Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64665

⸱

2 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Streszczenie

Właściwości mechaniczne komórek są zaangażowane w wiele różnych procesów biologicznych i chorób, począwszy od różnicowania komórek macierzystych, a skończywszy na przerzutach raka. Konwencjonalne metody pomiaru tych właściwości, takie jak mikroskopia sił atomowych (AFM) i aspiracja mikropipetami (MA), pozwalają uzyskać bogate informacje, odzwierciedlając pełną odpowiedź lepkosprężystą komórki; Metody te są jednak ograniczone bardzo niską przepustowością. Podejścia wysokoprzepustowe, takie jak cytometria odkształcalności w czasie rzeczywistym (RT-DC), mogą mierzyć tylko ograniczone informacje mechaniczne, ponieważ często ograniczają się do odczytów jednoparametrowych, które odzwierciedlają tylko właściwości sprężyste komórki. W przeciwieństwie do tych metod, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) jest elastyczną, bezznacznikową platformą mikroprzepływową, która wypełnia lukę w osiąganiu wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych komórki o umiarkowanej przepustowości. Pomiar prądu stałego (DC) służy do monitorowania komórek podczas przechodzenia przez kanał mikroprzepływowy, śledząc ich rozmiar i prędkość przed, w trakcie i po przepchnięciu przez wąskie zwężenie. Informacje te (tj. rozmiar i prędkość) są wykorzystywane do ilościowego określenia odkształcenia poprzecznego każdej komórki, odporności na deformację i powrotu do zdrowia po deformacji. Ogólnie rzecz biorąc, ta oparta na elektronice platforma mikroprzepływowa zapewnia wiele właściwości lepkosprężystych komórek, a tym samym pełniejszy obraz stanu mechanicznego komórki. Ponieważ wymaga minimalnego przygotowania próbki, wykorzystuje prosty pomiar elektroniczny (w przeciwieństwie do szybkiej kamery) i wykorzystuje standardową produkcję miękkiej litografii, implementacja tej platformy jest prosta, dostępna i można ją dostosować do dalszej analizy. Elastyczność, użyteczność i czułość tej platformy dostarczyły unikalnych informacji mechanicznych na temat różnorodnych komórek, z potencjałem do wielu innych zastosowań w naukach podstawowych i diagnostyce klinicznej.

Wprowadzenie

Pojedyncze komórki to dynamiczne, lepkosprężyste materiały1. Mnogość procesów wewnętrznych i zewnętrznych (np. początek mitozy lub przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej [ECM]) wpływa na ich strukturę i skład2,3,4, często skutkując odrębnymi właściwościami biofizycznymi, które uzupełniają ich obecny stan. W szczególności wykazano, że właściwości mechaniczne są ważnymi biomarkerami rozwoju komórkowego, fizjologii i patologii, dostarczając cennych informacji ilościowych, które mogą uzupełnić kanoniczne podejścia molekularne i genetyczne5,6,7. Na przykład Li i wsp. opisali niedawno mechaniczne różnice między opornymi na leki i reagującymi na leki komórkami ostrej białaczki promielocytowej, jednocześnie używając sekwencji RNA do odkrycia genów związanych z cytoszkieletem o zróżnicowanej ekspresji8. Dzięki zrozumieniu złożonych zależności między mechaniką pojedynczej komórki a funkcją komórki, mechanofenotytypowanie ma szersze zastosowanie w przekształcaniu nauk podstawowych i diagnostyki klinicznej9.

Najbardziej powszechnie stosowanym narzędziem do pomiaru mechaniki pojedynczej komórki jest mikroskopia sił atomowych (AFM). Chociaż AFM umożliwia zlokalizowany pomiar właściwości mechanicznych komórek w wysokiej rozdzielczości, pozostaje ograniczony do przepustowości <0,01 komórek/s10. Alternatywnie, napinacze optyczne, które wykorzystują dwie rozbieżne wiązki laserowe do wychwytywania i deformowania zawieszonych pojedynczych komórek11, są ograniczone do nieznacznie wyższych przepustowości <1 cell/s12. Ostatnie postępy w technologiach mikroprzepływowych umożliwiły stworzenie nowej generacji urządzeń do szybkiej, jednokomórkowej, mechanicznej oceny12,13. Techniki te wykorzystują wąskie kanały zwężające14,15, shear flow16, lub hydrodynamiczne rozciąganie17, aby szybko zdeformować komórki przy przepustowości 10-1,000 komórek/s18. Chociaż tempo pomiaru w tych metodach jest znacznie szybsze niż w przypadku konwencjonalnych technik, często zamieniają one możliwości w zakresie wysokiej przepustowości na ograniczone odczyty mechaniczne (Tabela uzupełniająca 1). Wszystkie wyżej wymienione szybkie metody mikroprzepływowe koncentrują się na podstawowych, jednoparametrowych wskaźnikach, takich jak czas przejścia lub współczynniki odkształcalności, które odzwierciedlają tylko właściwości sprężyste komórki. Jednak biorąc pod uwagę wewnętrzną lepkosprężystą naturę pojedynczych komórek, solidna i dokładna charakterystyka mechaniczna komórek wymaga uwzględnienia nie tylko składników elastycznych, ale także reakcji lepkich.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Rysunek 1A) to platforma mikroprzepływowa, która rozwiązuje istniejące ograniczenia w mechanofenetypowaniu pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar wielu parametrów biofizycznych, w tym średnicy komórki, względnej odkształcalności i czasu rekonwalescencji po odkształceniu, przy umiarkowanej przepustowości 1-10 komórek/s. Technika ta opiera się na wykrywaniu porów węzłów (NPS)19,20,21,22,23,24, który polega na użyciu czteropunktowego pomiaru sondą do pomiaru modulowanego impulsu prądu wytwarzanego przez komórkę przechodzącą przez kanał mikroprzepływowy, który został podzielony na szersze obszary, zwane "węzłami". Modulowany impuls prądowy jest wynikiem częściowego blokowania przez ogniwo przepływu prądu w segmentach (tj. "porach") i węzłach, przy czym w pierwszym z nich blokuje się więcej prądu niż w drugim. W mechano-NPS jeden segment, "kanał skurczu", jest węższy niż średnica komórki; w związku z tym komórka musi się zdeformować, aby przejść przez cały kanał (Rysunek 1B). Średnicę komórki można określić na podstawie wielkości podimpulsu wytwarzanego, gdy komórka przechodzi przez pory węzłów przed kanałem skurczu (Rysunki 1B, C). Tutaj |ΔInp|, bieżący spadek, gdy komórka znajduje się w porach, jest proporcjonalny do stosunku objętości komórki do poru, komórka V/Vpor<sup class="xref">2,8,19. Sztywność komórki można określić za pomocą ΔTc, czasu trwania znacznie większego podimpulsu wytwarzanego, gdy komórka przechodzi przez kanał skurczu (Rysunki 1B, C). Sztywniejsza komórka będzie potrzebowała więcej czasu na przejście przez kanał niż bardziej miękka komórka2,8. Wreszcie, "regeneracja" komórki, zdolność komórki do powrotu do pierwotnego rozmiaru i kształtu po deformacji, może być określona przez serię podimpulsów wytwarzanych, gdy komórka przechodzi przez pory węzłów za kanałem skurczu (Rysunki 1B, C). Czas odzyskiwania, ΔTr, to czas potrzebny na powrót obecnych podimpulsów do wielkości poprzednich podimpulsów, zanim ogniwo zostanie ściśnięte. Ogólnie rzecz biorąc, modulowane impulsy prądu wytwarzane przez komórkę przechodzącą przez kanał mikroprzepływowy są rejestrowane i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów mechanicznych pojedynczej komórki ( Rysunek 1D) < sup class = "xref" >2,8.

Powtarzalność i łatwość użycia tej opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej została już wcześniej zademonstrowana25. Ponadto platforma stanowi niską barierę wejścia dla mechanofenotypowania pojedynczych komórek. Standardowa miękka litografia jest stosowana do wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych. Sprzęt pomiarowy składa się z niedrogich komponentów, w tym prostej płytki drukowanej (PCB), zasilacza, przedwzmacniacza, płytki akwizycji danych (DAQ) i komputera. Wreszcie, dostępny jest przyjazny dla użytkownika kod do pozyskiwania i analizy danych, co umożliwia prostą implementację. Ta technika mechanofentypowania może rozróżnić populacje niezłośliwych i złośliwych linii komórek nabłonka piersi i płuc, rozróżnić podlinie w pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka sutka oraz scharakteryzować skutki zaburzeń cytoszkieletu i innych czynników farmakologicznych2,8. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta jest skutecznym podejściem do mechanofenotypowania pojedynczych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zaprojektuj geometrię urządzenia

  1. Wybierz szerokość segmentów kalibracyjnego i odzyskującego tak, aby była większa niż średnica największych komórek do pomiaru, ale jednocześnie zapewniała wystarczający stosunek sygnału do szumu (SNR). Przykłady różnych szerokości segmentów kalibracyjnych i odzyskujących dla różnych linii komórkowych przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 2.
  2. Wybierz szerokość segmentu kurczliwego, aby wywołać odkształcenie komórek poddawanych mechanofenotypowaniu w zakresie 30%–40%. Odkształcenie definiuje się jako formuła równowagi statycznej ε=(d-wc)/d, równanie odkształcenia w układach mechanicznych, gdzie d to średnica komórki, a wc to szerokość kanału kurczliwego2,8. Przykłady różnych szerokości segmentów kurczliwych dla różnych linii komórkowych zamieszczono w Tabeli uzupełniającej 2.
    UWAGA: Jeśli chce się porównać typy komórek lub warunki o znacznie różniących się średnicach, należy użyć oddzielnych projektów urządzeń z szerokościami segmentów kurczliwych dostosowanymi do każdego typu komórki lub warunku.
  3. Zaprojektuj urządzenie referencyjne dla każdej unikalnej geometrii urządzenia. Jest to konieczne do wyznaczenia De, czyli efektywnej średnicy segmentu poru kalibracyjnego kanału mikropłynowego.
    UWAGA: Urządzenie referencyjne ma taką samą geometrię jak urządzenie podstawowe. Jedyną modyfikacją jest to, że segment kurczliwy powinien mieć taką samą szerokość jak segment poru kalibracyjnego, aby umożliwić kalibrację za pomocą kulek polistyrenowych o znanej wielkości. Poszerzenie segmentu kurczliwego zapobiega zatykaniu kanału kurczliwego przez kulki polistyrenowe podczas kalibracji. Proces kalibracji szczegółowo opisano w krokach 4.1 i 5.3.1. Kalibrację można również przeprowadzić za pomocą komercyjnego licznika komórek, w takim przypadku nie jest potrzebne urządzenie referencyjne. Ten proces opisano w kroku 4.2.
  4. Wybierz wysokość kanału tak, aby największe badane komórki mogły się w pełni wydłużyć bez ograniczeń w segmencie kurczliwym2. Upewnij się, że wysokość kanału jest większa niż hmin Równanie analizy wymiarowej z formułą sqrt(d³/wc) w kontekście badań naukowych. (zakłada się, że komórka przed odkształceniem ma kształt sferyczny oraz że odkształcenie izometryczne zachodzi wzdłuż długości i wysokości kanału podczas deformacji).
    UWAGA: Biorąc pod uwagę wielkość podpulsu prądu, Równowaga, ΔI/I ∝ Vcell/Vpore, równanie, objętość komórki, objętość poru, analiza sygnału elektrycznego., im większa jest wartość hmin, tym niższy będzie ogólny stosunek sygnału do szumu (SNR).
  5. Zaprojektuj i utwórz fotomaszkę za pomocą oprogramowania CAD z wybranymi szerokościami kanałów. Przykładowy plik zamieszczono w Plku uzupełniającym 1. Powiększ projekt mikropłynowej maski o 1,5%, aby skompensować kurczenie się polidimetylosiloksanu (PDMS) po zdjęciu z negatywowej matrycy.
    UWAGA: Na jednej masce można umieścić zestaw urządzeń, o ile całkowity rozmiar zestawu nie przekracza rozmiaru płytki krzemowej (Ryc. uzupełniająca 1A).
  6. Zaprojektuj i utwórz fotomaszkę z elektrodami, które będą używane do czteropunktowego pomiaru prądu w urządzeniu mikropłynowym (Ryc. 1D). Przykładowy plik zamieszczono w Plku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Na jednej masce można umieścić zestaw elektrod, o ile rozmiar zestawu nie przekracza rozmiaru szkiełka mikroskopowego (Ryc. uzupełniająca 1B).

2. Wykonaj urządzenia (Rysunek 2)

  1. Przygotuj wzory elektrod na podłożu szklanym.
    1. Nanieś, wyeksponuj i wywołaj pozytywny fotorezyst na zwykłą szklaną płytkę zgodnie z kartą danych produktu. Przykład tej procedury przedstawiono w Dodatkowym pliku 2.
    2. Przeprowadź napylanie metali, odlanie i trawienie złota.
      1. Wykonaj napylanie cienkiej warstwy 75 Å Ti, 250 Å Pt oraz 250 Å Au na płytkę. Przykład tej procedury z zastosowaniem odparowania elektronowego przedstawiono w Dodatkowym pliku 3.
      2. Zanurz płytkę w acetonie na 15 minut, aby usunąć nadmiar metalu metodą lift-off.
      3. W okapie wentylacyjnym użyj jednorazowej pipety, aby nanieść roztwór trawiący złoto na obszar elektrod, który będzie wystawiony na działanie kanału mikroprzepływowego, jak pokazano na Dodatkowym rysunku 2. Uważaj, aby nie trawić innych obszarów płytki.
        UWAGA: Środek trawiący złoto może powodować podrażnienie skóry i oczu. Nie wdychaj oparów i nie połykaj. Postępuj ostrożnie, używaj odpowiedniego sprzętu ochrony indywidualnej (PPO) i usuwaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
      4. Opłucz płytkę wodą dejonizowaną (DI) i osusz suchym azotem (N2).
    3. Jeśli na tej samej szklanej płytce wydrukowano wiele elektrod, pokrój płytkę na pojedyncze chipy.
      1. Użyj narzędzia do cięcia szkła, aby nanieść nacięcia wzdłuż granic wzorów elektrod.
      2. Przełam szkło wzdłuż nacięć, aby podzielić płytkę na pojedyncze chipy.
    4. Sprawdź elektrody w mikroskopie. Upewnij się, że poszczególne elektrody nie są rozwarte elektrycznie i że elektrody nie są zwarte ze sobą.
  2. Wykonaj negatywny formę master dla kanałów.
    1. Nanieś, wyeksponuj i wywołaj fotorezyst epoksydowy SU-8 na polerowaną krzemową tafelkę zgodnie z kartą danych produktu. Przykład tej procedury przedstawiono w Dodatkowym pliku 2.
    2. Pomierz wysokości struktur za pomocą profilometru i sprawdź je wizualnie w mikroskopie (Dodatkowy rysunek 3). Upewnij się, że żądane geometrie są dobrze zdefiniowane.
  3. Wykonaj kanały PDMS metodą litografii miękkiej.
    1. Przygotuj PDMS, odważając elastomer i crosslinker w stosunku masowym 10:1 w jednorazowym kubku.
      UWAGA: Dla tafelki o średnicy 3 cali, 30 g PDMS jest wystarczające.
    2. Mieszaj PDMS intensywnie przez 30 s jednorazowym widełkami, aż PDMS stanie się nieprzezroczysty i zawiera pęcherzyki.
    3. Odgazuj PDMS w komorze próżniowej przez około 30–90 minut, lub aż PDMS stanie się przezroczysty i nie będzie widocznych pęcherzyków.
    4. Umieść tafelkę z formą master SU-8 w jednorazowym naczyniu Petriego i wlej PDMS na środek tafelki.
    5. Umieść naczynie Petriego z PDMS i tafelką w komorze próżniowej i odgazuj przez około 30 minut, lub aż nie pozostaną pęcherzyki w PDMS.
    6. Wypiecz PDMS w piecu lub na płytce grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
    7. Ostrożnym ostrzem odetnij i usuń PDMS z negatywnej formy master SU-8.
    8. Pokrój odlewany blok PDMS na pojedyncze formy ostrym ostrzem.
    9. Wykonaj otwory doprowadzające i odprowadzające za pomocą jednorazowego noża do biopsji. Dla najlepszych wyników używaj nowego noża do każdej płytki PDMS. Ostry nóż tworzy gładkie krawędzie otworów, minimalizując cząstki, które mogą zablokować kanał kurczliwy.
      UWAGA: Średnica otworów doprowadzających powinna być nieco mniejsza niż zewnętrzna średnica wężyka. Na przykład, jeśli używasz wężyka z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy zewnętrznej 1/32 cala, należy wykonać otwór o średnicy 1,5 mm.
  4. Połącz podłoże szklane/elektrodowe z kanałami PDMS.
    1. Wyczyść szklane płytki z elektrodami metanolem (≥99,8%). Osusz suchym N2.
    2. Wyczyść urządzenie PDMS taśmą scotch, a następnie opłucz alkoholem izopropylowym (IPA) i wodą dejonizowaną (DI; 18 MΩ/cm2). Osusz suchym N2. Następnie ponownie wyczyść taśmą scotch.
    3. Umieść szklane podłoże z wstępnie wytworzonymi elektrodami oraz przygotowaną formę PDMS (stroną struktur do góry) w czyszczeniu plazmowym.
    4. Naświetlaj oba elementy tlenową plazmą przez 2 minuty (100–300 mTorr, 30 W).
    5. Wyrównaj i umieść formę PDMS stroną struktur do dołu na szklanym podłożu z wstępnie wytworzonymi elektrodami.
      UWAGA: Połączenie następuje natychmiastowo po zetknięciu plazmowego PDMS i szkła; w związku z tym dalsze korekty wyrównania nie będą możliwe. Aby ułatwić wyrównanie, można pipetować 20 µL roztworu metanolu w wodzie DI (w stosunku 2:1) na plazmowo obrabianą powierzchnię szkła. Roztwór metanolu działa jako bariera fizyczna między obrabianym szkłem a PDMS, umożliwiając korektę wyrównania. Jeśli stosuje się metanol, wypiecz połączone urządzenie w temperaturze 50 °C przez 2 godziny, aby odparować roztwór i ukończyć proces wiązania.
    6. Sprawdź połączone urządzenie w mikroskopie. Upewnij się, że elektrody i geometria kanałów są prawidłowo wyrównane.

3. Pomiary komórek (Rycina 1D)

  1. Przygotuj źródło ciśnienia, płytę PCB, sprzęt stołowy oraz oprogramowanie do akwizycji danych.
    1. Połącz urządzenie mikropłynne z płytą PCB za pomocą zacisku. Przykład płyty PCB przedstawiono w Pliku uzupełniającym 4 (pliki GERBER) oraz w Pliku uzupełniającym 5 (schemat, pliki płyty i lista części PCB).
      1. Wyrównaj sprężynowe pinezki zacisku z polami kontaktowymi elektrod na urządzeniu mikropłynnym oraz wyrównaj pinezki zacisku z otworami na płytce PCB.
      2. Wsuń mocno pinezki zacisku do otworów na płytce PCB, upewniając się, że sprężynowe pinezki pozostają wyrównane z polami kontaktowymi elektrod.
    2. Skonfiguruj i podłącz sprzęt elektroniczny.
      1. Połącz dwa wyjścia zasilacza z portem napięcia zasilania płytki PCB za pomocą podwójnego adaptera bananowego do żeńskiego złącza Bayonet Neill-Concelman (BNC) oraz kabla BNC.
      2. Włącz zasilacz. Ustaw wyjście podłączone do wewnętrznego przewodnika BNC na +15 V, a drugie wyjście na -15 V. Włącz oba wyjścia, aby zasilić obwód.
      3. Połącz trzecie wyjście zasilacza z portem napięcia wejściowego płytki PCB za pomocą kabla BNC. Ustaw wyjście na żądane napięcie, ale nie włączaj go, dopóki nie rozpoczniesz eksperymentu.
      4. Połącz port prądu wyjściowego płytki PCB z wejściem wstępniezmacniacza prądu za pomocą kabla BNC.
      5. Połącz wyjście wstępniezmacniacza prądu z jednym analogowym wejściem bloku zacisków BNC systemu akwizycji danych za pomocą kabla BNC. Opcjonalnie, podłącz liniowy analogowy filtr dolnoprzepustowy w szeregu z kablem BNC, aby wyeliminować zakłócenia o wysokiej częstotliwości.
        UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu (SNR), płytkę PCB i urządzenie można umieścić w grubej metalowej obudowie. Wszystkie kable BNC i przewody płynowe mogą być prowadzone przez otwory wywiercone w obudowie.
    3. Zainstaluj i skonfiguruj wymagane oprogramowanie na komputerze osobistym (PC).
      1. Włącz i podłącz regulator ciśnienia do komputera PC. Zainstaluj wszelkie wymagane oprogramowanie regulatora ciśnienia zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Zainstaluj MATLAB oraz Data Acquisition Toolbox na komputerze PC. Upewnij się, że zainstalowano wymagane sterowniki dla systemu akwizycji danych, aby interfejs Data Acquisition Toolbox w MATLAB mógł go wykryć.
      3. Pobierz dołączone skrypt do akwizycji danych, „NPS.m”, z https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Otwórz i skonfiguruj skrypt akwizycji danych.
      1. Ustaw odpowiednie wartości do zainicjowania sesji akwizycji danych, w tym identyfikator producenta (Vendor ID), identyfikator urządzenia DAQ oraz numer kanału wejścia analogowego (wiersze 34–36 w dołączonym skrypcie).
        UWAGA: Identyfikator urządzenia można znaleźć za pomocą funkcji „daq.getDevices” lub „daqlist”.
      2. Ustaw żądaną częstotliwość próbkowania (wiersz 23 w dołączonym skrypcie). Dla optymalnych wyników powinna ona wynosić co najmniej 10 kHz.
  2. Przygotuj zawiesinę komórek.
    1. Przygotuj roztwór 2% cielęcego surowicy płodowej (FBS) w 1x buforze fosforanowym (PBS) i przefiltruj go przez filtr o wielkości porów 0,22 µm.
    2. Kulturowanie i przygotowanie komórek przeprowadź zgodnie z odpowiednim protokołem hodowli komórek wybranej linii komórkowej. Zawieś komórki w przygotowanym roztworze 2% FBS w 1x PBS w stężeniu 1–5 x 105 komórek/mL. Przez cały czas trwania eksperymentów trzymaj komórki na lodzie.
  3. Zmierz właściwości fizyczne komórek.
    1. Wprowadź próbkę komórkową do przewodu i podłącz ją do wejścia urządzenia.
      1. Odtnij 30 cm węża PTFE za pomocą ostrza brzytwy lub ostrego noża.
      2. Przymocuj jeden koniec węża do strzykawki z zatrzaskiem Luer Lock. Użyj strzykawki, aby wciągnąć próbkę komórkową do drugiego końca węża.
      3. Delikatnie wsuń wąż do wejścia urządzenia.
      4. Podłącz drugi koniec węża do regulatora ciśnienia mikropłynowego.
        UWAGA: Można dodać filtr pomiędzy regulatorem ciśnienia mikropłynowego a wężem, aby zapobiec cofaniu się cieczy do regulatora ciśnienia.
    2. Przeprowadź eksperyment.
      1. Ustaw żądane stałe ciśnienie napędowe w oprogramowaniu regulatora ciśnienia i pozwól próbce wypełnić urządzenie.
        UWAGA: Ciśnienie wynosi zazwyczaj 2–21 kPa. Prędkość przepływu musi być wystarczająco niska, aby uzyskać wyraźnie określone impulsy, ale wystarczająco duża, aby zapewnić odpowiednią wydajność.
        1. Jeśli w kanałach mikropłynowych powstają pęcherzyki, użyj wypełniania na ślepo: zablokuj wyjście urządzenia i zastosuj niskie ciśnienie na wejściu, aby wypchnąć powietrze przez gazoprzepuszczalny PDMS. Obecność pęcherzyków w kanale spowoduje niestabilną linię bazową prądu i uniemożliwi dokładne pomiary.
        2. Jeśli zanieczyszczenia zatykają kanał mikropłynowy, usuń je, delikatnie naciskając na górną część urządzenia PDMS podczas przyłożenia ciśnienia napędowego, „pulsując” wyższym ciśnieniem poprzez włączanie i wyłączanie ciśnienia lub usuwając i ponownie wstawiając wąż. Jeśli zanieczyszczenia pozostają, może być konieczna wymiana urządzenia.
      2. Ustaw żądane napięcie, obracając pokrętło Napięcie na zasilaczu i włącz napięcie, naciskając przycisk Włącz.
        UWAGA: Napięcie wynosi zazwyczaj 1–5 V. Wybierz najniższe napięcie konieczne do uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu (SNR). To samo napięcie powinno być stosowane we wszystkich warunkach, które mają być porównywane.
      3. Włącz wstępniezmacniacz prądu i ustaw czułość (A/V) na możliwie najniższy poziom; alternatywnie ustaw wzmocnienie (V/A) na możliwie najwyższy poziom, nie przeciążając wstępniezmacniacza ani nie przekraczając maksymalnego napięcia wejściowego analogowego systemu DAQ. W niniejszym badaniu czułość ustawiono na 10-7 A/V.
        UWAGA: Odpowiednia wartość czułości/wzmocnienia zależy zarówno od przyłożonego napięcia, jak i od oporu podstawowego kanału mikropłynowego.
      4. Naciśnij zielony przycisk Uruchom w menu wstążki MATLAB, aby rozpocząć skrypt akwizycji danych NPS.m i rozpocząć próbkowanie oraz zapisywanie danych.
      5. Aby zakończyć eksperyment, naciśnij przycisk Zatrzymaj w lewym dolnym rogu okna rysunku, aby zatrzymać skrypt akwizycji danych. Wyłącz wyjście zasilacza, naciskając przycisk Włącz. Ustaw źródło ciśnienia na zero w oprogramowaniu regulatora ciśnienia.
      6. W tym momencie eksperyment może zostać wstrzymany w celu wykonania jednej lub więcej z następujących czynności:
        1. Wymień bieżące urządzenie na nowe.
        2. Wprowadź ponownie do węża więcej próbek komórkowych.
          UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek, używaj nowych urządzeń do pomiaru komórek różnych typów lub w różnych warunkach.
        3. Odłącz urządzenie od płytki PCB i sprawdź stan kanału pod mikroskopem. Aby wznowić eksperyment z tym samym urządzeniem, należy zadbać o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Może być konieczne delikatne naciskanie na tłok strzykawki, aby utrzymać próbkę komórkową na samym końcu węża podczas jego wstawiania do wejścia urządzenia.

4. Kalibracja urządzenia mikropłynowego

  1. Opcja 1: Pomiar kulek polistyrenowych w urządzeniach referencyjnych.
    1. Wybierz rozmiar kulek polistyrenowych mniejszy niż kanał kalibrujący.
    2. Dodaj 1,5% Tween i kulki polistyrenowe do przefiltrowanego roztworu PBS i FBS używanego podczas eksperymentów z komórkami w stężeniu 1–3 x 105 kulek/mL.
    3. Przejdź do eksperymentu zgodnie z opisem w sekcji 3, używając urządzenia referencyjnego opisanego w kroku 1.3, i zastosuj takie samo napięcie, jak podczas eksperymentu. Użyj średniej wartości spadku natężenia prądu powstającego podczas przechodzenia kulek przez pory kalibrujące oraz znanego średnicy kulek do obliczenia De, jak opisano w sekcji 5.
  2. Opcja 2: Niezależny pomiar rozmiaru komórek przy użyciu oddzielnego urządzenia pomiarowego.
    1. Zamiast postępować zgodnie z protokołem opisanym w kroku 4.1, użyj komercyjnie dostępnego urządzenia do pomiaru rozmiaru komórek, aby zmierzyć średni rozmiar komórek w próbce. W tym przypadku nie jest potrzebne urządzenie referencyjne. Użyj średniego spadku natężenia prądu powstającego podczas przechodzenia komórek przez por kalibrujący oraz zmierzonej średniej średnicy komórek do obliczenia De, jak opisano w sekcji 5.

5. Analizuj dane w celu wyodrębnienia fenotypów komórkowych

UWAGA: Przetwarzanie danych można wykonać za pomocą pliku programu interfejsu wiersza poleceń MATLAB o nazwie mNPS_procJOVE.m pod adresem https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Aby uzyskać więcej instrukcji, zobacz Plik dodatkowy 6.

  1. Przetwórz dane (Rysunek 3A).
    1. Oblicz zmierzone natężenie prądu, stosując wartość wzmocnienia używaną w wzmacniaczu prądowo-napięciowym do surowych danych pozyskanych przez urządzenie DAQ.
    2. Usuń szumy wysokich częstotliwości, stosując funkcję wygładzania prostokątną i/lub filtr dolnoprzepustowy do pomiaru surowego prądu. Następnie przeprowadź ponowną próbkę przefiltrowanych danych z niższą częstotliwością próbkowania. Oblicz również odpowiadające dane czasowe (timestamp) dla tej niższej częstotliwości próbkowania.
    3. Oblicz dopasowany sygnał prądu bazowego, stosując metodę taką jak wygładzanie asymetrycznych najmniejszych kwadratów26.
    4. Oblicz przybliżoną pierwszą pochodną (sygnał różnicowy) przetworzonych danych prądowych, biorąc różnicę między kolejnymi punktami danych.
  2. Wykryj zdarzenia komórkowe i wyodrębnij dane podpulsów (Rysunek 3B).
    1. Wyszukaj kandydujące zdarzenia komórkowe, analizując przetworzone dane. Odrzuć zdarzenia komórkowe, które nakładają się na inne zdarzenia komórkowe (tzw. zdarzenia złożone) (Załącznik Rysunek 4), wykazują słabe dopasowanie linii bazowej lub mają nieoczekiwany lub błędny kształt impulsu (np. gdy kanał mógł być częściowo zatkany).
    2. Wyodrębnij dane podpulsów dla każdego zdarzenia komórkowego.
      1. Każdy segment węzeł-pora pojawi się jako odpowiadający mu podpuls w całym impulsie sygnału (Rysunki 1B, C). Zidentyfikuj początek każdego podpulsu, obliczając moment czasu, w którym sygnał różnicowy osiąga lokalne minimum. Zidentyfikuj koniec każdego podpulsu, obliczając moment czasu, w którym sygnał różnicowy osiąga lokalne maksimum.
      2. Określ szerokość każdego podpulsu jako czas upływający między punktami czasowymi początku i końca. Określ amplitudę każdego podpulsu, obliczając średnią wartość różnicy między zmierzonym prądem a prądem bazowym dla wszystkich punktów danych pomiędzy punktami czasowymi początku i końca.
  3. Określ mechanofenotyp komórki dla każdego zdarzenia komórkowego na podstawie danych podpulsów.
    1. Określ średnicę komórki d na podstawie równania zdefiniowanego przez Deblois i Bean24:
      Formuła równowagi statycznej, równanie ΔI/I na diagramie do badań i analiz naukowych.
      gdzie ΔI/I to średnie stosunki amplitudy podpulsu do prądu bazowego w podpulsach kalibracyjnych, De to efektywna średnica kanału (zmierzona w kroku 4), a L to całkowita długość kanału węzeł-pora.
      1. De wyznacza się, obliczając średnią wartość ΔI/I wygenerowaną przez zestaw cząstek o znanej średnicy (komórek lub kulek, patrz krok 4), przyjmując tę znaną średnicę jako d i rozwiązując Równanie 1 dla De.
    2. Ilościowo określ opór komórki na odkształcenie.
      1. Określ prędkość przepływu cieczy Uflow, obliczając średnią prędkość komórki w podpulsach kalibracyjnych, wykorzystując znane długości segmentów oraz zmierzony czas trwania każdego podpulsu.
      2. Określ indeks odkształcalności całej komórki (wCDI), zdefiniowany przez Kim i in.2 jako:
        Równanie wCDI; parametry kanału kapilarnego; dynamika płynów; analiza transferu cieplnego.
        gdzie Lc to długość segmentu zwężenia, hchannel to wysokość kanału, a ΔTc to czas trwania podpulsu zwężenia.
    3. Określ czas regeneracji komórki po odkształceniu, zdefiniowany jako pierwszy podpuls regeneracji, którego amplituda mieści się w granicach 8% średniej amplitudy z podpulsu kalibracyjnego2.
    4. Oblicz poprzeczne odkształcenie komórki w obrębie segmentu zwężenia.
      1. Oblicz efektywną średnicę segmentu zwężenia (De,c) zgodnie z definicją Kim i in.2: Formuła równowagi statycznej, De,c=De√(wc/wnp), równanie do analizy, do użytku edukacyjnego., gdzie wc to szerokość segmentu zwężenia, a wnp to szerokość wszystkich pozostałych segmentów.
      2. Oblicz równoważną średnicę kulistą dc komórki w obrębie zwężenia, ponownie korzystając z równania zdefiniowanego przez Deblois i Bean24:
        Równanie równowagi statycznej; formuła ΔIc/Ic; proces wyprowadzenia matematycznego
        gdzie ΔIc/Ic to stosunek amplitudy podpulsu do prądu bazowego w podpulsie zwężenia, a Lc to długość segmentu zwężenia.
      3. Oblicz długość wydłużenia komórki Ldeform zgodnie z opisem Kim i in.2:
        Równanie równowagi statycznej pokazujące obliczanie objętości odkształcenia, oznaczone jako Równanie 4.
      4. Na końcu oblicz poprzeczne odkształcenie komórki δdeform, które zgodnie z definicją Kim i in.2 wynosi Formuła równowagi statycznej δ<sub>deform</sub>=L<sub>deform</sub>/D<sub>cell</sub>, analiza odkształcenia..

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona tutaj platforma mechanofenotypowania to proste i wszechstronne podejście do pomiaru właściwości biofizycznych pojedynczych komórek przy umiarkowanej przepustowości. Komórki przepływają przez kanał mikrofluidyczny (Rysunek 1A) przy zastosowaniu stałego przepływu wymuszonego ciśnieniem. Podczas przemieszczania się komórek, długość kanału mikrofluidycznego oraz generowane impulsy prądu są rejestrowane za pomocą sprzętu do akwizycji danych. Pozyskany sygnał (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomiar właściwości mechanicznych pojedynczych komórek za pomocą tej techniki mechanofenotypowania składa się z trzech etapów: produkcji urządzenia, akwizycji danych i analizy danych. W ramach każdego etapu pojawiają się godne uwagi aspekty, które mogą znacząco wpłynąć na wyniki eksperymentu. Podczas produkcji urządzeń spójna geometria kanałów i jednorodność między urządzeniami mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników. W szczególności ściany boczne każdego urządzenia powinny być względnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

L. L. S posiada amerykański patent nr 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han i L. L. Sohn, wydany 12 lipca 2022 r.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z NIBIB 1R01EB024989-01 i NCI 1R01CA190843-01. A. L. i R. R. byli wspierani przez stypendium H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. było wspierane przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship oraz Siebel Scholar Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonJ.T. Baker5356-05Czystość (GC)  ≥ 99,5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Folia aluminiowaniedotyczy nie dotyczy
Analogowy filtr dolnoprzepustowyThorLabsEF504≤ Pasmo przepustowe 240 kHz, koncentryczny przepust BNC  (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Dziurkacz do biopsjiIntegra Miltex33-31AA-P/251mm, Jednorazowe, z Tłokiem (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Ostrzeniedotyczy
BNCPomona Electronics2249-C-12https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
Średni=CPC& utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW& utm_term=
& utm_content=Koncentryczne%20Kable%20%28RF%29& gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
W-EALw_wcB
Wacik poliestrowy do pomieszczeń czystychThermo Fisher Scientific18383https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Przedwzmacniacz prądowyDL Instruments1211https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Niestandardowa płytka drukowana (z komponentami)n/anie dotyczy patrz Pliki uzupełniające 4 i 5
Blok zacisków DAQNational InstrumentsBNC-2120https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ do BNC-2110 National InstrumentsSHC68-68-EPMhttps://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ)National InstrumentsPCI-6251https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
EksykatorThermo Fisher Scientific5311-0250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
żeński Przejściówka BNC na wtyczkę bananowąPomona Electronics72909https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR89510-186
https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs Nóż do szkłaChemglassCG-1179-21https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Złoty wytrawiacz transenowy TFANC0977944https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Płyta grzejnaThermo Fisher ScientificSP131825 
Spektrum alkoholu izopropylowegoChemicznyI1056-4LTPLCzystość (GC)  ≥ 99,5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metalowa obudowasprzętowa Hammond ManufacturingEJ12126https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
MetanolSigma-Aldrich34860Czystość (GC)  ≥ 99,8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 DeveloperKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive PhotoresistDuPontn/ahttps://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
PhotomaskFineline Imagingn/aPhotomask są zamawiane na zamówienie z naszych projektów CAD (https://www.fineline-imaging.com/)
Szkiełko mikroskopowe ze zwykłego szkłaFisher Scientific12-553-5BMateriał: wapno sodowane, dł. 75 x szer. 50 mm, grubość: 0,90 mm; 1,10 mm 
Myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-001https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
plastikowa szalka PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875712100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Regulator ciśnieniaFluigentMFCS-EZhttps://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Oprogramowanie regulatora ciśnieniaFluigentMAESFLO
Programowanie i Oprogramowanie obliczenioweMATLABR2021bdo akwizycji i analizy danych (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
Rurka PTFECole Parmer06417-310,032" ID x 0,056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórekMillapore SigmaPHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer WaferWorld288576,2 mm, jednostronnie polerowany (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coatern/an/a
SU-8 3025 Negatywny fotorezystorKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 DeveloperKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 PolydimethlysiloxaneDowChemical 4019862https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
TaśmaScotch810-341296https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Tytan, Platyna, ZłotoNiedotyczy Zasilacz z potrójnym
wyjściemMaska E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 Maska UV Keysight
MaskaKarl Suss AmericaMJB3 Aligner 

Bibliografia

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091(2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619(2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772(2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301(2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529(2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542(2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982(2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050(2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Viskoelastyczność pojedynczych komórekplatforma mikroprzepływowafenotypowanie mechanicznepomiar bez użycia znacznikówdeformacja komórkipomiar elektronicznywłaściwości mechaniczne komórekanaliza końcowalitografia miękka
Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.