Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Streszczenie

Mikroglej to wyspecjalizowana populacja komórek mózgu podobnych do makrofagów. Odgrywają istotną rolę zarówno w fizjologicznych, jak i patologicznych funkcjach mózgu. Większość naszej obecnej wiedzy na temat mikrogleju opiera się na eksperymentach przeprowadzonych na myszach. Mikroglej ludzki różni się od mikrogleju myszy, a zatem reakcja i charakterystyka mikrogleju myszy nie zawsze muszą być takie same jak mikrogleju ludzkiego. Ponadto, ze względu na trudności etyczne i techniczne, badania nad ludzkim mikroglejem są ograniczone do systemu hodowli in vitro, który nie kapituluje in vivo charakterystyki mikrogleju. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano uproszczoną metodę nieinwazyjnego przeszczepiania indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu immunokompetentnych myszy drogą przeznosową w połączeniu z farmakologicznym zubożeniem endogennego mikrogleju przy użyciu antagonisty receptora czynnika stymulującego tworzenie kolonii 1 (CSF1R). Protokół ten umożliwia nieinwazyjne przeszczepianie komórek do mózgu myszy i dlatego może być cenny dla oceny roli ludzkiego mikrogleju w fizjologicznych i patologicznych funkcjach mózgu in vivo.

Wprowadzenie

Mikroglej to wyspecjalizowana populacja komórek podobnych do makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają istotną rolę w kontrolowaniu różnych funkcji mózgu, takich jak rozwój obwodów nerwowych, modulowanie neurotransmisji i utrzymywanie homeostazy mózgu^1,2,3. Chociaż mysi mikroglej ma wiele funkcji wspólnych z ludzkimi, wykazują różnice specyficzne dla gatunku. W związku z tym reakcja mikrogleju myszy na różne bodźce nie zawsze musi reprezentować reakcję ludzkiego mikrogleju^4,5,6. Chociaż w wielu badaniach analizowano ludzki mikroglej, eksperymenty te ograniczają się do badań in vitro. Mikroglej ludzki hodowany in vitro wykazuje cechy morfologiczne i ekspresję genów, które znacznie różnią się od tych uprawianych in vivo. W związku z tym eksperymenty in vitro nie zawsze mogą podważyć cechy in vivo ludzkiego mikrogleju. Dlatego potrzebny jest eksperymentalny system do badania ludzkiego mikrogleju in vivo.

Ostatnio, w celu zbadania in vivo cech ludzkiego mikrogleju, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) - lub embrionalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkich komórek macierzystych są chirurgicznie przeszczepiane do mózgu myszy7^{,8,9,10,11,12,13,14}. Korzystając z tego podejścia, scharakteryzowano różne cechy ludzkiego mikrogleju in vivo. Jednak powszechne stosowanie tej metody jest ograniczone z dwóch powodów. Pierwszym z nich jest zapotrzebowanie na myszy z niedoborem odporności. Tak więc, aby zbadać rolę ludzkiego mikrogleju w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, myszy przenoszące mutacje choroby muszą zostać skrzyżowane z myszami z niedoborem odporności, co wymaga znacznego czasu i wysiłku. Ponadto w różnych zaburzeniach neurologicznych obwodowe komórki odpornościowe, takie jak limfocyty T, mogą modulować funkcje mikrogleju^15,16,17. W związku z tym eksperymenty przeprowadzone na myszach z niedoborem odporności mogą nie reprezentować prawdziwych cech ludzkiego mikrogleju in vivo. Po drugie, inwazyjne operacje przeszczepu mikrogleju wymagają dodatkowego sprzętu i szkolenia. Co więcej, uszkodzenie mózgu podczas inwazyjnego przeszczepu może zmienić fenotypy mikrogleju.

W tym protokole opisano nieinwazyjny przeznosowy przeszczep (Tsn) iPSMG immunokompetentnym myszom dzikiego typu¹⁸. Łącząc farmakologiczne włączanie/wyłączanie antagonisty CSF1R PLX5622 który zubaża endogenny mikroglej myszy ¹⁹ i Tsn, iPSMG można nieinwazyjnie przeszczepić do mózgu myszy. Ponadto, po zastosowaniu egzogennej ludzkiej cytokiny, przeszczepiony iPSMG pozostaje żywotny przez 60 dni w sposób specyficzny dla regionu bez żadnych leków immunosupresyjnych.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu zostały uzyskane, trzymane, opiekowane i używane zgodnie z "Zasadami przewodnimi w opiece i użytkowaniu zwierząt w dziedzinie nauk fizjologicznych" opublikowanym przez Japońskie Towarzystwo Fizjologiczne²⁰, oraz za uprzednią zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Yamanashi (Yamanashi, Japonia).

1. Przygotowanie pożywki komórkowej, pożywki transplantacyjnej i mieszaniny anestezjologicznej

1. Przygotuj pożywkę komórkową, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% penicyliny/streptomycyny do DMEM.
2. Przygotować pożywkę do przeszczepu, dodając hCSF1 (250 ng/ml) i hTGF-β1 (100 ng/ml) do pożywki komórkowej.
3. Przygotuj mieszaninę znieczulającą do wstrzyknięcia dootrzewnowego, mieszając 0,45 ml chlorowodorku medetomidyny, 1,2 ml midazolamu i 1,5 ml winianu butorfanolu w 11,8 ml zwykłej soli fizjologicznej.

2. Przygotowanie iPSMG

UWAGA: Zamrożone iPSMG (Tabela Materiałów) były przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

1. Zamrożone komórki szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszaj próbki, aż stopi się cały widoczny lód.
2. Dodać rozmrożony iPSMG do pożywki hodowlanej ogrzanej do 37 °C. Dodać 1 ml rozmrożonych komórek zawierających pożywkę (1 ×^{10 6} komórek) do 10 ml pożywki hodowlanej.
3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.
4. Po odwirowaniu usunąć cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Całkowite usunięcie supernatantu jest pożądane w celu zmniejszenia rozcieńczenia stężenia cytokin w pożywce transplantacyjnej.
5. Dodać pożywkę do przeszczepu, aby uzyskać stężenie komórek 1 x 10⁵ komórek/μl.
6. Umieść iPSMG na lodzie i natychmiast przystąp do przeszczepu.
   UWAGA: Przygotowanie iPSMG do przeszczepu odbywa się na czystej stole, aby uniknąć zanieczyszczenia.

3. Przygotowanie myszy do przeszczepu przeznosowego (Tsn)

1. Karmić samce myszy typu dzikiego (C57BL/6J, 8 tygodni) dietą zawierającą PLX5622 przez 7 dni.
2. Pod koniec 7 dnia należy przerwać dietę PLX i karmić myszy normalną dietą do końca badania.
   UWAGA: Dietę zawierającą PLX5622 przygotowuje się poprzez dodanie 1,2 g PLX5622 w 1 kg AIN-93G (Tabela Materiałów).

4. Przeznosowe przeszczepienie komórek

1. 24 godziny po zaprzestaniu karmienia PLX zważyć myszy i znieczulić je za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszanki znieczulającej (0,2 ml/20 g).
2. Po całkowitym znieczuleniu myszy ocenianym na podstawie braku reakcji na odruch wycofania pedału (mocne uszczypnięcie palca), należy podać 2,5 μl hialuronidazy w PBS (100 U/ml) na 1 godzinę przed Tsn iPSMG do każdego nozdrza dwa razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby zwiększyć przepuszczalność błony śluzowej nosa.
3. Po zastosowaniu hialuronidazy należy ułożyć myszy w pozycji leżącej.
4. Powtórz krok 4.2 10 minut przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG.
5. Nanieść 2,5 μl zawiesiny komórek do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
6. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem zawiesiny komórkowej do drugiego nozdrza.
7. Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 cztery razy, nakładając całkowitą objętość 20 μl na zwierzę.
8. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C do czasu wyleczenia ze znieczulenia.
9. Po 48 godzinach od zaprzestania karmienia PLX powtórz kroki 4.1-4.7 na tych samych myszach jeszcze raz.
   UWAGA: Należy zauważyć, że iPSMG umieszcza się na lodzie podczas przeszczepu.

5. Zastosowanie cytokin

1. Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny znieczulającej (0,2 ml/20 g).
2. Nanieść 2,5 μl pożywki transplantacyjnej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem pożywki do przeszczepu do drugiego nozdrza.
4. Powtórzyć kroki 5.2 i 5.3 cztery razy, nakładając całkowitą objętość 20 μl na zwierzę.
   UWAGA: Należy zauważyć, że donosowe podawanie pożywki transplantacyjnej (cytokin ludzkich) jest wymagane co 12 godzin dla żywotności przeszczepionego iPSMG do końca badania.

Wyniki

Technika ta pozwala badaczowi na nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do hipokampa i móżdżku, ale nie do kory mózgu myszy. Po zakończeniu badania znieczulone myszy poddano perfuzji transkardialnej lodowatym PBS(−), a następnie lodowatym 4% (w/v) paraformaldehydem w PBS. Mózgi wyizolowano, poddano postfixacji przez noc w 4% (w/v) paraformaldehydzie oraz krioprotekcji w PBS zawierającym 30% (w/v) sacharozy. Następnie mózgi zamrożono w związku do zatapiania i pocięto (przekroje czołowe o grubości 20 µm) na kriostacie. Przekroje przemyto trzykrotnie w PBS(−) (po 10 min każdy), a następnie poddano permeabilizacji i blokowaniu za pomocą 0,5% (v/v) Triton X-100 w 10% normalnym surowicy koziej przez 1 h. Następnie przekroje inkubowano przez 5 dni z markerem cytoplazmatycznym specyficznym dla ludzi, STEM121 (1:100), oraz przeciwciałem anty-Iba1 (1:1000). W dalszej kolejności przekroje przemyto trzy razy PBS(−) po 10 min każdy i inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałami wtórnymi: mysimi lub króliczymi IgG sprzężonymi z Alexa Fluor 488 lub 546 (1:1000). Po trzykrotnym przemyciu PBS(−), przekroje zamontowano na szkiełkach za pomocą medium montażowego przeciw wyblaknięciu. Do pozyskania obrazów fluorescencyjnych użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x. Żywotność iPSMG 2 miesiące po przeszczepieniu do hipokampa i kory przedstawiono na Rysunku 1. Liczbę przeszczepionych komórek można określić poprzez zliczenie komórek wykazujących pozytywny wynik zarówno dla przeciwciał specyficznych dla ludzi, jak i markerów pan-mikroglejowych/monocytarnych, podczas gdy endogenna mikroglej mysia jest pozytywna tylko dla markera pan-mikroglejowego/monocytarnego, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁸. Przeszczepione iPSMG zastępują mikroglej mysi, wykazują morfologię rozgałęzioną w hipokampie i nie są wykrywane w korze¹⁸.

Rycina 1: Żywotność iPSMG w korze i hipokampie 2 miesiące po Tsn. Panel lewy przedstawia immunobarwienie z użyciem pan-mikroglejowego/monocytowego markera Iba1 (zielony). Panel środkowy przedstawia immunobarwienie z użyciem specyficznego dla ludzi markera cytoplazmatycznego STEM121 (czerwony). Panel prawy przedstawia obraz złączony immunobarwień Iba1 i STEM121. (A) U myszy kontrolnych w korze i hipokampie wykryto wyłącznie mikroglej mysi (Iba1+/STEM121-). (B) U myszy z przeszczepionymi iPSMG w korze wykryto wyłącznie mikroglej mysi (Iba1⁺/STEM121^-), natomiast w hipokampie wykryto iPSMG (Iba1⁺/STEM121⁺). Strzałki na obrazie wskazują mikroglej mysi, natomiast groty strzałek wskazują iPSMG. Do akwizycji obrazów fluorescencyjnych użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x. Maksymalny rozmiar obrazu: 1024 x 1024 pikseli. Współczynnik powiększenia: 2. Paski skali = 50 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do mózgu myszy. Wyjątkowość obecnego protokołu polega na tym, że łącząc farmakologiczne metody PLX ON/OFF i przeszczep donosowy, iPSMG może być nieinwazyjnie przeszczepiony do immunokompetentnego mózgu myszy. Przeszczepiony iPSMG utworzył większość mikrogleju w hipokampie i móżdżku, zajmując wolną niszę przez okres do 60 dni, ale nie w korze.

Punktami krytycznymi dla skutecznego Tsn iPSMG są: (i) skuteczność zubożenia endogennego mikrogleju myszy, (ii) podawanie ludzkich cytokin co 12 godzin. Mikroglej utrzymuje swoje własne terytorium w mózgu. Skuteczne zubożenie mikrogleju myszy jest konieczne, aby zapewnić niszę do wszczepienia przeszczepionego iPSMG. Gdy zubożenie endogennego mikrogleju myszy jest niewystarczające, nie obserwuje się kolonizacji hipokampa i móżdżku myszy przez iPSMG. Żywotność mikrogleju zależy od sygnalizacji CSF1R i TGFBR 19,21,22^. Doniesiono, że hCSF1 selektywnie zwiększa żywotność ludzkiego mikrogleju, a hTGF-β1 jest wymagany do żywotności mikrogleju, a także tłumi stan zapalny, gdy jest podawany co 12 godzin 21,23,24. W przypadku braku egzogennych cytokin ludzkich, iPSMG nie są obserwowane w mózgu myszy. Ponadto należy zachować ostrożność, aby nie aktywować mechanicznie iPSMG poprzez nadmierne pipetowanie lub w jakikolwiek inny sposób przed zastosowaniem Tsn, ponieważ nieodwracalnie zmienia to charakterystykę iPSMG, jak również skuteczność przeszczepu. Jeżeli nie zaobserwuje się zadowalającego Tsn iPSMG, należy określić żywotność iPSMG przed przeszczepieniem, jak również zmniejszenie endogennego mikrogleju. Jeśli zubożenie endogennego mikrogleju myszy nie przekracza 90%, PLX5622 czas karmienia można zmodyfikować w celu zwiększenia zubożenia.

W porównaniu z konwencjonalną metodą przeszczepu chirurgicznego, która jest inwazyjna i wymaga dodatkowego sprzętu i szkolenia, Tsn umożliwia przeszczep w nieinwazyjny, prosty, stabilny i łatwy sposób. Ponadto metoda ta umożliwia przeszczepienie iPSMG do immunokompetentnych mózgów myszy; w ten sposób immunokompetentne myszy modelowe choroby można wykorzystać do badania odpowiedzi na iPSMG.

Największą wadą obecnej metody jest regionalna niejednorodność w ingrafpcji iPSMG. Jeśli wymagany jest przeszczep iPSMG specyficzny dla regionu mózgu, obecny protokół nie jest odpowiedni, ponieważ przeszczepiony iPSMG pozostaje wszczepiony przez 60 dni tylko w hipokampie i móżdżku, ale nie w korze. Co więcej, konieczność podawania egzogennych cytokin ludzkich donosowo co 12 godzin jest również ograniczeniem obecnego protokołu, ponieważ wymaga dużego nakładu pracy i jest kosztowna.

Podsumowując, przedstawiono szczegółowy protokół Tsn iPSMG do mózgów myszy immunokompetentnych. W połączeniu z farmakologicznym włączaniem/wyłączaniem mysiego mikrogleju przez PLX5622, protokół ten umożliwia pomyślne wszczepienie iPSMG. Ponieważ przeszczepione komórki można obserwować w hipokampie i móżdżku przez dłuższy czas, gdy stosowane są cytokiny egzogenne, obecna metoda może być cenna dla oceny roli ludzkiego mikrogleju zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych w tych regionach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy	DulbeccoThermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Drożdże orientalne Co
Przeciwciało anty-Iba1	FUJIFILM	019– 19741
Przeciwciało anty-STEM121	Takara Bioscience	Y40410
Winian butorfanolu	Kyoritsu Seiyaku	8019
Mikroskop konfokalny	Olympus	FV1200
Surowica bydlęca	płodu GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Mrożone iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratorium dla Odkrywanie leków i badania nad chorobami
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H-3506
Chlorowodorek medetomidyny	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyd	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicylina/streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipeta	Eppendorf	3120000011
Końcówka do pipety	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transformujący czynnik wzrostu-β 1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD Hard Set Medium montażowe	Vector Laboratories	H-1400-10	antifade