Artykuł metodologiczny

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

DOI:

10.3791/65102

⸱

26 maja 2023

 ,  , 
1PulmoScience Laboratory, Department of Pulmonology, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Warstwa komórek nabłonka dróg oddechowych tworzy pierwszą barierę między tkanką płucną a środowiskiem zewnętrznym i dlatego jest stale narażona na wdychane substancje, w tym czynniki zakaźne i zanieczyszczenia powietrza. Warstwa nabłonka dróg oddechowych odgrywa kluczową rolę w wielu różnych ostrych i przewlekłych chorobach płuc, a różne leki ukierunkowane na ten nabłonek są stosowane przez wdychanie. Zrozumienie roli nabłonka w patogenezie i sposobu, w jaki można go ukierunkować na terapię, wymaga solidnych i reprezentatywnych modeli. Coraz częściej stosuje się modele hodowli nabłonka in vitro, które oferują przewagę w postaci przeprowadzania eksperymentów w kontrolowanym środowisku, wystawiając komórki na różnego rodzaju bodźce, toksyny lub czynniki zakaźne. Zastosowanie komórek pierwotnych zamiast unieśmiertelnionych lub nowotworowych linii komórkowych ma tę zaletę, że komórki te różnicują się w hodowli do pseudowarstwowej spolaryzowanej warstwy komórek nabłonka z lepszą reprezentacją nabłonka w porównaniu z liniami komórkowymi.

Prezentowany tutaj jest solidny protokół, który został zoptymalizowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci, do izolacji i hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych z tkanki płucnej. Procedura ta umożliwia skuteczną izolację, ekspansję, hodowlę i różnicowanie śluzowo-rzęskowe pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli (PBEC) poprzez hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) i obejmuje protokół biobankowania. Ponadto opisano charakterystykę tych kultur przy użyciu genów markerowych specyficznych dla komórki. Te kultury ALI-PBEC mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do ekspozycji na cały dym papierosowy lub mediatory stanu zapalnego oraz do kohodowli/infekcji wirusami lub bakteriami.

Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie, ilustrujący procedurę krok po kroku, ma stanowić podstawę i/lub odniesienie dla osób zainteresowanych wdrożeniem lub adaptacją takich systemów hodowlanych w swoim laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola nabłonka dróg oddechowych w wielu ostrych i przewlekłych chorobach płuc została opisana w różnych recenzjach1,2,3,4,5,6,7. Dobrze zróżnicowane hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych są ważnym narzędziem do wyjaśnienia roli nabłonka dróg oddechowych. Hodowla komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy przepływu powietrza i cieczy (ALI) jest szeroko stosowana w celu promowania różnicowania komórek podstawnych nabłonka dróg oddechowych, a tym samym wiarygodnego badania nabłonka dróg oddechowych in vitro8,9. W ostatnich latach wykorzystanie takich modeli jeszcze bardziej wzrosło w wyniku nowych inicjatyw badawczych związanych z pandemią COVID-19 i ogólnoświatowym przejściem na badania bez udziału zwierząt. W związku z tym zwiększone wykorzystanie tej modelowej linii komórkowej podkreśla potrzebę dzielenia się procedurami i doświadczeniami w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Pozwoli to również na porównanie wyników pomiędzy grupami badawczymi. Solidność procedury jest kluczową cechą i dlatego musi zostać poddana kontroli jakości. Kilka laboratoriów zainwestowało w opracowanie protokołów hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych w ALI. Czas, wysiłek i wymagany budżet można zmniejszyć, gdy te procedury zostaną szczegółowo udostępnione. Szczegóły te obejmują na przykład wybór tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych i pożywek dostarczanych przez różnych producentów, ponieważ stwierdzono, że ma to wpływ na charakterystykę uzyskanych kultur10,11,12. Podkreśla to znaczenie dzielenia się doświadczeniami i szczegółami procedur hodowlanych, ponieważ brak takich spostrzeżeń może mieć wpływ na wyniki i/lub wysiłki walidacyjne w różnych laboratoriach mogą być utrudnione.

Nabłonek płuc człowieka składa się z różnych typów komórek, w tym głównych, takich jak komórki podstawne, komórki rzęskowe, komórki kubkowe i komórki maczugowe. Aby wiarygodnie naśladować warstwę komórek nabłonka w drogach oddechowych in vitro, te typy komórek muszą być reprezentowane w modelach hodowlanych, a ich polaryzacja i funkcja muszą być zachowane13,14,15,16. Równie ważne jest uświadomienie sobie, że cechy dawcy (w tym stan choroby) i anatomiczne pochodzenie komórek (tj. nos, tchawica, duże i małe drogi oddechowe) mogą wpływać na skład komórkowy i funkcjonalne odpowiedzi hodowli komórkowej. Odpowiednia wiedza specjalistyczna i praktyka są warunkiem wstępnym pomyślnej hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych i oceny jakości hodowli zarówno intuicyjnie (poprzez oględziny podczas hodowli), jak i ilościowo. Celem tego wkładu jest zapewnienie opłacalnej i efektywnej czasowo metody izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (PBEC), która może być również stosowana do hodowli komórek tchawicy i małych komórek nabłonka dróg oddechowych. Oprócz opisu metody izolowania takich komórek z wyciętej tkanki płucnej, przedstawiono i omówiono metodę ekspansji i biobankowania, a na końcu ustanowienia i scharakteryzowania dobrze zróżnicowanej kultury ALI w rozsądnym okresie kosztów i czasu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zostały wyizolowane z makroskopowo normalnej tkanki płucnej uzyskanej od pacjentów poddawanych operacji resekcji raka płuc w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdzie, Holandia. Pacjenci, od których pochodziła ta tkanka płucna, zostali włączeni do biobanku za pośrednictwem systemu bez zastrzeżeń do zakodowanego, anonimowego dalszego wykorzystania takiej tkanki (www.coreon.org). Jednak od 01-09-2022 pacjenci są rejestrowani w biobanku za aktywną świadomą zgodą zgodnie z lokalnymi przepisami biobanku LUMC za zgodą instytucjonalnej komisji etyki medycznej (B20.042/Ab/ab i B20.042/Kb/kb).

UWAGA: Wszystkie procedury są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z lokalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego, oraz w sterylnych warunkach pracy, w rękawicach chirurgicznych i fartuchu laboratoryjnym, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie media, odczynniki i inne roztwory użyte w protokole znajdują się w Tabeli materiałów i Tabeli Uzupełniającej 1. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się ze szczegółowymi krokami protokołu

.

1. Izolacja komórek nabłonka oskrzeli z ludzkiej tkanki płucnej

UWAGA: Aby uzyskać optymalny wskaźnik sukcesu w izolacji komórek nabłonka oskrzeli, wycięty pierścień oskrzelowy powinien być przechowywany w zanurzeniu w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z dodatkiem Primocin.

  1. Przygotowania przed rozpoczęciem zabiegu
    1. Przygotować roztwór powlekający w PBS, jak opisano w tabeli uzupełniającej 1, i pokryć odpowiednią liczbę płytek 6-dołkowych 1,5 ml roztworu powlekającego na studzienkę. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Liczba studzienek do pokrycia zależy od wielkości wyciętej tkanki. Jako przybliżoną wskazówkę, cztery płytki 6-dołkowe są powlekane, gdy wycięty pierścień oskrzelowy ma średnicę 10 mm i 4 mm szerokości.
    2. Przygotować kompletną pożywkę wolną od keratynocytów (c-KSFM), zgodnie z opisem w Tabeli Uzupełniającej 1; użyć 2 ml pożywki na dołek płytki 6-dołkowej.
      UWAGA: Ten c-KSFM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 7 dni. c-KSFM jest pożywką o niskiej zawartości wapnia stosowaną do rozszerzania komórek nabłonka dróg oddechowych przy jednoczesnym hamowaniu wzrostu zanieczyszczających fibroblastów.
  2. Oczyścić pierścień oskrzelowy, delikatnie płucząc pierścień w 10 ml sterylnego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Użyj pęsety, aby ostrożnie przytrzymać pierścień (dotykaj tylko na zewnątrz) i małych nożyczek, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej i resztki krwi. W celu dalszej obróbki przetnij pierścień na dwie części.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia używane w tym procesie powinny być wysterylizowane przed użyciem.
  3. Zanurzyć dwie połówki pierścienia oskrzelowego w 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu proteazy XIV (1,8 mg/ml) w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), w tym Primocin w zamkniętym sterylnym pojemniku, i inkubować dokładnie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    UWAGA: HBSS jest stosowany jako rozcieńczalnik do proteazy XIV w celu oderwania komórek od tkanki podczas 2-godzinnego okresu inkubacji. HBSS jest zrównoważonym roztworem izotonicznym, który umożliwia utrzymanie żywotności komórek podczas krótkotrwałych inkubacji.
  4. Po inkubacji przenieść kawałki tkanki na szalkę Petriego z 10 ml ciepłego PBS i zeskrobać wnętrze pierścienia za pomocą wygiętej pęsety, aby uzyskać roztwór komórkowy.
    UWAGA: Tkanka wydaje się bardziej miękka i nieco rozszerzona.
  5. Odrzucić pierścień, przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 50 ml i dodać ciepły PBS, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Wirować przez 7 minut przy 230 x g i w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml ciepłego PBS. Następnie uzupełnić objętość do 50 ml ciepłym PBS. Wirować przez 7 minut przy 230 x g przy suchej smosji.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości ciepłego c-KSFM zawierającego Primocin.
    UWAGA: Primocin stosuje się przez co najmniej 7 dni w celu wyeliminowania wszelkich bakterii, grzybów lub (co ważne) mykoplazmy, które mogły być obecne w tkance; Po 7 dniach wystarczy dodać do pożywki tylko penicylinę/streptomycynę.
  8. Odessać roztwór powlekający z płytek 6-dołkowych i dodać 2 ml zawiesiny komórek do dołka.
  9. Pozwól komórkom rosnąć aż do osiągnięcia 80% do 90% zbiegu i zmieniaj podłoże trzy razy w tygodniu (np. w każdy poniedziałek, środę i piątek). Pożądany stopień zbiegu osiąga się zwykle między 7 a 14 dniami; Jeśli czas potrzebny do osiągnięcia pożądanego zbiegu przekracza 14 dni, wyrzuć komórki.
    UWAGA: W ciągu pierwszych kilku dni tylko niewielka liczba komórek zaczyna się rozmnażać; Grupy komórek są zauważalne po kilku dniach.

2. Kriokonserwacja ludzkich pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli (PBECs)

UWAGA: Podczas pracy z temperaturami -80 °C i -196 °C, do ochrony używa się rękawic kriogenicznych, a pęsety do przenoszenia zamrożonych fiolek. Podczas pracy z ciekłym azotem do ochrony osobistej stosuje się rękawice kriogeniczne i osłonę twarzy.

  1. Odessać pożywkę i przemyć studzienki raz 2 ml ciepłego PBS na studzienkę.
  2. Trypsynizować komórki, dodając 0,5 ml miękkiej trypsyny na studzienkę (patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla składu miękkiego roztworu trypsyny). Inkubować komórki przez 5 do maksymalnie 10 minut w temperaturze 37 °C. Zamieszać roztwór trypsyny w płytce i uwolnić komórki, delikatnie stukając w płytkę.
  3. Przenieść oderwane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 1,1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej (SBTI; w celu zahamowania aktywności trypsyny) rozpuszczonego w KSFM z penicyliną/streptomycyną. Objętość SBTI musi być dwukrotnie większa niż całkowita objętość miękkiej trypsyny (tj. 1 ml na studzienkę).
    UWAGA: Nie dodawaj SBTI bezpośrednio do studzienek, ponieważ ogniwa ponownie przyczepią się w ciągu kilku minut.
  4. Wirować probówkę przez 7 minut przy 230 x g przy suchej smosji.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 10 ml RT KSFM zawierającego penicylinę/streptomycynę, ale bez innych dodatków. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przeprowadź zliczanie żywych/martwych komórek, dodając błękit trypanowy w stosunku 1:1 lub użyj alternatywnej procedury zliczania żywych/martwych komórek.
  6. Kriokonserwować komórki w stężeniu 400 000 komórek na ml pożywki zamrażającej (patrz Tabela Uzupełniająca 1 w celu uzyskania składu) i dodać 1 ml tej zawiesiny na kriowial. Przenieść kriowiale do pojemnika z komorą chłodzącą i umieścić go w temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieść fiolki do ciekłego azotu o temperaturze -196 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Możliwe są dwie opcje przeniesienia komórek do pożywki do zamrażania, z których obie działają dobrze: 1) Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić w zimnym podłożu do zamrażania o wymaganym stężeniu komórek; lub 2) dodać zimną pożywkę do zamrażania i dostosować stężenie kriokonserwantu (dimetylosulfotlenek [DMSO]) w oparciu o objętość KSFM, w której obecne są komórki.

3. Rozmrażanie kriokonserwowanych PBEC i hodowanie ich do hodowli na wkładkach

  1. Kolbę do hodowli komórkowych T75 należy przez noc pokryć 10 ml roztworu powlekającego w PBS ze szczelnie zamkniętymi pokrywkami. Inkubować kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Przed rozmrożeniem kriokonserwowanych PBEC należy usunąć roztwór powlekający z kolby i napełnić ją 10 ml c-KSFM. Pozostawić do ogrzania do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z lekko uchylonymi pokrywkami, aby wpuścić powietrze z inkubatora.
  3. Szybko rozmrozić komórki w kąpieli wodnej lub perełkowej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Kąpiel perełkowa jest preferowana w stosunku do kąpieli wodnej ze względu na mniejsze ryzyko zanieczyszczenia i mniejsze zużycie energii.
  4. Dodać całą zawartość kriowialu do wstępnie ogrzanej kolby T75 z pożywką (krok 3.2) i równomiernie rozprowadzić komórki.
    UWAGA: Na tym etapie nie należy odwirowywać komórek, ponieważ nie przetrwają one etapu wirowania.
  5. Po około 4 godzinach upewnij się, że ogniwa są wystarczająco przymocowane. Zastąp pożywkę 10 ml świeżego, ciepłego c-KSFM.
    UWAGA: W ten sposób DMSO z medium zamrażającego jest usuwane. Ten etap powinien mieć miejsce między 4 godzinami a 24 godzinami po wysianiu komórek w kolbie.
  6. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia zbiegu od 80% do 90%, zmieniając podłoże w każdy poniedziałek, środę i piątek.

4. Tworzenie hodowli na granicy faz powietrze-ciecz z pierwotnymi komórkami nabłonka oskrzeli (ALI-PBEC)

UWAGA: Poniższa procedura dotyczy hodowli PBEC na wkładkach o średnicy wewnętrznej 11,9 mm.

  1. Pokryć odpowiednią liczbę wkładek do hodowli komórkowych 0,4 ml roztworu powlekającego na wkładkę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  2. Przygotować kompletną pożywkę BD (pożywkę z białkiem białka), zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 1.
    UWAGA: Pożywka z CBD-em jest pożywką złożoną (patrz tabela uzupełniająca 1) opracowaną w celu wspomagania wzrostu komórek nabłonka oskrzeli przez dłuższy czas, umożliwiając jednocześnie ich różnicowanie po wzroście stężenia kwasu retinowego (RA) (lub analogu RZS stosowanego w niniejszym protokole) i hodowli w ALI, jak opisano w kroku 4.10.
  3. Trypsynizować PBEC w kolbie T75, używając 2 ml miękkiej trypsyny na kolbę. Inkubować komórki przez 5 do 10 minut, aby umożliwić ich odłączenie (na podstawie oględzin). Po 5 minutach inkubacji ułatwić oderwanie komórek, obracając trypsynę w kolbie i delikatnie stukając w kolbę (w razie potrzeby powtórzyć).
  4. Dodać 4 ml SBTI do kolby i bezpośrednio przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 25 ml.
    UWAGA: Komórki łączą się ponownie w ciągu kilku minut. W związku z tym, podczas pracy z więcej niż jedną kolbą, zawiesina komórek otrzymana w kroku 4.4 musi być bezpośrednio przeniesiona do probówki wirówkowej przed dodaniem SBTI do drugiej kolby. W tej procedurze przetwarzanych jest jednocześnie maksymalnie pięć kolb.
  5. Odwirowywać probówki przez 7 minut przy 230 x g w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki z CBD i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przeprowadź liczenie żywych/martwych komórek, na przykład dodając trypan niebieski w stosunku 1:1 lub stosując inną procedurę zliczania żywych/martwych komórek.
  7. Usunąć roztwór powlekający z wkładek do hodowli komórkowych.
  8. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, wytworzoną w kroku 4.6, pożywką z CBD, uzupełnioną 1 nM EC 23 do stężenia 80 000 komórek na ml, i dodać 0,5 ml na wierzch błony we wkładce. Dodać 1,5 ml pożywki z roztworem CBD uzupełnionej 1 nM EC 23 do studzienki znajdującej się pod wkładką.
  9. Zmieniaj pożywkę na pożywkę z CBD, uzupełnioną 1 nM EC 23 trzy razy w tygodniu, aż kultury będą gotowe do ekspozycji na powietrze (tj. 2 dni po osiągnięciu 100% zbieżności). Za każdym razem 0,5 ml pożywki dodaje się do wkładki (na komórki) i 1,5 ml dodaje się do dolnej komory (studzienki).
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, warstwa komórkowa osiąga 100% zbieżność około 5 dni po wysianiu PBEC na wkładkach. Na podstawie oględzin zbiegu komórek podejmuje się decyzję o przeniesieniu komórek do etapu ALI 2 dni później.
  10. Gdy komórki są gotowe do przeniesienia do ALI (tj. 2 dni po osiągnięciu 100% zbieżności), usuń pożywkę z wkładek i studzienki, nie dodawaj nowej pożywki do wkładki i dodaj nową pożywkę (1 ml pożywki CBD, uzupełnionej 50 nM EC 23) tylko do studzienki. Zmieniaj podłoże w studzienkach trzy razy w tygodniu.
  11. W celu usunięcia nadmiaru śluzu i resztek komórkowych należy delikatnie dodać 200 μl ciepłego PBS po wierzchołkowej stronie warstwy komórek wewnątrz wkładki (najlepiej przez bok wkładki, a nie bezpośrednio pipetując na komórki) i inkubować przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Następnie odessać PBS, aby usunąć nadmiar śluzu i resztek komórkowych.
    UWAGA: Od tego momentu (początek hodowli ALI), przed zmianą pożywki w dolnej komorze, należy za każdym razem przemywać wierzchołkową stronę komórek PBS.
  12. Hoduj komórki w ALI przez co najmniej 2 tygodnie, aby upewnić się, że wszystkie główne typy komórek są reprezentowane.

5. Tworzenie kultury ALI-PBEC z mieszanej populacji dawców

  1. Użyj komórek od maksymalnie pięciu indywidualnych dawców, aby rozpocząć hodowle PBEC z populacji mieszanej.
  2. Wymieszaj równą liczbę komórek na dawcę, używając komórek wygenerowanych w kroku 4.7, aby uzyskać łączną liczbę 150 000 komórek na wkładkę (tj. 30 000 komórek na dawcę w przypadku użycia pięciu dawców). Zapewni to, że proliferacja we wstawce zostanie ograniczona do minimum, a w hodowli będzie obecna taka sama liczba komórek od poszczególnych dawców.
  3. Kontynuuj hodowlę ALI-PBEC zgodnie z opisem w krokach 4.9-4.12.

6. Kontrola jakości kultury ALI-PBEC

  1. Monitorowanie oporności elektrycznej przeznabłonka trans (TEER) podczas hodowli komórkowej
    UWAGA: Pomiar oporu elektrycznego, oparty na użyciu woltoomomierza, może być wykonywany w dowolnym momencie podczas hodowli ALI-PBEC i jest wykonywany za każdym razem zgodnie z tym samym protokołem w tych samych warunkach, ponieważ na pomiar oporu elektrycznego mają wpływ różne zmienne, w tym położenie elektrody, temperatura, medium i obsługa. TEER można obliczyć za pomocą zmierzonej rezystancji elektrycznej, stosując następujący wzór oparty na prawie Ohma: figure-protocol-1, gdzie Rm jest zmierzonym oporem elektrycznym, Rb jest bazowym oporem elektrycznym wkładki bez powłoki i komórek, a SA jest powierzchnią membrany wkładki17.
    1. Delikatnie dodaj 200 μl ciepłego PBS do wierzchołkowej strony warstwy komórek, aby usunąć śluz i zanieczyszczenia z komórek. Inkubować wkładkę przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i ponownie usunąć PBS.
    2. Delikatnie dodaj 700 μl ciepłego PBS do wierzchołkowej strony warstwy komórek i inkubuj wkładkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację temperatury do pomiarów.
    3. Skalibruj woltomierz za pomocą rezystora testowego 1,000 Ω, ustaw woltoomomierz na pomiar omów i użyj śrubokręta, aby wyregulować kalibracyjną "R ADJ", aż ustawisz ją na 1,000 Ω.
    4. Przepłucz elektrodę, przesuwając ją kilka razy w górę i w dół w sterylnej wodzie (RT), a następnie w sterylnej PBS (RT).
    5. Zmierz opór elektryczny warstwy ogniw we wkładkach. W tym celu umieść elektrodę w pozycji pionowej w studzience tak, aby długie ramię elektrody dotykało dna płytki. W ten sposób krótkie ramię znajduje się nad warstwą komórek wewnątrz wkładu. Odczytaj wartość wyświetlaną na woltoomomierzu.
      UWAGA: Wyświetlana wartość nie ustabilizuje się w pełni; Odczytaj wartość w momencie, gdy wartość jest przerywana.
    6. Pomiędzy pomiarami wyczyść elektrodę, przesuwając ją kilka razy w górę i w dół w sterylnym PBS (RT).
    7. Wyczyść elektrodę po zakończeniu pomiarów, przesuwając ją kilka razy w górę iw dół w sterylnej wodzie (RT), sterylnym PBS (RT) i 70% etanolu (RT). Przechowuj elektrodę w suchym miejscu.
    8. Wykonaj pomiar podstawowy wkładki (bez powłoki) i komórek, dodając 700 μl ciepłego PBS do wkładki i 1 ml ciepłego PBS do studzienki i mierząc opór elektryczny wraz z innymi wkładkami.
  2. Ocena składu komórkowego hodowli ALI-PBEC
    1. Na etapie ALI sprawdź różnicowanie, oceniając wizualnie bijące rzęski. Można je zaobserwować za pomocą standardowej mikroskopii jasnego pola już po 9 dniach od ekspozycji na powietrze po wierzchołkowej stronie komórek.
      UWAGA: Bijące rzęski są najlepiej widoczne bezpośrednio po umyciu powierzchni wierzchołkowej. Komórki kubkowe wytwarzają śluz, a zatem obecność śluzu, obserwowana podczas mycia powierzchni wierzchołkowej, jest znakiem, że powstają komórki kubkowe. Jednak poziom komórek kubkowych i ilość wytwarzanego śluzu jest w dużym stopniu zależny od dawcy. Obecność śluzu można zauważyć podczas zasysania PBS po umyciu wierzchołkowej powierzchni warstwy komórkowej we wkładce; w tym przypadku zasysany PBS jest bardziej lepki, a podczas zasysania można zaobserwować nitki śluzu.
    2. Ocena składu komórkowego za pomocą barwienia immunologicznego i mikroskopii fluorescencyjnej lub sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) dostarcza ważnych informacji na temat stanu różnicowania hodowli, ale jej opis wykracza poza zakres tego wkładu.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury izolacji, ekspansji i hodowli pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli. (A) Tkanka płucna jest pozyskiwana podczas operacji resekcji raka, a patolog wycina tkankę pierścienia oskrzelowego, która jest makroskopowo normalna i wolna od guza. (B) Pierścień oskrzelowy jest czyszczony i poddawany leczeniu enzymatycznemu w celu oderwania i dysocjacji warstwy komórkowej. (C) Pobrana zawiesina komórek jest myta, a komórki są rozprowadzane w studzienkach na 6-dołkowej płytce w celu rozprężenia. (D) Po wystarczającym rozprężeniu izolowanych komórek w c-KSFM za pomocą Primocin, warstwy komórkowe są dysocjowane przez trypsynizację, a komórki są ponownie zawieszane w pożywce zamrażającej w celu kriokonserwacji. W razie potrzeby kriokonserwowane komórki są rozmrażane i ponownie namnażane za pomocą c-KSFM z penicyliną/streptomycyną w kolbach do hodowli komórkowych. Po rozprężeniu wysiewa się je w pożywce z CBD-em na wkładkach do hodowli komórkowych; Panie przewodniczący, panie i panowie! Hodowla ALI-PBEC odbywa się w dwóch głównych etapach: etap zanurzony w pożywce CBD uzupełnionej 1 nM EC 23 do momentu osiągnięcia przez komórki pełnej konfluencji, a następnie usunięcie pożywki wierzchołkowej i hodowla w ALI w celu umożliwienia różnicowania; w tej fazie ALI komórki są hodowane w pożywce CBD uzupełnionej 50 nM EC 23. Panie przewodniczący, panie i panowie! Graficzne przedstawienie komórek podstawnych, które pokrywają wkładkę podczas hodowli zanurzonej. Panie przewodniczący, panie i panowie! Graficzne przedstawienie zróżnicowanej warstwy komórek nabłonka otrzymanej po hodowli w ALI w obecności zwiększonych stężeń EC 23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspansja za pomocą zanurzonej kultury
Korzystając z przedstawionej tutaj metody, z jednej 6-dołkowej płytki można uzyskać średnio osiem kriowiali z 400 000 komórek/kriowial do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie (Rysunek 2A). Aby to osiągnąć, izolowane PBEC są hodowane na płytkach 6-dołkowych przez co najmniej 7 dni i maksymalnie 14 dni (Rysunek 2B) w obecności Primocin, aby wykluczyć zanieczyszczenie mikrobiologiczne (zwłaszcza mykoplazmą). Rysunek 2A,B daje wgląd w uzyskaną liczbę komórek i wymagany czas hodowli wśród różnych izolacji od różnych dawców. Przed zebraniem komórek przez trypsynizację do przechowywania w ciekłym azocie konfluencja musi wynosić ponad 80%. Jeśli nie zostanie to osiągnięte w ciągu 14 dni, komórki nie powinny być poddawane kriokonserwacji. Co ważne, podczas zbioru do przechowywania i pasażowania, zbieżność warstwy komórkowej nie powinna przekraczać ~95% (Rysunek 2C). Po przechowywaniu w ciekłym azocie komórki można rozmrozić i hodować w celu ekspansji, aż do uzyskania wystarczającej liczby komórek dla kultur ALI. Pożywką używaną do namnażania komórek na tym etapie jest c-KSFM, podobnie jak podczas początkowej hodowli po pobraniu z pierścienia oskrzelowego18. Na tym etapie nie ma jednak potrzeby stosowania preparatu Primocin, ponieważ nie ma ryzyka dodatkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego pochodzącego z tkanki płucnej, a zatem Primocin można zastąpić penicyliną/streptomycyną. Pożywka ta faworyzuje komórki nabłonkowe w stosunku do fibroblastów i dlatego zapobiega ewentualnemu przerostowi kultury poprzez szybsze namnażanie fibroblastów19,20,21. Używając pożywki c-KSFM, komórki są rozrzucane w kolbie i nie łączą się ze sobą, co znacznie różni się od morfologii hodowanych komórek zanurzonych na tym etapie w pożywce cBD (Rysunek 2D, E). Po 5 lub 6 dniach hodowli rozmrożonych komórek w kolbie T75 warstwa komórkowa powinna być zlewająca się w 80%-95%, co przekłada się na około 3 x 106 komórek w sumie (Rysunek 2F). Na tej podstawie można wygenerować około 75 wkładek (rozmiar płytki 12-dołkowej) do hodowli ALI.

Metoda izolacji i hodowli opisana w tym artykule może być również dostosowana do użycia z biopsjami oskrzeli lub szczotek oskrzelowych jako materiał wyjściowy.

figure-results-1
Rysunek 2: Ekspansja komórek bazowych przed i po krioprezerwacji. Komórki wyizolowano zgodnie z opisanym protokołem i hodowano przy użyciu c-KSFM. Monitorowano liczbę komórek generowanych na dawcę, liczbę żywych komórek przeprowadzono przy użyciu automatycznego licznika komórek (A) podczas pobierania komórek pasażujących 0 (P0) z płytek 6-dołkowych (krok 2 protokołu), n = 123 dawców, liczbę komórek przedstawiono jako liczbę komórek pobranych na studzienkę; Każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a mediana jest oznaczona poziomym paskiem. (B) W ramach kontroli jakości monitorowano czas, w którym komórki P0 musiały osiągnąć 80% do 90% konfluencji w płytkach 6-dołkowych i pokazano go w dniach po rozpoczęciu zanurzonej hodowli w c-KSFM (n = 127 różnych dawców). Każdy indywidualny dawca jest oznaczony kropką, wszystkie kropki należące do 1 dnia łączą się w linię; im szersza linia, tym więcej darczyńców oznacza; Mediana liczby dni, w których komórki znajdują się w hodowli, jest oznaczona cieńszym poziomym paskiem. (C) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P0 hodowanych zanurzonych w c-KSFM w momencie pobierania komórek w celu długotrwałej krioprezerwacji. (D) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P1 hodowanych zanurzonych w c-KSFM w momencie pobrania komórek i przeniesienia do insertów oraz (E) komórek P1 wyhodowanych zanurzonych w pożywce cBD. (F) liczba żywych komórek wytworzonych na dawcę była monitorowana przy użyciu automatycznego licznika komórek podczas pobierania komórek P1 z kolby T75 (sekcja 4 protokołu), n = 63 różnych dawców; liczba komórek jest przedstawiona jako liczba komórek w kolbie T75, każdy dawca jest oznaczony kropką, a mediana liczby komórek jest oznaczona poziomym paskiem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kultura interfejsu powietrze-ciecz (ALI)
Po 7 dniach od rozpoczęcia hodowli ALI mierzy się rezystancję elektryczną warstwy komórkowej, która powinna wynosić ponad 300 Ω (Rysunek 3A); Jeśli nie zostanie to osiągnięte, kultura jest uważana za nieudaną z powodu możliwego braku tworzenia ścisłych połączeń. Zaleca się wykluczenie możliwości uzyskania niskich wartości TEER spowodowanych uszkodzeniem warstwy nabłonkowej w poszczególnych wkładach wynikającym np. z uszkodzenia warstwy komórkowej podczas mycia i aspiracji. Można to sprawdzić za pomocą wizualnej kontroli mikroskopowej wkładek hodowlanych. Z naszego doświadczenia wynika, że zmienność oporności elektrycznej między donorami może być znacząca (Rysunek 3B), co jest również zgłaszane w literaturze14, i jak zaobserwowano, jest również pod wyraźnym wpływem pochodzenia zastosowanego zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco (Rysunek 3C).

figure-results-2
Rysunek 3: Przeznabłonkowa rezystancja elektryczna jako kontrola jakości kultur ALI-PBEC. PBEC wyizolowano i namnażano oraz stworzono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. W kilku punktach czasowych hodowli mierzono opór elektryczny, a następnie obliczano TEER (Ω ·cm2). (A) Opór elektryczny mierzono w ciągu 14 dni po ALI. n = 4 różnych dawców. Dane są przedstawiane jako wartość średnia ± odchyleniu standardowym (SD). (B) W ramach kontroli jakości hodowli komórkowych ALI-PBEC zmierzono oporność elektryczną w 7. dniu (n = 50) i w 14. dniu po ALI (n = 25); każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a mediana TEER (Ω·cm2) jest oznaczona poziomym paskiem. Dane zostały przetestowane pod kątem istotności za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya i nie stwierdzono żadnej istotnej różnicy. (C) Przetestowano media pochodzące od trzech różnych dostawców DMEM w celu oceny wpływu na powstawanie TEER. n = 4 różnych dawców; średnie wartości są przedstawione ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas tworzenia dobrze zróżnicowanej kultury ALI-PBEC, od początku ekspozycji na powietrze, stężenie RA wzrasta22. W ten sposób komórki przechodzą od proliferacji do różnicowania śluzowo-rzęskowego, które jest widoczne już po 9 dniach (w zależności od dawcy) po ekspozycji na powietrze za pomocą mikroskopii jasnego pola. Ruch pierwszych rzęsek jest widoczny w tym momencie, a nieco wcześniej, gdy opiera się na ekspresji genów markerów zróżnicowanych komórek luminalnych23 (Ryc. 4).

Jak opisano w protokole, produkcję śluzu można również zaobserwować podczas płukania powierzchni wierzchołkowej podczas zmiany podłoża. RZS jest bardzo wrażliwy na światło, co prowadzi do bardzo zmiennej aktywności przy tym samym stężeniu zapasów. Z tego powodu RZS zastępuje się syntetycznym analogiem RA EC 23 i stosuje się w tym samym stężeniu, z podobnymi wynikami, jak określono doświadczalnie. Z tego powodu, a także w celu uniknięcia zmiany procedury, wybrane stężenie EC 23 zostało utrzymane na poziomie wcześniej używanego stężenia RA (tj. 50 nM)24,25 (Rysunek 5). Rysunek 5A przedstawia wartości TEER osiągnięte przy użyciu różnych stężeń EC 23, pokazując maksymalny TEER przy 50 nM w tym zakresie badanych stężeń. Wyniki przedstawione w Rysunek 5B potwierdzają, że ekspresja genów markerów dla komórek rzęskowych i kubkowych jest podobna przy użyciu 50 nM EC 23 lub RA. EC 23 jest również wymagany podczas hodowli na etapie zanurzenia (choć w znacznie niższym stężeniu), ponieważ pominięcie go na tym etapie zanurzenia i dodanie go tylko na etapie ALI powoduje, że kultura nigdy nie osiąga pełnej konfluencji. Czas potrzebny do wytworzenia dobrze zróżnicowanej hodowli ALI-PBEC z widoczną aktywnością bicia rzęsek i produkcją śluzu wynosi około 14 dni, a zatem większość eksperymentów rozpoczyna się między 14-21 dniowymi hodowlami ALI (Ryc. 4). Wszystkie główne typy komórek (komórki podstawne, rzęskowe, kubkowe i klubowe) obserwuje się po 14 dniach hodowli ALI, chociaż poziomy ekspresji są w dużym stopniu zależne od dawcy. Wykazano to, oceniając ekspresję genów TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1 za pomocą RT-qPCR lub ekspresję białka za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko p63, α-tubulinie, Muc5AC i CC-16 za pomocą barwienia fluorescencją immunologiczną (IF), w celu wykrycia markerów odpowiednio dla komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i klubowych25,26. Jednakże, podczas gdy 14-21 dni można uznać za praktyczną zasadę dla większości eksperymentów, dla wybranych eksperymentów można rozważyć dłuższy czas różnicowania, jak stwierdzono w przypadku metabolizmu ksenobiotyków, zakażenia SARS-CoV-2 i oceny klirensu śluzowo-rzęskowego27,28,29.

figure-results-3
Rysunek 4: Kultura interfejsu powietrze-ciecz (ALI). PBEC wyizolowano i namnażano oraz stworzono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. Posiewy ALI-PBEC monitorowano przez 14 dni po ALI. Hodowle komórkowe poddano lizie w celu wyizolowania RNA w dniach 0, 7 i 14 po ALI. Pokazane są dane od dwóch różnych dawców, każda kropka reprezentuje jednego indywidualnego dawcę monitorowanego w czasie, a mediana jest oznaczona poziomym paskiem. Ekspresję genów markerów komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i maczugowych (odpowiednio TP63, FOXJ1, MUC5B i SCGB1A1) mierzono metodą qPCR i normalizowano pod kątem ekspresji genów RPL13A i ATP5B (szczegóły w odniesieniu 23). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Porównanie kwasu retinowego (RA) i jego syntetycznego analogu EC 23. PBEC wyizolowano i namnażano oraz stworzono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. Po rozpoczęciu ekspozycji powietrznej kultur PBEC, RA (50 nM) został zastąpiony różnymi stężeniami EC 23. (A) Opór elektryczny zmierzono w 14 dniu po ALI, a następnie obliczono TEER (Ω·cm2), n = 2 dawców, słupki przedstawiają średnią wartość ± SD. (B) W 14 dniu po ALI hodowle komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA, a następnie analizy ekspresji genów markerów komórkowych odpowiednio dla komórek rzęskowych i kubkowych (FOXJ1, MUC5AC) za pomocą qPCR i znormalizowane dla RPL13A (n = 3 dawców). Wzrost krotności pokazano w porównaniu z ALI-PBEC hodowanym z 50 nM RA i przedstawionym jako średnia wartość ± SD. (Zobacz odniesienie 23, aby uzyskać szczegółowe informacje) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

W ciągu ostatnich lat badano wydajność alternatywnych produktów w systemie hodowli, takich jak podłoża i tworzywa sztuczne. Powody takich ocen były różne, w tym zmiany w składzie pożywek przez producentów, wprowadzone nowe media, a także niedobór produktów w czasie pandemii COVID-19 (2020-2022). Zaobserwowano, że podobne produkty od różnych dostawców skutkują zróżnicowanymi kulturami komórek nabłonkowych w oparciu o ocenę markerów typów komórek nabłonkowych, chociaż ostateczny skład komórkowy może się znacznie różnić (Rysunek 6A), podczas gdy różnice w TEER były mniej wyraźne (Rysunek 6B)). Z drugiej strony, pożywka od różnych dostawców spowodowała znaczne różnice w składzie komórkowym; przy zastosowaniu wkładek różnych marek różnice te były ograniczone (Rysunek 6C). W szczególności przy użyciu pożywki do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych PneumaCult firmy STEMCELL Technologies zaobserwowano inną morfologię i szybsze powstawanie widocznej aktywności rzęsek. Oprócz tych obserwacji zaobserwowano również różnicę w wartościach TEER i różnicę w składzie komórkowym ALI-PBEC w porównaniu z pożywką cBD (Rysunek 6D).

figure-results-5
Rysunek 6: Porównanie różnych dostawców podłoża do komórek nabłonkowych i wkładek do hodowli komórkowych. PBEC wyizolowano, rozszerzono i stworzono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. (A) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i klubowych (odpowiednio TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1) mierzono metodą qPCR i normalizowano dla RPL13A i ATP5B. n = 2 dawców; słupki przedstawiają średnią wartość ± SD. (B) W ciągu 9 dni po ALI mierzono opór elektryczny, a następnie obliczano TEER (Ω·cm2). n = 3 różnych dawców; średnie wartości są przedstawione ± SD. (C) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni przy użyciu wkładek do hodowli komórkowych zakupionych od trzech różnych dostawców, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek rzęskowych, kubkowych i klubowych (odpowiednio FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1) mierzono metodą qPCR i normalizowano dla RPL13A. n = 18 różnych dawców, słupki przedstawiają średnią wartość ± SD. Dane przetestowano pod kątem istotności za pomocą jednoczynnikowego nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa ANOVA i nie stwierdzono istotnej różnicy. (D) ALI-PBEC hodowano w pożywce z CBD-u lub pożywce PneumaCult (technologie STEMMCELL) przez 14 dni po ALI, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i maczugowych (odpowiednio TP63, FOXJ1, MUC5B i SCGB1A1) mierzono metodą qPCR i normalizowano dla RPL13A (słupki przedstawiają średnią wartość ± SD), a opór elektryczny mierzono w 5 i 12 dniach po ALI i wykorzystano do obliczenia TEER (Ω·cm2). n = 2; wartość średnia jest przedstawiona ± SD (szczegóły w odnośniku 23). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Skład roztworów i mediów użytych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje izolację ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej, metodę optymalnej ekspansji komórek bez utraty potencjału różnicowania, procedurę kriokonserwacji oraz procedurę generowania dobrze zróżnicowanych kultur ALI-PBEC. Ponadto przedstawiono opis kontroli jakości, a także instrukcje dotyczące monitorowania i oceny zróżnicowanych ALI-PBEC.

Opisany protokół rozpoczyna się od makroskopowo normalnego, wolnego od guza pierścienia oskrzelowego, który jest wycinany z płata płuca od pacjentów poddawanych operacji związanej z rozpoznaniem raka płuc. Dlatego należy zauważyć, że pierścienie te nie mogą być uważane za zdrową tkankę, co może w związku z tym wpływać na charakterystykę hodowli komórkowej. Alternatywnymi źródłami pozyskiwania komórek nabłonka oskrzeli są biopsje oskrzeli, szczotkowanie oskrzeli lub tkanki z płuc dawcy lub biorcy przeszczepu. Niezależnie od źródła, przy stosowaniu tkanki płucnej należy wziąć pod uwagę ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, dlatego w różnych pożywkach hodowlanych stosuje się antybiotyki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego kultury komórkowej. W szczególności mykoplazma stanowi wysokie i powszechne ryzyko w hodowli komórkowej ze względu na jej szeroki zakres wpływu na hodowlę komórkową, oporność na antybiotyki powszechnie stosowane w hodowlach komórkowych oraz fakt, że zanieczyszczenie mykoplazmą można potwierdzić tylko za pomocą testów wykrywania mykoplazmy. Dlatego w początkowej fazie hodowli komórkowej po wyizolowaniu komórek z tkanki płucnej stosuje się preparat przeciwdrobnoustrojowy Primocin o szerokim spektrum działania, a podczas procesu hodowli losowo wybrane próbki są badane na obecność mykoplazmy.

Procedura izolacji, rozpoczynająca się od pierścienia oskrzelowego, zapewnia wystarczający materiał wyjściowy, aby umożliwić stopień ekspansji tych pierwotnych komórek potrzebny do rozpoczęcia hodowli w ALI bez uszczerbku dla zdolności różnicowania. Jednak rozpoczęcie ekspansji izolowanych komórek nabłonka z ograniczoną liczbą komórek może stwarzać problemy z uzyskaniem wystarczającej liczby insertów z wystarczającą liczbą komórek, które można wysiać do hodowli ALI. Przedłużona hodowla i wielokrotne pasażowanie komórek pierwotnych może powodować starzenie replikacyjne. Zaproponowano różne rozwiązania, aby przezwyciężyć to ograniczenie. Horani i wsp. wykazali, że inhibitor kinazy Rho (ROCK) Y-27632 zwiększył proliferację komórek podstawnych30, Mou i wsp. zastosowali podwójne hamowanie Smad w celu ekspansji podstawowych komórek macierzystych przy zachowaniu cech zróżnicowanej warstwy komórek nabłonka31, a Sachs i wsp. opracowali system organoidów dróg oddechowych, który można wykorzystać do rozszerzania komórek nabłonka dróg oddechowych i utrzymywania ich potencjału różnicowania w trakcie wielu pasaży32. Ta ostatnia metoda została również wykorzystana do namnażania komórek ze źródeł o bardzo niskiej liczbie komórek, takich jak aspiraty tchawicy (TA) wcześniaków (<28 tydzień ciąży) i płyn z płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL), przed przeniesieniem do hodowli ALI, jak opisano tutaj33. Stwierdzono, że komórki wyizolowane z BAL i TA wykazywały zdolność różnicowania podobną do komórek generowanych z tkanki oskrzelowej, chociaż różnice obserwowano, gdy różnicowanie było przekrzywione w kierunku bardziej rzęskowych lub więcej kultur zawierających komórki kubkowe przy użyciu hamowania sygnalizacji Notch lub cytokiny Th2 IL-1333. W związku z tym zaleca się, aby w przypadku hodowli ALI-PBEC z materiału wyjściowego o niskiej liczbie komórek nabłonkowych przy użyciu podobnych metod, zawsze sprawdzać hodowle pod kątem podstawowych kryteriów jakości, jak omówiono w sekcji 6 protokołu. Co ważne, zastosowanie komórek zasilających może również pomóc w uzyskaniu większej liczby komórek, co jest niezbędne w warunkach inżynierii rusztowań do przeszczepów, gdzie czas i liczba komórek mają kluczowe znaczenie. Ilustruje to badanie, w którym autologiczne komórki nabłonkowe wyhodowano z biopsji pobranych od pacjenta z chorobą tchawicy, a komórki szybko się namnażały w obecności mysiej warstwy embrionalnej żywiciela (mitotycznie inaktywowane fibroblasty 3T3-J2) i wyżej wspomnianego inhibitora szlaku Rho / ROCK (Y-27632)34. Uzyskana w ten sposób hodowla komórkowa okazała się przydatna do ponownego zasiedlenia rusztowań tchawicy, a zatem może być postrzegana jako odpowiedni protokół dla modelu przeszczepu.

Podczas korzystania z protokołu opisanego w tym artykule, ale także podczas korzystania z innych protokołów hodowlanych, nieuchronnie pojawia się błąd selekcji. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że różnice w szczegółach protokołu, takie jak pochodzenie komórek używanych do inicjacji hodowli, skład pożywki i inne szczegóły protokołu, mogą prowadzić do zmian w składzie komórkowym kultur, a tym samym zmian w odpowiedzi kultury ALI33,35. Ponadto różnice we właściwościach komórek zaobserwowano również przy porównywaniu różnych pożywek do różnicowania komórek dróg oddechowych10,11. Porównując PneumaCult i pożywkę z CBD, zaobserwowano różnice w markerach mRNA komórek kubkowych i maczugowych, wartościach TEER i grubości warstwy komórkowej. Na podstawie tych obserwacji, pomimo braku podstaw statystycznych, ze względu na małą liczbę użytych dawców, nieznany klientom skład pożywki oraz wyższe koszty pożywki PneumaCult, w naszym laboratorium podjęto decyzję o zastosowaniu pożywki z CBD.

Jak wspomniano, komórki można początkowo namnażać za pomocą hodowli organoidów, a następnie przenosić do systemu wstawiania 2D ALI. Jest to o tyle istotne, że organoidy nabłonka dróg oddechowych nie są przystosowane do ekspozycji na substancje unoszące się w powietrzu, natomiast zastosowanie systemu ALI 2D pozwala na ocenę wpływu substancji unoszących się w powietrzu, takich jak dym papierosowy23,36 na hodowane komórki nabłonka dróg oddechowych. Innym podejściem do tworzenia hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych ALI jest generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)37. W takich protokołach, na końcowym etapie protokołu różnicowania po różnicowaniu do progenitorów bliższych dróg oddechowych, komórki mogą być różnicowane przez hodowlę do ALI przy użyciu procedur podobnych do opisanych tutaj.

W obecnym protokole pożywka z CBD-a jest używana do hodowli w ALI. Pożywka CBD to pożywka wolna od surowicy, która jest przygotowywana przez dodanie mieszanki różnych suplementów, zainspirowanych Fulcherem i wsp.38 , a także innymi badaniami. Roztwór suplementu zawiera 52 μg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 0,5 ng/ml ludzkiego EGF, 0,5 μg/ml epinefryny, 10 μg/ml transferyny, 5 μg/ml insuliny, 6,5 ng/ml trójjodotyroniny i 0,1 ng/ml RA39. Ponieważ BPE jest ekstraktem tkankowym i podlega zmienności pod względem partii, pożywki nie można uznać za w pełni zdefiniowaną pożywkę ani nie jest ona wolna od zwierząt. Pożywka do hodowli komórkowych, która jest w pełni zdefiniowana, jest preferowana w celu zminimalizowania różnic między partiami. W związku z przejściem na badania bez udziału zwierząt ważne jest, aby dołożyć starań w celu wyprodukowania określonych pożywek, które nie zawierają produktów pochodzenia zwierzęcego i które są przystępne cenowo dla społeczności naukowej.

W zależności od pytania badawczego można zastosować różne konfiguracje eksperymentalne oparte na modelu ALI. Na przykład, aby zbadać wpływ związków, które mogą wpływać na proces różnicowania, można temu zaradzić, dodając związki do kultury na różnych etapach hodowli zanurzonej, podczas różnicowania lub na etapie dobrze zróżnicowanym. Na skład komórkowy kultury ALI-PBEC można wpływać poprzez dodawanie określonych związków; na przykład różnicowanie ALI-PBEC w obecności IL-13 generuje kulturę z większą liczbą komórek kubkowych i mniejszą liczbą komórek rzęskowych, podczas gdy leczenie inhibitorem γ-sekretazy DAPT (używanym do blokowania sygnalizacji Notch) podczas różnicowania powoduje hodowlę z większą liczbą komórek rzęskowych kosztem komórek kubkowych 23,40,41,42.

Ponadto środki stymulujące komórki lub blokujące pewne procesy mogą być stosowane do przedziału podstawowego lub (w bardzo małej objętości) do przedziału wierzchołkowego hodowli. Komórki mogą być również narażone na działanie substancji unoszących się w powietrzu od strony wierzchołkowej. Takie projekty ekspozycji wykorzystano do zbadania wpływu spalin z silników Diesla lub całego dymu papierosowego na PBEC 23,43,44. Pożywkę można zbierać za każdym razem, gdy podłoże jest zmieniane, w celu monitorowania wydzielanych białek po stronie podstawowej; to samo dotyczy wierzchołkowej strony komórek, którą przemywa się PBS podczas odświeżania podłoża podstawowego. Zbiera się tak zwane płukanie wierzchołkowe i opcjonalnie dodaje się ditioerytrytol (DTE) w celu bardziej efektywnej dysocjacji śluzu wytwarzanego przez komórki kubkowe. Lizaty komórkowe można uzyskać w celu wyizolowania białka całkowitego, RNA oraz chromosomalnego i mitochondrialnego DNA. Komórki można dalej badać przy użyciu przeciwciał dla specyficznych markerów, przecinając membranę politereftalanu etylenu (PET) z plastikowej wkładki i dalej tnąc tę błonę na mniejsze kawałki w celu wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego45. Ponadto cytometria przepływowa lub FACS może być również stosowana po trypsynizacji komórek we wstawkach. Na etapie ALI rozwój bariery komórkowej można monitorować, mierząc opór elektryczny, a następnie obliczając TEER, gdzie opór elektryczny jest odwrotnie proporcjonalny do powierzchni wkładu membranowego. Obliczenia opierają się na prawie Ohma przy użyciu następującego wzoru: figure-discussion-1, gdzie Rm jest zmierzoną rezystancją elektryczną, Rb jest podstawową rezystancją elektryczną wkładki bez powłoki i komórek, a SA jest polem powierzchni membrany wkładki. Pomiar oporu elektrycznego za pomocą elektrod EVOM2 i STX/pałeczek jest prosty, ale w dużym stopniu zależy od procedur obchodzenia się z nim podczas wprowadzania go do studni. Zasugerowano również, że kształt elektrody wpływa na pomiar funkcji barierowej stosunkowo dużej powierzchni17.

Dalsze doskonalenie systemu hodowli komórkowych ALI, mające na celu zwiększenie dokładnej reprezentacji tkanek, obejmuje kohodowlę dodatkowych typów komórek, takich jak leukocyty, fibroblasty lub komórki śródbłonka 46,47,48. Zaobserwowano, że ta kohodowla ALI-PBEC z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub makrofagami zróżnicowanymi M-CSF znacząco wpływa na wrodzone odpowiedzi nabłonkowe i naprawę48. Należy zauważyć, że w takich modelach kokultur kompatybilność ze średnimi nośnikami może stanowić problem. Ponieważ pożywka stosowana do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych została opracowana specjalnie dla PBEC i może nie być optymalnie dostosowana do innych typów komórek, konieczna jest optymalizacja. Innym rodzajem postępu obserwowanego w dziedzinie biologii dróg oddechowych, do którego można wykorzystać izolowane PBEC, jest zastosowanie technologii Organs-on-Chips (OoC)49,50. Za pomocą tej technologii można badać wpływ sił mechanicznych oddychania i przepływu krwi, takich jak rozciąganie, przepływ powietrza i medium 29.

Zmienność między dawcami może być znacząca w przypadku stosowania PBEC od różnych dawców, dlatego ważne jest, aby rozważyć użycie komórek od kilku dawców w celu uwzględnienia tej zmienności w badaniach hodowli komórek nabłonkowych. Ponieważ hodowla ALI-PBEC jest czasochłonna i wiąże się ze znacznymi kosztami, badana jest możliwość ustanowienia kultur ALI-PBEC poprzez mieszanie komórek pochodzących od różnych dawców w jednej wkładce do hodowli komórkowej. W ten sposób eksperymenty pilotażowe można łatwo przeprowadzić przy użyciu komórek pierwotnych, przed analizą odpowiedzi kultur pochodzących od różnych indywidualnych dawców. Ponadto dawcy o różnych cechach (np. różnej kategorii wiekowej lub płci) mogą zostać pogrupowani do badań eksploracyjnych. Podczas stosowania mieszanek dawców ważne jest, aby upewnić się, że obecna jest równa liczba komórek różnych dawców, aby zapobiec możliwości, że jeden dawca zdominuje wyniki w wyniku wyższego tempa proliferacji. W związku z tym komórki od indywidualnych dawców są ekspandowane oddzielnie i wysiewane z większą gęstością we wstawce w porównaniu z komórkami wysiewającymi od indywidualnego dawcy, aby zminimalizować proliferację we wstawce przed przejściem do ALI. Odpowiedzi mieszanek dawców i odpowiadających im indywidualnych dawców porównano, badając kinetykę infekcji SARS-CoV-2. Stosując RT-qPCR i barwienie immunofluorescencyjne, zaobserwowano, że mieszanka dawców zapewnia dobrą reprezentację różnych indywidualnych dawców, wykazując podobną liczbę wytwarzanych cząstek wirusa i podobną liczbę zakażonych komórek28.

Aby stać się akceptowalną alternatywą dla modeli zwierzęcych, edycja genów hodowanych komórek nabłonka oskrzeli powinna być wykonalna51. Badana jest technologia interferencji RNA przy użyciu małych interferujących RNA (siRNA) w ALI-PBEC, jednak ponieważ komórki muszą być transfekowane siRNA podczas zanurzonej fazy hodowli, knockdown nie jest wystarczająco utrzymywany podczas hodowli ALI ze względu na długi czas trwania hodowli, chyba że transfekcja siRNA jest często powtarzana podczas hodowli52. Niemniej jednak siRNA mogą być z powodzeniem wykorzystywane do modyfikacji ekspresji genów w zanurzonych komórkach podstawnych. Inni z powodzeniem wykorzystali technologię CRISPR/Cas9 do edycji genów w pierwotnych hodowlach komórek nabłonka dróg oddechowych ALI z dostarczaniem rybonukleoproteiny (RNP) 53. Podczas stosowania takich technik ważne jest, aby komórki zachowały pełną zdolność różnicowania. Ponieważ pierwotne hodowle komórek dróg oddechowych nie mogą być pasażowane w nieskończoność, klonalna ekspansja komórek edytowanych genem nie jest łatwa, a dodawanie pożywki w celu wyselekcjonowania transfekowanych komórek jest kłopotliwe. Dlatego trudno jest osiągnąć pożądany knockdown we wszystkich hodowanych komórkach. Alternatywą dla generowania klonów nokautujących jest zastosowanie strategii nokautu w hiPSCs54 i wykorzystanie tych komórek do generowania komórek nabłonka dróg oddechowych. Inną, choć nieoptymalną, alternatywą jest ustanowienie unieśmiertelnionej linii PBEC w celu klonalnego rozszerzania komórek edytowanych genetycznie55.

Przedstawiony tutaj protokół jest jednym ze sposobów generowania dobrze zróżnicowanego pseudostratyfikowanego ALI-PBEC, ale stwierdzono, że inne protokoły również ustanawiają taką kulturę, z mniejszymi i większymi różnicami w porównaniu z przedstawionym protokołem. Naszym zdaniem, walidacja metod hodowli w całym laboratorium i rygorystyczna kontrola jakości są niezbędne, aby system ALI-PBEC i podobne systemy hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych stały się ważną alternatywą dla doświadczeń na zwierzętach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują u nich istotne konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wykorzystujące model opisany w tym artykule były wspierane przez różne organizacje finansujące, w tym Lung Foundation Netherlands, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia (ZonMw, COVID-19 MKMD grant), Holenderskie Towarzystwo Wymiany Testów na Zwierzętach (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), a także granty badawcze od firm takich jak Boehringer Ingelheim i Galapagos. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rezystor testowy 1,000 omówWorld Precision InstrumentsN/ASłuży do kalibracji woltoomomierza nabłonkowego EVOM2
Kwas 4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)etynylo)-benzoesowy (EC 23)Tocris4011Stosowany w pożywce z bBD
6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe traktowane TCCorning3506Stosowany w pierwszym etapie do wzrostu komórek wyizolowanych z oskrzeli pierścień 
Zestaw do pomiaru wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowychPromoCellC-21160Używany do porównania z pożywką do kąpieli
perełkowej cBD 20 litrówLab Armor74220-720Służy do wstępnego podgrzewania roztworów do hodowli komórkowych
BEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeliBulletKit LONZACC-3170Służy do porównania z pożywką cBD
Frakcja albuminy bydlęcej V (BSA)Thermo Fisher Scientific15260037Stosowany w roztworze powlekającym
Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)Thermo Fisher Scientific37000-015Stosowany w c-KSFM
Suplement wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEpiCGS)Laboratoria badawcze ScienCell3262Stosowany w podłożu cBD
Komórka nabłonka oskrzeli średnio podstawna (BEpiCM-b)Laboratoria Badawcze ScienCellSCC3211-bStosowany w podłożu
cBDWkładki do hodowli komórkowych; 12 mm Transwell z 0,4 i mikro; Wkładka z membrany poliestrowej o m porachCorning3460Wkładki do hodowli komórkowych stosowane w protokole
Wkładki do hodowli komórkowych; Wkładki 12-dołkowe, 0,4 i mikro; m Bezbarwny PETCellQART firmy SABEU9310412Wkładki do hodowli komórkowych używane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning
Wkładki do hodowli komórkowych; 12-dołkowe wkładki do hodowli tkankowych ThinCertGreiner Bio-One82050-032Wkładki do hodowli komórkowych stosowane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning
Kolba CELLSTAR, TC, PS, 250 ml, 75 cm2Greiner Bio-One658170Służy do rozszerzania komórek liczbowych
CFX Maestro 1.0Bio-RadN/AProgram do analizy danych qPCR generowanych za pomocą systemu CFX384
CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym System wykrywaniaBio-Rad1855484qPCR
Zestaw elektrod pałeczkowychWorld Precision InstrumentsSTX2Służy do pomiaru oporu elektrycznego w inkubatorze ALI-PBEC
CO2-InkubatorPHCbiMCO-170AICUV-PEInkubator do hodowli komórkowych używany do hodowli komórek wolnych od mycplazmy
Inkubator CO2HereausHeracell 150Inkubator do hodowli komórkowych zakażonych mycplazmą
Pojemnik CoolcellCorning432006Służy do kriokonserwacji komórek w temperaturze -80 ° C przed przeniesieniem do cieczy N2
Hrabina 3 Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX2000Służy do liczenia komórek i określania stężenia komórek
KriowialneNalgene479-3224Służy do kriokonserwacji komórek w
D-GlucoseAvantor VWR BDH CHEMICALS101174YStosowany w miękkiej trypsynie
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Avantor VWR0231Stosowany w pożywce do zamrażania komórek
dNTP (10 mM)PromegaU1515Stosowany w syntezie cDNA
Zmodyfikowane podłoże Eagle'a (DMEM) firmy Dulbecco + 4500 mg/l D-GlucoseSTEMCELL Technologies36250Stosowany w pożywce cBD
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 4,5 g/l glukozy z l-glutaminąLONZALOBE12-604FStosowany w pożywce z CBD w porównaniu z DMEM innych producentów 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, pirogronianuThermo Fisher Scientific41966029Stosowany w pożywce z CBD, aby porównać z DMEM innych producentów 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Thermo Fisher Scientific37000-015Stosowany w c-KSFM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Avantor VWR BDH CHEMICALS443885JStosowany w miękkiej trypsyny
EVOM2 Woltoomomierz nabłonkowyWorld Precision Instruments91799Używany z zestawem elektrody pałeczki do pomiaru oporu elektrycznego w
roztworze fibronektyny ALI-PBEC, Człowiek PromoCellC-43060Stosowany w roztworze powlekającym
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Stosowany w podłożu cBD
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)ScienCell Research LaboratoriesSCC0313Służy do rozpuszczania proteazy XIV 
IQ SYBR Green Super mixBio-Rad170887odczynnik qPCR
Chlorowodorek izoproterenolu, (-)-Sigma-AldrichI-6504Stosowany w c-KSFM
Keratynocyty-SFM (KSFM)Thermo Fisher Scientific17005-034Stosowany w c-KSFM
Maxwell RSC InstrumentPromegaAS4500Zautomatyzowany system izolacji RNA
Maxwell RSC po prostu Zestaw tkanek RNAPromegaAS1340Służy do izolacji całkowitego RNA za pomocą Maxwell RSC Instrument
M-MLV Odwrotna transkryptazaPromegaM5301Stosowany w syntezie cDNA
M-MLV Odwrotna transkryptaza 5X bufor reakcyjnyPromegaM531AStosowany w syntezie cDNA
MycoStripInvivoGenrep-mys-10Używany do wykrywania obecności mykoplazmy w próbkach hodowli komórkowych
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630056Stosowany w pożywce cBD
Oligo(dT)15Qiagen79237Stosowany w syntezie roztworu
cDNA Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep)ScienCell Research LaboratoriesSCC0513Stosowany jako antybiotyk w pożywce c-KSFM i cBD
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)LUMC aptekaNie dotyczyStosowany w różnych etapach protokołu
Pneumacult-ALI MediumSTEMCELL Technologies05002Służy do hodowli komórek w fazie różnicowania w porównaniu z pożywką CBD
Pneumacult-Ex Plus MediumSTEMCELL Technologies05040Służy do hodowli komórek w fazie zanurzonej w celu porównania z pożywką CBD
, Starter, ATP5B, naprzódZintegrowane DNA TechnologieNie dotyczySekwencja nukleotydowa: TCACCCAGGCTGGTTCAGA
Primer, ATP5B, odwrotnyIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT
Primer, FOXJ1, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: GGAGGGGACGTAAATCCCTA
Primer, FOXJ1, odwrotnaIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC
Primer, MUC5AC, naprzódZintegrowane technologie DNANieSekwencja nukleotydowa: CCTTCGACGGACAGAGCTAC
Primer, MUC5AC, odwrotnaZintegrowana Technologia DNA NiedotyczySekwencja nukleotydowa: TCTCGGTGACAACACGAAAG
Primer, MUC5B, naprzódZintegrowane technologie DNANie dotyczySekwencja nukleotydowa: GGGCTTTGACAAGAGAGT
Primer, MUC5B, odwrotnasekwencja nukleotydowa Integrated Integrated DNA TechnologiesN/A: AGGATGGTCGTGTTGATGCG
Primer, RPL13A, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG
Primer, RPL13A, reverseIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC
Primer, SCGB1A1, naprzódIntegrated DNA TechnologiesNie dotyczySekwencja nukleotydowa: ACATGAGAGGAGGCAGGGGCTC
Primer, SCGB1A1, odwrotnaZintegrowane technologie DNANieSekwencja nukleotydowa: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA
Starter, TP63, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: CCACCTGGACGTATTCCACTG
Primer, TP63, odwrotnaIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: TCGAATCAAATGACTAGGGGGG
PrimocinInvivoGenant-pm-2Stosowany jako środek przeciwdrobnoustrojowy przeciwko bakteriom, mykoplazmom i grzybom w pożywce c-KSFM
Proteaza XIVSigma-AldrichP5147Stosowany do enzymatycznego leczenia pierścienia oskrzelowego
RNAsin Rekombinowany inhibitor rybonukleazyPromegaN2515Stosowany w syntezie cDNA
Inhibitor trypsyny sojowej ( SBTI)Sigma-AldrichT9128Służy do hamowania działania miękkiej trypsyny
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096Stosowany w syntezie cDNA
TissueSAFE plusMILESTONE MEDICALN/ASystem transferu próżniowego do próbek biologicznych
Roztwór błękitu trypanowegoThermo Fisher Scientific15250061Służy do liczenia żywych i martwych komórek 
Trypsyna 1:250Thermo Fisher Scientific27250-018Stosowany w miękkim
roztworze kolagenu trypsyna typu I (PureCol)Advanced BioMatrix5005-BStosowany w roztworze do powlekania
Pojemnik uniwersalny, PP, z nakrętką PEAvantor VWR216-2053Stosowany w protokole leczenia proteazy XIV pierścienia oskrzelowego
, dotyczy dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112(2022).
  2. de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  3. Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914(2022).
  4. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  5. Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128(2021).
  6. Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
  7. Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
  8. Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
  9. Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742(2019).
  10. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137(2020).
  11. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  12. Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540(2022).
  13. Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
  14. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
  15. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
  16. Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511(2022).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
  19. Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
  20. Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
  21. Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
  22. van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
  23. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).
  24. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
  25. Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
  26. Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
  27. Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
  28. Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
  29. Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
  30. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  31. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  32. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  33. Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
  34. Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
  36. Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071(2022).
  37. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  38. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
  39. Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
  40. Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
  41. Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
  42. Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347(2017).
  43. Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
  44. vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227(2022).
  45. Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278(2020).
  46. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013(2022).
  47. Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386(2017).
  48. van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
  49. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  50. Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
  51. Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
  52. Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
  53. Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
  54. Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
  55. Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotna hodowla kom rekbiobankowanie tkanki p ucnejizolacja kom rek nab onkowychr nicowanie luzowo rz skowepomiar TEERprotok kriokonserwacjianaliza ekspresji gen wcharakterystyka typ w kom rek

Powiązane artykuły