Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63949

⸱

8 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Na podstawie rodzinnej rodziny kardiomiopatii dziedzicznej znalezionej w naszej pracy klinicznej, stworzyliśmy model myszy C57BL/6N z mutacją punktową (G823E) w mysim locus MYH7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby zweryfikować tę mutację.

Streszczenie

Rodzinna kardiomiopatia przerostowa (HCM, OMIM: 613690) jest najczęstszą kardiomiopatią w Chinach. Jednak etiologia genetyczna leżąca u podstaw HCM pozostaje nieuchwytna.

Wcześniej zidentyfikowaliśmy heterozygotyczny wariant genu miozyny o ciężkim łańcuchu 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), u dużej chińskiej rodziny Han z HCM. W tej rodzinie wariant G823E ulega kosegregacji z zaburzeniem autosomalnym dominującym. Wariant ten znajduje się w domenie ramienia dźwigni w regionie szyi białka MYH7 i jest wysoce konserwatywny wśród homologicznych miozyn i gatunków. Aby zweryfikować patogenność wariantu G823E, wyprodukowaliśmy mysi model C57BL/6N z mutacją punktową (G823E) w mysim locus MYH7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Zaprojektowaliśmy wektory celujące w gRNA i oligonukleotydy donorowe (z sekwencjami celującymi otoczonymi 134 pz homologii). Miejsce p.G823E (GGG do GAG) w oligonukleotydzie donorowym zostało wprowadzone do eksonu 23 MYH7 przez naprawę ukierunkowaną na homologię. Wstawiono również wyciszony p.R819 (AGG do CGA), aby zapobiec wiązaniu gRNA i ponownemu rozszczepieniu sekwencji po naprawie kierowanej homologią. Echokardiografia wykazała przerost ściany tylnej lewej komory (LVPW) ze skurczem u myszy MYH7 G823E/- w wieku 2 miesięcy. Wyniki te zostały również potwierdzone przez analizę histologiczną (Rysunek 3).

Te wyniki pokazują, że wariant G823E odgrywa ważną rolę w patogenezie HCM. Nasze odkrycia wzbogacają spektrum wariantów MYH7 związanych z rodzinnym HCM i mogą stanowić wskazówkę dla poradnictwa genetycznego i diagnostyki prenatalnej w tej chińskiej rodzinie.

Wprowadzenie

Kardiomiopatia przerostowa (HCM, OMIM: 613690) jest najczęstszą kardiomiopatią w Chinach, z szacowaną częstością występowania 0,2%, dotykającą 150 000 osób1,2.

Patologiczną cechą anatomiczną charakteryzującą HCM jest asymetryczny przerost komorowy, który często obejmuje drogę odpływu komorowego i/lub przegrodę międzykomorową3. Objawem klinicznym jest duszność wysiłkowa, zmęczenie i ból w klatce piersiowej. Indywidualny fenotyp HCM ma zmienność, od klinicznie podstępnej do ciężkiej niewydolności serca. Pacjenci z HCM wymagają leczenia, przeszczepu serca, sprzętu podtrzymującego życie i multidyscyplinarnej obserwacji4.

W ubiegłym stuleciu technologia PCR zmieniła sposób, w jaki badamy DNA5. Metoda sekwencjonowania DNA do diagnozy klinicznej została odkryta przez Sangera i współpracowników6. Technika Sangera została następnie zastosowana w Projekcie Poznania Ludzkiego Genomu, ale podejście to było kosztowne i czasochłonne7. Pojawienie się sekwencjonowania całego genomu (WGS) przyniosło wgląd w ludzkie choroby genetyczne na nowy poziom, ale pozostało zaporowe pod względem kosztów. Technologia sekwencjonowania całego eksomu (WES) jest od dawna stosowana do wykrywania wariantów linii zarodkowej8 i odniosła sukces w identyfikacji mutacji somatycznych w egzomie różnych nowotworów9. Wykrywanie eksonów DNA lub regionów kodujących przez WES może być wykorzystane do ujawnienia wariantów patogennych w większości chorób mendlowskich. Obecnie, wraz ze spadającymi kosztami sekwencjonowania, oczekuje się, że WGS stanie się ważnym narzędziem w badaniach genomicznych i może być szeroko stosowany w wykrywaniu patogennych wariantów genomu.

Technologia WES została również wykorzystana w kardiomiopatii dziedzicznej do identyfikacji wariantów patogennych w celu dalszego wyjaśnienia etiologii. Pojawiające się dowody sugerują, że geny kodujące mutacje genów białka strukturalnego sarkomery, takie jak MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 i TPM118 są odpowiedzialne za etiologię genetyczną HCM. Świadomość patogennych wariantów w rzadkich genach chorobotwórczych (np. oburyna, kalmodulina cytoszkieletowa i RhoGEF ODDZIAŁUJĄCY Z TYTYNĄ (OBSCN, OMIM: 608616)19, działający alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 oraz białko bogate w cysteinę i glicynę 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) również jest związane z HCM. Obecne badania genetyczne zidentyfikowały wiele odrębnych wariantów patogennych w genie białka sarkomerowego u około 40%-60% pacjentów z HCM, a testy genetyczne u pacjentów z HCM wykazały, że większość patogennych wariantów występuje w łańcuchu ciężkim miozyny (MYH7) i białku C wiążącym miozynę (MYBPC3). Jednak genetyczne podstawy HCM pozostają nieuchwytne. Badanie patogenności tych odmian, które leżą u podstaw pacjentów z HCM, pozostaje głównym wyzwaniem22.

W tym badaniu opisujemy patogenny wariant MYH7 u chińskiej rodziny Han z HCM przez WES. W celu zweryfikowania patogenności tego wariantu stworzyliśmy myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9. Omawiamy również prawdopodobne mechanizmy tego wariantu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Historie rodzin uzyskano poprzez wywiady z członkami rodziny. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Prowincjonalnego Szpitala Medycyny Chińskiej w Guangdong (nr 2019074). Uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich członków rodziny. Wszystkie zwierzęta są leczone zgodnie z wytycznymi etycznymi Szpitala Prowincji Medycyny Chińskiej Guangdong (Guangzhou, Chiny).

1. Tematy badań

UWAGA: W lipcu 2019 roku probant III-3 zasięgnął porady lekarza na Wydziale Chirurgii Sercowo-Naczyniowej Prowincjonalnego Szpitala Medycyny Chińskiej w Guangdong.

  1. Uzyskaj szczegółowy rodzinny wywiad medyczny probanta. Powiadom i zadzwoń do wszystkich członków rodziny probanta. Wszyscy członkowie rodziny przeszli skrupulatne badania fizykalne.
    1. Wykonaj systematyczny przegląd wszystkich danych klinicznych, w tym dokumentacji medycznej, EKG, echokardiogramów i raportów z cewnikowania serca.
    2. Potwierdź fenotypy serca u wszystkich pacjentów podczas interwencji lub operacji.
  2. Wybierz łącznie 174 populacyjne kontrolki w dobrej kondycji z lokalnej bazy danych. Pobrać około 4,0 ml krwi żylnej obwodowej od każdego pacjenta.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: DNA jest ekstrahowane za pomocą dostępnego w sprzedaży zestawu do krwi, zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Lizować komórki krwi anionowym detergentem w obecności stabilizatora DNA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Dodaj 10 μl roztworu RNazy A do lizatu komórkowego i wymieszaj, odwracając probówkę 25 razy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut do 1 godziny.
  3. Usuń białka przez wytrącanie soli. Użyj roztworu do wytrącania białka (0,25 mg albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 25 ml wody destylowanej) i 100% izopropanolu do wytrącenia białek. Następnie użyj 200 μl 70% etanolu i przeprowadź wirowanie przy 12 000 x g/min w 4 °C przez 15 minut, aby przepłukać osad DNA.
  4. Odzyskaj genomowe DNA przez wytrącanie 500 μl 70% etanolu. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s. Odessać, a następnie rozpuścić osad w roztworze hydratacyjnym (1 mM EDTA, 10 mM Tris·Cl, pH 7,5).
  5. Użyj spektrofotometru (np. NanoDrop 2000), aby określić czystość. Oczyszczone DNA ma zazwyczaj stosunek A260/A280 między 1,7 a 1,9 i ma rozmiar do 200 kb.
  6. Przechowuj DNA przez długi czas w temperaturze 2-8, -20 lub -80 °C.

3. Sekwencjonowanie całego eksomu i analiza wariantów

UWAGA: Aby systematycznie szukać mutacji genów powodujących chorobę, przeprowadzono sekwencjonowanie egzomu u osób dotkniętych chorobą (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 i IV-3) i zdrowych (III-2, III-5, IV-4).

  1. Użyj sondy egzomu zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać wychwyt egzomu.
  2. Zastosuj kwalifikowane biblioteki do sekwencjonowania sparowanych końców 2 × 150 bp na platformie HiSeq X-ten. Patrz plik uzupełniający 1.
  3. Dopasuj pliki FASTQ do ludzkiego genomu referencyjnego (hg19/GRCh37) z BWA v0.7.1318,19. Posortuj wyrównane pliki (pliki w formacie sam/bam) za pomocą samtools, a następnie oznacz duplikaty za pomocą Picarda. Patrz plik uzupełniający 1.
  4. Użyj GATK, wyrównaj odczyty lokalnie i ponownie skalibruj podstawowe cechy. Patrz plik uzupełniający 1.
  5. Generuj statystyki mapowania, które obejmują pokrycie i głębokość z ponownie skalibrowanych plików przez BEDTools i wewnętrzne skrypty perl/python.
  6. Warianty genotypów (SNV i indels) z ponownie skalibrowanych plików BAM przy użyciu trybu przetwarzania wielu próbek narzędzia HaplotypeCaller firmy GATK.
  7. Użyj VQSR (ponowna kalibracja wariantowego wyniku jakości), aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich w wywołaniach wariantów.
  8. Za pomocą oprogramowania ANNOVAR21 dodawaj adnotacje do SNV i indeli w wielu bazach danych, w tym Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) i 1,000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretacja patogenności wariantów sekwencji zgodnie z wytycznymi ACMG.

4. Sekwencjonowanie Sangera

  1. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby potwierdzić potencjalne warianty sprawcze i określić segregację wariantów w rodzinie za pomocą sekwencera ABI 3500 23.
  2. Zaprojektuj sekwencje starterów dla wariantu w genie MYH7 (NM_000257) w następujący sposób: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' i 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Potwierdź wariant, przeanalizuj wszystkich dostępnych członków rodziny, aby określić segregację wariantów w rodzinie23.

5. Generacja myszy knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockin

  1. Użyj systemu CRISPR/Cas9 do wygenerowania myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). Mysi gen Myh7 (numer dostępu do GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) znajduje się na chromosomie 14 myszy i ma 41 eksonów. Kodon start ATG w eksonie 4 i kodon stop TAG w eksonie 41, a G823E znajduje się w eksonie 23. Wybierz ekson 23 jako miejsce docelowe.
  2. Zaprojektuj sekwencję wektora docelowego gRNA i oligo dawcy (z sekwencją docelową, otoczoną sekwencjami homologicznymi 134 pz połączonymi po obu stronach).
    1. Zaloguj się na stronie NCBI i kliknij funkcję projektowania podkładu online BLAST po prawej stronie.
    2. Kliknij funkcję Primer-BLAST u dołu strony, aby zaprojektować podkłady.
    3. Wklej numer sekwencyjny referencyjny NCBI MYH7 NM_000257.4 w polu szablonu PCR.
    4. Amplifikuj fragment docelowy (ekson 23 cDNA MYH7 i sąsiednie eksony), więc zaprojektuj starter w górę na eksonie 21 (2392-2528) i starter w dół na eksonie 25 (3205-3350). Wprowadź numer eksonu starterów przed i za starterami w odpowiednim polu zakresu.
    5. Kliknij przycisk Pobierz startery na dole, aby automatycznie wygenerować wiele par starterów.
  3. Wprowadzić gen MYH7 do bazy danych ZFIN, wprowadzić miejsce mutacji p.g823e (GGG do GAG) w oligonukleotydzie donorowym i cichą mutację p.r819 (AGG do CGA) do eksonu 23. Cicha mutacja zapobiega wiązaniu i ponownemu cięciu sekwencji przez gRNA po naprawie ukierunkowanej na homologię.
    1. Zaprojektuj gRNA zgodnie z ogólną sekwencją, sekwencje na obu końcach to TAATACGACTCACTATA- i -GTTTTAGAGCTA. Środek sekwencji to miejsce docelowe wymienione powyżej.
  4. Współwstrzykiwać mRNA Cas9, gRNA generowane przez transkrypcję in vitro i oligo dawcy do zapłodnionych jaj w celu produkcji myszy KI.
    1. Użyj zestawu do wykrywania skuteczności celu Cas9/gRNA, aby przepisać zaprojektowany cel gRNA na gRNA in vitro i wykryć aktywność transkryptu (patrz instrukcje zestawu VK007 dotyczące konkretnych metod wykrywania) zgodnie z protokołem producenta.
    2. Rozmrozić składniki zestawu mRNA T7 ARCA, wymieszać i pulsacyjnie wirować w mikrofudzie, aby zebrać roztwory na dnie probówek. Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej w następującej kolejności: 2x mieszanina ARCA/NTP do 10 μl, 1 μg matrycy DNA, 2 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 i woda wolna od nukleaz do 20 μL.
    3. Dokładnie wymieszaj i pulsacyjnie wiruj w mikrofuge. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Usunąć matrycę DNA, dodając 2 μl DNazy I, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu uzyskania mRNA.
    5. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie gonadotropiny surowicy i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej wstępnie przygotowanym samicom myszy C57BL/6 w wieku około 4 tygodni za pomocą strzykawki 0,5 ml w dawce około 5 j. na mysz w odstępie 48 godzin między dwoma wstrzyknięciami.
    6. Osiemnaście godzin po podaniu należy złożyć w ofierze samice myszy C57BL/6 i jednego 8-12-tygodniowego samca myszy C57BL/6 przez zwichnięcie szyjki macicy po wstrzyknięciu hormonu. Zbierz komórki jajowe i plemniki oddzielnie.
    7. Plemniki są kapacykowane w płynie kapacytacyjnym. Weź i upuść plemniki na krawędzi płynu do krótko żyjących komórek jajowych w celu zapłodnienia in vitro przez 3-4 godziny.
    8. Rozcieńczyć pomyślnie transkrybowane gRNA i mRNA Cas9 in vitro wodą wolną od RNaz do 25 ng/μL i 50 ng/μL. Wprowadzić do cytoplazmy zapłodnionych jaj myszy przez mikrowstrzyknięcie. Przeszczep zapłodnione jaja w dobrym stanie do powiększonego jajowodu samic myszy. Wspólna klatka z podwiązanymi samcami myszy.
  5. Genotyp szczeniąt metodą PCR. Stosować następujące warunki PCR: 94 °C przez 3 minuty, 35 cykli 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 35 s i 72 °C przez 35 s; 72 °C przez 5 min. Następnie przeprowadź analizę sekwencji.
    1. Odetnij ogony 4-miesięcznych myszy nożyczkami i umieść je w probówce EP o pojemności 1,5 ml. Dodać 180 μl buforu GL, 20 μl proteinazy K i 10 μl RNazy A na końcówkę (2-5 mm) w probówce do mikrowirówki. Uważaj, aby nie obciąć zbyt dużo ogona.
    2. Inkubować probówkę w temperaturze 56 °C przez noc.
    3. Wirować w probówce do mikrowirówki o masie 1 000 x g przez 2 minuty, aby usunąć zanieczyszczenia.
    4. Dodać 200 μl buforu GB i 200 μl bezwodnego alkoholu etylowego po odpowiednim wymieszaniu.
    5. Umieść kolumnę wirującą w probówce zbiorczej. Umieścić próbkę w wirówce i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty. Odrzuć przepływ.
    6. Dodać 500 μl buforu WA do kolumny wirowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.
    7. Dodać 700 μl buforu WB do kolumny wirowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.
      UWAGA: Upewnij się, że bufor WB został wstępnie zmieszany ze 100% etanolem. Dodając Buffer WB, dodaj do ścianki probówki, aby zmyć resztki soli.
    8. Powtórz krok 5.5.7.
    9. Umieścić kolumnę wirową w probówce zbiorczej i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty.
    10. Umieść kolumnę wirującą w nowej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 50-200 μl wysterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do środka membrany kolumny i odstawić kolumnę na 5 minut.
      UWAGA: Podgrzewanie sterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do 65 °C może zwiększyć wydajność elucji.
    11. Aby wymyć DNA, odwirować kolumnę przy 1 000 x g przez 2 minuty. Aby zwiększyć wydajność DNA, dodaj przepływ i/lub 50-200 μl wysterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do środka membrany kolumny wirującej i pozostaw kolumnę na 5 minut. Wirować przy 1.000 x g przez 2 min.
    12. Określ ilościowo eluowany genomowy DNA za pomocą elektroforezy.

6. Ocena morfologii i funkcji serca

UWAGA: Zastosuj echokardiografię w trybie M, aby ocenić morfologię i funkcję serca myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E).

  1. Umieść myszy knockin w zamkniętym akrylowym pudełku podłączonym do aparatu do znieczulenia i wyreguluj trójdrożny interfejs, aby umożliwić przepływ izofluranu (stężenie: 3%) do akrylowego pudełka. Po tym, jak myszy knockin przestaną poruszać się autonomicznie, usuń myszy knockin.
  2. Umieść myszy knockin płasko na platformie monitorowania życia urządzenia do znieczulania małych zwierząt i kontynuuj znieczulenie wziewne zmieszane z tlenem (przepływ: 0,8 l/min) i izofluranem (stężenie: 3%). Nałóż lubrykant do oczu na znieczulone myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  3. Zamocuj myszy knockin poziomo na platformie. Przechyl platformę o 30° ogonowo do myszy knockin. Usuń włosy z przedniej ściany klatki piersiowej pukającej myszy za pomocą kremu do depilacji.
  4. Ustaw sondę pionowo tak, aby guzek był skierowany w stronę głowy zwierzęcia. Następnie obróć sondę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, około 45°.
  5. W widoku przymostkowym o długiej osi obróć sondę o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby obserwować przymostkowy widok w krótkiej osi. Po obróceniu sondy o 90° wyreguluj przemieszczenie osi y, aby uzyskać prawidłowy plasterek.
  6. Obserwuj obraz serca na długiej osi (Rysunek 1C), a następnie wybierz dane pomiarowe w trybie M.
  7. Pozyskaj dane ultrasonograficzne z przymostkowych widoków długich osi myszy (Rysunek 1). Mierzy się tętno (HR), frakcję wyrzutową lewej komory (LVEF), rzut serca (CO), wymiar końcoworozkurczowy lewej komory (LVDd), LVD, wymiar skurczowy lewej komory lewej komory (LVSd), przegrodę międzykomorową (IVS) i tylną ścianę lewej komory (LVPW).
  8. Po pomiarze zapewnij myszom tlen i umieść je z powrotem w odpowiednich klatkach, gdy odzyskają autonomiczną aktywność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Profil kliniczny rodzin
Drzewa genealogiczne rodzin z HCM zostały sporządzone i przedstawiono je na Rysunku 2. Wszyscy udokumentowani członkowie rodzin zostali zdiagnozowani pod kątem HCM w momencie włączenia do badania.

W rodzinie (Rycyna 2A) probandem był pacjent III-7, u którego w wieku 46 lat zdiagnozowano HCM oraz zwężenie drogi odpływu z lewej komory (LVOTO), w związku z czym przeszedł on operację kardiochirurgiczną. Pacjent...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy jedną chińską rodzinę Han z HCM. Analiza genetyczna wykazała, że heterozygotyczna mutacja MYH6 p.G823E współsegreguje się z chorobą u członków rodziny z dziedziczeniem autosomalnym dominującym. Aby zweryfikować patogenność mutacji G823E i omówić mechanizmy leżące u jej podstaw, stworzyliśmy mysi model C57BL/6N z G823E w mysim locus Myh7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9.

Charakterystykę fenotypową myszy knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego finansowego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez projekt Funduszu Badań Medycznych prowincji Guangdong (A2022363) oraz główny projekt Komitetu Nauki i Technologii Guangdong w Chinach (grant nr 2022).

Chcielibyśmy podziękować Qingjian Chen z University of Maryland, College Park za pomoc podczas przygotowania tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 razy; TBESzanghaj Sangon
2 razy; Taq Master Mix (Dye Plus)Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
dla małych zwierzątReward Life Technology Co., Ltd.R500
BEDTools2.16.1
Cas9 metoda trawienia in vitro do wykrywania docelowej wydajności gRNAViewsolid Biotechnology Co., Ltd.VK007
Marker DNAThermo Fisher Naukowy
stabilizator DNAShanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.DNAstable LDzapobiega degradacji DNA
Elektryczny mikrotom parafinowyShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene zestaw do krwiSanta Clara
nakrywkoweJiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Roztwór do barwienia Hematoksyliny, roztwór do barwienia eozynyShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.C0107-500ml, C0109
Platforma HiSeq X-tenIlluminaprzeprowadza sekwencjonowanie na przechwyconych bibliotekach
Wstrzyknięcie gonadotropiny kosmówkowejLivzon Pharmaceutical Group Inc.
Wstrzyknięcie gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczyLivzon Pharmaceutical Group Inc.
IzofluranLokalni dostawcyznieczulenie wziewne
Mikroskop mikroiniekcyjnyNikonECLIPSE Ts2
NanoDropThermo Fisher Scientific2000
Maszyna do zatapiania parafinyShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
Proteinaza KMerck KGaA
samtools1.3
SekwencerApplied BiosystemsABI 3500
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ745T
SureSelect Human All Exon V6Agilent Technology Co., Ltd.sonda egzomu
T7 Zestaw mRNA ARCA NewEngland BioLabs, Inc.NEB-E2065S Skrzynka temperaturowa
BINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma Chlorowodorek RoztwórSigma, Merck KGaANr T2663
Weterynaryjny system ultrasonograficznyRoyal PhilipsCX50
Maszyna anestezjologiczna Szkiełko szkiełkowe, szkiełko

Bibliografia

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473(2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478(2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079(2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878(2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974(2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genomu CRISPRechokardiografiahipertrofia sercasekwencjonowanie metodą Sangerahipertrofia lewej komorywariant patogennyanaliza histologiczna
Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.