$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dziedzina biologii strukturalnej rozwinęła się w potężny system rozumienia biologii poprzez atomowe szczegóły struktur biomolekularnych, wzbogacając naszą wiedzę na temat szlaków biochemicznych i molekularnych podstaw chorób oraz oferując niezbędne narzędzie do badań translacyjnych.
Z biegiem lat biologia strukturalna wykroczyła daleko poza dostarczanie struktur statycznych, aby opisać również interakcje molekularne, zarówno w roztworze, jak i w komórkach, badając skale czasowe i dynamikę. Można uzyskać informacje w celu wyjaśnienia procesów zachodzących w różnych skalach wielkości, a mianowicie od atomów i pojedynczych cząsteczek po całe cząsteczki i komórki wirusa. Różne technologie zapewniają synergiczny zestaw podejść eksperymentalnych, w tym metody rozpraszania oparte na promieniowaniu rentgenowskim, neutronach lub elektronach, np. krystalografia rentgenowska (MX) lub rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS); magnetyczny rezonans jądrowy w stanie stałym i roztworze (NMR); oraz rekonstrukcja pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Metody takie jak tomografia krio-EM, krio-miękka tomografia rentgenowska i NMR w komórkach uzupełniają ten arsenał podejść do badania układów makromolekularnych, zwłaszcza w połączeniu z innymi narzędziami do obrazowania. Wraz z dodatkowymi metodami biofizycznymi, które dostarczają uzupełniających informacji na temat powinowactwa i skal czasowych interakcji molekularnych, integracyjna biologia strukturalna oferuje obecnie potężny pakiet do zrozumienia życia i opracowania leków, leków biologicznych (przeciwciał, nanociał, szczepionek), biomateriałów i innych czynników biologicznych, takich jak enzymy, które można wykorzystać do degradacji plastiku i pomocy środowisku.
Już na samym początku Komisja Europejska (KE) dostrzegła korzyści, jakie badania w dziedzinie biologii strukturalnej przynoszą społeczeństwu, a od lat osiemdziesiątych XX wieku Europa intensywnie inwestowała w bezpłatne udostępnianie drogiego sprzętu do biologii strukturalnej szerszemu gronu naukowemu. Ta demokratyzacja dostępu do obiektów wartych wiele milionów euro była siłą napędową i kamieniem węgielnym dla rozwoju obszaru biologii strukturalnej na arenie międzynarodowej. To sprawiło, że Europa znalazła się w czołówce tej dziedziny, umożliwiając tym samym silny sektor przemysłowy i przyczyniając się do rozwoju lokalnych gospodarek.
Komisja Europejska kultywuje długą i imponującą tradycję dostępu i szkolenia zewnętrznych badaczy w zakresie technologii biologii strukturalnej. Po udanym programie iNEXT (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research), który umożliwił bezpłatny dostęp do wysokiej klasy urządzeń i wszystkim europejskim naukowcom do końca 2019 r., w lutym 2020 r. rozpoczął się realizację projektu iNEXT-Discovery w ramach programu "Horyzont 2020", w ramach którego zapewniony zostanie kolejny czteroletni okres w pełni finansowanego dostępu do infrastruktury biologii strukturalnej. Równolegle, Instruct-ERIC jest punktem orientacyjnym Europejskiego Forum Strategii ds. Infrastruktur Badawczych, stanowiąc trwałą twierdzę w dziedzinie biologii strukturalnej dla europejskich i międzynarodowych społeczności naukowych. Wspólnie dążą do zaangażowania naukowców zajmujących się biologią biologiczną i innych osób w badania nad biologią strukturalną, a w tym celu oferują dostęp do jednych z najlepszych na całym świecie ekspertyz z zakresu biologii strukturalnej, technologii i obiektów, zarówno naukowcom ze środowisk akademickich, jak i przemysłu. Wraz z dodatkowymi partnerami organizują również warsztaty i szkolenia praktyczne.
Z powodu pandemii Covid19 podróżowanie do ośrodków badawczych iNEXT-Discovery i Instruct-ERIC zostało w znacznym stopniu ograniczone, co zasadniczo uniemożliwiło możliwość odbycia praktycznego szkolenia. Aby to częściowo zrekompensować, iNEXT-Discovery i Instruct-ERIC zorganizowały serię webinariów (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), a także to specjalne wydanie Journal of Visualized Experiments. Znajdą tu Państwo szczegółowe opisy nie tylko kilku z naszych głównych procedur dostępu, ale także specjalistycznych procedur, które są opracowywane w dziedzinie integracyjnej biologii strukturalnej. Chociaż nasze metody są szczegółowo opisane w tym numerze, niektóre wymagają specjalistycznej wiedzy i sprzętu, które są trudne do ustalenia na miejscu. Obiekty Instruct-ERIC i iNEXT-Discovery są dostępne w celu zapewnienia tych metod, w tym produkcji biomolekuł potrzebnych do badań strukturalnych, z pomocą i nadzorem wysoko wykwalifikowanego personelu lokalnego.
Ulepszone metody określania struktur makromolekularnych
W ciągu ostatniej dekady cryo-EM stał się bardzo popularną technologią określania złożonych struktur makromolekularnych. Zespół z Uniwersytetu w Leeds (Wielka Brytania) przedstawia przegląd wszystkich etapów związanych z analizą EM pojedynczych cząstek, koncentrując się na zmiennych, które można zoptymalizować podczas przepływu pracy i rozwiązywaniu typowych problemów1. W związku z tym, że obsługa mikroskopu online przez użytkowników zewnętrznych staje się standardem, wymagane są protokoły do wydajnej zdalnej obsługi i obrazowania. W przypadku analizy pojedynczych cząstek, zeszklone próbki są obrazowane w celu wytworzenia filmów pokazujących cząstki w losowych orientacjach. Proces przetwarzania obrazu identyfikuje parametry rekonstrukcji badanej próbki. Oprogramowanie Scipion firmy CSIC (ES) zapewnia wszystkie narzędzia do stworzenia tego przepływu pracy, umożliwiając również proste śledzenie wyników2.
Gromadzenie danych dyfrakcji rentgenowskiej na bardzo małych próbkach krystalicznych stwarza ogromne możliwości badawcze, ale także wyzwania techniczne. Zespół z Diamond (Wielka Brytania) prezentuje wykorzystanie narzędzi kriogenicznych do przygotowania setek mikrokryształów na pojedynczej siatce z minimalną ilością otaczającej cieczy na podłożu o niskim poziomie hałasu, przed zebraniem danych w dedykowanym środowisku linii badawczej, które obejmuje próżnię na ścieżce promieniowania rentgenowskiego przed i po próbce3. Szeregowe gromadzenie danych rentgenowskich w synchrotronach jest również kluczem do badania innych trudnych układów krystalicznych. W innym wkładzie Diamond pokazuje instrukcje krok po kroku, rysunki i filmy dotyczące zbierania danych przy użyciu różnych systemów dostarczania kryształów, poprzez serię przykładów4.
Nowoczesna integracyjna biologia strukturalna w odkrywaniu leków
Krystalografia rentgenowska ma ugruntowaną pozycję w odkrywaniu leków na podstawie fragmentów i jest już powszechnie stosowana do identyfikacji trafień, które można płynnie rozwinąć w głównych kandydatów. Zespoły z Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) i MAX IV (SE)6 oraz jednostki EMBL Grenoble (FR)7 opisują swoje najnowsze osiągnięcia w automatyzacji procesów roboczych w celu wydajnej krystalizacji celu, wygrzewania fragmentów, montażu kryształów, przesiewowego fragmentów opartego na krystalografii i osadzania struktury. Ich potoki są dość zautomatyzowane i wykorzystywane przez zewnętrznych badaczy na całym świecie. Zostały one zastosowane do już ponad 100 celów (często zdalnie) w celu identyfikacji trafień w celu dalszego projektowania związków i wspomaganego strukturą rozwoju ołowiu.
NMR jest również powszechnie stosowany do badań przesiewowych fragmentów w kampaniach opracowywania leków, ukierunkowanych na białka lub polinukleotydy, rozpuszczalne lub związane z błoną. Uniwersytet Goethego we Frankfurcie (DE) prezentuje zoptymalizowane metody badań przesiewowych NMR, które ograniczają ręczną interwencję podczas eksperymentów i analiz8. Ich podajniki próbek obsługują setki próbek NMR w jednym cyklu podczas kilku dni nieprzerwanych eksperymentów i zautomatyzowanych analiz.
Ponadto metody biofizyczne są komplementarne do promieniowania rentgenowskiego i NMR. Zespół z Holenderskiego Instytutu Raka (NL) prezentuje przebieg pracy wykorzystujący nanoróżnicową kalorymetrię skaningową do testów przesunięcia termicznego w celu pomiaru zmian docelowej temperatury topnienia po dodaniu fragmentów9. Wymagania wstępne dotyczące jakości i stężenia białka są spełnione przez protokół analityczny do projektowania eksperymentu, gromadzenia danych i analizy.
W kierunku komórkowej biologii strukturalnej
Tomografia krioelektronowa jest często wybieraną metodą do badania kompleksów makromolekularnych w komórkach. Obrazy z próbek zeszklonych są pozyskiwane pod różnymi kątami nachylenia, a następnie rekonstruowany za pomocą tomogramu 3D, z którego ekstrahuje się podobjętości w celu uzyskania wyższej rozdzielczości poprzez uśrednianie subtomogramu. Ponieważ elektrony silnie oddziałują z materią, takie badania wymagają próbek o grubości mniejszej niż 200 nm. Zespół CEITEC (CZ) przedstawia protokół10 dotyczący przygotowania blaszek komórkowych po zamrożeniu wgłębnym. Mimo że automatyzacja w cryo-ET poczyniła imponujące postępy, przed akwizycją serii przechyłu wymagane są godziny zbierania danych, a cele są zazwyczaj nadal identyfikowane przez wizualną inspekcję siatki. EMBL Heidelberg (DE) przygotował protokół automatyzacji do mapowania siatek i kwadratów siatki, wyboru celów i konfiguracji akwizycji serii pochylenia11.
Synchrotrony ALBA (ES) i Diamond wspólnie omawiają pułapki i zalety alternatywy dla tomografii krioelektromagnetycznej, która umożliwia badanie nienaruszonych komórek, a mianowicie kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej (cryo-SXT)12. Dostosowanie technik superrozdzielczości do temperatur kriogenicznych umożliwia obrazowanie korelacyjne za pomocą cryo-ET i cryo-SXT. Ponadto wysokoprzepustowa kriostrukturalna mikroskopia oświetleniowa (cryo-SIM) podwaja rozdzielczość konwencjonalnej fluorescencji, prowadząc do określonej lokalizacji cząsteczek lub struktur w grubych próbkach. Można to skorelować z cryo-SXT, aby wskazać określone cechy w kontekście komórkowym13.
Zespół z Uniwersytetu w Utrechcie (Holandia) informuje o przygotowaniu próbek i eksperymentach NMR w stanie stałym o wysokiej czułości, które można wykorzystać do badania trudnych układów fizjologicznych, w tym naturalnych błon i układów białkowo-lipidowo-glikanowych14. Ponadto NMR w roztworze komórkowym szybko ewoluuje, aby wyjaśnić procesy funkcjonalne. Zespół CERM/CIRMMP (IT) opisuje, jak montować i obsługiwać bioreaktory, które umożliwiają uzupełnianie składników odżywczych i tlenu dla żywych komórek wewnątrz sondy NMR w sercu magnesu o wysokim polu15. Pozwala to na rozszerzone pomiary i eksperymenty z rozdzielczością czasową, na przykład w celu monitorowania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-ligand.
Uwagi końcowe
Niniejszy numer JoVE jest w całości poświęcony najnowszym osiągnięciom biologii strukturalnej i ich zastosowaniom w europejskich infrastrukturach badawczych. Projekty iNEXT-Discovery i Instruct-ERIC umożliwiają specjalistom w dziedzinie biologii strukturalnej, ale coraz częściej także naukowcom niebędącym specjalistami w dziedzinie nauk przyrodniczych i innym badaczom, realizację ich celów badawczych poprzez oferowanie najnowocześniejszych usług.