spowodowane przez pompę. Konstrukcja kaniul tchawicy i tętnic płucnych jest szczegółowo opisana po lewej stronie. SNP = nitroprusydek sodu. (B) Szczegółowe informacje na temat zespołu tłumika impulsów. BPT i silikon odnoszą się do rodzajów rurek. (C) Pozycje kaniul tchawicy i tętnic płucnych umieszczonych podczas ekstrakcji płuc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Oś czasu hodowli dla recelularyzacji trójlinii. Proponowany harmonogram trójliniowego siewu i hodowli ELT, w tym czas siewu dwufazowego. Wskazane są numery komórek do wysiewu i pożywki hodowlanej dla każdej fazy. Szczegółowe informacje na temat pożywek hodowlanych znajdują się w Tabeli 3. AEC2 = komórka nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2. EC = komórka śródbłonka. FB = fibroblast. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat przygotowania zmodyfikowanej tkanki płucnej. (A) Rodzima tkanka płucna jest cięta na plastry za pomocą wibratomu. (B) Precyzyjnie pokrojone plastry płuc są krojone na standardowe paski o szerokości 3 mm, wpinane do kaset do hodowli tkankowych z politetrafluoroetylenu (PTFE) i decelularizowane detergentem w celu uzyskania bezkomórkowych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej. (C) Rusztowania są ponownie wysiewane w specjalistycznych kąpielach wysiewających, które ograniczają obszar wysiewu do obszaru tkanki, a następnie hodowane w standardowej płytce studziennej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Struktura rusztowań płuc bez celulozy. Barwienie H&E natywnych (A) i bezkomórkowych (B) wycinków płuc wykazujące zachowanie architektury wyrostka zębodołowego po decelularyzacji. (C,D) Przykłady zdecelularyzowanych rusztowań ECM oglądanych w 5-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, zawierających głównie tkankę pęcherzyków płucnych (C) lub zawierających duże rozgałęzione drogi oddechowe i naczynia (D, czarne i czerwone groty strzałek). Podziałka liniowa, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Usuwanie DNA i zachowanie matrycy w bezkomórkowych rusztowaniach płuc. (A) Kwantyfikacja DNA w natywnych i bezkomórkowych wycinkach płuc (średnia ± SEM, n = 5). Test t Welcha, **P < 0,01. Decell = bezkomórkowy. (B,C) Barwienie histologiczne natywnych i bezkomórkowych wycinków płuc dla kolagenu (B) i elastyny (C). Groty strzał, elastyna zachowana w pierścieniach wejściowych wyrostka zębodołowego tkanki pozbawionej komórek. (D,E) Barwienie immunofluorescencyjne natywnych i bezkomórkowych wycinków płuc dla kolagenu IV (D) i lamininy (E). Podziałka liniowa, 50 μm. We wszystkich panelach kropkowane pola wyznaczają obszar obrazu, który jest powiększony po prawej stronie w każdym odpowiednim panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Komórkowa repopulacja zmodyfikowanych tkanek płuc. (A-C) Przykłady recellularowanych ELT w 7 dniu hodowli, uwidocznione podczas hodowli za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Wzorzec recelularyzacji odzwierciedla strukturę wyrostka zębodołowego tkanki. W niektórych obszarach o wysokiej komórkowości mogą tworzyć się struktury przypominające organoidy (groty strzał). (A) i (B) reprezentują udaną repulację komórek, podczas gdy (C) oznacza słaby poziom recelularyzacji po 7 dniach hodowli. (D-G) Barwienie recellularowanych ELT w 7 lub 8 dniu hodowli. (D) Barwienie H&E wskazujące na ponowne zasiedlenie komórkowe przegród pęcherzykowych. (E) Markery barwienia immunofluorescencyjnego wszczepiły fibroblasty proCollagenuIα1 +, ABCA3 + AEC2 i komórki śródbłonka CD31 +. (F) Tkanki zawierają dużo SPB+ AEC2, ale niewiele RTI-40 (podoplanina) + AEC1 w tych warunkach. (G) Wiele AEC2 namnaża się w ELT, mierzone przez włączenie EdU. Podziałki liniowe, 500 μm (A-C); 25 μm (DG). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Roztwory decelularyzacyjne. Szczegóły przygotowania roztworów decelularyzacyjnych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Protokół decelularyzacji. Szczegóły protokołu decelularyzacji wycinków płuc. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Pożywki hodowlane. Szczegóły dotyczące przygotowania pożywki wzrostowej śródbłonka i AEC2. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał i ich stężeń stosowanych do barwienia immunologicznego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Projekt do laserowego cięcia ramek kaset do hodowli tkankowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Projekt do laserowego wycinania klipsów kasetowych do kultur tkankowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Projekt do laserowego wycinania zakładek kasety do hodowli tkankowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: plik CAD do podstawy formy do kąpieli siewnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik CAD do pierścienia formy do kąpieli siewnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano zastosowanie decelularnych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc jako platformy do generowania zmodyfikowanych tkanek płuc in vitro, które zawierają wieloliniowe struktury podobne do pęcherzyków płucnych. Łącząc strategie, które wcześniej opracowaliśmy w celu ponownego zasiedlenia bezkomórkowych rusztowań płuc ECM o wysokiej wierności do inżynierii całego płuc22,31, z naszym solidnym systemem do hodowli zmodyfikowanych tkanek serca na małą skalę30, protokół ten umożliwia wykorzystanie fizjologicznie istotnego ECM płuc jako substratu do hodowli tkankowej, w sposób powtarzalny i o umiarkowanej przepustowości.

Przedstawione tutaj metody szczegółowo opisują przygotowanie rusztowania ELT z płuc szczura, które są łatwo osiągalne, mogą być ekstrahowane en bloc z bezpośrednim dostępem do nienaruszonych dróg oddechowych w celu nadmuchania agarozy i mają większy rozmiar niż płuco myszy. Jednak każda tkanka płucna, która może być nadmuchana agarozą i uzyskać plastry o długości co najmniej 9 mm, może być wykorzystana w tym systemie. Niezależnie od źródła tkanki, równomierne napompowanie tkanki płucnej agarozą jest najważniejszym krokiem zapewniającym powodzenie dalszego krojenia tkanek, przycinania i obchodzenia się z tkankami. Niedopompowana tkanka płucna ma tendencję do nieczystego krojenia, podczas gdy nadmiernie napompowana tkanka może się rozerwać podczas przycinania. Po żelowaniu agarozy odpowiednio napompowane obszary tkanek są jędrne, ale nieco ustępują, gdy delikatnie uciskają kleszcze. W przypadku nienaruszonych płuc szczurów stwierdziliśmy, że kilkukrotne wstępne napompowanie pobranych płuc powietrzem, a następnie nadmuchanie agarozy tak szybko, jak to możliwe po ekstrakcji, skutkuje najlepszymi wynikami krojenia i najlepszą jakością powstałych rusztowań tkankowych. Odpowiednia objętość agarozy musi być zoptymalizowana empirycznie; w przypadku płuc szczura objętość wymagana do napełnienia płuc do całkowitej pojemności płuc wynosi około 30 ml/kg masy zwierzęcia (np. 10,5 ml agarozy w przypadku płuc szczura o masie 350 g). W przypadku większych wyciętych tkanek płucnych z mniej prostym dostępem do dróg oddechowych (takich jak te od dawców ludzkich), może być konieczne dodatkowe rozwiązywanie problemów w celu nadmuchania tkanki przez oskrzela32. Podczas kolejnego krojenia płuc wybór i orientacja tkanki na tłoku jest kolejnym ważnym krokiem w kierunku 1) zapewnienia, że plastry są wystarczająco duże, aby wytworzyć paski tkanki, które można przypiąć do kaset do hodowli tkankowych i 2) zmaksymalizować obszar tkanki miąższowej (pęcherzykowej), z wyłączeniem dużych dróg oddechowych lub naczyń.

Wpinanie PCLS do kaset do hodowli tkankowych może być początkowo trudnym krokiem, ale kasety znacznie upraszczają obsługę tkanek podczas decelularyzacji i wysiewu. Dwa potencjalne problemy, które mogą się pojawić, to rozrywanie tkanek (zarówno podczas procesu przycinania, jak i podczas decelularyzacji) lub umiejscowienie tkanek w klipsach, co skutkuje słabym wysiewem w dół (np. Brak wysiewu lub wysiew tylko na końcach). Rozdarcie może być wynikiem nadmiernego napompowania agarozy, nadmiernego rozciągnięcia tkanki podczas zakładania zakładki lub pozostawienia zbyt małego zwisu, aby zapewnić odpowiednią przyczepność tkanki podczas wkładania zakładek. Należy pamiętać, że plastry, które rozrywają się na jednym końcu klipsa, mogą być z powodzeniem wysiewane, jednak trudno je uwidocznić pod mikroskopem podczas hodowli, ponieważ tkanka nie jest płaska. Słabe wysiewanie tkanek (takie jak na rysunku 6C) jest prawdopodobnie wynikiem tego, że plasterek nie leży płasko między dwoma klipsami, a tym samym słabo styka się z podstawą kąpieli wysiewającej, gdy jest odwrócony do góry nogami. Inną możliwą przyczyną jest niewłaściwe osadzenie kasety na dnie wanny wysiewającej. Jeśli chodzi o przycinanie, podczas zakładania drugiego klipsa należy nieco mocniej naprężyć tkankę, aby leżała płasko. Niektóre plastry mają lekką wklęsłość; W takich przypadkach przytnij plasterek wypukłą stroną do góry. Po nabraniu wprawy zazwyczaj doświadczamy nieudanego siewu z mniej niż 2% plastrów.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest wymóg posiadania specjalistycznego sprzętu - wycinarki laserowej i drukarki 3D - do generowania wstępnych materiałów do przygotowania ELT. Jednak po utworzeniu kaset do hodowli tkankowych i kąpieli wysiewających nie są wymagane żadne dodatkowe materiały specjalne. Etapy krojenia płuc i decelularyzacji przygotowania rusztowania ELT są umiarkowanie czasochłonne; Kroki te można jednak wykonać z wyprzedzeniem lub w liczbie wystarczającej do przygotowania się do wielu eksperymentów w tym samym czasie. Wiele PCLS (>100 w przypadku optymalizacji pod kątem obszarów miąższowych) można wyciąć z jednego płuca i zatrzaskowo zamrozić do późniejszego wykorzystania. Podczas gdy pojedynczy cykl zamrażania i rozmrażania może spowodować niewielkie uszkodzenia ultrastrukturalne ECM46, wykazano, że nawet wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania nie powodują znacznych strat w ECM23,47. PCLS mogą być również przycinane i decellularizowane przed eksperymentem, do wykorzystania w ciągu jednego miesiąca. (Warto zauważyć, że opisany protokół decelularyzacji można przeprowadzić w ciągu około 6 godzin, co stanowi znaczną przewagę nad poprzednio opisanymi metodami, które wymagają dnia lub więcej27,28). Po przygotowaniu rusztowań proces wysiewu komórek jest prosty i szybki, a hodowla ELT nie wymaga specjalistycznych technik.

Zastrzeżeniem opisanej metody ELT jest brak wysiewu specyficznego dla regionu, tj. dostarczania AEC2 specyficznie do przestrzeni pęcherzykowej lub komórek śródbłonka specyficznie do przestrzeni naczyniowej. Niemniej jednak, chociaż komórki są po prostu wysiewane na rusztowaniach tkankowych, wzór recelularyzacji jest nielosowy, z pewnymi pozorami organizacji podobnej do pęcherzyków płucnych, w tym pierścieni nabłonkowych. Podejrzewamy, że interakcje komórka-komórka, a także lokalne różnice w składzie i geometrii ECM20,21, prawdopodobnie przyczyniają się do obserwowanych wzorców recelularyzacji. Na poparcie tej hipotezy, wcześniej opublikowane badanie, w którym fibroblasty zostały wysiane niespecyficznie na pozbawionych komórek wycinkach płuc, wykazało, że wzorzec ponownego zasiedlenia tkanek i związane z nim fenotypy komórkowe różniły się znacznie w zależności od mikroskopijnego regionu tkanki i źródła rusztowania ECM (np. zdrowi kontra chorzy)27. Zaobserwowano również, że fibroblasty wnikają do śródmiąższu - miejsca, w którym znajdują się w natywnej tkance płucnej 1,27. Podstawowa alternatywna metoda, którą możemy sobie wyobrazić, aby hodować komórki na wycinkach płuc w sposób naprawdę specyficzny dla regionu, polegałaby na wysiewaniu nienaruszonych pozbawionych komórek płuc przez drogi oddechowe31,48 i przedziały naczyniowe49,50, a następnie cięcie zrecellularnej tkanki. Jednak ta alternatywa 1) jest znacznie bardziej kosztowna, czasochłonna i zasobożerna; 2) jest mniejszą przepustowością; 3) wymaga zwiększonej liczby zwierząt; oraz 4) wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakażenia ze względu na wyzwania związane z posiewem całego płuca i późniejszym krojeniem wysianego płuca. Chociaż platforma ELT nie podsumowuje wszystkich aspektów natywnej organizacji komórkowej, umożliwia hodowlę komórek płuc na fizjologicznie istotnym podłożu ECM, w sposób dostępny dla znacznie większej liczby laboratoriów.

Elastyczność systemu ELT jest główną zaletą tej platformy i powinna umożliwić hodowlę tkanki płucnej na małą skalę z dowolną liczbą rusztowań tkankowych, komórek lub pożywek hodowlanych. Zastosowanie rusztowań pochodzących z chorej tkanki lub z modeli urazów może pozwolić na badanie interakcji komórka-komórka lub komórka-matryca w warunkach zmienionego chorobą ECM 27,29,51. Należy jednak pamiętać, że protokół decelularyzacji może wymagać dostosowania w celu uwzględnienia różnic w matrycy między gatunkami52. Opisana strategia wysiewu może być stosowana dla dowolnego typu komórek, a oś czasu hodowli dostosowana do potrzeb badacza. Na początek 1 x 106 komórek na rusztowanie powinno dać wysoce komórkową tkankę w ciągu 7 dni hodowli, podczas gdy 1 x 105 komórek ogółem powoduje słabą komórkowość. W przypadku każdej adaptacji osi czasu, kasety z kulturami tkankowymi powinny zostać wyjęte z kąpieli wysiewającej 24 godziny po ostatnim wysiewie tkanek. Tutaj, mając na celu modelowanie części złożoności komórkowej zębodołu płucnego, opisujemy strategię recelularizacji trójkulturowej, która wspiera utrzymanie dobrze zróżnicowanych AEC2 noworodków w strukturach podobnych do pęcherzyków płucnych przez co najmniej 7 dni. Nasze wyniki wskazują również na udane wszczepienie zarówno fibroblastów, jak i komórek śródbłonka w ELT, podkreślając szerokie zastosowanie substratu hodowli i jego przydatność do badań nad współkulturami. Wysiewanie dorosłych komórek w ELT może ułatwić modelowanie bardziej spokojnych struktur pęcherzyków płucnych, podczas gdy wysiewanie AEC2 pochodzących z ludzkich PSC, w tym tych z modyfikacjami genetycznymi, może ułatwić badania translacyjne chorób u ludzi13,53. Ogólnie rzecz biorąc, podejście oddolne, które umożliwia platforma ELT, daje możliwość zbadania wkładu poszczególnych typów komórek w interesujące odczyty, takie jak proliferacja AEC2 lub stan różnicowania.

Podsumowując, protokół ten przedstawia solidny system generowania zmodyfikowanych tkanek płuc do badań nad współhodowlą AEC2, fibroblastów i komórek śródbłonka w bezkomórkowych rusztowaniach ECM do wycinków płuc. ELT reprezentują nowatorską strategię hodowli 3D dla pierwotnych AEC2, które do tej pory zazwyczaj opierały się na mniej fizjologicznych matrycach żelowych w celu utrzymania dobrze zróżnicowanego fenotypu 6,11,12. Obecna platforma opiera się na wcześniejszych pracach nad ponownym zasiedlaniem bezkomórkowych wycinków płuc 24,25,26,27,28,29, ale oferuje kilka zalet: 1) system kaset do hodowli tkankowych ułatwiający obsługę ELT podczas decelularyzacji, wysiewu i hodowli; 2) dostosowana kąpiel wysiewająca w celu precyzyjnego wysiewu znanej liczby komórek na każdym rusztowaniu plasterka; oraz 3) strategia ponownego wysiewu trójkulturowego, która umożliwia ponowne zasiedlenie tkanek pęcherzyków płucnych komórkami nabłonka, mezenchymalnymi i śródbłonka. W związku z tym ELT stanowią ważny krok naprzód w kierunku tworzenia powtarzalnych modeli in vitro, które oddają złożoność komórkową i substratową natywnego zębodołu i niszy komórek macierzystych AEC2.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.E.N. jest założycielem i udziałowcem Humacyte, Inc, która jest firmą zajmującą się medycyną regeneracyjną. Humacyte wytwarza zmodyfikowane naczynia krwionośne z allogenicznych komórek mięśni gładkich do chirurgii naczyniowej. Małżonek L.E.N. posiada udziały w Humacyte, a L.E.N. zasiada w Radzie Dyrektorów Humacyte. L.E.N. jest wynalazcą na podstawie patentów, które są licencjonowane przez Humacyte i które generują tantiemy dla L.E.N. L.E.N. otrzymała nieograniczony dar badawczy na wsparcie badań w swoim laboratorium w Yale. Humacyte nie miał wpływu na przebieg, opis ani interpretację ustaleń zawartych w tym raporcie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lorenzo Sewananowi i Jorge Nunezowi za ich pracę nad projektem kasety do hodowli tkankowej użytej w tym protokole, laboratorium Kamińskiego za użycie ich wibratomu, Maurizio Chioccioli i Jessice Nouws za pomoc w krojeniu płuc, Allie LaRocco za pomoc w początkowych eksperymentach pilotażowych oraz Hong Qian za uważne przeczytanie protokołu. Praca ta była wspierana przez granty NIH F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) i U01HL145567 (L.E.N.); oraz dzięki nieograniczonemu darowi badawczemu od Humacyte Inc. (L.E.N.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3D: Form 2Formlabs
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)SigmaI5879
8-Bromo cAMPSigmaB7880
Agaroza, UltraPure LMPInvitrogen15517-014
Amfoterycyna BSigmaA2942
Kolczasta złączka redukcyjna, 3/8 cala x 1/4 calaMcMaster-Carr5121K271
Nukleaza benzonazySigmaE1014
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja VGemini700-104PDo podłoża wzrostowego AEC2
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), standardowa klasaGemini700-100PDo buforu benzonazy
Zawór zwrotny, polipropylen, 1/8 cala króciec wężaCole-ParmerSK-98553-10
CHIR99021PeproTech2520691
Clear Resin, 1 LFormlabsRS-F2-GPCL-04
Klej cyjanoakrylowy, taki jak Krazy Maximum Bond Permanent GlueDowolny sprzęt, rzemiosło lub aptekaKG483 lub podobny
DeksametazonSigmaD4902
DMEM (niski poziom glukozy)Gibco11885-084
DMEM (wysoki poziom glukozy)Gibco11965-092
(zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA)InvitrogenP7589
EDTA, 0,5 M, pH 8,0Zestaw AmericanBioAB00502-01000
EdU (zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, Alexa Fluor 647)InvitrogenC10340Używany zgodnie ze wskazówkami producenta
Łącznik kolankowy, 3/8 calaMcMaster-Carr5121K907
F12Gibco11765-054
Surowica bydlęca płodu (FBS), charakteryzowanaHyconSH30071.03
Siarczan gentamycynyGemini400-100PRozpuszczony w diH2O do roztworu podstawowego o sile 50 mg/ml
Maszynki do strzyżenia włosówWahlMiniArco
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), bez czerwieni fenolowejGibco14175-095
Heparyna sodowa do wstrzykiwań, USP, 1000 U/mlSagentNDC: 25021-400-30Do wstrzykiwań dootrzewnowych i dosercowych
Sól sodowa heparynySigmaH4784Do perfuzji tętnicy płucnej; przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 U/ml w PBS
HEPES BufferCorning25-060-CL
Trójnik liniowy, 3/8 cala x 1/8 calaMcMaster-Carr5121K851
Pętla do zaszczepiania, jednorazowaFisherbrand22-363-600
Insulina z trzustki bydlęcejSigmaI6634
Ketamina do wstrzykiwań, 100 mg/mlCovetrus (Butler Animal Health)010177
KGF, rekombinowana ludzkaPeproTech100-19
, VLS 3.50 30 WUniversal Laser
L-glutaminaGibco25030-081
Luer-lock, żeński, 3/32 calaCole-Parmer45508-02
Luer-lock, męski, 1/8 calaCole-Parmer30800-24
Luer-lock, męski, 1/4 calaMcMaster-Carr51525K146
MCDB-131 Kompletny bez surowicyVEC TechnologiesMCDB-131 WOFBS
Chlorek magnezu (MgCl2), 1 MAmericanBioAB09006-00100
NaClAmerican BioananalyticalAB01915
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), bez Ca2+ i Mg2+, 10XSigmaD1408Rozpuszcza się do 1X z diH2O
Fosforan buforowany solą fizjologiczną (PBS), z Ca2+ i Mg2+Gibco21300-058
PDMS - SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning Corporation4019862
Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/ml penicyliny/10 000 μ g/ml streptomycyny)Gibco15140-122
szalka Petriego, 150 mmFalcon351058
Folia z tworzywa sztucznego (parafilm)BemisPM-996
Rurka Pharmed BPT, LS 16Masterflex06508-16
Rurka Pharmed BPT, LS 17Masterflex06508-17
Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 14Masterflex96420-14
Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 16Masterflex96420-16
Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 36Masterflex96410-36
Poloxamer 407 (Pluronic F-127)SigmaP2443
Podkładki przygotowawcze z powidonem/jodem, 10%Dynarex Corporation1108
Arkusz PTFE o grubości 0,060 cala (1/16 cala)ePlasticsPTFENAT0.060X12X12Do zakładek kaset do hodowli tkankowych
Arkusz PTFE, grubość 0,093 cala (3/32 cala)ePlasticsPTFENAT0,093X12X12Do ramek i klipsów kaset do hodowli tkankowych
Napęd pompy perystaltycznej: Masterflex L/S Napęd cyfrowy o zmiennej prędkościCole-ParmerZM-07528-30
Głowica pompy perystaltycznej: Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load IICole-ParmerEW-77202-60
Szczur, Sprague DawleyCharles RiverKod szczepu: 400
ŻyletkaDowolny sklep z narzędziami lub rękodziełemPersonna 94-120-71 lub podobny
Kwas retinowySigmaR2625
Ostrza obrotowe, 28 mmOmnigrid2046
Nóż obrotowy, 28 mmOlfaModel 9551
Deoksycholan sodu (SDC)SigmaD6750
Nitrorusydek sodu (SNP)Sigma71778
Kran, 4-drożnyszew Edwards594WSC
, monofilamentowa polipropylenowa4-0 CovidienVP-557-X
, strzykawka 10 mlBD302995
, 50 mlBD309653
Naczynie do hodowli tkankowej, 35 mmFalcon353001
Naczynie do hodowli tkankowych, 100 mmCorning430167
Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowaFalcon353046
Płytka do hodowli tkankowej 12-dołkowaFalcon353043
Transferyna ludzkaSigmaT8158
Tris, 1 M roztwór, pH 8,0AmericanBioAB14043-01000
Triton X-100American BioanalyticalAB02025-00500
Vibratome, Compresstome VF-300-0ZPrecisionary Instruments LLC
Ksylazyna, 100 mg/mlHenry ScheinNDC: 11695-4022-1
Złącze Y, 1/16 cala kolczasteCole-Parmer30614-43
Test DNA Wycinarka laserowa Systems strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burri, P. H. Morphology and respiratory function of the alveolar unit. International Archives of Allergy and Applied Immunology. 76, Suppl 1 2-12 (1985).
  2. Barkauskas, C. E., Noble, P. W. Cellular Mechanisms of Tissue Fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (11), 987-996 (2014).
  3. Taylor, M. S., et al. A Conserved Distal Lung Regenerative Pathway in Acute Lung Injury. American Journal of Pathology. 188 (5), 1149-1160 (2018).
  4. Carsana, L., et al. Pulmonary post-mortem findings in a series of COVID-19 cases from northern Italy: a two-centre descriptive study. Lancet Infectious Diseases. 20 (10), 1135-1140 (2020).
  5. Basil, M. C., et al. The Cellular and Physiological Basis for Lung Repair and Regeneration: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. Desai, T. J., Brownfield, D. G., Krasnow, M. A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. Nature. 507 (7491), 190-194 (2014).
  8. Evans, M. J., Cabral, L. J., Stephens, R. J., Freeman, G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to NO2. The American Journal of Pathology. 70 (2), 1-24 (1973).
  9. Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
  10. Borok, Z., et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 18 (4), 554-561 (1998).
  11. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  12. Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary Type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
  13. Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Chen, Y. W., et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 19 (5), 542-549 (2017).
  16. Korogi, Y., et al. In vitro disease modeling of hermansky-pudlak syndrome Type 2 using human induced pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 431-440 (2019).
  17. Strikoudis, A., et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3709-3723 (2019).
  18. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  19. Chapman, H. A. Epithelial responses to lung injury: Role of the extracellular matrix. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (3), 89-95 (2012).
  20. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  21. Zhou, Y., et al. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease. Matrix Biology. 73, 77-104 (2018).
  22. Calle, E. A., et al. Targeted proteomics effectively quantifies differences between native lung and detergent-decellularized lung extracellular matrices. Acta Biomaterialia. 46, 91-100 (2016).
  23. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  24. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: Detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  25. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1055(2013).
  26. Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
  27. Burgstaller, G., et al. Distinct niches within the extracellular matrix dictate fibroblast function in (cell free) 3D lung tissue cultures. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (5), 708-723 (2018).
  28. Sun, H., et al. Fibroblast engraftment in the decellularized mouse lung occurs via a β1-integrin-dependent, FAK-dependent pathway that is mediated by ERK and opposed by AKT. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (6), 463-475 (2014).
  29. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  30. Schwan, J., et al. Anisotropic engineered heart tissue made from laser-cut decellularized myocardium. Scientific Reports. 6, 32068(2016).
  31. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  32. Gerckens, M., et al. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  33. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465(2017).
  34. Neuhaus, V., et al. Assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (135), e57042(2018).
  35. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (6), 1315-1321 (2002).
  36. Vaccaro, C., Brody, J. S. Ultrastructure of developing alveoli. I. The role of the interstitial fibroblast. The Anatomical Record. 192 (4), 467-479 (1978).
  37. Calle, E. A., et al. Fate of distal lung epithelium cultured in a decellularized lung extracellular matrix. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1916-1928 (2015).
  38. Dobbs, L. G., Gonzalez, R., Williams, M. C. An improved method for isolating type II cells in high yield and purity. American Review of Respiratory Disease. 134 (1), 141-145 (1986).
  39. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. American Journal of Physiology. 258, 134-147 (1990).
  40. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  41. Dobbs, L. G., Pian, M. S., Maglio, M., Dumars, S., Allen, L. Maintenance of the differentiated type II cell phenotype by culture with an apical air surface. The American Journal of Physiology. 273 (2), 347-354 (1997).
  42. Bruce, M. C., Honaker, C. E. Transcriptional regulation of tropoelastin expression in rat lung fibroblasts: changes with age and hyperoxia. American Journal of Physiology. 274 (6), 940-950 (1998).
  43. Berk, J. L., Franzblau, C., Goldstein, R. H. Recombinant interleukin-1 beta inhibits elastin formation by a neonatal rat lung fibroblast subtype. Journal of Biological Chemistry. 266 (5), 3192-3197 (1991).
  44. Schultz, C. J., Torres, E., Londos, C., Torday, J. S. Role of adipocyte differentiation-related protein in surfactant phospholipid synthesis by type II cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (2), 288-296 (2002).
  45. Maksvytis, H. J., et al. In vitro characteristics of the lipid-filled interstitial cell associated with postnatal lung growth: evidence for fibroblast heterogeneity. Journal of Cellular Physiology. 118, 113-123 (1984).
  46. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  47. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
  48. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
  49. Le, A. V., et al. Efficient and Functional Endothelial Repopulation of Whole Lung Organ Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (9), 2000-2010 (2017).
  50. Ren, X., et al. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nature Biotechnology. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  51. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  52. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  53. Alysandratos, K. D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Engineered Lung TissuesDecellularized Lung SlicesExtracellular MatrixLung Tissue EngineeringAlveolar EpitheliumEndothelial CellsFibroblast SeedingPrecision Cut Lung SlicesRecellularization ProtocolPhase Contrast Microscopy

Powiązane artykuły