Artykuł metodologiczny

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/64665

⸱

2 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości mechaniczne komórek są zaangażowane w wiele różnych procesów biologicznych i chorób, począwszy od różnicowania komórek macierzystych, a skończywszy na przerzutach raka. Konwencjonalne metody pomiaru tych właściwości, takie jak mikroskopia sił atomowych (AFM) i aspiracja mikropipetami (MA), pozwalają uzyskać bogate informacje, odzwierciedlając pełną odpowiedź lepkosprężystą komórki; Metody te są jednak ograniczone bardzo niską przepustowością. Podejścia wysokoprzepustowe, takie jak cytometria odkształcalności w czasie rzeczywistym (RT-DC), mogą mierzyć tylko ograniczone informacje mechaniczne, ponieważ często ograniczają się do odczytów jednoparametrowych, które odzwierciedlają tylko właściwości sprężyste komórki. W przeciwieństwie do tych metod, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) jest elastyczną, bezznacznikową platformą mikroprzepływową, która wypełnia lukę w osiąganiu wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych komórki o umiarkowanej przepustowości. Pomiar prądu stałego (DC) służy do monitorowania komórek podczas przechodzenia przez kanał mikroprzepływowy, śledząc ich rozmiar i prędkość przed, w trakcie i po przepchnięciu przez wąskie zwężenie. Informacje te (tj. rozmiar i prędkość) są wykorzystywane do ilościowego określenia odkształcenia poprzecznego każdej komórki, odporności na deformację i powrotu do zdrowia po deformacji. Ogólnie rzecz biorąc, ta oparta na elektronice platforma mikroprzepływowa zapewnia wiele właściwości lepkosprężystych komórek, a tym samym pełniejszy obraz stanu mechanicznego komórki. Ponieważ wymaga minimalnego przygotowania próbki, wykorzystuje prosty pomiar elektroniczny (w przeciwieństwie do szybkiej kamery) i wykorzystuje standardową produkcję miękkiej litografii, implementacja tej platformy jest prosta, dostępna i można ją dostosować do dalszej analizy. Elastyczność, użyteczność i czułość tej platformy dostarczyły unikalnych informacji mechanicznych na temat różnorodnych komórek, z potencjałem do wielu innych zastosowań w naukach podstawowych i diagnostyce klinicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedyncze komórki to dynamiczne, lepkosprężyste materiały1. Mnogość procesów wewnętrznych i zewnętrznych (np. początek mitozy lub przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej [ECM]) wpływa na ich strukturę i skład2,3,4, często skutkując odrębnymi właściwościami biofizycznymi, które uzupełniają ich obecny stan. W szczególności wykazano, że właściwości mechaniczne są ważnymi biomarkerami rozwoju komórkowego, fizjologii i patologii, dostarczając cennych informacji ilościowych, które mogą uzupełnić kanoniczne podejścia molekularne i genetyczne5,6,7. Na przykład Li i wsp. opisali niedawno mechaniczne różnice między opornymi na leki i reagującymi na leki komórkami ostrej białaczki promielocytowej, jednocześnie używając sekwencji RNA do odkrycia genów związanych z cytoszkieletem o zróżnicowanej ekspresji8. Dzięki zrozumieniu złożonych zależności między mechaniką pojedynczej komórki a funkcją komórki, mechanofenotytypowanie ma szersze zastosowanie w przekształcaniu nauk podstawowych i diagnostyki klinicznej9.

Najbardziej powszechnie stosowanym narzędziem do pomiaru mechaniki pojedynczej komórki jest mikroskopia sił atomowych (AFM). Chociaż AFM umożliwia zlokalizowany pomiar właściwości mechanicznych komórek w wysokiej rozdzielczości, pozostaje ograniczony do przepustowości <0,01 komórek/s10. Alternatywnie, napinacze optyczne, które wykorzystują dwie rozbieżne wiązki laserowe do wychwytywania i deformowania zawieszonych pojedynczych komórek11, są ograniczone do nieznacznie wyższych przepustowości <1 cell/s12. Ostatnie postępy w technologiach mikroprzepływowych umożliwiły stworzenie nowej generacji urządzeń do szybkiej, jednokomórkowej, mechanicznej oceny12,13. Techniki te wykorzystują wąskie kanały zwężające14,15, shear flow16, lub hydrodynamiczne rozciąganie17, aby szybko zdeformować komórki przy przepustowości 10-1,000 komórek/s18. Chociaż tempo pomiaru w tych metodach jest znacznie szybsze niż w przypadku konwencjonalnych technik, często zamieniają one możliwości w zakresie wysokiej przepustowości na ograniczone odczyty mechaniczne (Tabela uzupełniająca 1). Wszystkie wyżej wymienione szybkie metody mikroprzepływowe koncentrują się na podstawowych, jednoparametrowych wskaźnikach, takich jak czas przejścia lub współczynniki odkształcalności, które odzwierciedlają tylko właściwości sprężyste komórki. Jednak biorąc pod uwagę wewnętrzną lepkosprężystą naturę pojedynczych komórek, solidna i dokładna charakterystyka mechaniczna komórek wymaga uwzględnienia nie tylko składników elastycznych, ale także reakcji lepkich.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Rysunek 1A) to platforma mikroprzepływowa, która rozwiązuje istniejące ograniczenia w mechanofenetypowaniu pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar wielu parametrów biofizycznych, w tym średnicy komórki, względnej odkształcalności i czasu rekonwalescencji po odkształceniu, przy umiarkowanej przepustowości 1-10 komórek/s. Technika ta opiera się na wykrywaniu porów węzłów (NPS)19,20,21,22,23,24, który polega na użyciu czteropunktowego pomiaru sondą do pomiaru modulowanego impulsu prądu wytwarzanego przez komórkę przechodzącą przez kanał mikroprzepływowy, który został podzielony na szersze obszary, zwane "węzłami". Modulowany impuls prądowy jest wynikiem częściowego blokowania przez ogniwo przepływu prądu w segmentach (tj. "porach") i węzłach, przy czym w pierwszym z nich blokuje się więcej prądu niż w drugim. W mechano-NPS jeden segment, "kanał skurczu", jest węższy niż średnica komórki; w związku z tym komórka musi się zdeformować, aby przejść przez cały kanał (Rysunek 1B). Średnicę komórki można określić na podstawie wielkości podimpulsu wytwarzanego, gdy komórka przechodzi przez pory węzłów przed kanałem skurczu (Rysunki 1B, C). Tutaj |ΔInp|, bieżący spadek, gdy komórka znajduje się w porach, jest proporcjonalny do stosunku objętości komórki do poru, komórka V/Vpor<sup class="xref">2,8,19. Sztywność komórki można określić za pomocą ΔTc, czasu trwania znacznie większego podimpulsu wytwarzanego, gdy komórka przechodzi przez kanał skurczu (Rysunki 1B, C). Sztywniejsza komórka będzie potrzebowała więcej czasu na przejście przez kanał niż bardziej miękka komórka2,8. Wreszcie, "regeneracja" komórki, zdolność komórki do powrotu do pierwotnego rozmiaru i kształtu po deformacji, może być określona przez serię podimpulsów wytwarzanych, gdy komórka przechodzi przez pory węzłów za kanałem skurczu (Rysunki 1B, C). Czas odzyskiwania, ΔTr, to czas potrzebny na powrót obecnych podimpulsów do wielkości poprzednich podimpulsów, zanim ogniwo zostanie ściśnięte. Ogólnie rzecz biorąc, modulowane impulsy prądu wytwarzane przez komórkę przechodzącą przez kanał mikroprzepływowy są rejestrowane i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów mechanicznych pojedynczej komórki ( Rysunek 1D) < sup class = "xref" >2,8.

Powtarzalność i łatwość użycia tej opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej została już wcześniej zademonstrowana25. Ponadto platforma stanowi niską barierę wejścia dla mechanofenotypowania pojedynczych komórek. Standardowa miękka litografia jest stosowana do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych. Sprzęt pomiarowy składa się z niedrogich komponentów, w tym prostej płytki drukowanej (PCB), zasilacza, przedwzmacniacza, płytki akwizycji danych (DAQ) i komputera. Wreszcie, dostępny jest przyjazny dla użytkownika kod do pozyskiwania i analizy danych, co umożliwia prostą implementację. Ta technika mechanofentypowania może rozróżnić populacje niezłośliwych i złośliwych linii komórek nabłonka piersi i płuc, rozróżnić podlinie w pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka sutka oraz scharakteryzować skutki zaburzeń cytoszkieletu i innych czynników farmakologicznych2,8. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta jest skutecznym podejściem do mechanofenotypowania pojedynczych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie geometrii urządzenia

  1. Wybierz szerokość segmentów wymiarowania i odzyskiwania tak, aby była szersza niż średnica największych mierzonych komórek, ale także utrzymywała wystarczający stosunek sygnału do szumu (SNR). Patrz Tabela uzupełniająca 2, aby zapoznać się z przykładami różnych rozmiarów i szerokości segmentów odzysku dla różnych linii komórkowych.
  2. Wybierz szerokość segmentu skurczu, aby zastosować odkształcenie 30%-40% do średniej wielkości komórek, które mają zostać poddane mechanofenotypowaniu. Szczep jest zdefiniowany jako figure-protocol-1, gdzie d to średnica komórki, a wc to szerokość kanału skurczu2,8. Patrz Tabela Uzupełniająca 2, aby zapoznać się z różnymi szerokościami segmentów skurczu dla różnych linii komórkowych.
    UWAGA: Jeśli ktoś chce porównać typy lub warunki ogniw o zasadniczo różnych średnicach, należy użyć oddzielnych konstrukcji urządzeń z szerokościami segmentów skurczu specyficznymi dla każdego typu/warunku ogniwa.
  3. Zaprojektuj urządzenie referencyjne dla każdej unikatowej geometrii urządzenia. Jest to niezbędne do wyznaczenia De, efektywnej średnicy odcinka porów zaklejających kanał mikroprzepływowy.
    UWAGA: Urządzenie referencyjne korzysta z tej samej geometrii, co urządzenie główne. Jedyna modyfikacja polega na tym, że segment skurczowy powinien mieć równą szerokość segmentu porów do wymiarowania, aby umożliwić kalibrację za pomocą kulek polistyrenowych o znanym rozmiarze. Poszerzenie skurczu zapobiega zatykaniu kanału skurczowego przez kulki polistyrenowe podczas kalibracji. Proces kalibracji jest bardziej szczegółowo opisany w krokach 4.1 i 5.3.1. Kalibrację można również przeprowadzić za pomocą dostępnego na rynku licznika komórek, w którym to przypadku nie jest potrzebne żadne urządzenie referencyjne. Proces ten opisano w kroku 4.2.
  4. Wybierz wysokość kanału w taki sposób, aby największe interesujące komórki mogły się w pełni wydłużyć bez ograniczeń w segmencie skurczu2. Upewnij się, że wysokość kanału jest większa niż hmin figure-protocol-2 (zakłada się, że komórka jest sferycznie zdeformowana przed deformacją, a odkształcenie izometryczne występuje wzdłuż długości i wysokości kanału podczas deformacji).
    UWAGA: Biorąc pod uwagę wielkość bieżącego podimpulsu, figure-protocol-3, im większe jest hmin, tym niższy będzie ogólny SNR.
  5. Zaprojektuj i stwórz fotomaskę za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo z wybranymi szerokościami kanałów. Przykładowy plik znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Przeskaluj konstrukcję maski mikroprzepływowej o 1,5%, aby uwzględnić skurcz polidimetylosiloksanu (PDMS) po oderwaniu od ujemnego wzorca.
    UWAGA: Tablica urządzeń może być umieszczona na jednej masce, o ile cała tablica nie przekracza rozmiaru płytki (rysunek uzupełniający 1A).
  6. Zaprojektuj i stwórz fotomaskę z elektrodami, które posłużą do wykonania czteropunktowego pomiaru prądu urządzenia mikroprzepływowego za pomocą sondy (Rysunek 1D). Przykładowy plik znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Układ elektrod może być umieszczony na jednej masce, o ile układ nie przekracza rozmiaru szkiełka (rysunek uzupełniający 1B).

2. Wytwarzanie urządzeń (Rysunek 2)

  1. Przygotuj wzory elektrod na szklanym podłożu.
    1. Odwiruj powłokę, wzór i przetwór dodatniego fotorezystu na zwykłym szkiełku podstawowym zgodnie z kartą katalogową produktu. Przykład tej procedury znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
    2. Wykonaj osadzanie, podnoszenie i wytrawianie złota.
      1. Wykonaj nanoszenie cienkiej warstwy 75 Å Ti, 250 Å Pt i 250 Å Au na szkiełku. Przykład tej procedury z wykorzystaniem parowania za pomocą pistoletu elektronowego jest opisany w pliku uzupełniającym 3.
      2. Zanurz szkiełko w acetonie na 15 minut, aby wykonać uniesienie nadmiaru metalu.
      3. W dygestorium użyj jednorazowej pipety, aby odlewać złoty wytrawiacz na obszar elektrod, które będą wystawione na działanie kanału mikroprzepływowego, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2. Zachowaj ostrożność, aby nie upuścić wytrawiacza w innym miejscu na szkiełku.
        UWAGA: Wytrawiacz złota może powodować podrażnienie skóry i oczu. Nie wdychać oparów i nie połykać. Obchodź się z nimi ostrożnie, noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji.
      4. Przepłukać szkiełko wodą dejonizowaną (DI) i osuszyć suchym azotem (N2).
    3. Jeśli na tym samym szkiełku drukowanych jest wiele elektrod, pokrój szkiełko w kostkę na pojedyncze wióry.
      1. Użyj narzędzia do cięcia szkła, aby naciąć szkiełko wzdłuż wzorzystych granic elektrod.
      2. Rozbij szklankę wzdłuż nacięcia, aby podzielić zjeżdżalnię na pojedyncze żetony.
    4. Sprawdź wzrokowo elektrody pod mikroskopem. Upewnij się, że poszczególne elektrody nie są elektrycznie otwarte lub że elektrody nie są ze sobą zwarte.
  2. Wyprodukuj ujemną formę wzorcową dla kanałów.
    1. Powlekaj, modeluj i przetwarzaj rezystor epoksydowy SU-8 na polerowanej płytce krzemowej zgodnie z kartą danych produktu. Przykład tej procedury znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
    2. Zmierz wysokość elementów za pomocą profilometru i dokonaj wizualnej kontroli cech pod mikroskopem (rysunek uzupełniający 3). Upewnij się, że żądane geometrie są dobrze zdefiniowane.
  3. Kanały PDMS z miękką litografią.
    1. Przygotuj PDMS, ważąc elastomer i środek sieciujący w stosunku masowym 10:1 w jednorazowym kubku.
      UWAGA: W przypadku wafla o średnicy 3 wystarczy 30 g PDMS.
    2. Mieszaj PDMS energicznie przez 30 s jednorazowym widelcem, aż PDMS stanie się nieprzezroczysty z bąbelkami.
    3. Odgazuj PDMS w komorze próżniowej przez około 30-90 minut lub do momentu, gdy PDMS stanie się przezroczysty bez widocznych pęcherzyków.
    4. Umieść wafel z foremką główną SU-8 w jednorazowej szalce Petriego i wylej PDMS na środek wafla
      5. .
    5. Umieścić szalkę Petriego zawierającą PDMS i płytkę w komorze próżniowej i odgazowywać przez około 30 minut lub do momentu, gdy w PDMS nie pozostaną żadne pęcherzyki.
    6. Piecz PDMS w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w piekarniku lub na gorącej płycie.
    7. Ostrym ostrzem odetnij i usuń PDMS z ujemnego wzorca SU-8.
    8. Uformowaną płytę PDMS pokrój w osobne formy za pomocą ostrego ostrza
    9. Wydrąż otwory dostępowe wlotowe i wylotowe za pomocą jednorazowego dziurkacza do biopsji. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć nowego stempla dla każdej płyty PDMS. Ostrszy stempel tworzy otwory o gładkich krawędziach, minimalizując cząstki, które mogłyby blokować kanał skurczu.
      UWAGA: Średnica otworów dostępowych powinna być nieco mniejsza niż zewnętrzna średnica rurki. Na przykład w przypadku stosowania rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy zewnętrznej 1/32 cala należy przebić otwór o średnicy 1.5 mm.
  4. Podłącz podłoże szklane/elektrodowe do kanałów PDMS.
    1. Szkiełka elektrody należy oczyścić metanolem (≥99,8%). Suszyć suchym N2.
    2. Wyczyść urządzenie PDMS taśmą klejącą, a następnie spłucz alkoholem izopropylowym (IPA) i wodą dejonizowaną (DI; 18 MΩ/cm2). Suszyć suchym N2. Następnie ponownie wyczyść taśmą klejącą.
    3. Umieść szklane podłoże z prefabrykowanymi elektrodami i przygotowaną formą PDMS (cechą skierowaną do góry) w myjce plazmowej.
    4. Wystawić oba na działanie plazmy tlenowej przez 2 minuty (100-300 mTorr, 30 W).
    5. Wyrównaj i umieść formę PDMS stroną z funkcją skierowaną w dół na szklanym podłożu za pomocą prefabrykowanych elektrod.
      UWAGA: Klejenie jest natychmiastowe po zetknięciu się PDMS poddanego obróbce plazmowej ze szkłem; W związku z tym dalsze modyfikacje osiowania nie będą możliwe. Aby ułatwić wyrównanie, 20 μl metanolu w wodzie demineralizowanej w stosunku 2:1 można odpipetować na powierzchnię szkła poddanego obróbce plazmowej. Roztwór metanolu działa jak fizyczna bariera między obrabianym szkłem a PDMS, umożliwiając regulację wyrównania. W przypadku stosowania metanolu należy piec wyrównane i dopasowane urządzenie w temperaturze 50 °C przez 2 godziny, aby odparować roztwór i zakończyć proces wiązania.
    6. Sprawdź wzrokowo połączone urządzenie pod mikroskopem. Upewnij się, że elektrody i geometrie kanałów są prawidłowo wyrównane.

3. Zmierz komórki (Rysunek 1D)

  1. Przygotuj źródło ciśnienia, płytkę drukowaną, sprzęt laboratoryjny i oprogramowanie do akwizycji danych.
    1. Podłącz urządzenie mikroprzepływowe do płytki drukowanej za pomocą zacisku. Przykład płytki drukowanej znajduje się w pliku uzupełniającym 4 (pliki GERBER) i pliku uzupełniającym 5 (pliki schematów, płytek i list części PCB).
      1. Dopasuj sprężynowe styki zacisku do elektrod stykowych na urządzeniu mikroprzepływowym i wyrównaj kołki nagłówka zacisku z otworami na płytce drukowanej.
      2. Mocno włóż kołki nagłówka zacisku do otworów na płytce drukowanej, upewniając się, że kołki sprężynowe pozostają wyrównane z podkładkami stykowymi elektrody.
    2. Skonfiguruj i podłącz sprzęt elektroniczny.
      1. Podłącz dwa porty wyjściowe zasilacza do portu napięcia zasilania płytki drukowanej za pomocą podwójnego żeńskiego adaptera typu wtyk bananowy na Bayonet Neill-Concelman (BNC) i BNC.
      2. Włącz zasilanie. Ustaw wyjście podłączone do wewnętrznego przewodu BNC na +15 V, a drugie wyjście ustaw na -15 V. Włącz oba wyjścia do zasilania obwodu.
      3. Podłącz trzeci z portów wyjściowych zasilacza do portu napięcia wejściowego płytki drukowanej za pomocą BNC. Ustaw wyjście na żądane przyłożone napięcie, ale nie włączaj go do czasu rozpoczęcia eksperymentu.
      4. Podłącz port prądu wyjściowego płytki drukowanej do wejścia przedwzmacniacza prądowego za pomocą BNC.
      5. Podłącz wyjście przedwzmacniacza prądowego do jednego wejścia analogowego na listwie zaciskowej BNC systemu akwizycji danych za pomocą BNC. Opcjonalnie podłącz analogowy filtr dolnoprzepustowy na linii z BNC, aby odfiltrować zakłócenia o wysokiej częstotliwości.
        UWAGA: Aby poprawić SNR, płytka drukowana i urządzenie mogą być umieszczone w grubej metalowej obudowie. Wszystkie BNC i rurki fluidyczne mogą być poprowadzone przez otwory wywiercone w obudowie.
    3. Zainstaluj i skonfiguruj wymagane oprogramowanie na komputerze osobistym (PC)
      1. Włącz i podłącz regulator ciśnienia do komputera. Zainstaluj wymagane oprogramowanie regulatora ciśnienia zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Zainstaluj MATLAB i przybornik do akwizycji danych na komputerze. Upewnij się, że są zainstalowane wymagane sterowniki systemu akwizycji danych, aby interfejs MATLAB Data Acquisition Toolbox mógł go wykryć.
      3. Pobierz dołączony skrypt akwizycji danych "NPS.m" z https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Otwórz i skonfiguruj skrypt akwizycji danych.
      1. Ustaw poprawne wartości, aby zainicjować sesję akwizycji danych, która obejmuje identyfikator dostawcy, identyfikator urządzenia DAQ i numer kanału wejścia analogowego (wiersze 34-36 w dołączonym skrypcie).
        UWAGA: Identyfikator urządzenia można znaleźć za pomocą funkcji "daq.getDevices" lub "daqlist".
      2. Ustaw żądaną częstotliwość próbkowania dla akwizycji (wiersz 23 w dołączonym skrypcie). Aby uzyskać optymalne wyniki, należy go ustawić na co najmniej 10 kHz.
  2. Przygotować zawiesinę komórkową.
    1. Przygotować roztwór 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przefiltrować filtrem 0,22 μm.
    2. Hodowla i przygotowanie komórek zgodnie z odpowiednim protokołem hodowli komórkowej wybranej linii komórkowej. Zawiesić komórki w przygotowanym roztworze 2% FBS w 1x PBS o stężeniu 1-5 x 105 komórek/ml. Utrzymuj komórki na lodzie na czas trwania eksperymentów.
  3. Zmierz właściwości fizyczne komórek.
    1. Załaduj próbkę ogniwa do rurki i podłącz ją do wlotu urządzenia.
      1. Przetnij 30 cm rurki PTFE żyletką lub ostrym nożem.
      2. Podłącz jeden koniec rurki do strzykawki typu luer lock. Za pomocą strzykawki pobrać próbkę komórek na drugi koniec rurki.
      3. Ostrożnie włóż rurkę do wlotu urządzenia.
      4. Podłącz przeciwległy koniec rurki do mikroprzepływowego regulatora ciśnienia.
        UWAGA: Między regulatorem ciśnienia mikroprzepływowego a rurką można dodać filtr, aby zapobiec cofaniu się cieczy do regulatora ciśnienia.
    2. Uruchom eksperyment.
      1. Ustawić żądane stałe ciśnienie napędowe w oprogramowaniu regulatora ciśnienia i pozwolić, aby próbka wypełniła urządzenie.
        UWAGA: Ciśnienie wynosi zwykle 2-21 kPa. Prędkość przepływu musi być wystarczająco niska, aby umożliwić jasno określone impulsy, ale wystarczająco szybka, aby umożliwić odpowiednią przepustowość.
        1. Jeśli w kanałach mikroprzepływowych tworzą się pęcherzyki, należy zastosować wypełnienie ślepym zaułkiem: zatkać wylot urządzenia i przyłożyć niskie ciśnienie do wlotu, aby wypchnąć powietrze przez przepuszczalny dla gazu PDMS. Pozostawienie pęcherzyków w kanale doprowadzi do niestabilnej linii bazowej prądu i uniemożliwi dokładne pomiary.
        2. Jeśli zanieczyszczenia zatkają kanał mikroprzepływowy, usuń go, lekko naciskając górną część urządzenia PDMS podczas wywierania ciśnienia sterującego, "pulsując" wyższe ciśnienie poprzez włączanie i wyłączanie ciśnienia lub wyjmując rurkę i wkładając ją ponownie. Jeśli zanieczyszczenia pozostaną, może być konieczne przejście na nowe urządzenie.
      2. Ustaw żądane napięcie, obracając pokrętło Voltage na zasilaczu i włącz napięcie, naciskając przycisk On.
        UWAGA: Napięcie wynosi zazwyczaj 1-5 V. Wybierz najniższe napięcie niezbędne do uzyskania odpowiedniego SNR. To samo napięcie powinno być używane we wszystkich warunkach, które mają być porównywane.
      3. Włącz prąd przedwzmacniacz i ustaw czułość (A/V) tak nisko, jak to możliwe; alternatywnie, ustaw wzmocnienie (V/A) tak wysoko, jak to możliwe, bez przeciążania przedwzmacniacza lub przekraczania maksymalnego analogowego napięcia wejściowego DAQ. W tym badaniu czułość ustawiono na 10-7 A/V.
        UWAGA: Właściwa wartość czułości/wzmocnienia będzie zależeć zarówno od przyłożonej objętościtage, jak i rezystancja linii bazowej kanału mikroprzepływowego.
      4. Naciśnij zielony przycisk Uruchom w menu wstążki programu MATLAB, aby uruchomić skrypt akwizycji danych NPS.m i rozpocząć próbkowanie i zapisywanie danych.
      5. Aby zakończyć eksperyment, naciśnij przycisk Stop w lewym dolnym rogu okna rysunku, aby zatrzymać skrypt akwizycji danych. Wyłącz wyjście zasilania, naciskając przycisk On. Ustaw źródło ciśnienia na ciśnienie zerowe w oprogramowaniu regulatora ciśnienia.
      6. W tym momencie eksperyment można wstrzymać, aby wykonać co najmniej jedną z następujących czynności:
        1. Wymień obecne urządzenie na nowe.
        2. Ponownie załaduj rurkę większą liczbą próbek komórek.
          UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki, należy używać nowych urządzeń do pomiaru komórek różnych typów lub stanów.
        3. Odkręć urządzenie od płytki drukowanej i zbadaj stan kanału pod mikroskopem. Aby wznowić eksperyment przy użyciu tego samego urządzenia, należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Może być konieczne delikatne dociśnięcie tłoka strzykawki, aby utrzymać próbkę komórek na samym końcu rurki podczas wkładania jej do wlotu urządzenia.

4. Skalibruj urządzenie mikroprzepływowe

  1. Opcja 1: Zmierz kulki polistyrenowe w urządzeniach referencyjnych.
    1. Wybierz rozmiar listwy polistyrenowej, który jest mniejszy niż kanał do wymiarowania.
    2. Dodaj 1,5% Tween i kulki polistyrenowe do przefiltrowanego roztworu PBS i FBS używanego podczas eksperymentów z komórkami, w stężeniu 1-3 x 105 kulek/ml.
    3. Kontynuuj eksperyment zgodnie z opisem w sekcji 3, używając urządzenia referencyjnego opisanego w kroku 1.3 i przyłóż to samo napięcie, które jest używane podczas eksperymentowania. Do obliczenia De należy użyć średniej wielkości bieżącego spadku wytwarzanego, gdy koraliki przechodzą przez pory zaklejające i znanej średnicy kulek, jak opisano w sekcji 5.
  2. Opcja 2: Niezależny pomiar rozmiaru komórki za pomocą oddzielnego urządzenia pomiarowego.
    1. Zamiast postępować zgodnie z protokołem opisanym w kroku 4.1, należy użyć dostępnego na rynku przyrządu do pomiaru wielkości komórek, aby zmierzyć średnią wielkość komórek w próbce. W takim przypadku nie jest potrzebne żadne urządzenie referencyjne. Użyj średniego spadku prądu wytwarzanego, gdy komórki przechodzą przez pory zaklejające i zmierzonej średniej średnicy ogniwa, aby obliczyć De zgodnie z opisem w sekcji 5.

5. Analizuj dane, aby wyodrębnić fenotypy komórek

UWAGA: Przetwarzanie danych można przeprowadzić za pomocą pliku programu interfejsu wiersza poleceń MATLAB mNPS_procJOVE.m na https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Zobacz Plik uzupełniający 6, aby uzyskać więcej instrukcji.

  1. Wstępnie przetwórz dane (Rysunek 3A).
    1. Oblicz zmierzony prąd elektryczny, stosując wartość wzmocnienia używaną w przedwzmacniaczu prądowo-napięciowym do surowych danych uzyskanych przez DAQ.
    2. Usuń szum o wysokiej częstotliwości, stosując funkcję prostokątnego wygładzania i/lub filtr dolnoprzepustowy do pomiaru prądu surowego. Następnie ponownie próbkuj przefiltrowane dane do niższej częstotliwości próbkowania. Należy również obliczyć odpowiednie dane sygnatury czasowej przy tej niższej częstotliwości próbkowania.
    3. Oblicz dopasowany sygnał prądu linii bazowej, stosując metodę, taką jak asymetryczne wygładzanie metodą najmniejszych kwadratów26.
    4. Oblicz przybliżoną pierwszą pochodną (sygnał różnicowy) wstępnie przetworzonych bieżących danych, biorąc różnicę między kolejnymi punktami danych.
  2. Zidentyfikuj zdarzenia komórkowe i wyodrębnij dane subpulsacyjne ( Rysunek 3B).
    1. Wyszukaj zdarzenia w komórce kandydującej, sprawdzając wstępnie przetworzone dane. Odrzuć zdarzenia komórkowe, które nakładają się na inne zdarzenia komórkowe (tj. zdarzenia koincydencji) (rysunek uzupełniający 4), wykazują słabe dopasowanie linii bazowej lub mają nieoczekiwany lub błędny kształt impulsu (np. gdy w kanale mogło być zatkanie).
    2. Wyodrębnij dane subimpulsów dla każdego zdarzenia w komórce.
      1. Każdy segment porów węzła pojawi się jako odpowiadający mu podimpuls w ogólnym impulsie sygnału (rysunki 1B, C). Zidentyfikuj początek każdego podimpulsu, obliczając punkt czasowy, w którym sygnał różnicowy osiąga lokalną wartość minimalną. Zidentyfikuj koniec każdego podimpulsu, obliczając punkt czasowy, w którym sygnał różnicowy osiąga lokalną wartość maksymalną.
      2. Określ szerokość każdego podimpulsu jako czas, jaki upłynął między punktem czasu początkowego i końcowego. Określ amplitudę każdego podimpulsu, obliczając średnią różnicy między zmierzonym prądem a prądem linii bazowej dla wszystkich punktów danych między punktami czasu początkowego i końcowego.
  3. Określ mechanofenotyp komórki dla każdego zdarzenia komórkowego na podstawie danych subimpulsowych.
    1. Określ średnicę komórki d na podstawie równania zdefiniowanego przez Deblois i Bean24:
      figure-protocol-4
      gdzie ΔI/I jest średnim stosunkiem amplitudy podimpulsu do prądu linii podstawowej w podimpulsach wymiarowania, De jest efektywną średnicą kanału (mierzoną w kroku 4), a L jest całkowitą długością kanału porowo-węzłowego.
      1. De wyznacza się, obliczając średnią ΔI/I wytworzoną przez zestaw cząstek o znanej średnicy (komórek lub kulek, patrz krok 4), używając tej znanej średnicy jako d i rozwiązując równanie 1 dla De.
    2. Określ ilościowo odporność ogniwa na odkształcenia.
      1. Określ prędkość przepływu płynu U, obliczając średnią prędkość komórki w podimpulsach wymiarowania, używając znanych długości segmentów i zmierzonego czasu trwania każdego podimpulsu.
      2. Określ wskaźnik odkształcalności całej komórki (wCDI), zdefiniowany przez Kim et al.2 jako:
        figure-protocol-5
        gdzie Lc jest długością segmentu skurczu, kanał h jest wysokością kanału, a ΔTc jest czasem trwania podimpulsu skurczu.
    3. Zidentyfikuj czas odzyskiwania komórki po deformacji, zdefiniowany jako pierwszy podimpuls odzyskiwania o amplitudzie w granicach 8% średniej amplitudy z podimpulsu wymiarowania2.
    4. Oblicz odkształcenie poprzeczne komórki w segmencie skurczu.
      1. Oblicz efektywną średnicę segmentu skurczu (De,c) zgodnie z definicją Kim et al.2: figure-protocol-6, gdzie wc jest szerokością segmentu skurczu, a wnp jest szerokością wszystkich pozostałych segmentów.
      2. Oblicz równoważną średnicę sferyczną dc komórki w obrębie skurczu, ponownie korzystając z równania zdefiniowanego przez Deblois i Bean24:
        figure-protocol-7
        gdzie ΔIc/Ic jest stosunkiem amplitudy podimpulsu do prądu linii podstawowej w podimpulsie skurczowym, a Lc jest długością segmentu skurczu.
      3. Oblicz długość wydłużenia komórki Ldeformacja zgodnie z opisem Kim et al.2:
        figure-protocol-8
      4. Na koniec oblicz poprzeczne odkształcenie δdeformację komórki, które jest zdefiniowane przez Kim et al.2 jako figure-protocol-9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj platforma mechanofenotypowania jest prostym i wszechstronnym podejściem do pomiaru właściwości biofizycznych pojedynczych komórek z umiarkowaną przepustowością. Komórki są przepływane przez kanał mikroprzepływowy (Rysunek 1A) przy stałym przepływie napędzanym ciśnieniem. Podczas tranzytu komórek długość kanału mikroprzepływowego i wytwarzane impulsy prądowe są rejestrowane za pomocą sprzętu do akwizycji danych. Uzyskany sygnał ( Rysunek 1B,C) je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar właściwości mechanicznych pojedynczych komórek za pomocą tej techniki mechanofenotypowania składa się z trzech etapów: produkcji urządzenia, akwizycji danych i analizy danych. W ramach każdego etapu pojawiają się godne uwagi aspekty, które mogą znacząco wpłynąć na wyniki eksperymentu. Podczas produkcji urządzeń spójna geometria kanałów i jednorodność między urządzeniami mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników. W szczególności ściany boczne każdego urządzenia powinny być względnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L. L. S posiada amerykański patent nr 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han i L. L. Sohn, wydany 12 lipca 2022 r.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z NIBIB 1R01EB024989-01 i NCI 1R01CA190843-01. A. L. i R. R. byli wspierani przez stypendium H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. było wspierane przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship oraz Siebel Scholar Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonJ.T. Baker5356-05Czystość (GC)  ≥ 99,5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Folia aluminiowaniedotyczy nie dotyczy
Analogowy filtr dolnoprzepustowyThorLabsEF504≤ Pasmo przepustowe 240 kHz, koncentryczny przepust BNC  (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Dziurkacz do biopsjiIntegra Miltex33-31AA-P/251mm, Jednorazowe, z Tłokiem (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Ostrzeniedotyczy
BNCPomona Electronics2249-C-12https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
Średni=CPC& utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW& utm_term=
& utm_content=Koncentryczne%20Kable%20%28RF%29& gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
W-EALw_wcB
Wacik poliestrowy do pomieszczeń czystychThermo Fisher Scientific18383https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Przedwzmacniacz prądowyDL Instruments1211https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Niestandardowa płytka drukowana (z komponentami)n/anie dotyczy patrz Pliki uzupełniające 4 i 5
Blok zacisków DAQNational InstrumentsBNC-2120https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ do BNC-2110 National InstrumentsSHC68-68-EPMhttps://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ)National InstrumentsPCI-6251https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
EksykatorThermo Fisher Scientific5311-0250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
żeński Przejściówka BNC na wtyczkę bananowąPomona Electronics72909https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR89510-186
https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs Nóż do szkłaChemglassCG-1179-21https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Złoty wytrawiacz transenowy TFANC0977944https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Płyta grzejnaThermo Fisher ScientificSP131825 
Spektrum alkoholu izopropylowegoChemicznyI1056-4LTPLCzystość (GC)  ≥ 99,5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metalowa obudowasprzętowa Hammond ManufacturingEJ12126https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
MetanolSigma-Aldrich34860Czystość (GC)  ≥ 99,8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 DeveloperKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive PhotoresistDuPontn/ahttps://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
PhotomaskFineline Imagingn/aPhotomask są zamawiane na zamówienie z naszych projektów CAD (https://www.fineline-imaging.com/)
Szkiełko mikroskopowe ze zwykłego szkłaFisher Scientific12-553-5BMateriał: wapno sodowane, dł. 75 x szer. 50 mm, grubość: 0,90 mm; 1,10 mm 
Myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-001https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
plastikowa szalka PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875712100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Regulator ciśnieniaFluigentMFCS-EZhttps://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Oprogramowanie regulatora ciśnieniaFluigentMAESFLO
Programowanie i Oprogramowanie obliczenioweMATLABR2021bdo akwizycji i analizy danych (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
Rurka PTFECole Parmer06417-310,032" ID x 0,056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórekMillapore SigmaPHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer WaferWorld288576,2 mm, jednostronnie polerowany (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coatern/an/a
SU-8 3025 Negatywny fotorezystorKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 DeveloperKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 PolydimethlysiloxaneDowChemical 4019862https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
TaśmaScotch810-341296https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Tytan, Platyna, ZłotoNiedotyczy Zasilacz z potrójnym
wyjściemMaska E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 Maska UV Keysight
MaskaKarl Suss AmericaMJB3 Aligner 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091(2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619(2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772(2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301(2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529(2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542(2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982(2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050(2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Viskoelastyczno pojedynczych kom rekplatforma mikroprzep ywowafenotypowanie mechanicznepomiar bez u ycia znacznik wdeformacja kom rkipomiar elektronicznyw a ciwo ci mechaniczne kom rekanaliza ko cowalitografia mi kka

Powiązane artykuły