Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niezawodny model płata powięziowo-skórnego świni do badań bioinżynieryjnych unaczynionych kompozytowych przeszczepów allogenicznych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63557

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Center for Transplantation Sciences, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 3Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children, 5Department of Biomedical Engineering, Widener University, 6Service de Chirurgie Plastique, Hôpital Européen Georges Pompidou, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (APHP), Université Paris Descartes

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje model płata powięziowo-skórnego świń i jego potencjalne zastosowanie w badaniach nad unaczynionymi tkankami kompozytowymi.

Streszczenie

Unaczynione alloprzeszczepy kompozytowe (VCA), takie jak przeszczep dłoni, twarzy lub prącia, reprezentują najnowocześniejsze metody leczenia wyniszczających wad skóry, które nie przeszły przez pierwsze etapy drabiny rekonstrukcyjnej. Pomimo obiecujących wyników estetycznych i funkcjonalnych, głównym czynnikiem ograniczającym pozostaje potrzeba drastycznego stosowania immunosupresji przez całe życie i jej dobrze znane zagrożenia medyczne, zapobiegające szerszym wskazaniom. Dlatego zniesienie bariery immunologicznej w VCA jest niezbędne, aby przechylić szalę etyczną i poprawić jakość życia pacjentów przy użyciu najbardziej zaawansowanych technik chirurgicznych. Stworzenie de novo przeszczepu dostosowanego do potrzeb pacjenta jest nadchodzącym przełomem w transplantacji rekonstrukcyjnej. Korzystając z technik inżynierii tkankowej, VCA mogą zostać uwolnione od komórek dawcy i dostosowane do biorcy poprzez perfuzję-decelularyzację-recelularyzację. Aby opracować te nowe technologie, niezbędny jest wielkoskalowy zwierzęcy model VCA. Stąd płaty powięziowo-skórne świń, składające się ze skóry, tłuszczu, powięzi i naczyń, stanowią idealny model dla wstępnych badań VCA. Niemniej jednak większość modeli VCA opisanych w literaturze obejmuje mięśnie i kości. Praca ta przedstawia wiarygodną i powtarzalną technikę zbioru płatów powięziowo-skórnych odpiszczelowych u świń, które są praktycznym narzędziem dla różnych dziedzin badań, zwłaszcza unaczynionej inżynierii tkanek kompozytowych.

Wprowadzenie

Unaczynione kompozytowe alloprzeszczepy (VCA) zrewolucjonizowały leczenie trudnych do naprawienia ubytków części ciała, takich jak dłonie, twarz i penis1,2,3. Niestety, pierwsze długoterminowe wyniki 4 wykazały, że dożywotnie podawanie leków immunosupresyjnych w dużych dawkach może prowadzić do poważnych schorzeń ubocznych, w tym cukrzycy, infekcji, nowotworów i dysfunkcji naczyń krwionośnych5. Ostatnio zespoły ekspertów VCA musiały poradzić sobie z ryzykiem przewlekłego odrzucenia prowadzącego do utraty przeszczepu i przeprowadzić pierwsze przypadki retransplantacji twarzy6,7. Opisano różne strategie przezwyciężania ograniczeń immunosupresji w VCA. Pierwsza polega na ustaleniu długoterminowej tolerancji przeszczepu poprzez wywołanie immunologicznego stanu chimeryzmu mieszanego u biorcy przeszczepu allogenicznego8,9. Drugi polega na stworzeniu de novo przeszczepu specyficznego dla pacjenta za pomocą inżynierii tkankowej.

Ostatnio, decelularyzacja perfuzyjna tkanek biologicznych wygenerowała natywne rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co pozwala na zachowanie sieci naczyniowej i architektury tkankowej całych narządów10. W związku z tym recelularyzacja tych ECM z komórkami specyficznymi dla biorcy stworzyłaby spersonalizowany przeszczep wolny od ograniczeń immunologicznych. W badaniach nad bioinżynierią VCA wiele zespołów zdecellularyzowało i uzyskało taki ECM, zachowując całą architekturę11,12,13. Jednak proces recelularizacji pozostaje trudny i nie powiódł się w dużych modelach zwierzęcych14,15. Opracowanie tych przełomowych technologii stwarza zapotrzebowanie na wiarygodne i powtarzalne modele dużych kompozytowych tkanek zwierzęcych. Modele świń stanowią najwyższy wybór w procesie rozwoju bioinżynierii, ponieważ skóra świń ma najbliższe cechy anatomiczne i fizjologiczne ludzkiej skóry16. Zastosowanie płatów powięziowo-skórnych (FCF) jest idealne podczas pierwszych kroków w kierunku tworzenia "szytych na miarę" unaczynionych kompozytowych przeszczepów tkankowych. Rzeczywiście, FCF jest podstawowym modelem VCA zawierającym komórki skóry, tłuszczu, powięzi i śródbłonka. Opis płatów mięśniowo-skórnych świń17 i płatów kostno-skórnych18 można znaleźć w literaturze. Brakuje jednak skupienia się na technikach zbioru płatów powięziowo-skórnych.

Dlatego to badanie ma na celu dostarczenie badaczom szczegółowego opisu techniki pozyskiwania odpiszczeli od świń i przedstawienie wszystkich cech charakterystycznych klapy do jej zastosowania w wielu dziedzinach badawczych, zwłaszcza w inżynierii tkanek kompozytowych unaczynionych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta poddawano opiece zgodnie z wytycznymi National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Instytucjonalna Komisja ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt zatwierdziła protokół eksperymentalny (protokół IACUC nr 2020N000015). Do wszystkich eksperymentów wykorzystano siedem samic świń rasy Yorkshire (20-25 kg).

1. Opieka przedoperacyjna

  1. Pozbaw zwierzę pokarmu stałego na 12 h przed zabiegiem.
  2. Zastosuj sedację u zwierzęcia za pomocą 4,4 mg/kg Telazolu, 2,2 mg/kg ksylazyny oraz 0,04 mg/kg (IM) siarczanu atropiny (patrz Tabela materiałów).
  3. Wprowadź obwodowy cewnik dożylny 18 G do żyły usznej.
  4. Wykonaj intubację świni przy użyciu odpowiedniej rurki endotrachealnej (dla świń o masie 10-200 kg można zastosować rurki 6-15 mm) i podłącz rurkę do respiratora. Podaj przedoperacyjne leki przeciwbólowe w postaci buprenorfiny (0,05 mg/kg, IM) (patrz Tabela materiałów).

2. Monitorowanie śródoperacyjne

  1. Utrzymuj znieczulenie za pomocą mieszaniny inhalacyjnej 1,5%-3% izofluranu przy przepływie tlenu 1,5 L/min.
  2. Hryglowo monitoruj częstość akcji serca, pulsoksymetrię oraz końcowowe CO2. Co 5 min oceniaj ciśnienie tętnicze oraz temperaturę ciała.
    UWAGA: Docelowy zakres częstości akcji serca wynosi od 90 do 100 uderzeń/min, saturacja tlenem musi być wyższa niż 93%, a zakres końcowego CO2 wynosi od 5% do 6% CO2.
  3. W trakcie procedury podawaj 0,9% soli fizjologicznej w dawce 5-10 mL/kg na godzinę, aby utrzymać średnie ciśnienie tętnicze w przedziale od 60 mmHg do 90 mmHg.

3. Obustronny pobór FCF z żyły saphénous

  1. Umieść zwierzę w pozycji na plecach. Ogól i odkaź oba pachwiny oraz kończyny tylne, obejmując całe kończyny tylne polem operacyjnym, a następnie załóż sterylne obłożenie.
  2. Zbadaj palpacyjnie tętno tętnicy odłogowej, około 3 szerokości palców przyśrodkowo od rzepki, i oznacz to miejsce.
  3. Należy zidentyfikować i wyznaczyć granice płata.
    UWAGA: Górna granica to oś równoległa do fałdy pachwinowej, znajdująca się 3 cm poniżej niej. Granica boczna to oś biegnąca od przedniej górnej grzebieni kości biodrowej do przyśrodkowej części rzepki.
  4. Narysuj owalny płat o średnicy 10 cm, wyśrodkowany na szypule żyły odpiszczelnej i mieszczący się w granicach płata opisanych wcześniej (krok 3.3).
  5. Wykonaj nacięcie skóry o długości 1,5 cm w obrębie dystalnej części szypuły w miejscu wyznaczonego punktu orientacyjnego płata.
  6. Należy naciąć powięź i przeprowadzićtępne rozczłonkowanie w celu odsłonięcia tętnicy saphrenous oraz dwóch towarzyszących jej żył (venae comitantes). Następnie należy wykonać podwójne podwiązanie i oddzielić je w jednym pęczku.
  7. Naciąć pozostałą skórę płata za pomocą skalpela.
  8. Użyj kauteryzatora, aby rozciąć tkankę podskórną i otaczającą powięź. Przeprowadź dokładną hemostazę za pomocą kleszczyków bipolarnych (patrz Tabela materiałów).
  9. Przymocuj komponent skórny płata do leżącej poniżej powięzi za pomocą niewchłanialnych szwów 3-0, aby uniknąć przypadkowego pociągnięcia i przerwania naczyń perforujących.
  10. Uwolnij płat od mięśnia smukłego, odwarstwiając powięź od mięśnia.
    UWAGA: Dystalna część szypuły żyły saphynous biegnie w płaszczyźnie między mięśniem smukłym a powięzią. Odpowiednie napięcie oraz ostrożna bipolarna hemostaza gałęzi bocznych są kluczowymi elementami ułatwiającymi preparację szypuły.
  11. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości 12 cm w fałdzie pachwinowym. Wykonaj nacięcie prostopadłe, łącząc fałd pachwinowy z proksymalną częścią płata. Odwarstw skórę i otwórz warstwę podskórną przy użyciu kauteryzacji.
  12. Kontynuuj preparowanie szypuły, prowadząc naczynia odpiszczelowe w dół w kierunku naczyń udowych.
    UWAGA: Proksymalna część szypuły żyły odpiszczowej może przebiegać albo przez przegrodę międzymięśniową, albo zagłębiać się w mięsień smukły.
  13. Wypreparuj naczynia udowe i podwiąż je dystalnie względem odgałęzienia żyły odprzestronnej w dwóch oddzielnych wiązkach. Kontynuuj preparację naczyń udowych w kierunku proksymalnym, aż do poziomu więzadła pachwinowego. Użyj pęsety bipolarnej do koagulacji lub klipsów naczyniowych i nici jedwabnych 2-0 do podwiązania głębokich naczyń udowych, a następnie je przetnij.
    UWAGA: Przed przecięciem naczyń można również zastosować klipsy naczyniowe.
  14. Powtórz kroki 3.2–3.13 na przeciwstronnej kończynie tylnej, aby pobrać drugi płat żyły odpiszczowej.
  15. Podaj zwierzęciu heparynę w formie wstrzyknięcia dożylnego (IV) w dawce 100 IU/kg na 5 min przed krokiem 3.16.
  16. Podwiązać szypułkę udową (tętnicę i żyłę) tak proksymalnie w stosunku do więzadła pachwinowego, jak to możliwe, a następnie oddzielić płat od świni dawcy.
  17. Rozszerzyć końce naczyń udowych i wprowadzić kaniulę do angiokatetera 20 G zarówno do tętnicy, jak i żyły. Użyć jedwabnych nici 3-0 do przymocowania kaniul do naczyń.
  18. Powoli przemywaj tętnicę płata powięziowo-skórnego 10 ml soli fizjologicznej z heparyną (100 IU/ml), aż do momentu zaobserwowania przejrzystego odpływu żylnego (Rycina 1).

Porównanie tkanki przed i po decelularyzacją; obrazy histologiczne przy powiększeniu 50 μm, 25 μm.
Rycina 1: Natywny i decelularyzowany płat powięziowo-skórny żyły saphienous. (A) Izolowany płat skóry z wprowadzonym do tętnicy udowej kaniulą 20 G, umożliwiającą wypłukanie krwi z płata i przeprowadzenie różnych eksperymentów (angiografii, decelularyzacji perfuzyjnej). (B) Decelularyzowany płat skóry. Decelularyzacja perfuzyjna prowadząca do uzyskania białych, acelularnych rusztowań po 10 dniach perfuzji detergentem. Barwione H&E przekroje pełnej grubości (C) natywnego płata skóry i (D) decelularyzowanego płata skóry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Uśmierć zwierzę poprzez dożylny wtrysk fenobarbitalu sodu (100 mg/kg). Śmierć potwierdź brakiem akcji serca oraz ruchów oddechowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed rozpoczęciem prac na żywych zwierzętach określono położenie perforasomu żyły odłonowatej na trzech preparatach pośmiertnych (Rycina 2). Do tętnicy żyłowej wstrzyknięto kolorowy roztwór wypełniający, aby uwidocznić konkretną sieć naczyniową odchodzącą od tętnicy. Roztwór ten składa się z 10 ml niebieskiego środka glicerynowego zmieszanego z 10 ml środka rozcieńczającego (patrz Tabela materiałów). Pozwoliło to na wygenerowanie kolorowej mapy skóry unaczynionej przez tętn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano wiarygodny i powtarzalny płat powięziowo-skórny pobrany z tylnych kończyn świń. Postępowanie zgodnie z tym protokołem chirurgicznym krok po kroku pozwoli na pobranie dwóch płatów tylko na jednym zwierzęciu w czasie krótszym niż 2 godziny. Najbardziej krytycznym etapem operacji jest szkieletyzacja szypułki naczyniowej we włóknach mięśniowych gracilis, co wymaga dokładnego wypreparowania przez wykwalifikowanego chirurga. Mocowanie skóry do powięzi za pomocą szwów skórnych jest kluczową wskazówką, aby uni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez granty Shriners Hospitals for Children #85127 (BEU i CLC) oraz #84702 (AA). Autorzy pragną podziękować fundacji "Gueules Cassées" za wsparcie płacowe dla stypendystów zaangażowanych w ten projekt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 G angiocewnikBD Insyte Autoguard381409
20 G angiocewnikBD Insyte Autoguard381411
Kleszczyki do tkanek Adson, 11 cm, 1 x 2 zęby z platformą wiążącąASSIASSI.
Siarczan atropinyAdvaCare212-868
Sznury bipolarneASSI228000C
Buprenorfina HClPharmaceutical, Inc42023-179-01
Kleszcze rozszerzająceNarzędzia do nauki precyzyjnej (FST)18131-12
Rurka endotrachelowaJorgensen LabsJO615Xrozmiar od 6 do 15 mm w zależności od waga świni
Ethilon 3-0 16 mm 3/8EthiconMPVCP683H
EuthasolVirbac AH200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 jednostek/mlBD PosiFlush306424
IsofluranePatterson Veterinary14043-704-06
Jubilerzy Kleszcze bipolarne Non Stick 11 cm, końcówka spiczasta prosta, średnica końcówki 0,25 mmASSIASSI.
Nożyczki Metzenbaum 180 mmB BraunBC606R
Microfil niebieskiFlow techLMV-120
Rozcieńczanie mikrofiluFlow techLMV-112kolorowe rozwiązanie do segregatorów
Nóż monopolarnyASSI221230C
N° 15 ostrzy skalpelaSwann MortonNS11
OmnipaqueGeneral Electric4080358kontrastowy produkt
Perma-Hand Silk 3-0Nożyczki EthiconA184H
LigaclipEthiconMCM20
Stevens 115 mmB BraunBC008R
TelazolZoetis106-111
Ksylamed (ksylazyna)Bimeda200-529
ATK26426BPNS11223 Small

Bibliografia

  1. Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
  2. Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
  3. Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
  4. Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
  5. Derek, E., Dhanireddy, K. Immunosuppression. Current Opinion in Organ Transplantation. 17 (6), 616-618 (2012).
  6. Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
  7. Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
  8. Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
  9. Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
  10. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  11. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  12. Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
  13. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  14. Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
  15. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  16. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
  17. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  18. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475(2013).
  19. Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
  20. Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104(2018).
  21. Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
  22. Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
  23. Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
  24. Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Świński model płataunaczyniony przeszczep złożonyinżynieria tkankowapłat tętnicy odpiszczelowejunaczynienie płatadecelularyzacja perfuzyjnamodel dużego zwierzęciatechnika pobierania płatabioinżynieria złożonych tkanek
Niezawodny model płata powięziowo-skórnego świni do badań bioinżynieryjnych unaczynionych kompozytowych przeszczepów allogenicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.