Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych plastrach prążkowia od dorosłych myszy

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63379

⸱

8 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Thomas Jefferson University, 2School of Biomedical Engineering, Drexel University, 3Department of Pathology, MitoCare Center, Thomas Jefferson University, 4School of Life Sciences, Peking University

W tym artykule

Podsumowanie

Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest powszechnym wskaźnikiem funkcji mitochondriów i może być używany do badania różnych modeli chorób. Opracowaliśmy nową metodę wykorzystującą analizator Seahorse XF do bezpośredniego pomiaru OCR w ostrych wycinkach prążkowia od dorosłych myszy, która jest bardziej fizjologicznie istotna niż inne metody.

Streszczenie

Mitochondria odgrywają ważną rolę w komórkowej produkcji ATP, regulacji reaktywnych form tlenu i kontroli stężenia Ca2+. Dysfunkcja mitochondriów jest zaangażowana w patogenezę wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona i choroby Alzheimera. Aby zbadać rolę mitochondriów w modelach tych chorób, możemy zmierzyć oddychanie mitochondrialne za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) jako wskaźnika zastępczego funkcji mitochondriów. OCR został już z powodzeniem zmierzony w hodowlach komórkowych, a także w izolowanych mitochondriach. Jednak techniki te są mniej istotne fizjologicznie niż pomiar OCR w ostrych wycinkach mózgu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, autorzy opracowali nową metodę wykorzystującą analizator Seahorse XF do bezpośredniego pomiaru OCR w ostrych wycinkach prążkowia od dorosłych myszy. Technika ta jest zoptymalizowana z naciskiem na prążkowie, obszar mózgu zaangażowany w chorobę Parkinsona i chorobę Huntingtona. Analizator wykonuje test żywych komórek za pomocą 24-dołkowej płytki, co pozwala na jednoczesny pomiar kinetyczny 24 próbek. Metoda wykorzystuje jako próbki okrągłe fragmenty wycinków mózgu prążkowia. Pokazujemy skuteczność tej techniki, identyfikując dolny podstawowy OCR w wycinkach prążkowia mysiego modelu PD. Metoda ta będzie przedmiotem szerokiego zainteresowania badaczy zajmujących się chorobą Parkinsona i chorobą Huntingtona.

Wprowadzenie

Dysfunkcja mitochondriów jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi, w tym z chorobą Parkinsona (PD), chorobą Huntingtona i chorobą Alzheimera1,2,3. Modele PD, takie jak myszy i szczury z nokautem PINK1 (KO), wykazują upośledzoną funkcję mitochondriów4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondria wyizolowane z prążkowia (STR) lub całego mózgu starzejącej się myszy PINK1 KO wykazują defekty w kompleksie I7,10,12,13. Bezpośredni pomiar wskaźnika zużycia tlenu (OCR) jest jedną z najczęstszych metod oceny funkcji mitochondriów, ponieważ OCR jest sprzężony z produkcją ATP, główną funkcją mitochondriów14. Dlatego pomiar OCR w modelach choroby lub próbkach/tkankach pochodzących od pacjentów może pomóc w zbadaniach, w jaki sposób dysfunkcja mitochondriów prowadzi do choroby.

Obecnie istnieje kilka sposobów pomiaru mitochondrialnego OCR, w tym elektroda Clarka i inne elektrody O2, barwnik fluorescencyjny O2 oraz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego 15,16,17,18,19. Zaletą są metody oparte na elektrodachO2, które umożliwiają łatwe dodawanie różnych podłoży. Są one jednak niewystarczające do jednoczesnego pomiaru kilku próbek. W porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na elektrodachO2, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego, powszechnie używane narzędzie do OCR w hodowlach komórkowych lub oczyszczonych mitochondriach, oferuje lepszą przepustowość15,18,20. Niemniej jednak wszystkie te metody są zwykle stosowane do pomiaru OCR w izolowanych mitochondriach lub hodowlach komórkowych6,16,17,19,20,21. Izolacja mitochondriów powoduje niezamierzone uszkodzenia, a wyekstrahowane mitochondria lub kultury komórkowe są mniej istotne fizjologicznie niż nienaruszone wycinki mózgu22. Nawet jeśli mikroelektrody są używane w warstwach, są one mniej czułe i trudniejsze w obsłudze niż w hodowanych komórkach23.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy metodę wykorzystującą analizator strumienia zewnątrzkomórkowego XF24, który pozwala na analizę wielu parametrów metabolicznych z ostrych wycinków mózgu prążkowia u myszy24. Technika ta zapewnia ciągłą bezpośrednią kwantyfikację oddychania mitochondrialnego za pomocą OCR. Krótko mówiąc, małe fragmenty wycinków mózgu prążkowia umieszcza się w studzienkach płytki wyspy, a analizator wykorzystuje biosensory oparte na fluorescencji tlenu i protonów do pomiaru odpowiednio OCR i współczynnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego17,21,25.

Jedną z unikalnych cech analizatora są cztery dołki iniekcyjne, które pozwalają na ciągły pomiar OCR podczas sekwencyjnego wstrzykiwania do czterech związków lub odczynników; umożliwia to pomiar kilku parametrów oddychania komórkowego, takich jak podstawowy OCR mitochondrialny, OCR sprzężony z ATP i maksymalny OCR mitochondrialny. Związki wstrzyknięte podczas pomiarów do przedstawionego tu protokołu to stężenia robocze 10 mM pirogronianu w pierwszym studzience roztworu (port A), 20 μM oligomycyny w drugim dołku roztworu (port B), 10 μM cyjanku karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon (FCCP) w trzecim dołku (port C) i 20 μM antymycyny A w czwartym dołku (port D), na podstawie Fried et al.25. Należy zauważyć, że te stężenia były stężeniami roboczymi, a roztwory podstawowe 10x, 11x, 12x i 13x wstrzykiwano odpowiednio do portów roztworu od A do D. Cel użycia każdego roztworu był następujący: 1) Pirogronian był niezbędny, ponieważ bez niego dodanie FCCP spowodowałoby zmniejszoną odpowiedź OCR spowodowaną ograniczeniem dostępnych substratów; 2) Oligomycyna hamuje syntazę ATP i umożliwia pomiar oddychania związanego z ATP; 3) FCCP oddziela utlenianie od fosforylacji i umożliwia pomiar maksymalnej pojemności mitochondriów; 4) Antymycyna A hamuje kompleks III w łańcuchu transportu elektronów, a zatem umożliwia pomiar OCR niezwiązanego z mitochondriami.

Stężenie użytej oligomycyny zostało określone na podstawie następujących powodów: 1) Zalecana dawka oligomycyny dla większości typów komórek (izolowane mitochondria lub hodowle komórkowe) wynosi 1,5 μM. Z doświadczenia wynika, że zwykle do eksperymentów z plastrami stosuje się 3x-10x dawki zdysocjowanych komórek, ponieważ może występować gradient, a penetracja roztworu w plasterkach wymaga czasu. Dlatego stężenie powinno mieścić się w zakresie od 5 μM do 25 μM. 2) Stężenie 20 μM zostało wybrane na podstawie Fried et al.25. Nie próbowano wyższych stężeń ze względu na nieswoistą toksyczność oligomycyny. 3) W raporcie Underwood et al.26, autorzy przeprowadzili eksperyment miareczkowania oligomycyny i stwierdzili, że dawki 6,25, 12,5, 25 i 50 μg/ml powodowały podobne hamowanie. Wyższe stężenie oligomycyny (50 μg/ml) nie hamowało więcej, ale miało większą wariancję. 4) Z naszych obserwacji wynika, że czynnikiem decydującym wydaje się być zdolność oligomycyny do przenikania. Oligomycyna ma trudności z przeniknięciem do tkanki, dlatego potrzeba co najmniej 7 do 8 cykli, aby osiągnąć plateau, maksymalną odpowiedź. Dopóki osiąga plateau, zakłada się, że hamowanie jest maksymalne.

Kluczowym wyzwaniem technicznym związanym z dostosowaniem analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru OCR w wycinkach prążkowia jest zapobieganie niedotlenieniu tkanek. Ponieważ bufor nie był natleniany przez cały czas trwania pomiarów (około 4 godziny), hipoksja była głównym problemem. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek grubszych tkanek, w których tlen nie może dyfundować w próbkach. Aby przezwyciężyć ten problem, plastry zostały pocięte na kawałki o grubości 150 μm, tak aby tlen z otoczenia mógł przeniknąć do środka wycinków mózgu. Ponadto do wstępnie natlenionego buforu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) dodano 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), co ułatwiło określenie maksymalnego OCR, jak wcześniej sugerowano23. Sprawdzaliśmy, czy komórki są żywe. Najpierw użyto Hoechst 33258 (10 μM) i jodku propidyny (10 μM) do zbadania, czy komórki są zdrowe w tych warunkach. Następnie sprawdziliśmy, czy średnie neurony kolczaste są funkcjonalnie zdrowe za pomocą zapisu patch-clamp. Następnie oceniliśmy, czy zakończenia dopaminy (DA) w wycinkach prążkowia były funkcjonalnie zdrowe, mierząc uwalnianie DA za pomocą woltamperometrii szybkiego skanowania. Wyniki pokazały, że wycinki prążkowia, które nie były natlenione (grupa ACSF/BSA) były tak samo zdrowe jak natleniona grupa kontrolna24.

Następnie przetestowaliśmy różne kombinacje grubości plastra i rozmiaru stempla, aby określić optymalne warunki warstwy prążkowia do testu oddychania strumieniowego. Do analizy OCR za pomocą analizatora wykorzystano grzbietowe plastry prążkowia o różnych grubościach (150 μm i 200 μm) i rozmiarach stempla (średnica 1,0 mm, 1,5 mm i 2,0 mm). Warstwy prążkowia o grubości 150 μm i średnicy stempla 1,5 mm charakteryzowały się najwyższą wydajnością sprzęgania i OCR-ami w optymalnym zakresie dla analyzer24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury, w tym praca ze zwierzętami, zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Thomasa Jeffersona. Użyto samców myszy FVB/NTac w wieku od 3 do 14 miesięcy. Poniższe kroki zostały wykonane w niesterylnych warunkach, ale należy zachować ostrożność, aby wszystko było jak najbardziej czyste.

UWAGA: Przedstawiona tutaj metoda została opracowana i wykorzystana w badaniach zgłoszonych przez Zhi et al.24. W opisanych tutaj eksperymentach wykorzystano analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF24 (patrz Tabela Materiałów). Metody te można zaadaptować do analizatora XFe24, a niektóre wyniki zostały potwierdzone za pomocą tego analizatora.

1. Czujniki z wkładem hydratu (1 dzień przed testem)

  1. Otwórz zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego (patrz tabela materiałów) i wyjmij zarówno wkład czujnika (zielony), jak i płytkę użytkową (przezroczystą; Rysunek 1A). Odłóż wkład czujnika na bok (czujniki do góry) i nie dotykaj czujników.
  2. Dodać 600 μl roztworu kalibru (pH 7,4) do każdego dołka płytki użytkowej. Umieść wkład czujnika na górze płytki użytkowej i zanurz czujniki w roztworze kalibru. Upewnij się, że trójkątne wycięcie w płytce narzędzia i wkładu czujnika są prawidłowo wyrównane (Rysunek 1B).
  3. Uszczelnić zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu roztworu kalibru, a następnie umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, nieuzupełnionymCO2 lub tlenem, przez noc.

2. Przygotuj płytkę tkankową (w dniu testu)

  1. Otwórz mikropłytkę wychwytującą wychwyt wychwytu wysp i wyjmij płytkę wychwytującą wyspę w celu umieszczenia jej w tkankach.
  2. Podgrzać odpowiednią objętość (625 μl na studzienkę) wstępnie natlenionego zmodyfikowanego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF, skład 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mMMgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH 7,2) buforu do 37 °C w probówce o pojemności 50 ml. Następnie dodać BSA do końcowego stężenia 4 mg/ml w celu przygotowania buforu oddechowego. Ogólnie rzecz biorąc, 50 ml wystarcza na jedną płytkę.
  3. Ostrożnie dodać 625 μl buforu oddechowego (wstępnie natleniony bufor ACSF z 25 mM glukozy i 4 mg/ml BSA) do każdego dołka płytki wysepki i unikać potrząsania płytką. Upewnij się, że na wierzchu wkładu czujnika nie znajdują się żadne resztki kropli, a w buforze każdej studzienki nie ma pęcherzyków powietrza.

3. Przygotowanie ostrego prążkowia i rozmieszczenie wyciętego plastra

  1. Odetnij głowę myszy po zwichnięciu szyjki macicy i natychmiast wypreparuj mózg w 10 ml lodowatego, wstępnie natlenionego roztworu tnącego (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukozy, pH 7,4).
  2. Przekrój koronalne plastry prążkowia za pomocą wibratomu zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów) o grubości 150 μm w lodowatym, wstępnie natlenionym roztworze tnącym.
  3. Odzyskaj plastry w 50 ml natlenionego ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukozy, 2 mM HEPES, pH 7,4) i przechowuj w roztworze do 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Po wyzdrowieniu przenieść plastry na szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z 5 ml buforu oddechowego.
  5. Użyj stempla do biopsji ze stali nierdzewnej (np. o średnicy 1,5 mm), aby utworzyć okrągły kawałek tkanki w pożądanym obszarze pokrojonego mózgu. Trzymaj plasterek w buforze, delikatnie dociskając stemplem. Upewnij się, że stempel jest dociśnięty wystarczająco mocno, aby przeciąć tkankę. Usuń resztę tkanki, podnieś stempel i wyjmij okrągły kawałek tkanki do bufora.
  6. Odetnij ostatni koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zrobić otwór o średnicy 1,5-2,0 mm i użyj go do przytrzymania i przeniesienia dziurkowanego plasterka na górę ekranu przechwytywania. Odessać jeden kawałek przebitej tkanki mózgowej i ostrożnie umieścić tkankę po siatkowej stronie ekranu przechwytywania (Rysunek 2A). Ekran przechwytywania będzie okrągłym kawałkiem plastiku z siatką przymocowaną z jednej strony.
    UWAGA: Ekrany przechwytywania są zawarte w pakiecie z mikropłytkami (patrz Tabela materiałów) i są podobne do tych używanych w Schuh et al.23.
  7. Delikatnie użyj chusteczki papierowej, aby na krótko wysuszyć ekran przechwytywania. Po usunięciu wilgoci tkanka staje się lepka, co pozwala plasterkowi przymocować się do środka siatki. Nie susz plastra zbyt mocno, ponieważ w przeciwnym razie zostanie uszkodzony.
  8. Przytrzymaj pęsetą ekran przechwytywania stroną do dołu i umieść go w jednym z dołków płytki wysepki inkubującej ( Rysunek 2B). Uważaj, aby nie upuścić plasterka; Jeśli tak, wyjmij ekran i umieść na nim nowy plasterek.
    UWAGA: Nie umieszczaj plastrów mózgu w dwóch dołkach korekcyjnych tła (A1 i D6) w płycie wysepki.
  9. Inkubować płytkę wysepki w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie temperatury i pH przed uruchomieniem testu.

4. Ładowanie wkładów z pożądanymi związkami

  1. Rozcieńczyć pożądane związki w zmodyfikowanym ACSF (37 °C) do końcowego stężenia podstawowego 10x, 11x, 12x i 13x stężenia roboczego odpowiednio dla portów A do D i dostosować do pH 7,4. Test będzie podawał związki w kolejności od portu A do D. W tym doświadczeniu użyto następujących roztworów, których odpowiednie stężenie robocze zostało wymienione wcześniej: 10 mM pirogronianu (port A), 20 μM oligomycyny (port B), 10 μM lub innych stężeń FCCP (port C) oraz 20 μM antymycyny A (port D).
  2. Delikatnie załaduj wstępnie 75 μl rozcieńczonych związków do odpowiednich portów iniekcyjnych wkładu czujnika. Umieścić końcówki do połowy w otworach iniekcyjnych pod kątem 45°, tak aby końcówka przylegała do ścianki otworu iniekcyjnego. Końcówek nie należy wkładać całkowicie na dno otworów iniekcyjnych, ponieważ może to spowodować wyciek związku przez port.
  3. Ostrożnie wyjmij końcówki z portów, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Nie stukaj w żadną część wkładu, aby uniknąć złagodzenia pęcherzyków powietrza.
  4. Sprawdź wzrokowo porty wtryskowe pod kątem równomiernego obciążenia. Upewnij się, że cała ciecz znajduje się w porcie i nie ma żadnych resztek kropel na górze wkładu.
  5. Umieść wkład czujnika na płytce użytkowej i umieść go w inkubatorze (bezCO2) na 30 minut, aby ponownie nagrzał się do 37 °C. Obchodź się ostrożnie, trzymając się tylko za tabliczkę użytkową. Ruszaj się tak mało, jak to możliwe.

5. Kalibracja i wykonanie testu

  1. Załaduj szablon testu do oprogramowania. Naciśnij zielony przycisk START.
  2. Upewnij się, że załadowany jest prawidłowy protokół. Protokół zawiera kombinację 3-minutowych sekwencji pomiarowych, 3-minutowego oczekiwania i 2-minutowego pomiaru (te trzy kroki tworzą jeden pomiar). Zmień odległość głowicy sondy z 26 600 na 27 800 w ustawieniach sprzętowych w ustawieniach przyrządu25. Nie ma potrzeby wymiany głowicy sondy w analizatorze XFe24. Naciśnij przycisk START.
  3. Załaduj wkład czujnika z tabliczki narzędziowej do tacy na instrumenty. Wycięcie znajduje się w przednim, lewym rogu. Upewnij się, że płyta jest prawidłowo osadzona i płaska. Załaduj wypełniony lekiem wkład czujnika do analizatora w celu kalibracji.
  4. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby skalibrować i zrównoważyć czujniki. Trwa to około 30 minut.
  5. Po zakończeniu etapu kalibracji wyjmij płytkę kalibracyjną i zastąp ją płytką wysepkową (zawierającą siatkę i plastry tkanki).
  6. Zmierz zużycie tlenu w każdym dołku płytki przy użyciu protokołów testów. Protokół zawiera kombinację 3-minutowego mieszania, 3-minutowego oczekiwania i 2-minutowych sekwencji pomiarowych (te trzy kroki tworzą jeden pomiar), w którym to momencie obliczany jest OCR.
  7. Dla całego eksperymentu uwzględnij 4x pomiary OCR w celu stworzenia linii bazowej, następnie wstrzyknięcie portu A (pirogronian) z 4x pomiarami, następnie wstrzyknięcie portu B (oligomycyny) z 8x pomiarami, następnie wstrzyknięcie portu C (FCCP) z 5x pomiarami, a na koniec wstrzyknięcie portu D (antymycyna A) z 6x pomiarami.
    UWAGA: Ta liczba pomiarów po każdym wstrzyknięciu związku jest określana w zależności od tego, kiedy pomiar osiąga plateau.
  8. Przeanalizuj dane pomiarowe OCR i dane dotyczące wydajności sprzężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwszym krokiem niniejszego badania była optymalizacja grubości skrawka oraz rozmiaru wycińca używanego do wycięcia fragmentu prążkowia z preparatu (Rysunek 3A). Najlepsze wyniki, określone na podstawie wydajności sprzężenia, uzyskano dla skrawka o grubości 150 µm i rozmiarze wycińca 1,5 mm (Rysunek 3B-C). Jak pokazano na Rynku 3B, OCR pozostaje stosunkowo stabilny przez 5 h, przy spadku wartości ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowana przez nas metoda pozwoliła na wykorzystanie analizatora XF do pomiaru OCR w wycinkach prążkowia od dorosłych myszy w okresie 4 godzin. Metoda ta zapewnia nowy sposób pomiaru bioenergetyki komórkowej w stemplach wyciętych z anatomicznie zdefiniowanych struktur mózgu. Ponieważ analizowane próbki tkanek są raczej małe, można badać parametry metaboliczne określonych obszarów mózgu zaangażowanych w chorobę. Ponadto stosowanie ostrych plastrów ściślej naśladuje fizjologiczne środowisko komórkowe, czego nie można osi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Wangchen Tsering i Pameli Walter za ich krytyczne przeczytanie i zredagowanie tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) (NS054773 do C.J.L. i NS098393 do H.Z.) oraz Wydział Neurologii na Uniwersytecie Thomasa Jeffersona (Startup Funds do H.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laboratoryjny miernik pH Accumet AB150Thermo Fisher Scientific13-636-AB150Do pomiaru pH
Antymycyna A ze streptomyces sp.SIGMAA8674Aby zahamować kompleks III mitochondriów
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SIGMAA6003Do wytwarzania zmodyfikowanego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (BSA-ACSF)
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonylu cyjanku karbonylu (FCCP)SIGMAC2920Do rozprzęgania oddychania mitochondrialnego
D-GlukozaSIGMAG8270Do wytwarzania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
DMSOSIGMAD8418Do usuwania związków
HEPESSIGMAH3375Do wytwarzania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
Nawilżony inkubator bez CO2Fisher Scientific11-683-230DDo nawilżania płytek w temperaturze 37 & stopni; C
Oligomycyna ze Streptomyces diastatochromogenesSIGMAO4876Aby zahamować mitochondrialną syntazę ATP
ParafilmSIGMA-ALDRICHfolia uszczelniająca
RotenonTocris3616Aby zahamować kompleks I mitochondriów
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mlSeahorse Bioscience103681-100Roztwór do kalibracji konika morskiego
Seahorse XF Zewnątrzkomórkowy analizator strumienia SeahorseBioscienceSprzęt do analizy zużycia tlenu, starsza generacja
Seahorse XFe24 Zewnątrzkomórkowy analizator strumieniaSeahorse BioscienceSprzęt używany do analizy wskaźnika zużycia tlenu, nowa generacja
Seahorse XF24 FluxPaksSeahorse Bioscience101174-100Pakiet wkładów czujników analizatora strumienia, płytek do hodowli tkankowych, ekranów przechwytujących,  roztwór kalibracyjny i płytki kalibracyjne; zestaw do testów.
Pirogronian soduSIGMAP2256Aby zapobiec wszelkim ograniczeniom w dostarczaniu substratu
Stemple do biopsji ze stali nierdzewnejMiltexUrządzenie służące do dziurkowania plastrów
Sterylne naczynie do hodowli komórkowych, 35 x 10 mmEppendrof0030700102Używany do dziurkowania
VibratomeLeicaVT1200Do krojenia tkanki mózgowej
KąpielwodnaThermo Scientific Precision282-115Do bufora ciepła i roztworów

Bibliografia

  1. Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
  2. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  3. Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
  4. Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
  5. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
  7. Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
  8. Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777(2009).
  9. Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
  10. Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
  11. Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
  12. Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
  13. Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
  14. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  15. Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
  16. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
  17. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  18. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  19. Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
  20. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
  21. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  22. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317(2011).
  23. Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
  24. Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
  25. Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
  26. Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559(2021).
  27. Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przekroje prążkowia mózguoddychanie mitochondrialneanalizator Seahorse XFtest ostrych przekrojówmodel choroby Parkinsonadysfunkcja mitochondrialnaoddychanie podstawowewydajność sprzężeniaprzygotowanie przekrojów mózgu
Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych plastrach prążkowia od dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.