Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychCa2+ w komórkach urotelialnych

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64532

⸱

28 września 2022

 ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodologię oceny funkcji mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych w natywnych komórkach urotelialnych za pomocą fluorescencyjnego czujnika Ca2+ GCaMP5G.

Streszczenie

Mechanicznie aktywowane kanały jonowe to biologiczne przetworniki, które przekształcają bodźce mechaniczne, takie jak siły rozciągające lub ścinające, na sygnały elektryczne i biochemiczne. U ssaków kanały aktywowane mechanicznie są niezbędne do wykrywania bodźców zewnętrznych i wewnętrznych w procesach tak różnych, jak czucie dotyku, słuch, regulacja objętości czerwonych krwinek, regulacja podstawowego ciśnienia krwi i uczucie pełności pęcherza moczowego. Podczas gdy funkcja mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych została szeroko zbadana w warunkach in vitro przy użyciu techniki patch-clamp, ocena ich funkcji w ich naturalnym środowisku pozostaje trudnym zadaniem, często z powodu ograniczonego dostępu do miejsc ekspresji tych kanałów (np. końcówek aferentnych, komórek Merkla, baroreceptorów i kanalików nerkowych) lub trudności w zastosowaniu techniki patch-clamp (np. wierzchołkowe powierzchnie urotelialnych komórek parasolowych). Protokół ten opisuje procedurę oceny mechanicznie wywołanych stanów przejściowych Ca2 + przy użyciu czujnika fluorescencyjnego GCaMP5G w preparacie urotelialnym ex vivo, technice, którą można łatwo dostosować do badania mechanicznie wywołanych zdarzeń Ca2 + w innych natywnych preparatach tkankowych.

Wprowadzenie

Komórki nabłonkowe w drogach moczowych są poddawane siłom mechanicznym, gdy filtrat moczowy przemieszcza się przez nefrony, a mocz jest wypompowywany z miedniczki nerkowej i przechodzi przez moczowody, aby być przechowywanym w pęcherzu moczowym. Od dawna wiadomo, że siły mechaniczne (np. naprężenie ścinające i rozciąganie) wywierane przez płyny na komórki nabłonka wyściełające drogi moczowe regulują reabsorpcję białka w kanaliku proksymalnym i substancji rozpuszczonych w dystalnym nefronie1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, a także magazynowanie moczu w pęcherzu moczowym i oddawanie moczu14,15,16,17.

Konwersja bodźców mechanicznych na sygnały elektryczne i biochemiczne, proces określany jako mechanotransdukcja, odbywa się za pośrednictwem białek, które reagują na deformację struktur komórkowych lub związanej z nimi macierzy zewnątrzkomórkowej18,19,20,21. Mechanicznie aktywowane kanały jonowe są wyjątkowe w tym sensie, że przechodzą ze stanu zamkniętego do otwartego stanu przepuszczalnego w odpowiedzi na zmiany napięcia membrany, ciśnienia lub naprężenia ścinającego18,19,20,21,22. Ponadto stany przejściowe Ca2+ mogą być inicjowane przez mechanotransdukcję za pośrednictwem integryny lub przez aktywację mechanoreaktywnych systemów adhezyjnych na połączeniach komórka-komórka23,24,25,26. Funkcja kanału jonowego jest zwykle oceniana za pomocą techniki patch-clamp, która polega na utworzeniu gigaomowego uszczelnienia między błoną komórkową a pipetą krosową27. Jednak komórki znajdujące się w głębokich warstwach tkanek z gęstą macierzą zewnątrzkomórkową (np. kanaliki nerkowe) lub otoczone barierą fizyczną (np. glikokaliksem) są trudno dostępne za pomocą szklanej mikropipety. Podobnie, komórki osadzone lub będące integralnymi częściami tkanek o słabej stabilności mechanicznej (np. nabłonek dróg moczowych) nie mogą być łatwo badane za pomocą techniki patch-clamp. Ponieważ wiele mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych jest przepuszczalnych dlaCa2+, alternatywnym podejściem jest ocena ich aktywności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu barwnika wrażliwego na Ca2+ lub genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak GCaMP. Ostatnie wysiłki w dziedzinie inżynierii białek znacznie zwiększyły zakres dynamiki, czułość i odpowiedź GECIs28,29,30, a postępy w genetyce umożliwiły ich ekspresję w określonych populacjach komórek, dzięki czemu idealnie nadają się do badania mechanotransdukcji.

Nabłonek dróg moczowych, warstwowy nabłonek, który pokrywa wnętrze pęcherza moczowego, funkcjonuje jako bariera, zapobiegając dyfuzji substancji rozpuszczonych w moczu do śródmiąższu pęcherza, ale także działa jako przetwornik, wykrywając wypełnienie pęcherza moczowego i komunikując te zdarzenia do leżących poniżej nerwów i mięśni16. Wcześniejsze badania wykazały, że komunikacja między nabłonkiem dróg moczowych a leżącymi pod nim tkankami wymaga mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych Piezo1 i Piezo231. Aby ocenić mechanicznie indukowane stany przejścioweCa2+ w komórkach urotelialnych, opracowano nową technikę, która wykorzystuje transfer genów adenowirusa do ekspresji czujnika Ca2+ GCaMP5G w komórkach urotelialnych. Technika ta wykorzystuje przygotowanie arkusza błony śluzowej, który zapewnia łatwy dostęp do najbardziej zewnętrznej warstwy komórek parasolowych oraz system wspomagany komputerowo do jednoczesnej mechanicznej stymulacji pojedynczych komórek za pomocą zamkniętej szklanej mikropipety i rejestrowania zmian fluorescencji w czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi odbywało się zgodnie z Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Do niniejszego badania wykorzystano samice, 2-4-miesięczne myszy C57Bl/6J. Myszy uzyskano komercyjnie (patrz tabela materiałów).

1. Montaż i konfiguracja sprzętu

  1. Wykonaj obrazowanie Ca2+ za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości i stabilne źródło światła (patrz tabela materiałów).
    1. Obrazy można rejestrować za pomocą oprogramowania kompatybilnego z mikroskopem, które umożliwia bezpośrednie sterowanie kamerą, źródłem światła i siłownikiem piezoelektrycznym za pośrednictwem cyfrowego urządzenia I/O USB (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat konfiguracji. GCaMP5G ma szczytową długość fali wzbudzenia 470 nm i szczytową długość fali emisji 497 nm28. Użyj kostki filtrującej odpowiedniej do obrazowania GCaMP5G.
  2. Do stymulacji poszczególnych komórek urotelialnych w preparacie błony śluzowej pęcherza moczowego (patrz krok 2) należy użyć siłownika piezoelektrycznego sterowanego przez jednokanałowy sterownik piezoelektryczny z otwartą pętlą (patrz tabela materiałów). Zamontuj siłownik piezoelektryczny w mikromanipulatorze.
    1. Zamontuj szklane mikropipety w uchwycie na pipety przymocowanym do siłownika piezoelektrycznego (Rysunek 1). Zdalnie steruj regulatorem piezoelektrycznym za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego sterowanego za pomocą programu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Zewnętrzny wyzwalacz w postaci sygnału logicznego tranzystor-tranzystor (TTL) inicjowany przez oprogramowanie do obrazowania jest używany do wyzwalania protokołu stymulacji w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych, które porusza siłownikiem piezoelektrycznym (Rysunek 1).
  3. Upewnij się, że oprogramowanie do obrazowania (patrz tabela materiałów) łączy się z cyfrowym urządzeniem we/wy. Skonfiguruj cyfrowy kanał wyjściowy w cyfrowym urządzeniu I/O USB, aby dostarczyć sygnał TTL do przetwornika analogowo-cyfrowego, który zainicjuje protokół w oprogramowaniu elektrofizjologicznym, które porusza siłownikiem piezoelektrycznym.
    1. Za pomocą podłącz port Start BNC w przetworniku analogowo-cyfrowym do masy (GND) oraz zacisk śrubowy w cyfrowym urządzeniu I/O USB.
  4. Skonfiguruj protokół nagrywania w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
    UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak wygenerować protokół, który wyśle sygnał TTL i rozpocznie zbieranie obrazów w określonych odstępach czasu.
    1. Skonfiguruj protokół akwizycji w oprogramowaniu do obrazowania, klikając Menedżer eksperymentów i wybierając Nowy eksperyment. Otworzy się nowe okno.
    2. Wybierz ikonę Pętla poklatkowa i przeciągnij ją do nowo otwartego okna; ustaw liczbę cykli na 2, a interwał na najszybsze ustawienie dozwolone w konfiguracji.
    3. Z ikony Migawka przesyłana/Migawka ręczna wybierz ikonę NI USB-6501 i przeciągnij ją do okna Pętla poklatkowa, a następnie ustaw NI USB-6501 jako zamknięty. Przeciągnij dodatkowy NI USB-6501 z migawki przesyłanej/migawki ręcznej do okna pętli poklatkowej i ustaw je jako otwarte. Aby połączyć dwie ikony NI USB-6501, przeciągnij grot strzałki z boku zamkniętej ikony NI USB-6501 i pociągnij, aż dotknie ikony otwarcia NI USB-6501. Pojawi się linia łącząca obie ikony.
    4. Przeciągnij kolejną pętlę poklatkową do okna Experiment Manager i połącz ją z pierwszą, pociągając za grot strzałki. Ustaw parametry nagrywania. Ustaw liczbę cykli nowej pętli poklatkowej na 2400.
    5. Z ikony Image Acquisition (Akwizycja obrazu) przeciągnij filtr GFP do ostatnio otwartej pętli poklatkowej i ustaw czas ekspozycji na 100 ms.
    6. Ustaw typ obrazu z kamery na 8-bitowy, rozdzielczość na 576 x 576 (Binning 4 x 4), zegar pikseli na 480 MHz i korekcję pikseli na gorąco na standardowy.
      UWAGA: Parametry można regulować w zależności od poziomu ekspresji czujnika fluorescencyjnego, czułości kamery i konfiguracji konfiguracji.
  5. Skonfiguruj stanowisko laboratoryjne w oprogramowaniu do elektrofizjologii (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Spowoduje to zdefiniowanie sygnału wyjściowego w mV przetwornika analogowo-cyfrowego.
    1. Przejdź do menu Configure w oprogramowaniu do elektrofizjologii i wybierz Lab Bench. W wyświetlonym oknie Sygnały wyjściowe wybierz Wyjście analogowe #1, naciśnij Dodaj sygnał i nazwij go (np. "Piezo"). Ustaw jednostkę sygnału na mV, a współczynnik skali (mV/V) na 1.
  6. Wygeneruj protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii, wykonując poniższe czynności.
    1. Aby wygenerować nowy protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii, przejdź do punktu menu Zdobądź i wybierz Nowy protokół.
    2. Ustaw Tryb/Szybkość na Stymulację epizodyczną, Bieg/Próba na 1, Przemiatanie/Bieg na 1 i Czas trwania przemiatania (s) na 150.
    3. W menu Outputs (Wyjścia) wybierz kanał #1 Piezo jako Analog out (Wyjście analogowe).
    4. W menu Trigger (Wyzwalacz) ustaw wyzwalacz na Digitizer Start Input (Wejście startowe digitizera) i Internal Timer (Wewnętrzny timer).
    5. W menu Waveform (Kształt fali) wybierz kanał #1 i Analog Waveform with Epochs (Przebieg analogowy z epokami). Ustaw Krok A na Krok, Pierwszy poziom na 0, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 10000 i Czas trwania Delta na 0.
    6. Ustaw Krok B na Krok, Pierwszy poziom na 10, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 1000 i Czas trwania delty na 0. Ustaw Krok C na Krok, Pierwszy poziom na 0, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 130000, a Czas trwania Delta na 0.
    7. Zapisz protokół i nadaj mu nazwę Protokół stymulacji.
  7. Użyj BNC, aby podłączyć wyjście analogowe #1 w przetworniku analogowo-cyfrowym do WEJŚCIA ZEWNĘTRZNEGO z przodu jednokanałowego kontrolera piezoelektrycznego z otwartą pętlą (patrz Tabela materiałów).
  8. Wytwarzaj szklane mikropipety do mechanicznej stymulacji komórek parasolowych z rurki ze szkła kapilarnego, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Umieść szklankę kapilarną w ściągaczu (patrz Tabela materiałów) i wyreguluj ją za pomocą pokręteł ustalających kapilary.
    2. Ustaw nagrzewnicę na pełnej wysokości. Ustaw suwak pozycji zakończenia pierwszego pociągnięcia ściągacza na 5.
    3. Ustaw pierwsze pokrętło grzałki na 76.7, a drugie pokrętło na 52.7.
    4. Pociągnij szklaną kapilarnę w dwóch krokach, naciskając przycisk start.
    5. Zamknij końcówkę mikropipety za pomocą mikrokuźni (patrz Tabela materiałów) z pokrętłem regulacji grzałki ustawionym na 60.
      UWAGA: W niniejszym protokole ostateczna średnica końcówki mikropipety używanej do nakłuwania pojedynczych komórek wynosi ~1-3 μm.
  9. Sprawdzić, czy mikropipeta stymulująca porusza się na odległość określoną w protokole stymulacji.
    UWAGA: Poniższe kroki mają na celu zapewnienie, że po 12,5 s od zainicjowania protokołu stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii generowany jest impuls napięciowy o czasie trwania 1 s, który powoduje ruch siłownika piezoelektrycznego o 20 μm.
    1. Zamontuj mikropipetę w uchwycie i przymocuj ją do siłownika piezoelektrycznego.
    2. Umieść siłownik piezoelektryczny i dołączoną mikropipetę równolegle do środka stolika mikroskopu i w obszarze view.
    3. Skoncentruj się na końcówce pipety i unieruchom piezoelektryczny pręt montażowy (patrz Tabela materiałów) za pomocą taśmy. Przy jasnym oświetleniu wyreguluj parametry kamery, aby uzyskać wyraźny obraz końcówki pipety.
    4. Otwórz protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii i ustaw go na odtwarzanie.
      UWAGA: Protokół elektrofizjologii nie zostanie uruchomiony, dopóki nie zostanie odebrany sygnał TTL wysłany z oprogramowania do obrazowania.
    5. W Experiment Manager w oprogramowaniu do obrazowania naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie danych.
      UWAGA: Spowoduje to wyzwolenie protokołu w oprogramowaniu do elektrofizjologii, który będzie sterował siłownikiem piezoelektrycznym. Protokół w oprogramowaniu do obrazowania wygeneruje plik z obrazami eksperymentu.
  10. Sprawdź odległość przebytą przez pipetę, wykonując poniższe czynności.
    1. Aby zmierzyć odległość przebytą przez pipetę podczas protokołu stymulacji, wybierz pozycję Count and Measure (Policz i zmierz) w oprogramowaniu do obrazowania.
    2. Z menu Measure (Miara) wybierz opcję Measurement and ROI (Pomiar i zwrot z inwestycji), a pod oknem filmu pojawi się nowe okno.
    3. Z menu Miara wybierz opcję Dowolny wiersz.
    4. W oknie filmu narysuj dowolną linię, zaczynając od końcówki pipety. Należy pamiętać, że koniec dowolnej linii zostanie dostosowany później.
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolną linię, aby przekształcić ją w obszar zainteresowania (ROI), który będzie widoczny we wszystkich klatkach filmu.
    6. Obejrzyj film i ustaw koniec dowolnej linii (ROI) w końcowej pozycji, po której porusza się pipeta w odpowiedzi na bodziec.
      UWAGA: Odległość przebyta przez pipetę w μm pojawi się w oknie Measurement and ROI (Pomiar i zwrot z inwestycji). Protokół stymulacji może być modyfikowany w zależności od potrzeb użytkownika.

2. Transdukcja in situ i izolacja błony śluzowej pęcherza moczowego

  1. Transdukcja pęcherzy myszy u samic in situ za pomocą adenowirusa kodującego cDNA CGaMP5G zgodnie z procedurą opisaną w protokole transdukcji wirusa31.
    1. Podczas transdukcji komórek urotelialnych do eksperymentów obrazowania Ca2+ należy wkroplić do pęcherzy 50 μl roztworu zawierającego 2 x 107 zakaźnych cząstek wirusowych (IVP).
      UWAGA: Ta technika ma tendencję do ograniczania ekspresji CGaMP5G do warstwy komórek parasolowych. Alternatywnie, eksperymenty można przeprowadzić na pęcherzach moczowych pobranych od transgenicznych myszy eksprymujących CGaMP5G w komórkach urotelialnych (tj. Ekspresja GCaMP5G napędzana przez promotor uroplakiny-2) lub dowolnym innym typie komórek będących przedmiotem zainteresowania.
  2. 24-72 godziny po transdukcji należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 i wykonać torakotomię, otwierając jamę klatki piersiowej nożyczkami, aby spowodować zapadnięcie się płuc.
  3. Kanonuluj cewkę moczową za pomocą cewnika 24 G. Odsłoń pęcherz moczowy przez nacięcie brzuszne o długości ~1,5 cm przez skórę i mięśnie, a następnie użyj szwu 6,0 (patrz Tabela materiałów), aby przymocować cewnik do cewki moczowej.
  4. Zbierz pęcherz moczowy i cewkę moczową32 i przymocuj do podkładki z gumy silikonowej (patrz Tabela Materiałów) skąpanych w roztworze rejestrującym zawierającym (w mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,4 i bąbelkuje 100% O2 (Rysunek 2A).
  5. Oddziel błonę śluzową pęcherza moczowego od leżącej pod nią warstwy mięśniowej za pomocą cienkich kleszczy zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami32 (Rysunek 2B).
  6. Rozetnij błonę śluzową pęcherza moczowego i przypnij ją nabłonkiem dróg moczowych skierowanym do góry do wkładki z elastomeru silikonowego na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm (Rysunek 2C).

3. Mechaniczna stymulacja pojedynczych komórek urotelialnych i obrazowanie Ca2+

  1. Zamontuj naczynie z hodowlą tkankową z przypiętą błoną śluzową pęcherza moczowego na stoliku mikroskopowym wyposażonym w inkubator do hodowli z rezystancyjnymi elementami grzejnymi (Rysunek 2E). Wykonuj perfaktorkę (zgodnie z instrukcjami producenta, patrz Tabela materiałów) w naczyniu do hodowli komórkowych w sposób ciągły z szybkością 1,7 ml / min z roztworem zapisującym podgrzanym do temperatury ~37 °C za pomocą grzałki liniowej.
  2. Utrzymywać temperaturę inkubatora do naczyń tkankowych i roztworów na poziomie ~37 °C za pomocą dwukanałowego bipolarnego regulatora temperatury (patrz tabela materiałów). Równoważyć tkankę w komorze ciągłą perfuzją przez co najmniej 15 minut przed przeprowadzeniem dalszych procedur doświadczalnych.
  3. Aby zarejestrować mechanicznie indukowane stany przejścioweCa2+, zanurz mikropipetę w roztworze, kąpiąc przygwożdżoną błonę śluzową pęcherza moczowego w naczyniu na tkanki. Przesuń mikropipetę na środek pola za pomocą obiektywu skanującego o małym powiększeniu (4x) przy jasnym oświetleniu pola.
    1. Przesunąć mikropipetę w pobliże powierzchni tkanki urotelialnej, koordynująco przesuwając mikromanipulator w płaszczyźnie pionowej i regulując ostrość.
    2. Zmień obiektyw na taki o większym powiększeniu (20x), odpowiedni do immunofluorescencji z dużym otworem numerycznym (NA).
    3. Ustaw mikromanipulator w pozycji Fine i przesuń mikropipetę w pobliże górnej części celi docelowej.
    4. Zmień pole widzenia na kamerę i naciśnij Live w oprogramowaniu do obrazowania.
      UWAGA: Musi to włączyć odbitą migawkę i umożliwić obserwację sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez tkankę w komputerze.
    5. Dostosuj ostrość, aby uwidocznić górną część kuwety i w razie potrzeby dostosuj położenie pipety.
    6. Otwórz protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii i ustaw go na odtwarzanie.
      UWAGA: Protokół w oprogramowaniu do elektrofizjologii nie zostanie uruchomiony, dopóki nie zostanie odebrany sygnał TTL wysłany z oprogramowania do obrazowania.
    7. W Experiment Manager w oprogramowaniu do obrazowania naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie danych. Spowoduje to uruchomienie protokołu w oprogramowaniu do elektrofizjologii, które będzie sterować siłownikiem piezoelektrycznym i wygeneruje plik z obrazami eksperymentu. Protokół stymulacji może być modyfikowany w zależności od potrzeb użytkownika.

4. Analiza danych

  1. Określ ilościowo intensywność fluorescencji w czasie, wykonując poniższe czynności.
    1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz okno Count and Measure (Zlicz i zmierz). Wybierz narzędzie wielokąta i narysuj ROI na granicach komórki, która została szturchnięta.
    2. Przejdź do okna Pomiar, wybierz opcję Profil intensywności, ustaw pomiar na Z czasem, Wyniki na Średnia, Odejmowanie tła na Brak, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj. Średnia intensywność fluorescencji zostanie obliczona w czasie (Rysunek 3).
    3. Aby wyeksportować dane profilu intensywności, kliknij ikonę Excela w oknie Wyniki profilu intensywności . Umożliwi to użytkownikowi wybranie folderu docelowego i nazwy pliku oraz zapisanie danych w formacie .xlsx.
  2. Przeprowadzaj analizę danych za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Amplituda piku Ca2+ wywołana szturchaniem jest wyrażona jako zmiana intensywności fluorescencji (ΔF/F), gdzie F jest intensywnością fluorescencji GCaMP5G w czasie 0, a ΔF jest różnicą między maksimami intensywności fluorescencji a bazową w czasie 0. Można również obliczyć zanik odpowiedzi Ca2+ (nie pokazano).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje technikę oceny mechanicznie wywołanych przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w komórkach parasolowatych przy użyciu fluorescencyjnego sensora Ca2+ GCaMP5G. Do ekspresji GCaMP5G w komórkach urothelium wykorzystano transdukcję adenowirusową ze względu na jej wysoką wydajność oraz zdolność do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji. Obrazy fluorescencyjne barwionych krioprzecięć z transdukowanego pęcherza przedstawiono na Rysunku 2D. W tych eksperym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wszystkie organizmy i pozornie większość typów komórek wyrażają kanały jonowe, które reagują na bodźce mechaniczne 20,33,34,35,36,37. Funkcja tych mechanicznie aktywowanych kanałów została oceniona głównie za pomocą techniki patch-clamp. Jednak ze względu na problemy z dostępnością, badania patch-clamp mechanicznie aktywowany...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01DK119183 (dla G.A. i M.D.C.) i S10OD028596 (dla G.A.) oraz przez Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores z Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20x ObiektywOlympusUMPlanFL N
24 G ¾ ” cewnikMedline Prowadnica Suresite IV 
4x ObiektywOlympusUPlanFL N
Przetwornik analogowo-cyfrowyUrządzenia molekularneDigidata 1440A Przeciwciało
anty-GFPAbcam Ab6556
Rozdzielacz wiązkiChromaT495lpxr
Bipolarny regulator temperatury Warner InstrumentsTC-344B
CaCl2Fluka21114-1L1 M solution
cellSens softwareOlympusImaging
Kamera CMOSHamamatsuORCA fusion
Donkey anty-rabbit skoniugowany z Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch711-545-152
ExcelMicrosoft Corporation
Filtr Chroma ET470/40X
Kapilary szklane Szkło Corning 8250Warner Instruments G85150T-4
GlukozaSigmaG8270
HEPES SigmaH4034
Nagrzewnica liniowa Warner InstrumentsSH-27B
KClSigma793590
Źródło światłaSutter InstrumentsLambda XL 
Przewody pompy kolektoraFisherbrand14-190-510ID 1,52 mm
Przewody pompy kolektoraFisherbrand14-190-533ID 2,79 mm
MgCl2SigmaM9272
Myszy Jackson Lab6642-4 miesięczna suczka C57BL/6J
MicroforgeNarishige MF-830
MikromanipulatorSutter InstrumentsMP-285
MikroskopOlympusBX51W
Nośnik montażowy z DAPIInvitrogenS36964 Slowfade Diamond Antifade z DAPI
NaCl Oprogramowanie pClamp SigmaS7653
Molecular DevicesWersja 10.4Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych
Pompa perystaltycznaGilsonMinipuls 3
Siłownik piezoelektrycznyThorlabsPAS005
Uchwyt na pipetyWorld Precision Instruments
Ściągacz do pipetNarishigePP-830
Podgrzewana podstawa szybkiej wymiany z zestawem pierścieni perfuzyjnych i adapteraWarner InstrumentsQE-1Platforma szybkiej wymiany pasuje do czaszy 35 mm   
Rodamina-falloidyna InvitrogenR415
Sigma-PlotSystat Software IncWersja 14.0Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych   
Elastomersilikonowy DowSylgard 184
Jednokanałowy kontroler piezoelektryczny z otwartą pętląThorlabsMDT694B
Kwadratowa podkładka na siatkęTed Pella10520
SzewAD ChirurgicznyS-S618R136-0
Sylk Teflonowy pręt montażowyWykonaneSłuży do montażu siłownika piezoelektrycznego w mikromanipulatorze
RurkaFisher Scientific14171129Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN
USB Digital I/O device National InstrumentsNI USB-6501
na zamówienie

Bibliografia

  1. Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
  2. Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
  3. Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
  4. Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
  5. Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
  6. Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
  7. Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
  8. Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
  9. Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
  10. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
  11. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
  12. Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
  13. Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
  14. Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
  15. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  16. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  17. Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
  18. Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
  19. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
  20. Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
  21. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
  22. Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
  23. Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
  24. Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).
  25. Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
  26. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  27. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  28. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  29. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  30. Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170(2013).
  31. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).
  32. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
  33. Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
  34. Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
  35. Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).
  36. Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).
  37. Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kana y aktywowane mechanicznieprzej cia wapniowepreparat ex vivostymulacja mechanicznafluorescencyjny sensor wapniaobrazowanie GCaMP5Gkom rki parasolowateluz wka p cherza moczowegointensywno fluorescencji
Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychCa2+ w komórkach urotelialnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.