Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA): test diagnostyczny w mukowiscydozie

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63818

⸱

10 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Development and Regeneration, Woman and Child Unit, CF research lab, KU Leuven, 2Department of Pediatrics, Pediatric Pulmonology, University Hospitals Leuven, 3VIB Bio Imaging Core, VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, 4Department for Neuroscience, KU Leuven, 5Interuniversity Center for Biostatistics and Statistical Bioinformatics, University of Leuven and University of Hasselt, 6Department of Pediatrics, 2<sup>nd</sup> Faculty of Medicine, Charles University and Motol University Hospital, 7Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), Translational Research Center for Gastrointestinal Disorders (TARGID), KU Leuven, 8Department of Development and Regeneration, Stem Cell Institute Leuven (SCIL), KU Leuven, 9Department of Gastroenterology and Hepatology, University Hospitals Leuven, KU Leuven, 10Department of Chronic Diseases, Metabolism and Ageing; Pneumology, KU Leuven, 11Department of Respiratory Diseases, University Hospitals Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje analizę morfologii organoidów odbytniczych (ROMA), nowatorski test diagnostyczny mukowiscydozy (CF). Cechy morfologiczne, a mianowicie okrągłość (wskaźnik kolistości, CI) i obecność światła (współczynnik natężenia, IR), są miarą funkcji CFTR. Analiza 189 osób wykazała doskonałe rozróżnienie między mukowiscydozą a bez mukowiscydozy.

Streszczenie

Diagnoza mukowiscydozy (CF) nie zawsze jest prosta, zwłaszcza gdy stężenie chlorku potu jest pośrednie i/lub można zidentyfikować mniej niż dwie chorobowe mutacje CFTR. Fizjologiczne testy CFTR (różnica potencjału nosowego, pomiar prądu jelitowego) zostały włączone do algorytmu diagnostycznego, ale nie zawsze są łatwo dostępne lub wykonalne (np. u niemowląt). Organoidy odbytnicze to struktury 3D, które wyrastają z komórek macierzystych wyizolowanych z krypt biopsji odbytnicy podczas hodowli w określonych warunkach. Organoidy od osób bez mukowiscydozy mają okrągły kształt i światło wypełnione płynem, ponieważ transport chlorków za pośrednictwem CFTR kieruje wodę do światła. Organoidy z upośledzoną funkcją CFTR nie pęcznieją, zachowują nieregularny kształt i nie mają widocznego światła. Różnice w morfologii między organoidami z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy określono ilościowo w analizie morfologii organoidów doodbytniczych (ROMA) jako nowy test fizjologiczny CFTR. W teście ROMA organoidy są siane na 96-dołkowych płytkach, barwione kalceiną i obrazowane w mikroskopie konfokalnym. Różnice morfologiczne określa się ilościowo za pomocą dwóch wskaźników: wskaźnik kołowości (CI) określa ilościowo okrągłość organoidów, a współczynnik intensywności (IR) jest miarą obecności centralnego światła. Organoidy inne niż CF mają wysoki CI i niski IR w porównaniu z organoidami CF. Indeksy ROMA doskonale rozróżniły 167 osób z mukowiscydozą od 22 osób bez mukowiscydozy, co czyni ROMA atrakcyjnym fizjologicznym testem CFTR pomagającym w diagnozowaniu mukowiscydozy. Biopsje odbytnicy mogą być rutynowo wykonywane w każdym wieku w większości szpitali, a tkanki mogą być wysyłane do centralnego laboratorium w celu hodowli organoidów i ROMA. W przyszłości ROMA może być również stosowana do testowania skuteczności modulatorów CFTR in vitro. Celem niniejszego raportu jest pełne wyjaśnienie metod zastosowanych w ROMA, aby umożliwić replikację w innych laboratoriach.

Wprowadzenie

Mukowiscydoza (CF) jest chorobą autosomalną recesywną spowodowaną mutacjami w genie CFTR (transbłonowego regulatora przewodnictwa CFTR). Białko CFTR jest kanałem chlorkowym i wodorowęglanowym, zapewniającym nawodnienie kilku nabłonków1. Mukowiscydoza jest chorobą wieloukładową o dużym obciążeniu, skracającą życie, objawiającą się przede wszystkim jako choroba układu oddechowego, ale także wpływająca na przewód pokarmowy, trzustkę, wątrobę i drogi rodne2.

Chorobowe mutacje CFTR prowadzą do zmniejszenia ilości lub funkcji CFTR, co z kolei powoduje odwodnienie śluzu. Opisano ponad 2000 wariantów genu CFTR 3, z czego tylko 466 zostało dokładnie scharakteryzowanych4.

Diagnoza mukowiscydozy może być postawiona, gdy stężenie chlorku potu (SCC) przekracza próg 60 mmol/L lub gdy zidentyfikowane zostaną dwie chorobowe mutacje CFTR (zgodnie z bazą danych CFTR2)4,5. U osób z tylko pośrednio podwyższonym (30-60 mmol/l) SCC, który występuje w około 4%-5% testów potu6, oraz mutacjami CFTR o różnych lub nieznanych konsekwencjach klinicznych, diagnozy nie można potwierdzić ani wykluczyć, nawet jeśli mają objawy zgodne z mukowiscydozą lub pozytywny wynik testu przesiewowego noworodka. W tych przypadkach do algorytmu diagnostycznego włączono fizjologiczne testy CFTR drugiej linii (NPD) i pomiary prądu jelitowego (ICM)). Testy te nie są łatwo dostępne w większości ośrodków ani możliwe do wykonania we wszystkich grupach wiekowych, zwłaszcza u niemowląt5.

Organoidy odbytnicze to struktury 3D wyhodowane z dorosłych komórek macierzystych Lgr5(+) z krypt jelitowych uzyskanych za pomocą biopsji odbytnicy7. Organoidy są coraz częściej wykorzystywane w badaniach biomedycznych, takich jak testowanie leczenia modulatorami w CF8. Wykonalną biopsję można uzyskać za pomocą biopsji ssącej lub kleszczowej, procedury, która powoduje tylko minimalny dyskomfort i jest bezpieczna nawet u niemowląt, z niskimi wskaźnikami powikłań9. Krypty wyizolowane z biopsji odbytnicy są wzbogacone w komórki macierzyste, które w określonych warunkach hodowli samoorganizują się w organoidy doodbytnicze. Morfologia tych organoidów zależy od ekspresji i funkcji CFTR, zlokalizowanego na błonie wierzchołkowej komórek nabłonkowych. Funkcjonalny CFTR umożliwia chlorkowi i wodzie przedostanie się do światła organoidu, wywołując w ten sposób pęcznienie organoidów innych niż CF. Organoidy CF nie pęcznieją i nie mają widocznego lumenu10,11.

Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA) pozwala na rozróżnienie między organoidami z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy na podstawie tych różnic w morfologii organoidów. Organoidy inne niż mukowiscydoza są bardziej okrągłe i mają widoczne światło, podczas gdy w przypadku organoidów z mukowiscydozą jest odwrotnie. W tym teście organoidy specyficzne dla pacjenta są siane w 32 dołkach na 96-dołkowej płytce. Po 1 dniu wzrostu organoidy są barwione zielenią kalceinową i obrazowane w mikroskopie konfokalnym. Organoidy bez mukowiscydozy mają bardziej okrągły kształt i mniej fluorescencyjną część środkową, ponieważ światło zawiera płyn, a kalceina barwi tylko komórki. Te różnice w morfologii określa się ilościowo za pomocą dwóch indeksów ROMA: wskaźnik kolistości (CI) określa ilościowo okrągłość organoidów, podczas gdy współczynnik intensywności (IR) jest miarą obecności lub braku światła centralnego. W tym raporcie szczegółowo opisujemy protokół uzyskiwania tych wskaźników dyskryminacyjnych, aby umożliwić replikację techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W przypadku wszystkich procedur obejmujących tkankę ludzką uzyskano zgodę Komisji Etycznej ds. Badań UZ/KU Leuven (EC research). Wszystkie badania przeprowadzono za świadomą zgodą i/lub po uzyskaniu zgody od rodziców, opiekunów prawnych i/lub pacjentów.

UWAGA: Wszystkie procedury obejmujące biopsje odbytnicy i organoidy powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby chronić badacza przed zagrożeniami biologicznymi i zminimalizować ryzyko kontaminacji kultur. Podobnie jak w przypadku każdej procedury laboratoryjnej, badacze powinni przez cały czas nosić fartuchy laboratoryjne, rękawiczki i okulary ochronne podczas manipulacji próbkami.

1. Biopsja odbytnicy, izolacja dorosłych komórek macierzystych z krypt oraz hodowla organoidów

  1. W tej początkowej części protokołu, obejmującej przygotowanie i zastosowanie pożywek, hodowlę organoidów, pasażowanie, ekspansję oraz zamrażanie do biobankowania, należy postępować zgodnie z dwoma wcześniej opublikowanymi protokołami8,12.
  2. W skrócie należy wykonać następujące kroki:
    1. Pobrać od trzech do czterech biopsji odbytnicy za pomocą kleszczyków lub urządzenia ssącego i umieścić je w sterylnym pojemniku (np. probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL) z pożywką Ad-DF+++, zgodnie z opisem w wyżej wspomnianym protokole.
    2. Transportować biopsje do laboratorium centralnego w lodzie lub w temperaturze 4 °C. Możliwy jest transport do innych ośrodków; jakość nie ulega znacznemu pogorszeniu nawet wtedy, gdy transport trwa do 48 h. Jeśli przewidywany czas transportu przekracza 6 h, należy użyć stożkowej probówki 15 mL z 6 mL pożywki Ad-DF+++ zamiast probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL.
    3. Przemyć biopsje w zimnym PBS, aż supernatant stanie się przejrzysty, aby usunąć zanieczyszczenia i tkanki nienabłonkowe, takie jak tkanka tłuszczowa.
    4. Inkubować biopsje z EDTA (stężenie końcowe 10 mM), aby oddzielić krypty. Wysiać krypty w matrycy błony podstawnej. W pierwszym tygodniu hodowli do pożywki dodać antybiotyki o szerokim spektrum działania (gentamycynę 50 µg/mL i wankomycynę 50 µg/mL), aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej.
    5. Gdy krypty wypączkują, zamkną się i rozrosną, przeprowadzić mechaniczne pasażowanie, zazwyczaj po 7 dniach.
    6. Pasażować powstałe organoidy mniej więcej co 7 dni. W ten sposób można prowadzić ekspansję hodowli, zamrażać próbki zapasowe w biobanku lub wykorzystywać organoidy do analiz.

2. Wysiewanie organoidów dla ROMA (dzień 1)

  1. Mechaniczne rozdzielenie organoidów przed wysiewaniem
    1. Zebrać organoidy z trzech dobrze wyhodowanych studni płytki 24-dołkowej, przemywając je dwukrotnie zimną pożywką Ad-DF+++, przenieść je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i ocenić pod mikroskopem12.
    2. Upewnić się, że organoidy są żywotne i wysokiej jakości, co zazwyczaj udaje się osiągnąć po 5-7 dniach wzrostu od poprzedniego rozdzielenia (Rysunek 1).
    3. Mechanicznie rozdzielić organoidy zgodnie z wyżej wspomnianym protokołem8,12. Powtarzać czynność aż większość organoidów, oceniana pod mikroskopem w świetle przechodzącym, będzie wystarczająco mała w porównaniu z obserwacją początkową.
    4. Zebrać mniejsze organoidy, co zazwyczaj odpowiada pobraniu górnych 4/5 zawiesiny organoidów w pożywce do nowej probówki do mikrowirówki, ponieważ duże organoidy opadają na dno probówki pod wpływem grawitacji, a małe pozostają w zawiesinie w górnej części słupa pożywki.
    5. Odwirować próbkę mniejszych organoidów przy 0,3 x 1000 g przez 2 min i usunąć pożywkę.
    6. Rozcieńczyć osad z mniejszych organoidów w 130 µL 40%-50% macierzy błony podstawnej (rozcieńczonej pożywką Ad-DF+++12).
    7. Dokładnie resuspender za pomocą mikropipety 200 µL.
  2. Wysiewanie organoidów na płytkę 96-dołkową
    1. Za pomocą pipety 20 µL wysiać organoidy do 32 studni uprzednio ogrzanej płytki 96-dołkowej. Upewnić się, że każda studnia zawiera jedną 4 µL kroplę roztworu organoidów w macierzy przygotowanego w poprzednim kroku.
    2. Organoidy w roztworze mają tendencję do tworzenia osadu na dnie probówki z powodu grawitacyjnego przemieszczania się w dół. Aby temu zapobiec i zapewnić jednorodne wysiewanie, należy regularnie resuspender roztwór organoidów w macierzy za pomocą mikropipety 200 µL (np. po każdym wysianiu od czterech do ośmiu studni).
    3. Każdą kroplę nanosić w centrum studni, aby zapobiec spływaniu kropli w stronę krawędzi studni, co obniżyłoby późniejszą jakość obrazu.
    4. Dążyć do uzyskania około 30 organoidów na studnię (minimum 15, maksimum 90) bez nakładania się organoidów.
    5. Pamiętać, że organoidy te będą inkubowane przez noc i w tym czasie nieco urosną, co przy zbyt wysokiej gęstości wysiewu może doprowadzić do ich nakładania się.
    6. Sprawdzić gęstość wysiewu pod mikroskopem w świetle przechodzącym z obiektywem 5x po wysianiu pierwszej lub drugiej studni.
    7. Jeśli gęstość wysiewu jest zbyt wysoka, stopniowo rozcieńczać roztwór organoidów w macierzy poprzez dodawanie macierzy błony podstawnej, aż do uzyskania pożądanej gęstości wysiewu (Rysunek 2).
    8. Po wysianiu delikatnie stuknąć płytką o płaską powierzchnię, aby upewnić się, że większość organoidów znajduje się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
  3. Inkubacja płytki
    1. Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 8-10 min, aby umożliwić żelowanie macierzy błony podstawnej.
    2. Do każdej studni dodać 50 µL pożywki dla ludzkich organoidów okrężnicy +/+12 i inkubować przez noc przez 16-24 h.
    3. Nie dodawać forskoliny ani modulatorów CFTR, aby organoidy mogły rosnąć w warunkach bazalnych.

3. Obrazowanie organoidów przy użyciu mikroskopii konfokalnej (dzień 2)

  1. Barwienie organoidów kalceiną zieloną
    1. Przygotować roztwór zapasowy kalceiny zielonej o stężeniu 1 mM, dodając 50 µL dimetylosulfotlenku (DMSO) do jednej fiolki zawierającej 50 µg kalceiny zielonej.
    2. Przygotować roztwór roboczy kalceiny zielonej, dodając 1,2 µL roztworu zapasowego do 200 µL Ad-DF+++ (stężenie 6 µM).
    3. Dodać 5 µL tej mieszaniny kalceiny do każdej studni płytki 96-dołkowej, w której osadzono organoidy (końcowe stężenie kalceiny 0,6 µM). Podczas wykonywania tego kroku nie wolno dotykać ani przesuwać kropli macierzy wewnątrz studni.
    4. Kilka razy obrócić i lekko przechylić płytkę z zamkniętą pokrywą, aby zapewnić jednorodny rozkład kalceiny zielonej w całej studni.
    5. Ponownie inkubować płytkę przez 15-30 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby zapewnić zabarwienie wszystkich organoidów w studniach.
  2. Przeniesienie płytki do mikroskopu konfokalnego
    1. Przenieść płytkę do mikroskopu konfokalnego z automatycznym stolikiem i zintegrowanym inkubatorem. Upewnić się, że płytka jest dobrze zamocowana w uchwycie.
    2. Inkubacja w 37 °C i 5% CO2 jest opcjonalna, ale niekonieczna, biorąc pod uwagę krótki czas (około 10 min) procesu obrazowania.
  3. Ustawienie ostrości na organoidach (Rysunek 3)
    1. Za pomocą mikroskopu konfokalnego ręcznie określić optymalną pozycję x/y oraz ostrość (pozycja z) organoidów w każdej studni, a następnie zapisać te pozycje w oprogramowaniu do obrazowania.
    2. Optymalna ostrość oznacza jak najwyraźniejsze odrysowanie organoidów i wizualizację jak największej części kropli z organoidami. Jeśli rozkład barwnika jest niewłaściwy, powtórzyć kroki 3.1.4 i 3.1.5 (inkubować np. przez dodatkowe 5-10 min).
    3. Użyć ustawień obrazowania żywych komórek z emisją przy 488 nm i wzbudzeniem przy 515 nm (specyficznych dla wizualizacji fluorescencji kalceiny) oraz obiektywu o powiększeniu 5x LD.
  4. Pozyskanie zdjęć organoidów z 32 studni za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 3 oraz Rysunek 4).
    1. Wykonać obrazy w sposób jednokierunkowy z rozdzielczością 1024 pikseli x 1024 pikseli (rozmiar piksela 2,5 µm x 2,5 µm) i głębią 16 bitów.
    2. dobrać intensywność lasera oraz wzmocnienie główne (master gain) dla optymalnej wizualizacji różnic morfologicznych między organoidami CF a non-CF (np. rozróżnienie między niezabarwionym, wypełnionym wodą światłem centralnym (jeśli występuje) a zabarwioną granicą komórkową).
      UWAGA: Organoidy nie zostaną poprawnie odrysowane, gdy wzmocnienie główne, a tym samym sygnał fluorescencji, będzie zbyt niskie; ustawienie zbyt wysokiego wzmocnienia głównego spowoduje uzyskanie obrazów z organoidami o jednorodnej, bardzo wysokiej intensywności sygnału, co uniemożliwi obrazowanie subtelniejszych różnic morfologicznych (Rysunek 2).
    3. Zapisać jedno zdjęcie na studnię dla wszystkich 32 studni w formacie mikroskopowym i wyeksportować je do plików TIFF.

4. Analiza obrazu (Rycina 5)

  1. Wczytaj pliki TIFF w oprogramowaniu do analizy obrazu.
  2. Wykonaj pierwszą kontrolę jakości na podstawie kryteriów wykluczenia określonych przez operatora (Rysunek 2): obecność wielu struktur zróżnicowanych lub martwych bądź debris, niewłaściwa gęstość wysiewu, zbyt duża liczba (np. nakładające się) lub zbyt mała liczba organoidów oraz niewłaściwy rozkład fluorescencji (organoidy niewyraźnie odrysowane, zbyt wysoki sygnał tła).
    UWAGA: Ten krok można również wykonać przed eksportem obrazów do plików TIFF w kroku 3.4.
  3. Przygotuj obrazy do analizy
    1. Rekalibruj obrazy tak, aby 1 piksel odpowiadał 2.5 µm x 2.5 µm.
    2. Utwórz i otwórz jeden plik danych sieciowych (.ND) zawierający wszystkie 32 zdjęcia dla każdej hodowli organoidów, co umożliwi jednoczesną analizę wszystkich 32 zdjęć na jeden obiekt.
  4. Wyznacz obrysy organoidów
    1. Wyznacz obrysy struktur, stosując dolny próg intensywności 4 500 i górny próg 65 535 (funkcje Smooth i Clean wyłączone; funkcja Fill Holes włączona; funkcja Separate ustawiona na x3).
      UWAGA: Pozwala to na wyznaczenie struktur fluorescencyjnych, przy czym funkcja Fill Holes obejmuje światło wewnątrz wyznaczonej struktury, jeśli ono występuje.
  5. Policz organoidy
    1. Wybierz wszystkie struktury ≥40 µm.
    2. Kliknij przycisk Update ND Measurement (za każdym razem, gdy wymagany jest pomiar); policzone organoidy zostaną ponumerowane.
      UWAGA: Odpowiada to całkowitej liczbie organoidów w 32 dołkach, podczas gdy małe debris, takie jak martwe komórki, zostają wykluczone.
  6. Zmierz intensywność i kolistość w celu obliczenia indeksów
    1. Wybierz wszystkie struktury ≥60 µm i policz je.
      UWAGA: Pozwala to na policzenie organoidów wystarczająco dużych, aby wykazywały morfologię typową dla CF lub non-CF. Organoidy >40 µm i <60 µm są małe i gęste, zarówno w przypadku non-CF, jak i CF.
    2. Usuń wszystkie struktury dotykające krawędzi zdjęcia. Należy to zrobić, aby usunąć organoidy, które nie są w pełni widoczne, ponieważ ich morfologii nie można dokładnie ilościowo określić.
    3. Wykonaj erozję o 1 piksel (= 2.5 µm) od brzegu każdej struktury ≥60 µm. Usuwa to otoczkę rozproszonej fluorescencji kalceiny otaczającej organoidy.
    4. Zmierz średnią intensywność każdej struktury. W ten sposób mierzona jest średnia fluorescencja organoidów.
    5. Ponownie wybierz wszystkie struktury ≥60 µm i usuń wszystkie struktury dotykające krawędzi.
    6. Wykonaj erozję o 10 pikseli (= 25 µm) od brzegu każdej struktury ≥60 µm.
      UWAGA: W organoidach non-CF powoduje to usunięcie brzegu komórkowego i pozostawienie jedynie światła. W organoidach CF powoduje to usunięcie zewnętrznej części organoidu, która ma w przybliżeniu taką samą fluorescencję jak pozostała część wewnętrzna.
    7. Zmierz średnią intensywność każdej poddanej erozji struktury. W ten sposób mierzona jest średnia fluorescencja centralnej części organoidów.
    8. Zmierz kolistość każdej struktury. Odpowiada to średniej kolistości organoidów.
  7. Wykonaj drugą kontrolę jakości: kryteria wykluczenia określone przez oprogramowanie. Wyklucz zestaw zdjęć, jeśli mniej niż 50% organoidów (zdefiniowanych jako struktury ≥40 µm) ma rozmiar ≥60 µm, ponieważ wystarczająca liczba organoidów powinna być na tyle duża, aby wykazywać morfologię typową dla CF lub non-CF. Wyklucz również w przypadku, gdy w 32 dołkach znajduje się <500 lub >3 000 organoidów (zdefiniowanych jako struktury ≥40 µm).

5. Pomiar wskaźników w oprogramowaniu do analizy obrazu (Rysunek 6)

  1. Zmierz wskaźnik kolistości (CI).
    UWAGA: Odpowiada on średniej kolistości zmierzonej w kroku 4.6, która jest średnią kolistością wszystkich organoidów we wszystkich 32 studzienkach. CI określa stopień zaokrąglenia organoidów, definiowany jako Wzór na zwartość kształtu, równanie: 4π*pole/obwód dla analizy geometrycznej., który jest niższy w przypadku organoidów CF niż w organoidach non-CF
  2. Zmierz stosunek intensywności (IR)
    1. Oblicz IR, dzieląc średnią pomiaru intensywności po erozji 25 µm od krawędzi każdej struktury ≥60 µm przez średnią pomiaru intensywności po erozji 2,5 µm od krawędzi każdej struktury ≥60 µm.
      UWAGA: IR określa obecność lub brak centralnego światła. IR jest równy Wzór na stosunek: intensywność centralnej części organoidu/intensywność całego organoidu; metoda analizy danych. i jest wyższy w organoidach CF niż w organoidach non-CF.
  3. Uprość proces analizy
    1. Przygotuj standardowy arkusz za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby automatycznie obliczać te wskaźniki po skopiowaniu danych (Rycina 7).
    2. Aby obliczyć IR:
      1. Przyjmij pomiar intensywności po erozji 2,5 µm od krawędzi każdej struktury ≥60 µm. Użyj średniej do obliczeń (mianownik).
      2. Przyjmij pomiar intensywności po erozji 25 µm od krawędzi każdej struktury ≥60 µm. Użyj średniej do obliczeń (licznik).
    3. Aby obliczyć CI, przyjmij kolistość wszystkich organoidów we wszystkich studzienkach. Średnia odpowiada wskaźnikowi CI.
      UWAGA: W przypadku konieczności analizy dużych partii obrazów, proces analizy obrazu opisany w sekcji 4 może zostać zsemiautomatyzowany, zaczynając od skalibrowanych plików ND i uruchamiając makro łączące wszystkie kroki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Organoidy od 212 badanych zebrano podczas rutynowych wizyt klinicznych. Podczas lub po procedurze biopsji odbytnicy nie wystąpiły żadne niepożądane zdarzenia. Obrazowanie organoidów przeprowadził jeden badacz, który nie znał charakterystyki pacjentów, takiej jak genotyp i informacje kliniczne. Ze względu na niską jakość obrazów wykluczono 23 badanych. Przykłady udanych i nieudanych hodowli organoidów oraz akwizycji obrazu przedstawiono na Rysunku 2.

Przeanalizowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udostępniamy szczegółowy protokół analizy morfologii organoidów odbytniczych (ROMA). Dwa indeksy obliczone za pomocą ROMA, IR i CI z doskonałą dokładnością odróżniały organoidy od osób bez mukowiscydozy. ROMA może zatem funkcjonować jako nowatorski fizjologiczny test CFTR uzupełniający SCC i inne obecnie dostępne testy 13,14,15.

Protokół jest zależny od użycia organoidów jelitowych, które mają okrągły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Badanie to zostało sfinansowane przez belgijskie stowarzyszenie pacjentów z mukowiscydozą "Mucovereniging/Association Muco", grant badawczy Belgijskiego Towarzystwa Pediatrycznego BVK-SBP 2019 oraz grant z UZ Leuven Fund for Translational Biomedical Research. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy pacjentom i rodzicom, którzy wzięli udział w tym badaniu. Dziękujemy firmie Abida Bibi za wszystkie prace związane z hodowlą organoidów. Dziękujemy Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anji Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pimowi Sansenowi, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monice Waskiewicz i Bernardowi Wenderickxowi za wsparcie logistyczne. Dziękujemy również Stowarzyszeniu Mucovereniging/Association Muco, a w szczególności Stefanowi Jorisowi i dr Janowi Vanleeuwe, za ich wsparcie i finansowanie. Dziękujemy wszystkim współpracownikom z belgijskiego projektu Organoid: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgia), Linda Boulanger (Szpital Uniwersytecki w Leuven, Belgia), Georges Casimir (HUDERF, Bruksela, Belgia), Benedicte De Meyere (Szpital Uniwersytecki w Gandawie, Belgia), Elke De Wachter (Szpital Uniwersytecki w Brukseli, Belgia), Danny De Looze (Szpital Uniwersytecki w Gandawie, Belgia), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruksela, Belgia), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruksela), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruksela, Belgia), Monique Lequesne (Szpital Uniwersytecki w Antwerpii, Belgia), Vicky Nowé (GZA Szpital św. Wincentego w Antwerpii), Dirk Staessen (GZA Szpital św. Wincentego w Antwerpii), Stephanie Van Biervliet (Szpital Uniwersytecki w Gandawie, Belgia), Eva Van Braeckel (Szpital Uniwersytecki w Gandawie, Belgia), Kim Van Hoorenbeeck (Szpital Uniwersytecki w Antwerpii, Belgia), Eef Vanderhelst (Szpital Uniwersytecki w Brukseli, Belgia), Stijn Verhulst (Szpital Uniwersytecki Antwerpia, Belgia), Stefanie Vincken (Szpital Uniwersytecki w Brukseli, Belgia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlSorenson17040
Probówki stożkowe 15 mlVWR525-0605
Płytki 24-dołkoweCorning3526
96-dołkowe MikroskopGreiner655101
Brightfield WirówkaZeissAxiovert 40C
Eppendorf5702
Inkubator CO2BinderCB160
KomputerowyHewlett-PackardZ240
 laminarnym ZeissLSM 800
Thermo Fisher51025413
Materiał do hodowli organoidów zgodnie z opisem w poprzednim protokole10
Mikropipety (20, 200 i 1000 &mikro; L)Eppendorf3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft ExcelMicrosoftMicrosoft Excel 2019 MSO 64-bitoweoprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych
NIS-Elements Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania analizy badawczej Nikonv.5.02.00Oprogramowanie do obrazowania
Końcówki do pipet (20, 200 i 1000 &mikro; L)Oprogramowanie Greiner774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue Oprogramowanie do obrazowaniaZeissv2.6
mikroskop konfokalny Okap z przepływem

Bibliografia

  1. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
  2. Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
  3. Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
  4. CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
  5. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
  6. Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
  7. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  8. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159(2017).
  9. Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
  10. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  11. Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
  12. Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019(2020).
  13. Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
  14. Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
  15. Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
  16. Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Diagnostyka mukowiscydozytest CFTRhodowla organoidówwskaźnik kolistościstosunek intensywnościmikroskopia konfokalnaobrazowanie organoidówkontrola jakościtestowanie modulatorów CFTR
Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA): test diagnostyczny w mukowiscydozie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.