Artykuł metodologiczny

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64166

⸱

14 października 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1EMBL: European Molecular Biology Laboratory, 2Institut Curie, 3Agilent Technologies, 4Genmab BV, 5Collège de France

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Streszczenie

Przestrzenna organizacja genomu przyczynia się do jego funkcji i regulacji w wielu kontekstach, w tym transkrypcji, replikacji, rekombinacji i naprawy. Zrozumienie dokładnego związku przyczynowo-skutkowego między topologią a funkcją genomu ma zatem kluczowe znaczenie i jest coraz częściej przedmiotem intensywnych badań. Technologie wychwytywania konformacji chromosomów (3C) pozwalają na wnioskowanie o strukturze 3D chromatyny poprzez pomiar częstotliwości interakcji między dowolnym regionem genomu. Tutaj opisujemy szybki i prosty protokół do wykonywania Capture Hi-C, metody wzbogacania celów opartej na 3C, która charakteryzuje specyficzną dla alleli organizację 3D celów genomowych o dużych rozmiarach w wysokiej rozdzielczości. W Capture Hi-C regiony docelowe są wychwytywane przez szereg biotynylowanych sond przed sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości. W ten sposób uzyskuje się wyższą rozdzielczość i swoistość alleli przy jednoczesnej poprawie efektywności czasowej i przystępności cenowej technologii. Aby zademonstrować jego mocne strony, protokół Capture Hi-C zastosowano do mysiego centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), głównego miejsca regulatorowego inaktywacji chromosomu X (XCI).

Wprowadzenie

Liniowy genom zawiera wszystkie informacje niezbędne do tego, aby organizm mógł przejść rozwój embrionalny i przetrwać przez całe dorosłe życie. Jednak instruowanie genetycznie identycznych komórek, aby wykonywały różne funkcje, ma fundamentalne znaczenie dla dokładnego kontrolowania, które informacje są używane w określonych kontekstach, w tym w różnych tkankach i/lub etapach rozwoju. Uważa się, że trójwymiarowa organizacja genomu uczestniczy w tej dokładnej czasoprzestrzennej regulacji aktywności genów poprzez ułatwianie lub zapobieganie fizycznej interakcji między elementami regulatorowymi, które mogą być oddzielone przez kilkaset kilozasad w genomie liniowym (dla recenzji1,2,3). W ciągu ostatnich 20 lat nasza wiedza na temat wzajemnych zależności między fałdowaniem genomu a aktywnością gwałtownie wzrosła, głównie dzięki rozwojowi technologii wychwytywania konformacji chromosomów (3C) (dla przeglądu4,5,6,7). Metody te mierzą częstotliwość interakcji między dowolnymi regionami genomu i opierają się na ligacji sekwencji DNA, które znajdują się w bliskiej odległości 3D w jądrze. Najpopularniejsze protokoły 3C rozpoczynają się od utrwalenia populacji komórek za pomocą środka sieciującego, takiego jak formaldehyd. Usieciowana chromatyna jest następnie trawiona enzymem restrykcyjnym, chociaż zastosowano również trawienie MNazą8,9. Po trawieniu wolne końce DNA znajdujące się w bliskiej odległości przestrzennej są ponownie ligowane, a sieciowanie jest odwrócone. Ten krok daje początek "bibliotece" lub "szablonowi" 3C, mieszanej puli fragmentów hybrydowych, w których sekwencje, które znajdowały się w 3D blisko jądra, mają większe szanse na ligację w tym samym fragmencie DNA. Kwantyfikacja tych hybrydowych fragmentów umożliwia wnioskowanie o konformacji 3D regionów genomu, które znajdują się tysiące par zasad w genomie liniowym, ale mogą wchodzić w interakcje w przestrzeni 3D.

Wiele różnych podejść zostało opracowanych do scharakteryzowania biblioteki 3C, różniąc się zarówno pod względem tego, które podzbiory fragmentów ligacji są analizowane, jak i technologii używanej do ich dalszej kwantyfikacji. Oryginalny protokół 3C opierał się na wyborze dwóch regionów zainteresowania i ilościowym określeniu częstotliwości ich interakcji "jeden na jeden" za pomocą PCR10,11. Podejście 4C (wychwytywanie konformacji chromosomu kołowego) mierzy interakcje między pojedynczym locus zainteresowania (tj. "punktem widzenia") a resztą genomu ("jeden kontra wszystko")12,13,14. W 4C biblioteka 3C przechodzi drugą rundę trawienia i ponownej ligacji w celu wygenerowania małych kolistych cząsteczek DNA, które są amplifikowane PCR przez startery specyficzne dla punktu widzenia15. 5C (chromosome conformation capture carbon copy) umożliwia charakteryzację interakcji 3D w większych obszarach zainteresowania, dostarczając wglądu w fałdowanie chromatyny wyższego rzędu w tym regionie ("wiele kontra wiele")16. W 5C biblioteka 3C jest hybrydyzowana do puli oligonukleotydów nakładających się na miejsca restrykcyjne, które mogą być następnie amplifikowane przez multipleksowy PCR z uniwersalnymi starterami15. Zarówno w 4C, jak i 5C, informacyjne fragmenty DNA były początkowo oznaczane ilościowo za pomocą mikromacierzy, a następnie za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS)17,18,19. Strategie te charakteryzują docelowe obszary zainteresowania, ale nie mogą być stosowane do mapowania interakcji w całym genomie. Ten ostatni cel został osiągnięty dzięki Hi-C, wysokoprzepustowej strategii opartej na 3C, w której masowo równoległe sekwencjonowanie matrycy 3C pozwala na bezstronną charakterystykę fałdowania chromatyny na poziomie całego genomu ("wszyscy kontra wszyscy")20. Protokół Hi-C obejmuje włączenie biotynylowanej reszty na końcach strawionych fragmentów, po czym następuje ściąganie fragmentów ligacji za pomocą kulek streptawidyny w celu zwiększenia odzysku podwiązanych fragmentów20.

Hi-C ujawniło, że genomy ssaków są strukturalnie zorganizowane w wielu skalach w jądrze 3D. W skali megapodstawowej genom jest podzielony na regiony aktywnej i nieaktywnej chromatyny, odpowiednio przedziały A i B20,21. Istnienie dalszych podprzedziałów reprezentowanych przez różne stany chromatyny i aktywności zostało również następnie wykazane22. W wyższej rozdzielczości genom jest dalej dzielony na sub-megabazy, samooddziałujące domeny zwane topologicznie asocjującymi domenami (TAD), po raz pierwszy ujawnione przez analizę Hi-C i 5C genomów człowieka i myszy23,24. W przeciwieństwie do przedziałów, które różnią się w sposób specyficzny dla tkanki, TAD mają tendencję do bycia stałymi (chociaż istnieje wiele wyjątków). Co ważne, granice TAD są zachowane we wszystkich gatunkach25. W komórkach ssaków TAD często obejmują geny o tym samym krajobrazie regulacyjnym i wykazano, że reprezentują ramy strukturalne, które ułatwiają koregulację genów, jednocześnie ograniczając interakcje z sąsiednimi domenami regulacyjnymi (dla przeglądu3,26,27,28). Ponadto, w obrębie TAD, interakcje spowodowane miejscami CTCF u podstawy pętli ekstrudowanych kohezyny mogą zwiększać prawdopodobieństwo interakcji promotor-wzmacniacz lub wzmacniacz-wzmacniacz (dla przeglądu29).

W Hi-C, kompartmenty i TADy mogą być wykrywane w rozdzielczości od 1 Mb do 40 kb, ale wyższą rozdzielczość można osiągnąć do scharakteryzowania kontaktów o mniejszej skali, takich jak pętle interakcji między elementami dystalnymi w skali 5-10 kb. Jednak zwiększenie rozdzielczości, aby móc skutecznie wykrywać takie pętle za pomocą HiC, wymaga znacznego zwiększenia głębokości sekwencjonowania, a tym samym kosztów sekwencjonowania. Sytuacja ta nasila się, jeśli analiza musi być specyficzna dla alleli. Rzeczywiście, X-krotny wzrost rozdzielczości wymaga X2-krotnego zwiększenia głębokości sekwencjonowania, co oznacza, że podejścia o wysokiej rozdzielczości i specyficzne dla alleli całego genomu mogą być zbyt drogie30.

Aby poprawić opłacalność i przystępność cenową przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczości, docelowe obszary zainteresowania mogą być fizycznie ściągane z bibliotek 3C lub Hi-C całego genomu po ich hybrydyzacji z komplementarnymi sondami oligonukleotydowymi znakowanymi biotyną przed sekwencjonowaniem dalej. Te strategie wzbogacania celu są określane jako metody Capture-C i umożliwiają badanie interakcji setek docelowych loci rozsianych po całym genomie (tj. Promoter Capture (PC) Hi-C; Przechwytywanie nowej generacji (NG) C; Przechwytywanie niskiego sygnału wejściowego (LI)-C; Wychwytywanie metodą miareczkowania jądrowego (NuTi)-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, lub w regionach obejmujących do kilku megabaz (np. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Tiled-C)41,42,43. Dwa aspekty mogą się różnić w metodach opartych na wychwytywaniu: (1) charakter i konstrukcja biotynylowanych oligonukleotydów (tj. RNA lub DNA, pojedyncze oligonukleotydy wychwytujące rozproszone cele genomowe lub wiele oligonukleotydów układających się w obszar zainteresowania); oraz (2) szablon, który jest używany do ściągania celów, które mogą być biblioteką 3C lub Hi-C, przy czym ta ostatnia składa się z biotynylowanych fragmentów restrykcyjnych pobranych z biblioteki 3C.

Tutaj opisany jest protokół Capture Hi-C oparty na wzbogacaniu kontaktów docelowych z biblioteki 3C. Protokół opiera się na zaprojektowaniu specjalnie dostosowanej macierzy kafelków biotynylowanych sond RNA i może być wykonany w ciągu 1 tygodnia od przygotowania biblioteki 3C do sekwencjonowania NGS. Protokół jest szybki, prosty i pozwala scharakteryzować organizację 3D wyższego rzędu obszarów zainteresowania o rozmiarach megabaz w rozdzielczości 5 kb, jednocześnie poprawiając efektywność czasową i przystępność cenową w porównaniu z innymi metodami 3C. Protokół Capture Hi-C został zastosowany do głównego locus regulatorowego inaktywacji chromosomu X (XCI), centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), w którym znajduje się niekodujący RNA Xist. Xic był wcześniej przedmiotem obszernych analiz strukturalnych i funkcjonalnych (dla review44,45). U ssaków XCI kompensuje dawkę genów sprzężonych z chromosomem X między samicami (XX) i samcami (XY) i obejmuje transkrypcyjne wyciszenie prawie całego jednego z dwóch chromosomów X w komórkach żeńskich. Xic stanowi potężny, złoty standard locus do badań nad topologią genomu 3D i wzajemnym oddziaływaniem z regulacją genów44. Analiza 5C Xic w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC) doprowadziła do odkrycia i nazwania TAD, dostarczając pierwszych informacji na temat funkcjonalnego znaczenia partycjonowania topologicznego i koregulacji genów24. Następnie wykazano, że organizacja topologiczna Xic jest krytycznie zaangażowana w odpowiedni czas rozwoju regulacji w górę Xist i XCI46, a nieoczekiwane elementy cis-regulatorowe, które mogą wpływać na aktywność genów w obrębie i między TAD, zostały również niedawno odkryte w Xic47,48,49. Zastosowanie Capture Hi-C do 3 Mb mysiego chromosomu X obejmującego Xic demonstruje moc tego podejścia w analizie fałdowania chromatyny na dużą skalę w wysokiej rozdzielczości. Zapewniony jest szczegółowy i łatwy do naśladowania protokół, począwszy od zaprojektowania zestawu biotynylowanych sond w każdym miejscu restrykcji DpnII w regionie zainteresowania, po generowanie biblioteki 3C obejmującej cały genom, hybrydyzację i przechwytywanie kontaktów docelowych oraz dalszą analizę danych. Uwzględniono również przegląd odpowiednich kontroli jakości i oczekiwanych wyników, a także omówiono zarówno mocne strony, jak i ograniczenia tego podejścia w świetle podobnych istniejących metod.

Protokół

Mysie embrionalne komórki macierzyste (mESC) użyte w tym badaniu pochodziły ze skrzyżowania TX/TX R26rtTA/rtTA samicy50 z samcem Mus musculus castaneus zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Instytutu Curie (Paryż)51.

1. Konstrukcja sondy

  1. Zaprojektuj szereg biotynylowanych sond (120-merowych oligonukleotydów RNA) pokrywających docelowy obszar zainteresowania.
    1. Ułóż obszar zainteresowania nakładającymi się oligonukleotydami tak, aby średnio każda sekwencja w obrębie celu była pokryta dwiema unikalnymi sondami (2x pokrycie) (Rysunek 1).
    2. Wyklucz powtarzające się sekwencje z pokrycia sondy, aby uniknąć wzbogacania niespecyficznych interakcji.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować wzbogacenie informacyjnych fragmentów ligacji, zdefiniowano regiony obejmujące 300 pz w górę i w dół każdego miejsca restrykcji DpnII w poprzek celu (ChrX: 102 475 000-105 475 000), a 28 913 biotynylowanych sond zaprojektowano zgodnie z technologią wzbogacania celu DNA SureSelect za pośrednictwem platformy Sure Design52. Zgodnie z tą strategią, w każdym oligonukleotydzie dozwolonych jest maksymalnie 40 zasad powtarzających się sekwencji, aby zminimalizować wzbogacenie oddziaływań niespecyficznych. Układ sond został zsyntetyzowany przez firmę Agilent. W tym przypadku DpnII jest używany jako enzym restrykcyjny z dwóch powodów: (1) jest to czterocylindrowy enzym rutynowo stosowany w kilku metodach opartych na 3C53; oraz (2) maksymalizuje szanse na wychwycenie informacyjnych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w pobliżu miejsc cięcia w porównaniu z innymi enzymami restrykcyjnymi, które zostały przetestowane in silico w liniach hybrydowych F1 użytych w tym badaniu (C57BL / 6J x CASTEi / J).

2. Procedura eksperymentalna

  1. Przygotowanie komórek
    1. Wysiewać odpowiednią liczbę komórek na jednej lub wielu płytkach do hodowli komórkowych, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek ≥ 5 x 107 komórek w dniu utrwalenia.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC). mESC są siane na żelatynizowanych (0,1% żelatyny w 1x PBS - o/n w 37 °C, 5% inkubatorze CO2) płytkach do hodowli komórkowych w pożywce mESC zawierającej 2i + LIF i testowanej partiami płodowej surowicy cielęcej (DMEM, 15% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 1,000 czynnika hamującego białaczkę (LIF) U/mL−1, CHIR99021 (3 μM) i PD0325901 (1 μM)). W przypadku tego typu komórek jedna 80% zlewająca się płytka o średnicy 10 cm zawiera około 2 x 107 komórek.
    2. Przygotować jedną dodatkową płytkę do hodowli komórkowej do zliczania komórek.
      UWAGA: W celu zmniejszenia zużycia pożywki można użyć mniejszej płytki do hodowli komórkowej. W takim przypadku należy odpowiednio dostosować liczbę komórek do wysiewu na mniejszej płytce (np. 3 razy mniej komórek na talerzu 10 cm w porównaniu do talerza 15 cm).
  2. Utrwalanie formaldehydu
    1. Oszacuj całkowitą liczbę komórek, które mają być usieciowane.
      1. Przed rozpoczęciem reakcji sieciowania należy dokonać trypsynizacji i zliczenia komórek z płytki kontrolnej przygotowanej specjalnie do zliczania komórek za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Uwzględnij barwienie żywotności (np. błękit trypanowy), aby określić procent żywotnych komórek54. Na podstawie tej liczby komórek oszacuj całkowitą liczbę komórek w płytce (płytkach) przygotowanych do sieciowania.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytek przygotowanych do sieciowania i zastąpić ją odpowiednią ilością roztworu utrwalającego (2% formaldehydu w pożywce do hodowli komórkowych). Użyj 10 ml na talerzu 10 cm (np. ~20 ml na talerzu 15 cm).
      UWAGA: Dodać dokładną objętość roztworu utrwalającego. Jeśli utrwalenie przylegających komórek nie jest możliwe, krok ten można dostosować do komórek trypsynizowanych i wykonać w 30 ml roztworu utrwalającego w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Formaldehyd nie może mieć więcej niż 1 rok. Zaleca się stosowanie fiolek jednorazowego użytku. Przed użyciem roztwór utrwalający musi być doprowadzony do temperatury pokojowej (RT).
      UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić zgodnie z odpowiednimi przepisami BHP.
    3. Utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem na shakerze.
    4. Ugasić reakcję utrwalania przez dodanie 2,5 M glicyny-1x PBS do końcowego stężenia 0,125 M. Dodać 530 μL 2,5 M glicyny-1x PBS do 10 ml na 10 cm płytce (np. 1060 μl do 20 ml na 15 cm płytce).
      UWAGA: Jeśli komórki zostały utrwalone w roztworze, wygasić reakcję utrwalania 1590 μl 2,5 M glicyny-1x PBS.
    5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze.
    6. Przenieś płytki do lodu i inkubuj przez dodatkowe 15 minut na lodzie, delikatnie mieszając na shakerze.
      UWAGA: Od teraz ogniwa muszą być trzymane na lodzie, a muszą być wstępnie schłodzone, aby uniknąć dalszego sieciowania. Przenieś się do chłodni, jeśli trzeba przetworzyć wiele talerzy.
    7. Usunąć roztwór utrwalający z komórek, przelewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę.
      UWAGA: Należy pamiętać o utylizacji odpadów płynnych zawierających formaldehyd zgodnie z odpowiednimi przepisami BHP.
    8. Szybko opłucz 10-centymetrową płytkę dwa razy 5 ml zimnej 0,125 M glicyny-1x PBS (8 ml na płytkę 15 cm), aby zmyć zanieczyszczenia i martwe komórki. Usuń płyn z płytki, wlewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę.
    9. Dodaj 5 ml zimnej 0,125 M glicyny-1x PBS do płytki 10 cm (10 ml na płytkę 15 cm) i szybko zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka do komórek.
    10. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej.
    11. Przepłukać płytkę dwukrotnie 5 ml zimnej 0,125 M glicyny-1x PBS i dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej.
    12. Wirować z prędkością 480 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli komórki zostały utrwalone w roztworze, przenieść komórkę do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej i wirować w dół przy 480 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór utrwalający, wlewając go do zlewki i przemyć trzykrotnie w 10 ml zimnej 0,125 M glicyny-1x PBS. Pamiętaj, aby ponownie zawiesić komórki na każdym etapie prania.
    13. Usunąć supernatant przez zasysanie za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji. Zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS na 1 x10 7 komórek, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Aby ponownie zawiesić komórki w dokładnej objętości, należy zapoznać się z oszacowaniem całkowitej liczby komórek uzyskanym w ppkt 2.2.1.
    14. Podzielić 500 μl zawiesiny komórek na obliczoną liczbę 1,5 ml probówek do mikrowirówek (1 x 107 komórek/probówkę).
    15. Wirować przy 480 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    16. Usunąć supernatant za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji i zatrzaskowo zamrozić granulki komórek w ciekłym azocie. Przechowywać granulki suchych komórek w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez co najmniej 1 rok.
  3. Liza komórek
    1. Rozmrozić zamrożone granulki na lodzie.
    2. Przygotować 1,5 ml buforu do lizy w H20 na próbkę: dodać 10 mM Tris-HCl o pH 8,0, 10 mM NaCl i 0,2% NP40.
    3. Dodać 600 μl buforu do lizy na zimno i dobrze zawiesić na lodzie.
    4. Inkubować na lodzie przez 15 minut, aby komórki pęczniały.
    5. Wirować w temperaturze 2655 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji.
    6. W celu usunięcia zanieczyszczeń należy ponownie zawiesić osad w 1 ml zimnego buforu do lizy, odwirować w temperaturze 2655 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    7. Ponownie krótko odwirować w temperaturze 2655 x g i temperaturze 4 °C i usunąć jak najwięcej pozostałego supernatantu za pomocą stołowego systemu aspiracji wyposażonego w końcówkę P200.
    8. Zawiesić w 100 μl 0,5% (vol/vol) SDS.
    9. Inkubować w termomikserze w temperaturze 62 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut.
    10. Dodać 290 μLH2O+ 50 μL 10% TritonX-100 i dobrze wymieszać, unikając pęcherzyków powietrza.
    11. Inkubować w termomikserze w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez 15 minut.
    12. Dodać 50 μl 10x buforu Dpnll i odwrócić probówkę do wymieszania.
    13. Weź 50 μl niestrawionego DNA do kontroli jakości do osobnej probówki. Nie należy zapominać o pobraniu niestrawionej próbki kontrolnej.
  4. Trawienie DpnII
    1. Dodać 10 μl Dpnll o wysokim stężeniu (łącznie 500 U) i wymieszać przez odwrócenie.
    2. Próbki i niestrawioną kontrolę inkubować w termomieszaczu w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez >4 godziny.
    3. Na koniec dnia dodać 10 μl Dpnll o wysokim stężeniu (łącznie 500 U).
    4. Inkubować próbki i niestrawioną kontrolę w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez noc.
    5. Dodać do próbek 10 μl Dpnll o wysokim stężeniu (łącznie 500 U) na początku następnego dnia.
    6. Inkubować próbki i niestrawioną kontrolę w termomieszaczu w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez 4 godziny.
  5. Podwiązanie i odwrócenie sieciowania
    1. Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez 20 minut przy 1400 obr./min.
      UWAGA: Nie dodawaj SDS w tym momencie. Chodzi o to, aby zachować integralność jądrową, więc ligacja odbywa się wewnątrz jąder, omijając potrzebę ekstremalnego rozcieńczania.
    2. Próbki schładzać na lodzie maksymalnie przez 5-10 minut. Aby uniknąć wytrącania się SDS, nie należy pozostawiać próbek na lodzie dłużej.
    3. Pobrać 50 μl nieligowanego, strawionego DNA do kontroli jakości w osobnej probówce. Przechowywać niestrawione i niezligowane kontrole w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Nie należy zapominać o pobraniu nieligowanej próbki kontrolnej.
    4. Dodać 800 μl koktajlu ligacyjnego: 122 μl 10x buforu ligazy, 8 μl ligazy T4 (30 U/μL) i 670 μL H20.
    5. Inkubować w temperaturze 16 °C, wirując z prędkością 1000 obr./min przez noc.
    6. Dodać 7,5 μl proteinazy K (20 mg/ml) do próbek i 2 μl do kontroli.
    7. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 4 godziny przy 1000 obr./min.
  6. Oczyszczanie DNA
    1. Przenieść próbki na lodzie do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i dodać 2 ml wody, 10,5 ml lodowatego EtOH i 583 μl 3 M NaAC.
      UWAGA: Dodatkowa woda ma na celu zapobieżenie przedostawaniu się naziemnej telewizji cyfrowej do granulatu.
    2. Dodać 200 μl lodowatego EtOH, 10,8 μl NaAC i 1 μl miedziacytantu do niestrawionych i nieligowanych kontroli jakości.
    3. Inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny, aż do nocy.
    4. Wirować probówki o pojemności 15 ml w temperaturze 2200 x g w temperaturze 4 °C przez 45 minut.
    5. Obracać probówki kontrolne o pojemności 1,5 ml w temperaturze 20 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    6. Przemyć raz 3 ml (próbki) i 1 ml (kontrole) lodowatego 70% EtOH.
    7. Wirować w temperaturze 2200 x g (próbki) lub 20 500 x g (kontrole) w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    8. Ostrożnie usunąć EtOH i suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut; nie przesuszać.
    9. Zawiesić próbki i próby kontrolne odpowiednio w 100 μl i 20 μl H20.
    10. Dodać 1 μl RNAseA i inkubować w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością 1400 obr./min przez 30 minut.
  7. Kontrola jakości przygotowania szablonu 3C
    1. Określ ilościowo każdą próbkę i kontrolę za pomocą zestawu fluorometru do pomiarów stężenia DNA o wysokiej czułości.
    2. Załadować 100-200 ng każdej próbki i każdej kontroli na 1% agarozy/1x żel TBE.
    3. Sprawdź, czy obraz żelu pokazuje oczekiwany wynik, porównując różnice w rozmiarach fragmentów DNA kontrolnych i matrycy 3C, jak pokazano na Rysunek 2A.
    4. Przechowywać próbki i kontrole w temperaturze -20 °C.
  8. Hybrydyzacja, przechwytywanie i przetwarzanie próbek do sekwencjonowania multipleksowego
    1. Aby zhybrydyzować układ biotynylowanych sond RNA z matrycą 3C, przechwyć docelowe fragmenty ligacji i przygotuj próbki do sekwencjonowania multipleksowanego zgodnie z docelowym systemem wzbogacania zastosowanym w tym badaniu do sekwencjonowania multipleksowanego na sparowanych końcach (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem zgodnie z instrukcjami producenta, wprowadzając następujące drobne modyfikacje:
      1. Sekcja 2 protokołu producenta: Przygotowanie próbki
        1. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wzbogacania celu, zaczynając od 3 μg danych wejściowych gDNA.
        2. Ścinaj DNA w sonikatorze przy użyciu następujących specyfikacji: 10% cykl pracy, intensywność 4, 200 cykli/burst i 130 s. Zacznij od 4 μg matrycy 3C zawieszonej w 130 μl wody dla każdej reakcji wychwytywania, aby zapewnić wystarczającą ilość materiału do kontynuowania przygotowania próbki z 3 μg ściętego DNA.
        3. Oceń jakość ściętego DNA. Uruchom 1 μl ściętego DNA na bioanalizatorze DNA zgodnie z protokołem wysokiej czułości. Spodziewaj się rozkładu wielkości fragmentu między 150-700 pz (Rysunek 2).
        4. Oczyścić próbkę za pomocą kulek odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI). Dodać 124 μl kulek SPRI do 124 μl próbki DNA, aby dokonać selekcji wielkości lewej strony 1:1 zgodnie z instrukcjami producenta i eluować w 25 μl wody wolnej od nukleaz. Ten etap oczyszczania usunie krótsze fragmenty, aby wzbogacić fragmenty o objętości około 300 pz (Rysunek 2).
          UWAGA: Ilość próbek i kulek SPRI użytych na tym etapie uwzględnia utratę objętości, która nastąpiła podczas przenoszenia próbek do nowych probówek i przeprowadzania kontroli jakości w bioanalizatorze. Wszystkie kolejne kroki doboru rozmiaru są wykonywane zgodnie ze stosunkami zalecanymi w protokole producenta. Elucja DNA z kulek SPRI jest przeprowadzana w RT przez cały czas trwania protokołu.
        5. Oceń jakość ściętego DNA o wybranej wielkości. Uruchom 1 μl ściętego DNA na bioanalizatorze DNA zgodnie z protokołem wysokiej czułości (HS). Spodziewaj się rozkładu rozmiarów fragmentów o najwyższym wzbogaceniu przy 300 pz (Rysunek 2). Kontynuuj kwantyfikację ściętego DNA, jeśli ścinanie się powiodło.
        6. Określ ilościowo ścięte DNA za pomocą zestawu fluorometru do pomiarów stężenia HS DNA.
          UWAGA: Jeśli ścinanie DNA daje wydajność DNA <3 μg, wykonaj drugą rundę ścinania DNA z kolejnymi 4 μg DNA i połącz ścięte próbki DNA po pierwszym etapie oczyszczania kulek SPRI, aby uzyskać łącznie 3 μg ściętego DNA.
        7. Dodać wodę wolną od nukleaz do wybranej wielkości oczyszczonej próbki DNA (łącznie 3 μg) do końcowej objętości 48 μl i postępować z końcową reakcją naprawy zgodnie z protokołem producenta.
        8. Po ligacji adapterów z sparowanymi końcami należy wzmocnić bibliotekę, wykonując pięć cykli PCR przed wychwytywaniem zgodnie z instrukcjami producenta (warunki PCR i startery są podane w zestawie).
      2. Sekcja 4 protokołu producenta: Hybrydyzacja i wychwytywanie
        1. Aby zhybrydyzować przygotowane próbki DNA z docelowymi sondami RNA, należy rozcieńczyć 750 ng próbek DNA w końcowej objętości 3,4 μl, co daje początkowe stężenie 221 ng / μl. W przypadku próbek DNA rozcieńczonych w większych objętościach należy użyć koncentratora szybkoobrotowo-próżniowego, aby zredukować do końcowej objętości. Stężenie prędkościowo-próżniowe (250 x g; ≤45 °C) przez 15-20 minut jest zwykle wystarczające dla próbek zawieszonych w 10 μl. Upewnij się, że masz taką samą objętość wejściową dla każdej próbki przed uruchomieniem koncentratora próżni o prędkości obrotowej.
        2. Mieszaninę hybrydyzacyjną inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze 65 °C pod pokrywką podgrzewaną w temperaturze 105 °C zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Sekcja 5 protokołu producenta: Indeksowanie i przetwarzanie próbek do sekwencjonowania multipleksowego
        1. Aby amplifikować przechwycone biblioteki za pomocą starterów indeksujących, należy wykonać 12 cykli PCR po przechwyceniu zgodnie z instrukcjami producenta (warunki do PCR i starterów są podane w zestawie).
  9. Sekwencjonowanie nowej generacji
    1. Aby uruchomić wiele bibliotek przechwytywania Hi-C w tej samej komórce przepływowej, przygotuj równomolową mieszaninę bibliotek przechwytywania i sekwencję 100-120 mln odczytów na bibliotekę.
    2. Jeśli potrzebna jest analiza specyficzna dla alleli, należy sekwencjonować 150 pz sparowanym końcem, aby zapewnić wystarczające pokrycie SNP.

3. Analiza danych

  1. Zastosuj potok HiC-Pro, aby przeprowadzić analizę danych Capture Hi-C55. HiC-Pro zapewnia kontrolę jakości na każdym etapie przetwarzania, w tym (Rysunek 3):
    orazSzybkość dopasowania w genomie referencyjnym określająca frakcję odczytów obejmujących miejsce ligacji, a także liczbę par i singletonów.
    orazFrakcja prawidłowych produktów ligacji i nieinformacyjnych par odczytu (zwisający-koniec, samoligaturacja itp.
    orazOdsetek kontaktów krótkiego/dalekiego zasięgu i wewnątrz/międzychromosomowych.
    orazOdsetek kontaktów namierzonych w celu dla Capture Hi-C.
    (v)Frakcja odczytów specyficznych dla alleli, jeśli jest określona.
    UWAGA: HiC-Pro obsługuje szeroką gamę protokołów, w tym in situ Hi-C i Capture Hi-C. W tym drugim przypadku użytkownik musi po prostu określić region docelowy (format BED) w pliku konfiguracyjnym. Po przetworzeniu danych, wyjścia HiC-Pro można łatwo przekształcić w chłodniejszy obiekt do dalszej analizy56. Na tym etapie mapy kontaktów w różnych rozdzielczościach są normalizowane przy użyciu metody ICE opisanej wcześniej przez Imakaeva i współpracowników57. Następnie można przeprowadzić kilka analiz w celu wywołania przedziałów chromosomowych, TAD lub pętli chromatyny (dla review58). Przebieg pracy protokołu jest pokazany w Rysunek 4. W tym przypadku pakiet "cooltools" jest stosowany do obliczania wyniku izolacji i granic TADs, jak pokazano w Rysunek 5 i Rysunek 659.

Wyniki

Opisany protokół Capture Hi-C opiera się na przygotowaniu matrycy 3C w skali całego genomu z wykorzystaniem enzymu tnącego co cztery zasady (DpnII). Następnie wzbogacenie fragmentów ligacji w obrębie interesującego regionu genomowego uzyskuje się poprzez hybrydyzację zestawu płytek sondujących RNA (tiling RNA probes) i ich wychwyt z użyciem streptawidyny, zgodnie z systemem wzbogacania celowanego zastosowanym w niniejszym badaniu (Rysunek 1). Wybrano biotynilowane sondy RNA, ponieważ wykazują one silniejsze powinowactwo wiązania do swoich celów w porównaniu z sondami DNA52,60Przechwycone biblioteki są następnie indeksowane i łączone w celu przeprowadzenia multipleksowego sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Dane Capture Hi-C mogą być wizualizowane jako wysokorozdzielcze mapy oddziaływań Hi-C, ale także jako mapy kontaktów z pojedynczym punktem widzenia (typu 4C), aby specyficznie zobrazować oddziaływania mniejszych sekwencji, takich jak promotory lub wzmacniacze, w obrębie całego przechwyconego regionu. Schemat procedury przedstawiono w Rycina 4Kontrolę jakości przed sekwencjonowaniem przedstawiono w Rycina 2 oraz obejmuje ocenę prawidłowego trawienia i religacji matrycy 3C oraz jej efektywnego ścinania i oczyszczania na poszczególnych etapach protokołu. Oczekuje się, że ścinane DNA matrycy 3C będzie migrować w zakresie od 150 do 700 bp i nie wystąpi wzbogacenie fragmentów >Należy wykryć fragment o wielkości 2 kb. W kolejnych etapach przeprowadza się kilka procedur oczyszczania DNA i selekcji wielkości z użyciem kulek magnetycznych — najpierw po fragmentacji, a następnie po reakcjach PCR przed i po wzbogaceniu (pre-capture i post-capture). Oczyszczone biblioteki wykazują wyraźny profil wzbogacenia fragmentów, co można zwizualizować za pomocą bioanalizatora DNA o wysokiej czułości (Rycina 2). Średnia wielkość fragmentów zwiększa się w trakcie przygotowywania biblioteki na skutek ligacji adapterów, primerów sekwencyjnych i indeksujących. Po sekwencjonowaniu przeprowadzono kontrolę jakości poprzez Hi-C Pro oraz przedstawiono w Rycina 3Zaproponowano wiele różnych aplikacji bioinformatycznych do przetwarzania i analizy danych typu 3C. Wśród nich rurociąg HiC-Pro jest jednym z najpopularniejszych rozwiązań, umożliwiającym przetwarzanie surowych danych sekwencjonowania aż do końcowych map kontaktów w różnych rozdzielczościach.55HiC-Pro wykorzystuje dwuetapową strategię mapowania do dopasowania odczytów sekwencjonowania do genomu referencyjnego. Następnie produkty 3C są rekonstruowane i filtrowane w celu usunięcia nieinformacyjnych par kontaktów oraz wygenerowania map kontaktów. Ponadto narzędzie to umożliwia wykorzystanie listy znanych polimorfizmów do przeprowadzenia analizy allelocentrycznej i rozdzielenia kontaktów pochodzących od dwóch alleli rodzicielskich na osobne mapy kontaktów. Niedawno HiC-Pro został włączony i rozszerzony w ramach struktury nf-core (nf-core-hic), zapewniając wysoce skalowalny i powtarzalny potok analiz tworzony przez społeczność.61,62.

Aby uchwycić mysie Xic, zaprojektowano zestaw 28 913 sond RNA pokrywających 3 Mb chromosomu X. Obszar ten obejmuje kluczowy element procesu XCI, długi niekodujący gen Xist oraz jego znany obszar regulacyjny o wielkości ~800 kb (Rysunek 5). Ten region o wielkości ~800 kb jest podzielony na dwie domeny TAD: jedną zawierającą promotor Xist oraz jego znane pozytywne regulatory (tj. niekodujące transkrypty Ftx, Jpx i Xert oraz gen kodujący białko Rnf12) oraz sąsiednią domenę TAD obejmującą negatywne regulatory cis Xist (tj. jego transkrypt antysensowny Tsix, element wzmacniający Xite oraz niekodujący transkrypt Linx) (przegląd literatury44,45).

Zastosowanie opisanego protokołu Capture Hi-C do Xic pozwoliło na uzyskanie organizacji topologicznej tego locus z niespotykaną dotąd rozdzielczością (Rysunek 6 oraz Rysunek 7). Jest to szczególnie widoczne przy porównaniu profilu Capture Hi-C z wcześniej opublikowanymi profilami 5C47 (Rysunek 6 oraz Rysunek 7; Tabela uzupełniająca 1) oraz Hi-C61 (Rysunek 6 oraz Rysunek 7; Tabela uzupełniająca 1). Na przykład struktury sub-TAD są bardziej wyraźne — TAD zawierający promotor Xist (Xist-TAD) jest wyraźnie podzielony na dwie mniejsze domeny (Rysunek 6A, niebieska strzałka). Wcześniej można było to jedynie wizualnie „przypuszczać” na podstawie profilu 5C (Rysunek 6B), mimo wykrycia granicy w tym regionie za pomocą algorytmu insulation score. Podobnie rozdzielczość profilu Capture Hi-C pozwala na identyfikację dwóch mniejszych domen w sąsiednim TAD (Rysunek 6A, B), który zawiera promotor locus Tsix (Tsix-TAD); nie udało się tego wcześniej osiągnąć za pomocą 5C (Rysunek 6B). Warto zauważyć, że granice topologiczne wyznaczone przez insulation score z danych Capture Hi-C i 5C są zazwyczaj wykrywane w nieco innych lokalizacjach i z różną siłą względną.

Co więcej, z danych Capture Hi-C wyraźnie widoczne są inne struktury sub-TAD, takie jak pętle kontaktowe, na przykład pętla między Xist a Ftx (Rysunek 7A), zidentyfikowana wcześniej metodą Capture-C63, oraz pętla między Xist a Xert (Rysunek 7B), niedawno zidentyfikowana przy użyciu podobnego protokołu Capture Hi-C48. Dzięki zwiększonej rozdzielczości profili Capture Hi-C można również dokładniej zmapować inne kontakty, takie jak te tworzące znane punkty zapalne (hotspots) kontaktów w obrębie Tsix-TAD pomiędzy locusami Linx, Chic1 i Xite (Rysunek 7A).

W porównaniu z danymi Hi-C przedstawionymi na Rysunku 7, metoda Capture Hi-C pozwoliła na czterokrotny wzrost rozdzielczości, wymagając jednocześnie jedynie jednej czwartej głębokości sekwencjonowania (tj. 126 M odczytów w porównaniu do 571 M) (Tabela uzupełniająca 1). Ten wzrost rozdzielczości umożliwia wykrycie subTAD-ów oraz interakcji pętlowych, których nie można było wykryć za pomocą Hi-C przy głębokości sekwencjonowania przedstawionej na Rysunku 6 oraz Rysunku 7. Opisany protokół Capture Hi-C pozwala zatem na znacznie bardziej szczególną charakterystykę o wysokiej rozdzielczości dużego, interesującego regionu genomowego w porównaniu do poprzednich podejść.

Schemat mapowania chromosomowego; miejsce restrykcyjne DpnII; sondy genowe; analiza sekwencji; szczegóły ChrX.
Rysunek 1: Projektowanie sond. Schematyczna reprezentacja strategii wykorzystanej do projektowania sond. Wybrano regiony o długości 300 bp powyżej i poniżej każdego miejsca restrykcyjnego DpnII w obrębie 3 Mb docelowego obszaru, które następnie pokryto nakładającymi się biotynowanymi sondami RNA. Przedstawiono jeden z tych wybranych regionów, chrX: 102,474,805-102,475,500. W każdej sondzie dopuszczono maksymalnie 40 zasad sekwencji repetytywnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Żel elektroforetyczny z rozdziałem fragmentów DNA; wykresy fluorescencji dla analizy biblioteki 3C.
Rycina 2: Kontrole jakości przed sekwencjonowaniem w metodzie Capture Hi-C. (A) Reprezentatywny przykład kontroli jakości matrycy 3C. Na 1% żel agarozowy naniesiono 200 ng DNA. Ścieżka 1: drabinka 1 kb. Ścieżka 2: Niestrawiona, sieciowana i nienaruszona chromatyna przebiega jako ostry prążek przy >10 kb. Ścieżka 3: Sieciowana chromatyna trawiona enzymem DpnII przebiega jako rozmycie (smear) o rozmiarze od 1 kb do 3 kb. Ścieżka 4: Końcowa biblioteka lub matryca 3C; wolne końce strawionych, sieciowanych fragmentów DNA zostały religowane. Rozmycie DNA o niższej masie cząsteczkowej jest prawie niewykrywalne, a produkt ligacji jest wykrywany jako prążek >10 kb. (B) Reprezentatywne przykłady profili DNA z bioanalizatora o wysokiej czułości. Górna lewa część: pomyślnie pofragmentowana biblioteka 3C wykazująca rozkład rozmiaru fragmentów między 150 bp a 700 bp. Górna prawa część: niezadowalająca pofragmentowana biblioteka 3C. Niepofragmentowane DNA jest wykrywane jako szerokie wzbogacenie fragmentów >2 kb. (C) Dolna lewa część: próbka pofragmentowanego DNA po selekcji rozmiaru strony lewej w stosunku 1:1 przy użyciu kulek SPRI. Wzbogacone są fragmenty o rozmiarze ~300 bp. Dolna środkowa część: profil PCR przed przechwytywaniem po ligacji adapterów do końców parzystych zgodnie z protokołem producenta. Dolna prawa część: końcowa biblioteka Capture Hi-C zawierająca adaptery, primery do sekwencjonowania i indeksowania dla sekwencjonowania multipleksowego. Skróty: bp = pary zasad, FU = dowolna jednostka fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy statystycznej HiC-Pro; mapowanie, parowanie, filtrowanie, dane dotyczące kontaktów, alleli i wychwytu.
Rycina 3: Kontrola jakości po sekwencjonowaniu Capture Hi-C z wykorzystaniem HiC-Pro. (A) Przykład współczynnika mapowania w genomie referencyjnym dla pierwszego odczytu z par sekwencjonowania. Jasnoniebieska frakcja reprezentuje odczyty wyrównane przez HiC-Pro obejmujące miejsce ligacji. Metryka ta może zatem służyć do walidacji eksperymentalnego etapu ligacji. (B) Po wyrównaniu par sekwencjonowania w genomie, do analizy zachowywane są tylko jednoznacznie wyrównane pary odczytów. (C) Pary nieważne (na czerwono), takie jak wolne końce (dangling-end), samokolizje (self-circle) lub religacje, są odrzucane z analizy. Frakcja par ważnych jest dobrym wskaźnikiem wydajności ligacji i pull-down. (D) Pary ważne mogą być dalej podzielone na kontakty wewnątrz- i międzychromosomalne oraz krótkie i długie zasięgi. Zduplikowane pary odczytów, które prawdopodobnie reprezentują artefakty PCR, są odrzucane z analizy. (E) W analizie specyficznej dla alleli HiC-Pro raportuje liczbę odczytów allelicznych wspieranych przez jeden lub dwa odczyty z pary dla każdego genomu rodzicielskiego (tj. C57BL/6J x CASTEi/J). Oczekuje się podobnej frakcji odczytów przypisanych do allela matczynego i ojcowskiego. (F) Na koniec, do budowy map kontaktów wybierane są tylko ważne pary nakładające się na region wychwytu. Pary typu capture-capture reprezentują kontakty w obrębie regionu docelowego, natomiast pary capture-reporter obejmują interakcje między regionem docelowym a regionem poza docelowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat workflowu przechwytywania konformacji chromatyny: sieciowanie, trawienie DpnII, sekwencjonowanie, analiza.
Rysunek 4: Workflow protokołu Capture Hi-C. Schematyczne przedstawienie poszczególnych etapów protokołu. W celu wytworzenia matrycy 3C dla całego genomu, chromatynę najpierw sieciuje się formaldehydem, a następnie trawi enzymem restrykcyjnym DpnII. Wolne końce DNA są następnie religowane, sieciowanie jest odwracane, a DNA oczyszczane. Aby wzbogacić fragmenty obejmujące region docelowy, zestaw biotynylowanych sond RNA jest hybrydyzowany z matrycą 3C i przechwytywany za pomocą pull-down z udziałem streptawidyny. Biblioteki Capture są przetwarzane w celu sekwencjonowania multipleksowego, a prawidłowe fragmenty ligacji są kwantyfikowane, aby wywnioskować częstotliwość kontaktów chromatyny w obrębie celu, co jest wizualizowane w postaci map interakcji o wysokiej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat chromosomu X myszy; geny i lokalizacje; od centromeru do telomeru; mapowanie genetyczne.
Rysunek 5: Przegląd regionu obejmującego Xic na chromosomie X myszy. Schematyczne przedstawienie chromosomu X myszy oraz powiększenie uchwyconego regionu o wielkości 3 Mb (ChrX: 102 475 000-105 475 000). Region docelowy obejmuje ok. 800 kb DNA odpowiadających Xic, głównemu locus regulacyjnemu XCI. Xic zawiera długie niekodujące geny, w tym Xist, kluczowy element XCI, oraz jego krajobraz regulacyjny. Pozytywne regulatory Xist zaznaczono na zielono, a negatywne regulatory na fioletowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wychwytywanie chromatyny: Hi-C, 5C, schematy oddziaływań genomowych, siła granicy, wskaźnik izolacji.
Rysunek 6: Mapy oddziaływań Capture Hi-C, 5C i Hi-C w obrębie wychwyconego regionu o wielkości 3 Mb. (A) Mapa oddziaływań Capture Hi-C celu o wielkości 3 Mb obejmującego mysi region Xic przy rozdzielczości 10 kb (niniejsze badanie). (B) Mapa oddziaływań 5C tego samego regionu celu co w A przy rozdzielczości 6 kb (dane przetworzone ponownie z47). Regiony powtarzalne, niewłączone do analiz, są zamaskowane kolorem białym. Dane 5C wymagają oddzielnego przetwarzania bioinformatycznego (patrz47). Po oczyszczeniu i dopasowaniu, mapy 5C w rozdzielczości starterów są grupowane za pomocą ruchomej mediany (okno = 30 kb, krok = 5), aby uzyskać końcową rozdzielczość 6 kb. (C) Mapa oddziaływań Hi-C tego samego regionu genomowego co w A i B przy rozdzielczości 40 kb (dane przetworzone ponownie z64). Wszystkie mapy oddziaływań zostały wygenerowane z mysich komórek ESC. Wskaźnik izolacji obliczono za pomocą cooltools i przedstawiono w formie histogramów z minimami izolacji na granicach TAD. Granice TAD są przedstawione jako linie pionowe poniżej mapy. Wysokość każdej linii wskazuje siłę granicy. Geny są przedstawione jako strzałki wskazujące kierunek transkrypcji. Granice sub-TAD, które są wykrywane wyłącznie lub dokładniej na mapach Capture Hi-C, są oznaczone purpurowymi i niebieskimi grotami strzałek odpowiednio dla sub-TAD w obrębie TAD-ów Tsix i Xist. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapy ciepła interakcji chromatyny; Capture Hi-C, 5C, schemat; siła granicy, wynik izolacji.
Rycina 7: Mapy interakcji Capture Hi-C, 5C i Hi-C na odcinku 1 Mb w obrębie uchwyconego regionu. (A) Mapa interakcji Capture Hi-C regionu genomowego 1 Mb obejmującego mysie Xic przy rozdzielczości 5 kb (niniejsze badanie). (B) Mapa interakcji 5C tego samego regionu genomowego co w A przy rozdzielczości 6 kb (dane przetworzone ponownie z47). Regiony powtarzalne, niewłączone do analiz, są zamaskowane kolorem białym. Należy zauważyć, że dane 5C wymagają oddzielnego przetwarzania bioinformatycznego (patrz47). Po czyszczeniu i dopasowaniu, mapy 5C w rozdzielczości starterów są grupowane za pomocą ruchomej mediany (okno = 30 kb, krok = 5), aby osiągnąć końcową rozdzielczość 6 kb. (C) Mapa interakcji Hi-C tego samego regionu genomowego co w A i B przy rozdzielczości 20 kb (dane przetworzone ponownie z64). Wszystkie mapy interakcji zostały wygenerowane z mESCs. Wynik izolacji został obliczony przy użyciu cooltools i jest przedstawiony w formie histogramów z minimami izolacji na granicach TAD. Granice TAD są pokazane jako linie pionowe pod mapą. Wysokość każdej linii wskazuje siłę granicy. Geny są przedstawione jako strzałki wskazujące kierunek transkrypcji. Pętle kontaktowe, które zostały wykryte wyłącznie lub dokładniej w Capture Hi-C, są oznaczone magenta i niebieskimi gwiazdkami odpowiednio dla pętli w TAD-ach Tsix i Xist. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Tabela uzupełniająca 1: Statystyki po sekwencjonowaniu dla zbiorów danych użytych w niniejszym manuskrypcie: Capture Hi-C (niniejsza praca), Hi-C64 oraz 5C47. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy stosunkowo szybki i łatwy protokół Capture Hi-C, aby scharakteryzować organizację wyższego rzędu regionów genomowych o rozmiarach megabaz w rozdzielczości 5-10 kb. Capture Hi-C należy do rodziny technologii Capture-C, które mają na celu wzbogacenie docelowych interakcji chromatyny z matryc 3C lub Hi-C w całym genomie. Do tej pory zdecydowana większość aplikacji Capture-C została wykorzystana do mapowania kontaktów chromatyny stosunkowo małych elementów regulatorowych rozsianych po całym genomie. W pierwszym protokole Capture-C użyto wielu nakładających się na siebie sond biotynylowanych RNA do wychwycenia >400 wstępnie wybranych promotorów w bibliotekach 3C przygotowanych z komórek erytroidalnych31. Ta sama strategia została następnie ulepszona w New Generation (NG) i Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C w celu uzyskania profili interakcji o wysokiej rozdzielczości >8 000 promotorów przy użyciu pojedynczych przynęt DNA 120 pz obejmujących pojedyncze miejsca restrykcyjne i dwie sekwencyjne rundy wychwytywania w celu maksymalizacji wzbogacenia informacyjnych fragmentów ligacji32,40. Strategie te doprowadziły do funkcjonalnej sekcji elementów działających cisowo w wielu różnych kontekstach, w tym rozwoju embrionalnego myszy, różnicowania komórek, inaktywacji chromosomu X i nieprawidłowej regulacji genów w stanach patologicznych 46,63,65,66,67,68,69,70,71.

W Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) >22 000 adnotowanych promotorów zawierających fragmenty restrykcyjne zostało ściągniętych z bibliotek Hi-C przez hybrydyzację pojedynczych 120-merowych biotynylowanych sond RNA na jednym lub obu końcach fragmentu restrykcyjnego34,72. Metoda ta pozwoliła na rozbiór międzyaktomii tysięcy promotorów w szybko rosnącej liczbie typów komórek, w tym mysich embrionalnych komórek macierzystych, komórek wątroby płodu i adipocytów 34,35,72,73, ale także ludzkich linii limfoblastoidalnych, krwiotwórczych komórek progenitorowych, keratynocytów naskórka i komórek pluripotencjalnych 37,74,75,76, Lokal mieszkalny 77.

W porównaniu z tymi technologiami wzbogacania celów, Capture Hi-C jest ukierunkowany na ciągłe regiony genomu aż do skali megabazowej, obejmując w ten sposób jeden lub więcej TAD i obejmując krajobrazy regulacyjne genów. Cały obszar zainteresowania musi być pokryty szeregiem biotynylowanych sond obejmujących każde miejsce restrykcji DpnII w obrębie celu. Hybrydyzacja biotynylowanej macierzy do matrycy 3C, jej późniejsze wychwytywanie na bazie streptawidyny i przetwarzanie w celu sekwencjonowania multipleksowanego odbywa się przy użyciu systemu wzbogacania celu do sekwencjonowania multipleksowanego Illumina Paired-End. Cały protokół jest szybki, ponieważ można go wykonać w ciągu 1 tygodnia od przygotowania biblioteki 3C do sekwencjonowania NGS i wymaga jedynie drobnych adaptacji i/lub rozwiązywania problemów specyficznych dla użytkownika.

Protokół zapewnia również korzyści w porównaniu z innymi metodami opartymi na 3C. Aby uzyskać mapy interakcji w rozdzielczości 5-10 kb, zsekwencjonowaliśmy 100-120 mln odczytów sparowanych końców. Dla porównania, użyliśmy tutaj zestawu danych Hi-C 571 M odczytów, aby osiągnąć rozdzielczość 20 kb64 (GSM2053973), a co najmniej 1 miliard odczytów byłby wymagany do osiągnięcia rozdzielczości 5 kb z Hi-C22 dla całego chromosomu.

Capture Hi-C zastosowany w niniejszym badaniu osiąga znacznie wyższą rozdzielczość niż poprzednio opublikowany 5C oparty na enzymie restrykcyjnym 6-bp47 (Tabela uzupełniająca 1). Co ważne, strategia mająca na celu wzbogacenie i amplifikację docelowych interakcji w 5C nie pozwala na analizę oddziaływań chromatyny specyficzną dla alleli. Wręcz przeciwnie, dane Capture Hi-C mogą być mapowane specyficznie dla alleli, co pozwala na analizę 3D krajobrazów strukturalnych par homologicznych chromosomów, na przykład w komórkach ludzkich lub w hybrydowych liniach komórkowych F1 pochodzących ze skrzyżowania genetycznie różnych szczepów myszy78. Aby wygenerować specyficzne dla alleli mapy interakcji Capture Hi-C w rozdzielczości 5 kb, zsekwencjonowaliśmy 150 bp odczytów sparowanych końców, aby zwiększyć pokrycie SNP. Podobne podejścia specyficzne dla alleli można zastosować do ludzkich linii komórkowych, dla których dostępna jest adnotacja SNP22.

Co ważne, chociaż Capture Hi-C ogólnie zapewnia wysoką rozdzielczość, jednocześnie poprawiając przystępność kosztów sekwencjonowania, produkcja dostosowanych do potrzeb klienta biotynylowanych oligonukleotydów ma wpływ na całkowity koszt tej metody. W związku z tym wybór najbardziej odpowiedniej metody 3C będzie się różnił dla różnych zastosowań i będzie zależał od pytania biologicznego, które jest poruszane, i wymaganej rozdzielczości, a także od wielkości obszaru zainteresowania. Inne opracowane protokoły Capture Hi-C mają kluczowe cechy wspólne z opisanym tutaj protokołem. Na przykład zastosowano strategię Capture Hi-C w celu scharakteryzowania regionów genomu o wielkości od ~50 kb do 1 Mb obejmujących niekodujące warianty związane z ryzykiem raka piersi i jelita grubego; w tym protokole regiony docelowe zostały ściągnięte z bibliotek Hi-C poprzez hybrydyzację przynęt 120-merowego RNA, układając regiony docelowe przy3-krotnym pokryciu 33,38,79. Podobnie, HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2) został wykorzystany do celowania w interakcje w obszarach zainteresowania do 2 Mb80. W obu protokołach zastosowanie matrycy Hi-C wzbogaconej o fragmenty ligacji ściąganej biotyną zwiększyło odsetek całkowitych odczytów informacyjnych w porównaniu z naszym protokołem. Na przykład w zestawie danych Hi-C, którego użyliśmy do porównania64 (GSM2053973), odsetek prawidłowych par po usunięciu duplikatów jest 4,8-krotnie wyższy niż w przypadku prawidłowych par uzyskanych w Capture Hi-C, jak opisano na rysunku 3 i w tabeli uzupełniającej 1. Jednak kolejne ściąganie biotynylowanych ligowanych fragmentów i zhybrydyzowanych sond sprawia, że protokół jest znacznie bardziej złożony i czasochłonny, jednocześnie prawdopodobnie zmniejszając złożoność przechwyconego regionu.

Inną dostępną metodą wzbogacania szablonów 3C za pomocą sond kafelkowych jest Tiled-C, która została zastosowana do badania architektury chromatyny w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej podczas różnicowania erytroidalnego myszy43. W Tiled-C panel biotynylowanych sond o długości 70 pz jest używany do wzbogacania kontaktów w dużych regionach w dwóch kolejnych rundach przechwytywania w celu wygenerowania map ukierunkowanych interakcji o bardzo wysokiej rozdzielczości43,81. Podwójne wzbogacenie przechwytywania sprawia również, że protokół jest dłuższy i bardziej złożony w porównaniu do Capture Hi-C. Jednak w przeciwieństwie do strategii Capture-C ukierunkowanych na pojedyncze miejsca z ograniczeniami, w Tiled-C druga runda przechwytywania nie wydaje się znacząco zwiększać skuteczności przechwytywania, a zatem prawdopodobnie można ją pominąć43. Wreszcie, podobne podejście do kafelkowania oparte na tej samej strategii wzbogacania docelowego, które zastosowano w tym badaniu, zastosowano do rozbioru krajobrazów regulacyjnych obejmujących warianty strukturalne opisane u pacjentów z wrodzonymi wadami rozwojowymi i przeprojektowane u myszy transgenicznych 41,42. W tym przypadku układ kafelkowy sond został zaprojektowany na całej powierzchni docelowej, a nie w pobliżu miejsc ograniczeń DpnII41. Niemniej jednak praca ta była przełomowa w podkreślaniu wrażliwości i mocy tej strategii w celu osiągnięcia charakterystyki dużych regionów genomu w wysokiej rozdzielczości w różnych kontekstach 41,42,48.

Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi łatwą, solidną i potężną strategię charakteryzowania 3D w wysokiej rozdzielczości dowolnych regionów genomu będących przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie tego podejścia do różnych systemów modelowych, typów komórek, regulowanych rozwojowo krajobrazów chromatyny i regulacji genów w zdrowych i patologicznych warunkach prawdopodobnie ułatwi nam zrozumienie wzajemnych oddziaływań i przyczynowości między topologią genomu a regulacją genów, co jest jednym z podstawowych otwartych pytań w dziedzinie epigenetyki. Co więcej, zastosowanie Capture Hi-C do mapowania interakcji dalekiego zasięgu i fałdowania chromatyny wyższego rzędu wariantów ryzyka zidentyfikowanych w badaniach GWAS może ujawnić funkcjonalne znaczenie niekodujących loci genomowych związanych z chorobami ludzkimi w różnych kontekstach, dostarczając tym samym nowych informacji na temat procesów potencjalnie leżących u podstaw patogenezy.

Oświadczenia

Kai Hauschulz jest naukowcem zajmującym się zastosowaniami terenowymi w Agilent Technologies - Diagnostic and Genomics Group. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium Heard została wsparta nagrodą Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla zaawansowanych badaczy (XPRESS - AdG671027). A.L. jest wspierany przez indywidualne stypendium Unii Europejskiej w ramach działań "Maria Skłodowska-Curie" (IF-838408). A.H. jest wspierany przez innowacyjną i interdyscyplinarną sieć ITN ChromDesign, w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie 813327. Autorzy są wdzięczni Danielowi Ibrahimowi (MPI for Molecular Genetics, Berlin) za pomocne porady techniczne, platformie NGS w Instytucie Curie (Paryż) oraz Vladimirowi Benešowi i Genomics Core Facility w EMBL (Heidelberg) za wsparcie i pomoc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x PBS pH 7,4Gibco10010-023
37% (vol/vol) roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa Sciences15686jednorazowe szklane fiolki; nie używać ponownie
50 ml PP stożkowa rurkaFalcon352070
AgarozaSigmaA9539-500g
BioanalizatorAgilentG2939BA
Skrobaki do komórek - Uchwyt 25 cm i ostrze 3,0 cmFalcon353089
CHIR99021Axon Medchem BVAxon 1386
cOmplete Mini, koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)Szkiełka komory do11836170001
CountessInvitrogenC10228
Hrabina II FLInvitrogenZGEXSCCOUNTESS2FLAutomated licznik komórek
Covaris S2Covaris500217Sonicator
DNA LoBind probówka, 1,5 mlEppendorf30108051
DpnII (50000 jednostek/ml)New England BiolabsR0543M
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)MerckD6429
Etanol (100%)Merck1.00983.2500
Płód Surowica bydlęca (FBS)Thermo Scientific10270106
żelatyna ze skóry świniSigmaG1890
GeneRuler 1 kb Plus Drabinka DNAThermo ScientificSM0313
GlycoBlueThermo ScientificAM9516Coprecipitant
Chipsy Bioanlayzer o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Duże chłodzenie Wirówka 5920 REppendorf5948000018
czynnik hamujący białaczkę (LIF)MerckESG1107
LiquiportKNFNF300Stołowy system aspiracji
Niskowiążące końcówki filtrująceBiozymVT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U
Woda klasy białologii molekularnejMerckW3500-6x500ML
Następny sekwencja 500IlluminaSY-415-1001
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cykli)IlluminaFC-404-2004
Nonidet P40 Substytut (NP40)Merck11332473001
PD0325901Axon Medchem BVAxon 1408
Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)Merck11873580001
Proteinaza K - rekombinowany, Klasa PCR (20 mg / ml)Thermo ScientificEO0491
Qubit 2.0Thermo ScientificQ32871
Probówki do testów kubitowychThermo ScientificQ32856
Zestaw Qubit dsDNA o wysokiej czułościThermo ScientificQ32851
RNaza A (10 mg / ml)Thermo ScientificEN0531
Octan sodu pH 5,2 (3M)SzybkiS7899
EppendorfEP5305000100-1EA
Agencourt AMPureXPBeckman CoulterA63881Koraliki SPRI
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent5190-8645
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2Agilent5190-4455
SureSelect XT Zestaw przygotowawczy do biblioteki ILMAgilent5500-0132
T4 ligaza (30 sztuk/&mikro; L)Thermo ScientificEL0013
5427 REppendorf5409000012
Triton-X-100 (500 mL)MerckX100-500ML
Trypan BlueInvitrogenT10282
TrypsineThermo Scientific25300054
UltraPure GlycineThermo Scientific15527013
β-merkaptoetanolThermo Scientific31350010
liczenia komórek Merck koncentrator próżniowy Merck Wirówka stołowa

Bibliografia

  1. Ibrahim, D. M., Mundlos, S. The role of 3D chromatin domains in gene regulation: a multi-facetted view on genome organization. Current Opinion in Genetics & Development. 61, 1-8 (2020).
  2. Bolt, C. C., Duboule, D. The regulatory landscapes of developmental genes. Development. 147 (3), (2020).
  3. Glaser, J., Mundlos, S. 3D or not 3D: Shaping the genome during development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (5), 040188(2021).
  4. Denker, A., De Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  5. Kempfer, R., Pombo, A. Methods for mapping 3D chromosome architecture. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 207-226 (2020).
  6. McCord, R. P., Kaplan, N., Giorgetti, L. Chromosome conformation capture and beyond: Toward an integrative view of chromosome structure and function. Molecular Cell. 77 (4), 688-708 (2020).
  7. Jerkovic, I., Cavalli, G. Understanding 3D genome organization by multidisciplinary methods. Nature ReviewsMolecular Cell Biology. 22 (8), 511-528 (2021).
  8. Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  9. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  10. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  11. Naumova, N., Smith, E. M., Zhan, Y., Dekker, J. Analysis of long-range chromatin interactions using Chromosome Conformation Capture. Methods. 58 (3), 192-203 (2012).
  12. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  13. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra-and interchromosomal interactions. Nature Genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  14. Würtele, H., Chartrand, P. Genome-wide scanning of HoxB1-associated loci in mouse ES cells using an open-ended Chromosome Conformation Capture methodology. Chromosome Research. 14 (5), 477-495 (2006).
  15. De Wit, E., De Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes & Development. 26 (1), 11-24 (2012).
  16. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  17. Splinter, E., et al. The inactive X chromosome adopts a unique three-dimensional conformation that is dependent on Xist RNA. Genes & Development. 25 (13), 1371-1383 (2011).
  18. Ferraiuolo, M. A., Sanyal, A., Naumova, N., Dekker, J., Dostie, J. From cells to chromatin: capturing snapshots of genome organization with 5C technology. Methods. 58 (3), 255-267 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. 5C-ID: Increased resolution Chromosome-Conformation-Capture-Carbon-Copy with in situ 3C and double alternating primer design. Methods. 142, 39-46 (2018).
  20. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  21. Zhang, Y., et al. Spatial organization of the mouse genome and its role in recurrent chromosomal translocations. Cell. 148 (5), 908-921 (2012).
  22. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  23. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  24. Nora, E. P., et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature. 485 (7398), 381-385 (2012).
  25. Krefting, J., Andrade-Navarro, M. A., Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biology. 16 (1), 87(2018).
  26. Galupa, R., Heard, E. Topologically associating domains in chromosome architecture and gene regulatory landscapes during development, disease, and evolution. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 267-278 (2017).
  27. Tena, J. J., Santos-Pereira, J. M. Topologically associating domains and regulatory landscapes in development, evolution and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 702787(2021).
  28. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  29. Davidson, I. F., Peters, J. -M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (7), 445-464 (2021).
  30. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  31. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  32. Davies, J. O. J., et al. Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity. Nature Methods. 13 (1), 74-80 (2016).
  33. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Sahlén, P., et al. Genome-wide mapping of promoter-anchored interactions with close to single-enhancer resolution. Genome Biology. 16, 156(2015).
  36. Joshi, O., et al. Dynamic reorganization of extremely long-range promoter-promoter interactions between two states of pluripotency. Cell Stem Cell. 17 (6), 748-757 (2015).
  37. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  38. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  39. Oudelaar, A. M., Davies, J. O. J., Downes, D. J., Higgs, D. R., Hughes, J. R. Robust detection of chromosomal interactions from small numbers of cells using low-input Capture-C. Nucleic Acids Research. 45 (22), 184(2017).
  40. Oudelaar, A. M., et al. Single-allele chromatin interactions identify regulatory hubs in dynamic compartmentalized domains. Nature Genetics. 50 (12), 1744-1751 (2018).
  41. Franke, M., et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 538 (7624), 265-269 (2016).
  42. Despang, A., et al. Functional dissection of the Sox9-Kcnj2 locus identifies nonessential and instructive roles of TAD architecture. Nature Genetics. 51 (8), 1263-1271 (2019).
  43. Oudelaar, A. M., et al. Dynamics of the 4D genome during in vivo lineage specification and differentiation. Nature Communications. 11 (1), 1-12 (2020).
  44. Galupa, R., Heard, E. X-chromosome inactivation: A crossroads between chromosome architecture and gene regulation. Annual Review of Genetics. 52, 535-566 (2018).
  45. Loda, A., Collombet, S., Heard, E. Gene regulation in time and space during X-chromosome inactivation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (4), 231-249 (2022).
  46. van Bemmel, J. G., et al. The bipartite TAD organization of the X-inactivation center ensures opposing developmental regulation of Tsix and Xist. Nature Genetics. 51 (6), 1024-1034 (2019).
  47. Galupa, R., et al. A conserved noncoding locus regulates random monoallelic Xist expression across a topological boundary. Molecular Cell. 77 (2), 352-367 (2020).
  48. Gjaltema, R. A. F., et al. Distal and proximal cis-regulatory elements sense X chromosome dosage and developmental state at the Xist locus. Molecular Cell. 82 (1), 190-208 (2022).
  49. Galupa, R., et al. Inversion of a topological domain leads to restricted changes in its gene expression and affects inter-domain communication. Development. 149 (9), (2022).
  50. Savarese, F., Flahndorfer, K., Jaenisch, R., Busslinger, M., Wutz, A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation. Molecular and Cellular Biology. 26 (19), 7167-7177 (2006).
  51. Schulz, E. G., et al. The two active X chromosomes in female ESCs block exit from the pluripotent state by modulating the ESC signaling network. Cell Stem Cell. 14 (2), 203-216 (2014).
  52. Gnirke, A., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature Biotechnology. 27 (2), 182-189 (2009).
  53. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  54. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2D and 3D Cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biological Procedures Online. 19 (1), 8(2017).
  55. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  56. Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2020).
  57. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  58. Forcato, M., et al. Comparison of computational methods for Hi-C data analysis. Nature Methods. 14 (7), 679-685 (2017).
  59. Venev, S., et al. open2c/cooltools: v0.4.1. , (2021).
  60. Wages, J. M. NUCLEIC ACIDS | Immunoassays. Encyclopedia of Analytical Science. , Elsevier. 408-417 (2005).
  61. Ewels, P. A., et al. The nf-core framework for community-curated bioinformatics pipelines. Nature Biotechnology. 38 (3), 276-278 (2020).
  62. Servant, N., Peltzer, A. nf-core/hic: Initial release of nf-core/hic. Zenodo. , (2019).
  63. Furlan, G., et al. The Ftx noncoding locus controls X chromosome inactivation independently of its RNA products. Molecular Cell. 70 (3), 462-472 (2018).
  64. Giorgetti, L., et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature. 535 (7613), 575-579 (2016).
  65. Simon, C. S., et al. Functional characterisation of cis-regulatory elements governing dynamic Eomes expression in the early mouse embryo. Development. 144 (7), 1249-1260 (2017).
  66. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the global neural crest gene regulatory network in vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-276 (2019).
  67. Godfrey, L., et al. DOT1L inhibition reveals a distinct subset of enhancers dependent on H3K79 methylation. Nature Communications. 10 (1), 2803(2019).
  68. Hanssen, L. L. P., et al. Tissue-specific CTCF-cohesin-mediated chromatin architecture delimits enhancer interactions and function in vivo. Nature Cell Biology. 19 (8), 952-961 (2017).
  69. Larke, M. S. C., et al. Enhancers predominantly regulate gene expression during differentiation via transcription initiation. Molecular Cell. 81 (5), 983-997 (2021).
  70. Oudelaar, A. M., et al. A revised model for promoter competition based on multi-way chromatin interactions at the α-globin locus. Nature Communications. 10 (1), 5412(2019).
  71. Long, H. K., et al. Loss of extreme long-range enhancers in human neural crest drives a craniofacial disorder. Cell Stem Cell. 27 (5), 765-783 (2020).
  72. Schoenfelder, S., Javierre, B. -M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  73. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  74. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  75. Freire-Pritchett, P., et al. Global reorganisation of cis-regulatory units upon lineage commitment of human embryonic stem cells. eLife. 6, 21926(2017).
  76. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  77. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  78. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  79. Baxter, J. S., et al. Capture Hi-C identifies putative target genes at 33 breast cancer risk loci. Nature Communications. 9 (1), 1028(2018).
  80. Sanborn, A. L., et al. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 6456-6465 (2015).
  81. Owens, D. D. G., et al. Dynamic Runx1 chromatin boundaries affect gene expression in hematopoietic development. Nature Communications. 13 (1), 773(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa struktura genomuprzechwytywanie konformacji chromosom wwzbogacanie celowanespecyficzno allelicznamapowanie o wysokiej rozdzielczo cicentrum inaktywacji chromosomu Xtopologia genomusekwencjonowanie multipleksowe
Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.