Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody in vitro Trawienie emulsji w pojedynczej kropli poprzez wielofazową wymianę symulowanych płynów żołądkowo-jelitowych

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64158

⸱

18 listopada 2022

 ,  ,  , 
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

W tym artykule

Podsumowanie

Balans folii wisiorek z kroplą powierzchni, zaimplementowany z wymianą wielofazową, nazywaną OCTOPUS, pozwala na naśladowanie warunków trawiennych poprzez sekwencyjną wymianę podfaz oryginalnego roztworu masowego z symulowanymi płynami żołądkowo-jelitowymi. Symulowane trawienie in vitro jest monitorowane poprzez rejestrowanie in situ napięcia międzyfazowego strawionej warstwy międzyfazowej.

Streszczenie

Emulsje są obecnie używane do kapsułkowania i dostarczania składników odżywczych i leków do walki z różnymi schorzeniami żołądkowo-jelitowymi, takimi jak otyłość, wzbogacanie składników odżywczych, alergie pokarmowe i choroby trawienne. Zdolność emulsji do zapewnienia pożądanej funkcjonalności, a mianowicie dotarcia do określonego miejsca w przewodzie pokarmowym, zahamowania/opóźnienia lipolizy lub ułatwienia strawności, ostatecznie zależy od jej podatności na degradację enzymatyczną w przewodzie pokarmowym. W emulsjach typu olej w wodzie kropelki lipidów są otoczone warstwami międzyfazowymi, w których emulgatory stabilizują emulsję i chronią zamknięty w kapsułkach związek. Osiągnięcie dostosowanej do potrzeb strawności emulsji zależy od ich początkowego składu, ale wymaga również monitorowania ewolucji tych warstw międzyfazowych, ponieważ są one poddawane różnym fazom trawienia żołądkowo-jelitowego. Wisząca równowaga folii powierzchniowej z wymianą wielofazową pozwala na symulację mineralizacji in vitro emulsji w pojedynczej kropli wodnej zanurzonej w oleju poprzez zastosowanie niestandardowego modelu mineralizacji statycznej. Przejście przez przewód pokarmowy jest naśladowane przez wymianę podfazową oryginalnego roztworu masowego kropelki ze sztucznymi pożywkami, naśladując warunki fizjologiczne każdego przedziału/etapu przewodu pokarmowego. Dynamiczna ewolucja napięcia międzyfazowego jest rejestrowana in situ podczas całego symulowanego trawienia żołądkowo-jelitowego. Właściwości mechaniczne trawionych granic faz, takie jak elastyczność i lepkość dylatacji międzyfazowej, są mierzone po każdej fazie trawienia (jamy ustnej, żołądka, jelita cienkiego). Skład każdej pożywki trawiennej można dostosować do specyfiki warunków trawiennych, w tym patologii żołądkowo-jelitowych i pożywek trawiennych dla niemowląt. Zidentyfikowano specyficzne mechanizmy międzyfazowe wpływające na proteolizę i lipolizę, dostarczając narzędzi do modulowania trawienia przez inżynierię międzyfazową emulsji. Uzyskanymi wynikami można manipulować w celu zaprojektowania nowych matryc żywnościowych o dostosowanych funkcjach, takich jak niska alergenność, kontrolowane spożycie energii i zmniejszona strawność.

Wprowadzenie

Zrozumienie procesu trawienia tłuszczów, który obejmuje trawienie emulsji, jest istotne dla racjonalnego projektowania produktów o dostosowanej funkcjonalności1. Podłożem dla trawienia tłuszczów jest emulsja, ponieważ tłuszcz podczas spożycia ulega emulgowaniu poprzez działanie mechaniczne oraz mieszanie z biosurfaktantami w jamie ustnej i żołądku. Ponadto większość tłuszczów spożywanych przez ludzi jest już zemulgowana (np. produkty mleczne), a w przypadku niemowląt lub niektórych osób starszych jest to jedyna forma spożycia. Dlatego projektowanie produktów opartych na emulsjach o specyficznych profilach trawiennych jest bardzo ważne w żywieniu1. Co więcej, emulsje mogą enkapsulować i dostarczać składniki odżywcze, leki lub lipofilne substancje bioaktywne2 w celu przeciwdziałania różnym schorzeniom przewodu pokarmowego, takim jak otyłość3, wzbogacanie w składniki odżywcze, alergie pokarmowe i choroby trawienne. W emulsjach typu olej w wodzie kropelki lipidów są otoczone interfacialnymi warstwami emulgatorów, takich jak białka, surfaktanty, polimery, cząstki i ich mieszaniny4. Rola emulgatorów jest dwupłaszczyznowa: stabilizacja emulsji5 oraz ochrona/transport enkapsulowanego związku do konkretnego miejsca. Osiągnięcie dostosowanej strawności emulsji zależy od ich początkowego składu, ale wymaga również monitorowania ciągłej ewolucji tej granicy fazowej podczas przejścia przez przewód pokarmowy (Rysunek 1).

Schemat trawienia u niemowląt; macierze pokarmowe, mechanizmy trawienia, fortyfikacja składnikami odżywczymi, alergie.
Rysunek 1: Zastosowanie inżynierii powierzchni międzyfazowych emulsji w celu zwalczania niektórych głównych schorzeń żołądkowo-jelitowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Trawienie lipidów jest w gruncie rzeczy procesem międzypowierzchniowym, ponieważ wymaga adsorpcji lipaz (żołądkowych lub trzustkowych) na granicy faz olej-woda zemulgowanych kropli lipidów poprzez warstwę międzypowierzchniową, aby dotrzeć do zawartych w oleju tryglicerydów i zhydrolizować je do wolnych kwasów tłuszczowych oraz monoacyloglicerydów6. Przedstawiono to schematycznie na Rysunku 2. Lipaza żołądkowa konkuruje w żołądku z pepsyną i fosfolipidami o granicę faz olej-woda (Rysunek 2, trawienie żołądkowe). Następnie w jelicie cienkim lipaza trzustkowa/kolipaza konkurują z trypsyną/chymotrypsyną, fosfolipidami, solami żółciowymi i produktami trawienia. Proteazy mogą zmieniać stopień pokrycia powierzchni, zapobiegając lub sprzyjając adsorpcji lipaz, podczas gdy sole żółciowe wykazują wysoką aktywność powierzchniową i wypierają większość pozostałego emulgatora, aby promować adsorpcję lipazy (Rysunek 2, trawienie jelitowe). W rezultacie szybkość i zakres lipolizy zależą od właściwości międzypowierzchniowych początkowej emulsji lub emulsji po trawieniu żołądkowym, takich jak grubość, połączenia między- i wewnątrzcząsteczkowe oraz oddziaływania elektrostatyczne i steryczne. W związku z tym monitorowanie ewolucji warstwy międzypowierzchniowej podczas trawienia stanowi platformę eksperymentalną do identyfikacji mechanizmów i zdarzeń międzypowierzchniowych wpływających na adsorpcję lipaz, a tym samym na trawienie lipidów.

Schemat trawienia żołądkowego i jelitowego, rozkład emulgowanych lipidów, działanie enzymów trawiennych.
Rycina 2: Schemat ilustrujący rolę międzyfaz w trawieniu lipidów w przewodzie pokarmowym. Hydroliza pepsyną zmienia skład międzyfazowy w fazie żołądkowej, podczas gdy lipaza żołądkowa hydrolizuje triglicerydy. W jelicie cienkim trypsyna/chymotrypsyna dodatkowo hydrolizują film międzyfazowy, natomiast lipoliza przebiega poprzez adsorpcję BS/lipaz, hydrolizę triglicerydów oraz desorpcję produktów lipolizy poprzez solubilizację w micelach/kompleksach BS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Urządzenie do metody wiszącej kropli na Uniwersytecie w Grenadzie (UGR) wykorzystuje opatentowaną technologię współosiowej podwójnej kapilary, która umożliwia wymianę podłoża roztworu objętościowego7. Kapilara, w której zawieszona jest kropla, składa się z układu dwóch współosiowych kapilar, z których każda jest niezależnie połączona z osobny kanałem podwójnego mikroinjektora. Każdy mikroinjektor może pracować niezależnie, co pozwala na wymianę zawartości kropli poprzez przepływ ciągły7. W związku z tym wymiana podłoża polega na jednoczesnym wtryskiwaniu nowego roztworu przez kapilarę wewnętrzną i odsysaniu roztworu objętościowego przez kapilarę zewnętrzną przy zastosowaniu tej samej szybkości przepływu. Proces ten pozwala na wymianę roztworu objętościowego bez zaburzania powierzchni międzyfazowej lub objętości kropli. Procedura ta została później udoskonalona do wielokrotnej wymiany podłoża, co pozwala na przeprowadzenie do ośmiu sekwencyjnych wymian roztworu objętościowego w kropli8. Umożliwia to symulację procesu trawienia w pojedynczej kropli wodnej zawieszonej w ośrodku lipidowym poprzez sekwencyjną wymianę roztworu objętościowego na sztuczne media naśladujące poszczególne odcinki układu pokarmowego (jamę ustną, żołądek, jelito cienkie). Cały układ, wraz ze szczegółami komponentów, przedstawiono na Rysunku 3. Strzykawki w mikroinjektorze są połączone z zaworami ościeżnymi, z których każdy prowadzi do probówki do mikrocentryfugi zawierającej sztuczny płyn trawienny o składzie opisanym na Rysunku 2.

Układ do mikroiniekcji z źródłem światła, mikropozycjonerem i kamerą CCD, służący do precyzyjnej manipulacji komórkami.
Rycina 3: Ogólny widok urządzenia OCTOPUS ze wszystkimi komponentami. Kamera CCD, mikroskop, mikropozycjoner, komora termostabilizowana oraz podwójna kapilara połączona niezależnie z podwójnym mikroiniektorem z dwiema strzykawkami podłączonymi do zaworów ośmioportowych. Każda strzykawka łączy się z kapilarą, czterema probówkami do mikrocentryfugowania z próbką oraz jednym odpływem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4A pokazuje, w jaki sposób każdy z syntetycznych płynów trawiennych jest wstrzykiwany do wiszącej kropli poprzez wymianę podfazową za pomocą podwójnej kapilary. Każdy związek trawienny opisany w Rycina 2 mogą być stosowane jednocześnie lub sekwencyjnie, symulując przejście przez przewód pokarmowy. Sztuczne płyny trawienne zawierają różne enzymy i biosurfaktanty, które zmieniają napięcie powierzchniowe pierwotnego emulgatora, zgodnie ze schematem przedstawionym w Rycina 4BOprogramowanie DINATEN (patrz Tabela materiałów), również opracowany na UGR, rejestruje w czasie rzeczywistym zmiany napięcia międzyfazowego w miarę trawienia początkowej warstwy międzyfazowej in vitroPonadto po każdej fazie trawienia oblicza się sprężystość dylatacyjną warstwy międzyfazowej poprzez nakładanie okresowych oscylacji objętości/powierzchni międzyfazowej na ustabilizowaną warstwę międzyfazową i rejestrowanie odpowiedzi napięcia międzyfazowego. Można zmieniać okres/częstotliwość oraz amplitudę oscylacji, a przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania CONTACTO pozwala na wyznaczenie parametrów reologicznych dylatacyjnych.8.

Proces trawienia enzymatycznego; wykres napięcia międzyfazowego; układ do proteolizy, lipolizy i desorpcji.
Rycina 4: Przykłady profili trawienia. (A) Początkowa warstwa emulsyfikatora jest poddawana działaniu sztucznych mediów trawiennych umieszczonych w mikrocentryfudze poprzez sekwencyjną wymianę podfazy różnych roztworów w kropli wiszącej. (B) Ogólna zmiana napięcia międzyfazowego (oś y) początkowego emulsyfikatora w funkcji czasu (oś x) podczas trawienia in vitro przez różne enzymy/biosurfaktanty w sztucznych mediach. Końcowa wymiana podfazy na czysty płyn jelitowy służy do pomiaru desorpcji strawionego lipidu poprzez solubilizację w micelach mieszanych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Niniejsze badanie przedstawia ogólny protokół zaprojektowany do pomiaru trawienia warstw międzyfazowych in vitro z wykorzystaniem urządzenia do kropli wiszącej9. Początkowa warstwa międzyfazowa jest poddawana sekwencyjnie warunkom naśladującym przejście przez przewód pokarmowy, co przedstawiono na Rysunku 2. Różne media trawienne są wstrzykiwane do kropli wiszącej poprzez wymianę podfazy różnych roztworów zawartych w probówkach do mikrocentryfugi (Rysunek 4A). Skład tych mediów może być dostosowany w zależności od ocenianych warunków żołądkowo-jelitowych, a mianowicie proteolizy/lipolizy żołądkowej i jelitowej, co pozwala na pomiar efektów kumulatywnych i synergii10. Warunki eksperymentalne stosowane do naśladowania procesu trawienia w każdym przedziale zgodne są z międzynarodowym protokołem konsensusu opublikowanym przez INFOGEST, określającym pH oraz ilości elektrolitów i enzymów11. Urządzenie eksperymentalne oparte na kropli wiszącej umożliwia rejestrację napięcia międzyfazowego in situ przez cały proces symulowanego trawienia. Reologia dylatacyjna warstwy międzyfazowej jest obliczana po każdym etapie trawienia. W ten sposób każdy emulgator wykazuje profil trawienia ilustrujący właściwości strawionych powierzchni międzyfazowych, jak pokazano na Rysunku 4B. Pozwala to na wyciągnięcie wniosków dotyczących podatności lub odporności emulgatora na poszczególne etapy procesu trawienia. Generalnie sztuczne media trawienne zawierają pH kwasowe/zasadowe, elektrolity, proteazy (żołądkowe i jelitowe), lipazy (żołądkowe i jelitowe), sole żółciowe i fosfolipidy, które są rozpuszczone w odpowiednich płynach trawiennych (żołądkowym lub jelitowym). Rysunek 4B przedstawia generyczny profil zmian napięcia międzyfazowego emulgatora, który najpierw został poddany działaniu proteaz, a następnie lipaz. Zazwyczaj proteoliza warstwy międzyfazowej sprzyja wzrostowi napięcia międzyfazowego ze względu na desorpcję zhydrolizowanych peptydów9,12, podczas gdy lipoliza prowadzi do gwałtownego spadku napięcia międzyfazowego z powodu adsorpcji soli żółciowych i lipaz13. Końcowa wymiana podfazy na płyn jelitowy usuwa z roztworu masowego materiał niezaadsorbowany/strawiony i sprzyja desorpcji związków rozpuszczalnych oraz solubilizacji strawionych lipidów w micelach mieszanych. Jest to kwantyfikowane przez zarejestrowany wzrost napięcia międzyfazowego (Rysunek 4B).

Podsumowując, projekt eksperymentalny zrealizowany w metodzie wiszącej kropli w celu symulacji trawienia in vitro w pojedynczej kropli pozwala na pomiar efektów kumulatywnych i synergii, ponieważ proces trawienia jest stosowany sekwencyjnie do początkowej warstwy międzyfazowej10. Skład każdego medium trawiennego można łatwo dostosować do specyfiki warunków trawienia, w tym patologii przewodu pokarmowego lub mediów trawiennych dla niemowląt14. Następnie identyfikacja mechanizmów międzyfazowych wpływających na proteolizę i lipolizę może zostać wykorzystana do modulowania trawienia poprzez inżynierię międzyfazową emulsji. Uzyskane wyniki mogą zostać zastosowane w projektowaniu nowatorskich matryc żywnościowych o dostosowanych funkcjonalnościach, takich jak niska alergenność, kontrolowana podaż energii oraz zmniejszona strawność15,16,17,18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sekwencja czyszczenia wszystkich wyrobów szklanych używanych w eksperymentach z powierzchnią

  1. Wyszoruj szkło skoncentrowanym roztworem czyszczącym (patrz Tabela materiałów) rozcieńczonym w wodzie (10%).
  2. Dokładnie spłucz sekwencją wody z kranu, propanolu, wody destylowanej i wody ultraczystej. Suszyć w kabinie i przechowywać w zamkniętej szafce do czasu użycia.

2. Przygotowanie próbki

  1. Przygotuj sztuczne podłoża trawienne zgodnie ze znormalizowanymi protokołami INFOGEST11,20 (patrz Tabela Materiałów). Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1 i zawierają niewielkie dostosowania do wymagań prac międzyfazowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchniowo czynnemu i rozcieńczeniu próbek (1:10)10.
  2. Przygotuj roztwór emulgatora, wykonując poniższe czynności.
    1. Przygotować 0,01 l stężonego roztworu (1 kg·L−1) emulgatora lub mieszaniny emulgatorów (patrz Tabela Materiałów) w początkowym buforze (Tabela 1) i przechowywać przez noc w łagodnym mieszaniu.
    2. Rozcieńczyć do 0,1 kg·L−1 (lub zgodnie z wymaganiami) w celu nasycenia interfejsu; osiągnąć pseudo plateau w napięciu międzyfazowym po 1 godzinie adsorpcji w stałym obszarze międzyfazowym zgodnie z poprzednio opublikowanym raportem21.
    3. Przechowywać w lekkim wstrząsie przez 15 minut przed użyciem.
  3. Oczyść fazę olejową.
    1. Przygotuj mieszankę oleju roślinnego (słonecznikowego, oliwkowego, trioleiny itp.)oraz żywice metakrzemianowe magnezu (patrz tabela materiałów) w proporcji 2:1 w/w w dużej zlewce. Przechowywać w warunkach łagodnego mieszania mechanicznego przez co najmniej 3 godziny.
    2. Odwirować mieszaninę przy 8 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wirówce handlowej (patrz Tabela materiałów).
    3. Przefiltrować mieszaninę oleju pod próżnią za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,2 μm) (patrz tabela materiałów). Przechowywać w czystych, bursztynowych butelkach, szczelnie zamkniętych i bąbelkujących azotem do czasu użycia.

3. Kalibracja i czyszczenie OCTOPUS

  1. Przepłukać wszystkie rurki ultraczystą wodą, ustawiając sekwencję czyszczenia zarówno strzykawek, jak i wszystkich zaworów przez kapilarę (zawory 6/4) i do zewnętrznego wyjścia (zawór 8-kolor niebieski). Zrób to, naciskając przycisk czyszczenia w lewym oknie dialogowym (Rysunek uzupełniający 1A).
  2. Sprawdź napięcie powierzchniowe 7 wody w temperaturze pokojowej, formując kroplę wody i mierząc w czasie rzeczywistym przez 5 minut (Rysunek uzupełniający 1B, C).
    1. Ustaw gęstość różnicową na powietrze-woda (0,9982 kg·L−1) w lewym oknie dialogowym, Rysunek uzupełniający 1B.
  3. Napełnij czystą kuwetę (szkło optyczne) 0,002 l czystego oleju roślinnego i umieść ją w uchwycie kuwety w celi termostatycznej (Rysunek 3).
  4. Ustawić termostat i pozwolić na wyrównanie temperatury na poziomie 37 °C.
  5. Sprawdź napięcie międzyfazowe wody i oleju w temperaturze pokojowej7.
    1. Ustaw gęstość różnicową na olej roślinny-woda (oliwa z oliwek: 0,800 kg·L−1) (rysunek uzupełniający 1C).
    2. Wstrzyknąć 40 μl z szybkością 0,5 μL·s−1 i mierzyć w czasie rzeczywistym co sekundę do końca wstrzyknięcia. Jest to prosty proces dynamiczny (rysunek uzupełniający 1B, D).
    3. Wykreślić napięcie międzyfazowe w funkcji objętości kropli w arkuszu danych.
    4. Sprawdź, czy zakres objętości kropli podaje wartość napięcia międzyfazowego niezależną od objętości kropli. Wykreślić obszar międzyfazowy w funkcji objętości kropli.
    5. Zaprogramuj proces składający się z dwóch kroków (Rysunek uzupełniający 1B i Rysunek uzupełniający 2A), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Za pomocą strzykawki wewnętrznej wstrzyknąć objętość zawartą w tym zakresie stałego napięcia międzyfazowego.
      2. Utrzymuj stałą powierzchnię międzyfazową na wartości wybranej w kroku 3.5.4 i zapisuj napięcie międzyfazowe przez 5 min7.

4. Programowanie jednego procesu eksperymentalnego w DINATEN dla każdego etapu trawienia

UWAGA: Aby zapoznać się z parametrami procesu, zobacz Rysunek Uzupełniający 1B.

  1. Wykonaj kontrolę wstępną.
    1. W celu utworzenia kropli wstrzyknąć 10 μl (±5 μl) roztworu emulgatora do kapilary (zawór 6) (rysunek uzupełniający 2A).
    2. Rejestruj adsorpcję w stałym obszarze międzyfazowym21 z 20 mm2 (±10 mm2) przez 1 godzinę (rysunek uzupełniający 2B).
    3. Zapisz reologię dylatacyjną8 (Rysunek uzupełniający 2C).
      1. Ustaw amplitudę oscylacji na 1,25 μL, okres 10 s.
      2. Rejestrować adsorpcję w wybranym obszarze międzyfazowym (krok 4.1.2) przez 10 s.
      3. Powtórz krok 4.1.3 w różnych odstępach czasu: 5 s, 20 s, 50 s i 100 s.
  2. Rejestruj trawienie żołądka.
    1. Rejestruj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym przez 10 s.
    2. Wymiana podfazowa7 z cieczą w zaworze 2 (sSGF) i enzymami żołądkowymi (Tabela 1) (Rysunek uzupełniający 2D).
      1. Napełnić lewą strzykawkę z zaworu 2. Wstrzyknąć 125 μl do kapilary zaworu 6 za pomocą lewej strzykawki o stężeniu 5 μl·s−1.
      2. Pobrać 125 μl z kapilary za pomocą prawej strzykawki o stężeniu 5 μL·s−1. Rozładować prawą strzykawkę, aby wypłynąć z zaworu 8. Powtórz kroki 4.2.2.1-4.2.2.2 10 razy, aby zapewnić pełną wymianę.
    3. Zapisuj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 1 godzinę (rysunek uzupełniający 2B).
    4. Zapisz reologię dylatacyjną8 (Rysunek uzupełniający 2C).
      1. Ustaw amplitudę oscylacji na 1,25 μL, okres 10 s.
      2. Rejestruj adsorpcję wybranego obszaru międzyfazowego w kroku 4.1.2 przez 10 s. Powtarzaj w różnych okresach: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Rejestruj trawienie jelitowe.
    1. Zapisuj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 10 s (rysunek uzupełniający 2B).
    2. Wymiana podfazowa7 z cieczą w zaworze 3 (sSIF) i enzymami jelitowymi/solami żółciowymi/fosfolipidami (Tabela 1) (Rysunek uzupełniający 2D).
      1. Napełnić lewą strzykawkę z zaworu 2. Wstrzyknąć 125 μl do kapilary zaworu 6 za pomocą lewej strzykawki o stężeniu 5 μl·s−1. Pobrać 125 μl z kapilary za pomocą prawej strzykawki o stężeniu 5 μL·s−1.
      2. Rozładować prawą strzykawkę, aby wypłynąć z zaworu 8. Powtórz kroki 4.3.2.1-4.3.2.2 10 razy, aby zapewnić pełną wymianę.
    3. Zapisuj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 1 godzinę.
    4. Zapisz reologię dylatacyjną8 (Rysunek uzupełniający 2C).
      1. Ustaw amplitudę oscylacji na 1,25 μL, okres 10 s.
      2. Rejestruj adsorpcję w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 10 s.
      3. Powtarzaj w różnych okresach: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Zarejestruj desorpcję, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Zapisuj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 10 s (rysunek uzupełniający 2B).
    2. Wymiana podfazowa7 z cieczą w zaworze 5 (sSIF) (Tabela 1, Rysunek uzupełniający 2D).
      1. Napełnić lewą strzykawkę z zaworu 5. Wstrzyknąć 125 μl do kapilary zaworu 5 za pomocą lewej strzykawki o stężeniu 5 μl·s−1.
      2. Pobrać 125 μl z kapilary za pomocą prawej strzykawki o stężeniu 5 μL·s−1. Rozładować prawą strzykawkę, aby wypłynąć z zaworu 8. Powtórz kroki 4.4.2.1-4.4.2.2 10 razy, aby zapewnić pełną wymianę.
    3. Zapisuj adsorpcję21 w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 1 godzinę (rysunek uzupełniający 2B).
    4. Zapisz reologię dylatacyjną8 (Rysunek uzupełniający 2C).
      1. Utrzymuj amplitudę 1,25 μl, okres 10 s.
      2. Rejestruj adsorpcję w wybranym obszarze międzyfazowym w kroku 4.1.2 przez 10 s.
      3. Powtórz krok 4.4.4 w różnych odstępach czasu: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.

5. Przygotowanie eksperymentu

  1. Napełnij probówki do mikrowirówek sztucznym roztworem mineralizacyjnym i podłącz każdą z nich do odpowiedniego zaworu za pomocą odpowiedniego wężyka.
  2. Napełnij rurkę w zaworach 2-5, czyszcząc z zaworu 2, zaworu 3, zaworu 4 i zaworu 5 do zewnętrznego wyjścia (zawór 8) (rysunek uzupełniający 1A).
  3. Napełnij rurkę w zaworze 1, czyszcząc od zaworu 1 do zaworu 6-kapilarnego 5 razy.
  4. Umieść kapilar w fazie olejowej. Naładować lewą strzykawkę zaworem 1 (roztwór początkowy, Tabela 1).
  5. Rozpocznij sekwencyjne przetwarzanie kroku 4.1 - początkowego, kroku 4.2 - żołądkowego, kroku 4.3 - jelit i kroku 4.4 - desorpcji, zapisując dane na końcu każdego procesu.

6. Obliczanie dylatacyjnych parametrów reologicznych za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu CONTACTO8

UWAGA: Aby uzyskać szczegóły, zobacz Maldonado-Valderrama et al.8.

  1. Załaduj obrazy odpowiadające oscylacji obszaru o danej częstotliwości i amplitudzie (rysunek uzupełniający 3A).
  2. Naciśnij Reologię (rysunek uzupełniający 3B) i uzyskaj parametry dylatacyjne (rysunek uzupełniający 3C).
  3. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza kalkulacyjnego danych.

7. Wykreślanie wyników eksperymentu

  1. Ponownie oblicz kolumnę czasu w każdym z etapów procesu mineralizacji, dodając ostatnie dane z czasu poprzedniego kroku.
  2. Wykreślić napięcie międzyfazowe w funkcji czasu dodawania dla każdego z etapów zastosowanego procesu trawienia.
  3. Wykreślić końcowe napięcie międzyfazowe/elastyczność dylatacyjną i lepkość uzyskane na końcu każdego etapu w porównaniu z fazą trawienia: trawienie początkowe, trawienie żołądkowe, trawienie dwunastnicy i desorpcja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono różne przykłady profili trawienia zmierzonych za pomocą urządzenia OCTOPUS. Ogólny przebieg symulowanego profilu trawienia pokazano na Rysunku 4B. W profilu trawienia napięcie międzyfazowe jest zazwyczaj przedstawione w funkcji czasu. Poszczególne fazy/etapy trawienia są oznaczone różnymi kolorami. Pierwsza faza tworzy warstwę początkową i odpowiada fazie adsorpcji emulgatora lub białka/surfaktantu/polimeru, w zależności od przypadku. Następnie, poprzez wymianę pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano uogólniony protokół pomiaru trawienia in vitro warstw międzyfazowych przy użyciu sprzętu do upuszczania wisiorków. Protokół można dostosować do specyficznych wymagań eksperymentu poprzez dostrojenie składu trawiennych, które są oparte na zharmonizowanym protokole INFOGEST11,20 w celu ułatwienia porównania z literaturą. Enzymy trawienne i biosurfaktanty mogą być dodawane pojedynczo, sekwencyjnie lub razem. Ta ostatnia opcja musi być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez projekty RTI2018-101309-B-C21 i PID2020-631-116615RAI00, finansowane przez MCIN/AEI/10.13039/501100011033 oraz przez "EFRR Sposób na tworzenie Europy". Prace te były (częściowo) wspierane przez Grupę Fizyki Biokoloidów i Płynów (ref. PAI-FQM115) z Uniwersytetu w Granadzie (Hiszpania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alfa-chymotrypsyna z trzustki bydlęcejSigma-AldrichC4129Enzym
Beta-laktoglobulinaSigma-AldrichL0130Emulgator
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich9048-46-8Emulgator
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Wirówka elektrolitowa
Kronton instrumentyCentrikon T-124Do oddzielania oleju i żywic
Pektyna cytrusowaSigma-AldrichP9135Emulgator
ko-lipaza Z TRZUSTKI ŚWINISigmaC3028Enzym
CONTACTOUniwersytet w Granadzie (UGR)https://core.ugr.es/dinaten/, ostatni dostęp: 18.07.2022
Uniwersytet DINATENw Granadzie (UGR)https://core.ugr.es/dinaten/, ostatni dostęp: 18.07.2022
Lipaza żołądkowaLipolytechRGE15-1GEnzym
Albumina surowicy ludzkiejSigma-Aldrich70024-90-7Emulgator
INFOGESThttp://www.proteomics.ch/IVD/
Lipaza z trzustki świni, typ IISigma-AldrichL33126Enzym
Metakrzemian magnezu żywiceFluka1343-88-0Żywice do oczyszczania oleju
Micro 90Produkty międzynarodoweM-9051-04Środek czyszczący
NaClSigma7647-14-5Elektrolit
NaH2PO4Scharlau10049-21-5Do przygotowania buforu
OCTOPUSProducciones Cientí ficas y Té cnicas S.L. (Gó słoik, Hiszpania)Pendandt Drop Sprzęt zaimplementowany z wielofazową wymianą
Oliwa z oliwekSigma-Aldrich1514Olej
Trzustka z trzustki świniSigmaP7545-25 gEnzym
PepsynaSigma-AldrichP6887Enzym
Pluronic F127SigmaP2443Emulgator
Pluronic F68SigmaP1300Emulgator
Deoksycholan soduSole żółcioweSigma
Glicodeoksycholan soduSigmaC9910Sole żółciowe
Taulocholan soduSigma86339Sole żółciowe
Filtr strzykawkowyMillex-DPSLGP033R  Filtr strzykawkowy 0,22 i mikro; m wielkość porów polieterosulfonu
TrypsynaSigma-AldrichT1426Enzym

Bibliografia

  1. McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
  2. McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
  3. Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
  4. Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301(2021).
  5. Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
  6. Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
  7. Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
  8. Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
  9. Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
  10. Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
  11. Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
  12. del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
  13. Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045(2019).
  14. Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
  15. Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
  16. Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
  17. Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576(2022).
  18. del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
  19. Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
  20. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
  21. Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
  22. del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330(2022).
  23. Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trawienie emulsjisymulacja przewodu pokarmowegometoda pojedynczej kroplinapi cie powierzchniowehamowanie lipolizytechnika wisz cej kroplitrawienie o dkowetrawienie jelitowereologia mi dzyfazowa
Metody in vitro Trawienie emulsji w pojedynczej kropli poprzez wielofazową wymianę symulowanych płynów żołądkowo-jelitowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.