Ten protokół opisuje analizę morfologii organoidów odbytniczych (ROMA), nowatorski test diagnostyczny mukowiscydozy (CF). Cechy morfologiczne, a mianowicie okrągłość (wskaźnik kolistości, CI) i obecność światła (współczynnik natężenia, IR), są miarą funkcji CFTR. Analiza 189 osób wykazała doskonałe rozróżnienie między mukowiscydozą a bez mukowiscydozy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA): test diagnostyczny w mukowiscydozie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Diagnoza mukowiscydozy (CF) nie zawsze jest prosta, zwłaszcza gdy stężenie chlorku potu jest pośrednie i/lub można zidentyfikować mniej niż dwie chorobowe mutacje CFTR. Fizjologiczne testy CFTR (różnica potencjału nosowego, pomiar prądu jelitowego) zostały włączone do algorytmu diagnostycznego, ale nie zawsze są łatwo dostępne lub wykonalne (np. u niemowląt). Organoidy odbytnicze to struktury 3D, które wyrastają z komórek macierzystych wyizolowanych z krypt biopsji odbytnicy podczas hodowli w określonych warunkach. Organoidy od osób bez mukowiscydozy mają okrągły kształt i światło wypełnione płynem, ponieważ transport chlorków za pośrednictwem CFTR kieruje wodę do światła. Organoidy z upośledzoną funkcją CFTR nie pęcznieją, zachowują nieregularny kształt i nie mają widocznego światła. Różnice w morfologii między organoidami z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy określono ilościowo w analizie morfologii organoidów doodbytniczych (ROMA) jako nowy test fizjologiczny CFTR. W teście ROMA organoidy są siane na 96-dołkowych płytkach, barwione kalceiną i obrazowane w mikroskopie konfokalnym. Różnice morfologiczne określa się ilościowo za pomocą dwóch wskaźników: wskaźnik kołowości (CI) określa ilościowo okrągłość organoidów, a współczynnik intensywności (IR) jest miarą obecności centralnego światła. Organoidy inne niż CF mają wysoki CI i niski IR w porównaniu z organoidami CF. Indeksy ROMA doskonale rozróżniły 167 osób z mukowiscydozą od 22 osób bez mukowiscydozy, co czyni ROMA atrakcyjnym fizjologicznym testem CFTR pomagającym w diagnozowaniu mukowiscydozy. Biopsje odbytnicy mogą być rutynowo wykonywane w każdym wieku w większości szpitali, a tkanki mogą być wysyłane do centralnego laboratorium w celu hodowli organoidów i ROMA. W przyszłości ROMA może być również stosowana do testowania skuteczności modulatorów CFTR in vitro. Celem niniejszego raportu jest pełne wyjaśnienie metod zastosowanych w ROMA, aby umożliwić replikację w innych laboratoriach.
Wprowadzenie
Mukowiscydoza (CF) jest chorobą autosomalną recesywną spowodowaną mutacjami w genie CFTR (transbłonowego regulatora przewodnictwa CFTR). Białko CFTR jest kanałem chlorkowym i wodorowęglanowym, zapewniającym nawodnienie kilku nabłonków1. Mukowiscydoza jest chorobą wieloukładową o dużym obciążeniu, skracającą życie, objawiającą się przede wszystkim jako choroba układu oddechowego, ale także wpływająca na przewód pokarmowy, trzustkę, wątrobę i drogi rodne2.
Chorobowe mutacje CFTR prowadzą do zmniejszenia ilości lub funkcji CFTR, co z kolei powoduje odwodnienie śluzu. Opisano pon....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
W przypadku wszystkich procedur obejmujących tkankę ludzką uzyskano zgodę Komisji Etycznej ds. Badań UZ/KU Leuven (EC research). Wszystkie badania przeprowadzono za świadomą zgodą i/lub po uzyskaniu zgody od rodziców, opiekunów prawnych i/lub pacjentów.
UWAGA: Wszystkie procedury obejmujące biopsje odbytnicy i organoidy powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby chronić badacza przed zagrożeniami biologicznymi i zminimalizować ryzyko kontaminacji kultur. Podobnie jak w przypadku każdej procedury laboratoryjnej, badacze powinni przez cały czas nosić fartuchy laboratoryjne, rękawiczki i okulary ochronne podczas ma....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Organoidy od 212 badanych zebrano podczas rutynowych wizyt klinicznych. Podczas lub po procedurze biopsji odbytnicy nie wystąpiły żadne niepożądane zdarzenia. Obrazowanie organoidów przeprowadził jeden badacz, który nie znał charakterystyki pacjentów, takiej jak genotyp i informacje kliniczne. Ze względu na niską jakość obrazów wykluczono 23 badanych. Przykłady udanych i nieudanych hodowli organoidów oraz akwizycji obrazu przedstawiono na Rysunku 2.
Przeanalizowan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Udostępniamy szczegółowy protokół analizy morfologii organoidów odbytniczych (ROMA). Dwa indeksy obliczone za pomocą ROMA, IR i CI z doskonałą dokładnością odróżniały organoidy od osób bez mukowiscydozy. ROMA może zatem funkcjonować jako nowatorski fizjologiczny test CFTR uzupełniający SCC i inne obecnie dostępne testy 13,14,15.
Protokół jest zależny od użycia organoidów jelitowych, które mają okrągły.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Badanie to zostało sfinansowane przez belgijskie stowarzyszenie pacjentów z mukowiscydozą "Mucovereniging/Association Muco", grant badawczy Belgijskiego Towarzystwa Pediatrycznego BVK-SBP 2019 oraz grant z UZ Leuven Fund for Translational Biomedical Research. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy pacjentom i rodzicom, którzy wzięli udział w tym badaniu. Dziękujemy firmie Abida Bibi za wszystkie prace związane z hodowlą organoidów. Dziękujemy Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anji Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pimowi Sansenowi, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monice Waskiewicz i Bernardowi Wenderickxowi za wsparcie logistyczne. Dziękujemy również Stowarzyszeniu Mucovereniging/Association Muco, a w szczególności Stefanowi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml | Sorenson | 17040 | |
| Probówki stożkowe 15 ml | VWR | 525-0605 | |
| Płytki 24-dołkowe | Corning | 3526 | |
| 96-dołkowe Mikroskop | Greiner | 655101 | |
| Brightfield Wirówka | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Eppendorf | 5702 | ||
| Inkubator CO2 | Binder | CB160 | |
| Komputerowy | Hewlett-Packard | Z240 | |
| laminarnym Zeiss | LSM 800 | ||
| Thermo Fisher | 51025413 | ||
| Materiał do hodowli organoidów zgodnie z opisem w poprzednim protokole10 | |||
| Mikropipety (20, 200 i 1000 &mikro; L) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bitowe | oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych |
| NIS-Elements Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania analizy badawczej | Nikon | v.5.02.00 | Oprogramowanie do obrazowania |
| Końcówki do pipet (20, 200 i 1000 &mikro; L) | Oprogramowanie Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue | Oprogramowanie do obrazowania | Zeiss | v2.6 |
Bibliografia
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
