Artykuł metodologiczny

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65102

⸱

26 maja 2023

 ,  , 
1PulmoScience Laboratory, Department of Pulmonology, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Streszczenie

Warstwa komórek nabłonka dróg oddechowych tworzy pierwszą barierę między tkanką płucną a środowiskiem zewnętrznym i dlatego jest stale narażona na wdychane substancje, w tym czynniki zakaźne i zanieczyszczenia powietrza. Warstwa nabłonka dróg oddechowych odgrywa kluczową rolę w wielu różnych ostrych i przewlekłych chorobach płuc, a różne leki ukierunkowane na ten nabłonek są stosowane przez wdychanie. Zrozumienie roli nabłonka w patogenezie i sposobu, w jaki można go ukierunkować na terapię, wymaga solidnych i reprezentatywnych modeli. Coraz częściej stosuje się modele hodowli nabłonka in vitro, które oferują przewagę w postaci przeprowadzania eksperymentów w kontrolowanym środowisku, wystawiając komórki na różnego rodzaju bodźce, toksyny lub czynniki zakaźne. Zastosowanie komórek pierwotnych zamiast unieśmiertelnionych lub nowotworowych linii komórkowych ma tę zaletę, że komórki te różnicują się w hodowli do pseudowarstwowej spolaryzowanej warstwy komórek nabłonka z lepszą reprezentacją nabłonka w porównaniu z liniami komórkowymi.

Prezentowany tutaj jest solidny protokół, który został zoptymalizowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci, do izolacji i hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych z tkanki płucnej. Procedura ta umożliwia skuteczną izolację, ekspansję, hodowlę i różnicowanie śluzowo-rzęskowe pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli (PBEC) poprzez hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) i obejmuje protokół biobankowania. Ponadto opisano charakterystykę tych kultur przy użyciu genów markerowych specyficznych dla komórki. Te kultury ALI-PBEC mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do ekspozycji na cały dym papierosowy lub mediatory stanu zapalnego oraz do kohodowli/infekcji wirusami lub bakteriami.

Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie, ilustrujący procedurę krok po kroku, ma stanowić podstawę i/lub odniesienie dla osób zainteresowanych wdrożeniem lub adaptacją takich systemów hodowlanych w swoim laboratorium.

Wprowadzenie

Rola nabłonka dróg oddechowych w wielu ostrych i przewlekłych chorobach płuc została opisana w różnych recenzjach1,2,3,4,5,6,7. Dobrze zróżnicowane hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych są ważnym narzędziem do wyjaśnienia roli nabłonka dróg oddechowych. Hodowla komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy przepływu powietrza i cieczy (ALI) jest szeroko stosowana w celu promowania różnicowania komórek podstawnych nabłonka dróg oddechowych, a tym samym wiarygodnego badania nabłonka dróg oddechowych in vitro8,9. W ostatnich latach wykorzystanie takich modeli jeszcze bardziej wzrosło w wyniku nowych inicjatyw badawczych związanych z pandemią COVID-19 i ogólnoświatowym przejściem na badania bez udziału zwierząt. W związku z tym zwiększone wykorzystanie tej modelowej linii komórkowej podkreśla potrzebę dzielenia się procedurami i doświadczeniami w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Pozwoli to również na porównanie wyników pomiędzy grupami badawczymi. Solidność procedury jest kluczową cechą i dlatego musi zostać poddana kontroli jakości. Kilka laboratoriów zainwestowało w opracowanie protokołów hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych w ALI. Czas, wysiłek i wymagany budżet można zmniejszyć, gdy te procedury zostaną szczegółowo udostępnione. Szczegóły te obejmują na przykład wybór tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych i pożywek dostarczanych przez różnych producentów, ponieważ stwierdzono, że ma to wpływ na charakterystykę uzyskanych kultur10,11,12. Podkreśla to znaczenie dzielenia się doświadczeniami i szczegółami procedur hodowlanych, ponieważ brak takich spostrzeżeń może mieć wpływ na wyniki i/lub wysiłki walidacyjne w różnych laboratoriach mogą być utrudnione.

Nabłonek płuc człowieka składa się z różnych typów komórek, w tym głównych, takich jak komórki podstawne, komórki rzęskowe, komórki kubkowe i komórki maczugowe. Aby wiarygodnie naśladować warstwę komórek nabłonka w drogach oddechowych in vitro, te typy komórek muszą być reprezentowane w modelach hodowlanych, a ich polaryzacja i funkcja muszą być zachowane13,14,15,16. Równie ważne jest uświadomienie sobie, że cechy dawcy (w tym stan choroby) i anatomiczne pochodzenie komórek (tj. nos, tchawica, duże i małe drogi oddechowe) mogą wpływać na skład komórkowy i funkcjonalne odpowiedzi hodowli komórkowej. Odpowiednia wiedza specjalistyczna i praktyka są warunkiem wstępnym pomyślnej hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych i oceny jakości hodowli zarówno intuicyjnie (poprzez oględziny podczas hodowli), jak i ilościowo. Celem tego wkładu jest zapewnienie opłacalnej i efektywnej czasowo metody izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (PBEC), która może być również stosowana do hodowli komórek tchawicy i małych komórek nabłonka dróg oddechowych. Oprócz opisu metody izolowania takich komórek z wyciętej tkanki płucnej, przedstawiono i omówiono metodę ekspansji i biobankowania, a na końcu ustanowienia i scharakteryzowania dobrze zróżnicowanej kultury ALI w rozsądnym okresie kosztów i czasu.

Protokół

Komórki wyizolowano z makroskopowo prawidłowej tkanki płuc pobranej od pacjentów poddawanych operacjom resekcji z powodu raka płuc w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Leiden w Holandii. Pacjenci, od których pobrano tę tkankę płucną, zostali włączeni do biobanku via system braku sprzeciwu w celu dalszego zakodowanego i anonimowego wykorzystania takiej tkanki (www.coreon.org). Jednak od 01-09-2022 pacjenci są włączani do biobanku na podstawie aktywnej świadomej zgody, zgodnie z lokalnymi przepisami biobanku LUMC i za zgodą instytucjonalnej komisji etyki medycznej (B20.042/Ab/ab i B20.042/Kb/kb).

UWAGA: Wszystkie procedury są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z lokalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego oraz w sterylnych warunkach pracy, przy użyciu rękawic chirurgicznych i fartucha laboratoryjnego, chyba że wskazano inaczej. W przypadku wszystkich mediów, odczynników i pozostałych roztworów użytych w protokole, należy zapoznać się z Tabelą materiałów oraz Uzupełniającą tabelą 1. Szczegółowe kroki protokołu przedstawiono na Rysunku 1

1. Izolacja komórek nabłonka oskrzelowego z tkanki płuc człowieka

UWAGA: Aby uzyskać optymalny stopień powodzenia w izolacji komórek nabłonkowych oskrzeli, wycięty pierścień oskrzeli należy przechowywać w zanurzeniu w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) z dodatkiem Primocinu.

  1. Przygotowania przed rozpoczęciem procedury
    1. Przygotować roztwór powlekający w PBS, zgodnie z opisem w Supplementary Table 1, i pokryć odpowiednią liczbę płytek 6-dołkowych, stosując 1,5 mL roztworu powlekającego na dołek. Inkubować przez 2 h w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
      UWAGA: Liczba dołków do powlekania zależy od wielkości wyciętej tkanki. Jako ogólną wytyczną, cztery płytki 6-dołkowe są powlekane, gdy wycięty pierścień oskrzeli ma średnicę 10 mm i szerokość 4 mm.
    2. Przygotować pełną bezsurowiczą pożywkę dla keratynocytów (c-KSFM), zgodnie z opisem w Supplementary Table 1; użyć 2 mL pożywki na dołek w płytce 6-dołkowej.
      UWAGA: Pożywkę c-KSFM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni. c-KSFM jest pożywką z niską zawartością wapnia, stosowaną do ekspansji komórek nabłonka dróg oddechowych przy jednoczesnym hamowaniu wzrostu zanieczyszczających fibroblastów.
  2. Oczyścić pierścień oskrzeli, delikatnie płucząc go w 10 mL sterylnego PBS w 10-centymetrowej płytce Petriego. Za pomocą pęsety ostrożnie przytrzymać pierścień (dotykać tylko z zewnątrz) i za pomocą małych nożyczek usunąć nadmiar tkanki łącznej oraz pozostałości krwi. Do dalszej obróbki przeciąć pierścień na pół.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia używane w procesie powinny zostać wysterylizowane przed użyciem.
  3. Zanurzyć dwie połowy pierścienia oskrzeli w 10 mL podgrzanego roztworu proteazy XIV (1,8 mg/mL) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS), zawierającego Primocin, w zamkniętym sterylnym pojemniku i inkubować dokładnie przez 2 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    UWAGA: HBSS jest stosowany jako rozcieńczalnik dla proteazy XIV w celu oddzielenia komórek od tkanki podczas 2-godzinnego okresu inkubacji. HBSS jest zrównoważonym roztworem izotonicznym, który umożliwia utrzymanie żywotności komórek podczas krótkotrwałych inkubacji.
  4. Po inkubacji przenieść fragmenty tkanki do płytki Petriego z 10 mL ciepłego PBS i zeskrobać wnętrze pierścienia za pomocą zgiętej pęsety, aby uzyskać zawiesinę komórkową.
    UWAGA: Tkanka wydaje się miększa i nieco obrzęknięta.
  5. Usunąć pierścień, przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL i dodać ciepły PBS, aby uzyskać końcową objętość 50 mL. Centryfugować przez 7 min przy 230 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Odssać nadpływ i resuspendować osad w 10 mL ciepłego PBS. Następnie uzupełnić objętość do 50 mL za pomocą ciepłego PBS. Centryfugować przez 7 min przy 230 x g w temperaturze RT.
  7. Odssać nadpływ i resuspendować osad komórkowy w odpowiedniej ilości ciepłej pożywki c-KSFM zawierającej Primocin.
    UWAGA: Primocin jest stosowany przez minimum 7 dni w celu wyeliminowania bakterii, grzybów lub (co istotne) mykoplazm, które mogły znajdować się w tkance; po 7 dniach wystarczające jest dodawanie do pożywki tylko penicyliny/streptomycyny.
  8. Odssać roztwór powlekający z płytek 6-dołkowych i dodać 2 mL zawiesiny komórkowej na dołek.
  9. Pozostawić komórki do wzrostu aż do osiągnięcia 80% do 90% konfluencji i zmieniać pożywkę trzy razy w tygodniu (np. w każdy poniedziałek, środę i piątek). Pożądany stopień konfluencji jest zazwyczaj osiągany między 7 a 14 dniem; jeśli czas wymagany do osiągnięcia pożądanej konfluencji przekroczy 14 dni, należy zutylizować komórki.
    UWAGA: W ciągu pierwszych kilku dni proliferuje tylko niewielka liczba komórek; grupy komórek stają się widoczne po kilku dniach.

2. Kriokonserwacja ludzkich pierwotnych komórek nabłonka oskrzelowego (PBECs)

UWAGA: Podczas pracy w temperaturach -80 °C i -196 °C w celu ochrony należy stosować rękawice kriogeniczne, a do przenoszenia zamrożonych probówek należy używać pęsety. Podczas pracy z ciekłym azotem w celu ochrony osobistej należy stosować rękawice kriogeniczne oraz przyłbicę.

  1. Odssać medium i wypłukać studienki raz, używając 2 mL ciepłego PBS na studienkę.
  2. Poddać komórki trypsynizacji, dodając 0,5 mL łagodnej trypsyny na studienkę (skład roztworu łagodnej trypsyny znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1). Inkubować komórki przez okres od 5 do maksymalnie 10 min w temperaturze 37 °C. Zamieszać roztwór trypsyny w płytce i uwolnić komórki, delikatnie opukując płytkę.
  3. Przenieść oddzielone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL zawierającej 1,1 mg/mL inhibitora trypsyny sojowej (SBTI; w celu zahamowania aktywności trypsyny) rozpuszczonego w KSFM z penicyliną/streptomycyną. Objętość SBTI musi być dwukrotnością całkowitej objętości łagodnej trypsyny (tj. 1 mL na studienkę).
    UWAGA: Nie dodawać SBTI bezpośrednio do studni, ponieważ komórki przyłączą się ponownie w ciągu kilku minut.
  4. Wirować probówkę przez 7 min przy 230 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 10 mL KSFM w temperaturze pokojowej zawierającego penicylinę/streptomycynę, bez innych dodatków. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przeprowadzić pomiar żywotności komórek (live/dead), dodając błękit trypanu w stosunku 1:1 lub zastosować alternatywną procedurę liczenia komórek żywych i martwych.
  6. Kriokonserwować komórki w stężeniu 400 000 komórek na mL medium do zamrażania (skład znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1) i dodać 1 mL tej zawiesiny do każdej krioprobowki. Przenieść krioprowbki do pojemnika coolcell i umieścić go w temperaturze -80 °C. Po 24 h przenieść probówki do ciekłego azotu w temperaturze -196 °C w celu długoterminowego przechowywania.
    UWAGA: Możliwe są dwie opcje przenoszenia komórek do medium do zamrażania, obie są skuteczne: 1) ponowne sformowanie osadu komórkowego poprzez wirowanie i resuspensja w zimnym medium do zamrażania przy wymaganym stężeniu komórek; lub 2) dodanie zimnego medium do zamrażania i dostosowanie stężenia krioprotektanta (siarczku dimetylu [DMSO]) w zależności od objętości KSFM, w którym znajdują się komórki.

3. Rozmrażanie krio konserwowanych PBEC i ich namnażanie w celu hodowli na wkładkach

  1. Pokryj kolbę do hodowli komórek T75 10 mL roztworu powlekającego w PBS, szczelnie zamykając nakrętki. Inkubuj kolbę w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Przed rozmrożeniem krio konserwowanych PBECs usuń roztwór powlekający z kolby i wypełnij ją 10 mL c-KSFM. Pozostaw do ogrzania do 37 °C w inkubatorze do hodowli komórek, z lekko uchylonymi nakrętkami, aby umożliwić dopływ powietrza z inkubatora.
  3. Szybko rozmroź komórki w kąpieli wodnej lub w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Łaźnia z kuleczkami jest preferowana nad kąpielą wodną ze względu na niższe ryzyko kontaminacji i mniejsze zużycie energii.
  4. Przenieś całą zawartość krio probówki do uprzednio ogrzanej kolby T75 z medium (krok 3.2) i równomiernie rozmieść komórki.
    UWAGA: Nie wiruj komórek na tym etapie, ponieważ nie przetrwają one procesu wirowania.
  5. Po około 4 h upewnij się, że komórki są wystarczająco przytwierdzone. Wymień medium na 10 mL świeżego, ciepłego c-KSFM.
    UWAGA: W ten sposób usuwa się DMSO z medium do zamrażania. Krok ten powinien zostać wykonany od 4 h do 24 h po wysianiu komórek do kolby.
  6. Hoduj komórki aż do osiągnięcia 80% do 90% konfluencji, wymieniając medium w każdy poniedziałek, środę i piątek.

4. Ustanowienie hodowli na granicy powietrze-ciecz z pierwotnymi komórkami nabłonka oskrzeli (ALI-PBEC)

UWAGA: Poniższa procedura dotyczy hodowli PBEC na insertach o średnicy wewnętrznej 11,9 mm.

  1. Pokryć odpowiednią liczbę wkładów do hodowli komórkowej 0,4 mL roztworu powlekającego na każdy wkład. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowej.
  2. Przygotować pełne pożywkę BD (pożywka cBD), zgodnie z opisem w Tabeli uzupełniającej 1.
    UWAGA: Pożywka cBD jest pożywką złożoną (patrz Tabela uzupełniająca 1), sformułowaną w celu wspierania wzrostu komórek nabłonka oskrzeli przez dłuższy czas, umożliwiając jednocześnie ich różnicowanie po zwiększeniu stężenia kwasu retinowego (RA) (lub analogu RA zastosowanego w niniejszym protokole) i hodowlę w warunkach ALI, zgodnie z opisem w kroku 4.10.
  3. Trypsynizować komórki PBEC w kolbie T75, używając 2 mL łagodnej trypsyny na każdą kolbę. Inkubować komórki od 5 do 10 min, aby umożliwić ich odklejenie (na podstawie oceny wizualnej). Po 5 min inkubacji ułatwić odklejanie komórek poprzez zakręcanie trypsyny w kolbie i delikatne opukiwanie kolby (powtórzyć w razie potrzeby).
  4. Dodać 4 mL SBTI do kolby i bezpośrednio przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 25 mL.
    UWAGA: Komórki ponownie przywierają w ciągu kilku minut. Dlatego w przypadku pracy z więcej niż jedną kolbą, zawiesina komórkowa uzyskana w kroku 4.4 musi zostać bezpośrednio przeniesiona do probówki wirówkowej przed dodaniem SBTI do drugiej kolby. W tej procedurze jednocześnie przetwarza się maksymalnie pięć kolb.
  5. Wirować probówki przez 7 min przy 230 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Resuspendować komórki w 6 mL pożywki cBD i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Przeprowadzić obliczenie liczby komórek żywych i martwych, na przykład poprzez dodanie błękitu trypanu w stosunku 1:1 lub stosując inną procedurę liczenia komórek żywych i martwych.
  7. Usunąć roztwór powlekający z wkładów do hodowli komórkowej.
  8. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową przygotowaną w kroku 4.6 pożywką cBD uzupełnioną o 1 nM EC 23 do stężenia 80 000 komórek na mL i dodać 0,5 mL na górną stronę membrany we wkładzie. Dodać 1,5 mL pożywki cBD uzupełnionej o 1 nM EC 23 do dołka pod wkładem.
  9. Wymieniać pożywkę na pożywkę cBD uzupełnioną o 1 nM EC 23 trzy razy w tygodniu, aż kultury będą gotowe do ekspozycji na powietrze (tj. 2 dni po osiągnięciu 100% konfluencji). Za każdym razem 0,5 mL pożywki dodaje się do wnętrza wkładu (na komórki), a 1,5 mL dodaje się do komory dolnej (do dołka).
    UWAGA: Zazwyczaj warstwa komórek osiąga 100% konfluencji około 5 dni po wysianiu PBEC na wkłady. Na podstawie wizualnej oceny konfluencji komórek podejmuje się decyzję o przeniesieniu komórek do etapu ALI 2 dni później.
  10. Gdy komórki będą gotowe do przeniesienia do ALI (tj. 2 dni po osiągnięciu 100% konfluencji), usunąć pożywkę z wkładów i dołka, nie dodawać nowej pożywki do wnętrza wkładu i dodać nową pożywkę (1 mL pożywki cBD uzupełnionej o 50 nM EC 23) wyłącznie do dołka. Wymieniać pożywkę w dołkach trzy razy w tygodniu.
  11. Aby usunąć nadmiar śluzu i szczątków komórkowych, delikatnie dodać 200 µL ciepłego PBS na stronę apikalną warstwy komórkowej we wkładzie (najlepiej przez ściankę wkładu, a nie poprzez bezpośrednie pipetowanie na komórki) i inkubować przez 10 min w inkubatorze do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C. Następnie aspirację PBS w celu usunięcia nadmiaru śluzu i szczątków komórkowych.
    UWAGA: Od tego momentu (rozpoczęcie hodowli ALI), przed każdą wymianą pożywki w dolnej komorze, należy przemyć stronę apikalną komórek za pomocą PBS.
  12. Hodować komórki w warunkach ALI przez minimum 2 tygodnie, aby upewnić się, że wszystkie główne typy komórek są reprezentowane.

5. Ustanowienie hodowli ALI-PBEC z mieszanej populacji dawców

  1. Użyj komórek od maksymalnie pięciu indywidualnych dawców, aby rozpocząć hodowle PBEC z populacji mieszanej.
  2. Wymieszaj równą liczbę komórek od każdego dawcy, korzystając z komórek uzyskanych w kroku 4.7, aby osiągnąć całkowitą liczbę 150 000 komórek na wkładkę (np. 30 000 komórek od każdego dawcy przy użyciu pięciu dawców). Zapewni to minimalizację proliferacji we wkładce oraz obecność równej liczby komórek od poszczególnych dawców w hodowli.
  3. Kontynuuj hodowlę ALI-PBEC zgodnie z opisem w krokach 4.9-4.12.

6. Kontrola jakości hodowli ALI-PBEC

  1. Monitorowanie transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) podczas hodowli komórkowej
    UWAGA: Pomiar rezystancji elektrycznej z użyciem woltomierza może być przeprowadzany w dowolnym momencie hodowli ALI-PBEC i jest wykonywany za każdym razem według tego samego protokołu, w tych samych warunkach, ponieważ pomiar rezystancji elektrycznej jest zależny od wielu zmiennych, w tym od położenia elektrod, temperatury, pożywki oraz sposobu manipulacji. Wartość TEER można obliczyć na podstawie zmierzonej rezystancji elektrycznej, stosując następujący wzór oparty na prawie Ohma: Obliczanie TEER: formuła oporu elektrycznego śródbłonkiego, równania naukowe., gdzie Rm jest zmierzoną rezystancją elektryczną, Rb jest bazową rezystancją elektryczną wkładu bez powłoki i komórek, a SA to powierzchnia błony wkładu17.
    1. Ostrożnie dodać 200 µL ciepłego PBS na stronę apikalną warstwy komórkowej, aby usunąć śluz i zanieczyszczenia z powierzchni komórek. Inkubować wkładkę przez 10 min w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i ponownie usunąć PBS.
    2. Ostrożnie dodać 700 µL ciepłego PBS na stronę apikalną warstwy komórek i inkubować wkładkę przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację temperatury przed pomiarami.
    3. Zkalibruj woltomierz przy użyciu rezystora testowego 1 000 Ω, ustaw woltomierz na pomiar omów, a następnie za pomocą śrubokręta wyreguluj śrubę kalibracyjną „R ADJ”, aż urządzenie wskaże wartość 1 000 Ω.
    4. Opłucz elektrodę, poruszając nią kilkakrotnie w górę i w dół w wodzie sterylnej (temp. pokojowa), a następnie w sterylnym PBS (temp. pokojowa).
    5. Zmierz oporność elektryczną warstwy komórkowej w insertach. W tym celu umieść elektrodę w pozycji pionowej w studzience, tak aby długie ramię elektrody dotykało dna płytki. W ten sposób krótkie ramię znajdzie się nad warstwą komórkową wewnątrz insertu. Odczytaj wartość wyświetloną na woltomierzu.
      UWAGA: Wyświetlana wartość nie ustabilizuje się całkowicie; należy odczytać wartość w momencie, gdy staje się ona przerywana.
    6. Między pomiarami należy oczyścić elektrodę, przesuwając ją kilka razy w górę i w dół w sterylnym PBS (temperatura pokojowa).
    7. Po zakończeniu pomiarów należy oczyścić elektrodę, kilkukrotnie zanurzając ją i wyjmując z wody sterylnej (temp. pokojowa), sterylnego PBS (temp. pokojowa) oraz 70% etanolu (temp. pokojowa). Elektrodę przechowywać w stanie suchym.
    8. Wykonaj pomiar bazowy wkładki (bez powłoki) oraz komórek poprzez dodanie 700 µL ciepłego PBS do wnętrza wkładu oraz 1 ml ciepłego PBS do dołka i pomiaru oporności elektrycznej wraz z pozostałymi wkładami.
  2. Ocena składu komórkowego hodowli ALI-PBEC
    1. W fazie ALI należy sprawdzić różnicowanie poprzez wizualną ocenę ruchów rzęsek. Można je zaobserwować poprzez standardową mikroskopią w jasnym polu już 9 dni po ekspozycji na powietrze strony apikalnej komórek.
      UWAGA: Bijące rzęski są najlepiej widoczne bezpośrednio po przemyciu powierzchni apikalnej. Komórki kubkowe produkują śluz, zatem obecność śluzu, zaobserwowana podczas przemywania powierzchni apikalnej, świadczy o obecności komórek kubkowych. Należy jednak pamiętać, że liczba komórek kubkowych oraz ilość produkowanego śluzu zależą w dużym stopniu od dawcy. Obecność śluzu można dostrzec podczas aspiracji PBS po przemyciu powierzchni apikalnej warstwy komórkowej w insercie; w takim przypadku aspirowany PBS jest bardziej lepki, a podczas aspiracji mogą być widoczne nici śluzu.
    2. Ocena składu komórkowego za pomocą immunobarwień i mikroskopii fluorescencyjnej lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), albo analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR), dostarcza istotnych informacji o stanie różnicowania hodowli, jednak opis tych metod wykracza poza zakres niniejszego opracowania.

Schemat procesu hodowli tkanki płucnej; izolacja komórek, wirowanie, inkubacja, różnicowanie.
Rycina 1: Schematyczny przegląd procedury izolacji, ekspansji i hodowli pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli. (A) Tkanka płucna jest pobierana podczas operacyjnej resekcji nowotworu, a patomorfolog wycina tkankę pierścienia oskrzeli, która jest makroskopowo prawidłowa i wolna od guza. (B) Pierścień oskrzeli jest oczyszczany i poddawany działaniu enzymów w celu odseparowania i dysocjacji warstwy komórkowej. (C) Uzyskana zawiesina komórkowa jest płukana, a komórki są rozdzielane do studzienek płytki 6-dołkowej w celu ekspansji. (D) Po dostatecznej ekspansji izolowanych komórek w c-KSFM z Primocinem, warstwy komórkowe są dysocjowane poprzez trypsynizację, a komórki są resuspenderowane w medium do zamrażania w celu kriokonserwacji. W razie potrzeby kriokonserwowane komórki są rozmrażane i ponownie eksponowane przy użyciu c-KSFM z penicyliną/streptomycyną w kolbach do hodowli komórkowej. Po ekspansji są one wysiewane w medium cBD na insertach do hodowli komórkowej; (Ea) Hodowla ALI-PBEC odbywa się w dwóch głównych etapach: etapie zanurzonym w medium cBD uzupełnionym o 1 nM EC 23, aż komórki osiągną pełną konfluencję, a następnie po usunięciu medium apikalnego i hodowli w warunkach ALI w celu umożliwienia różnicowania; w fazie ALI komórki są hodowane w medium cBD uzupełnionym o 50 nM EC 23. (Eb) Graficzne przedstawienie komórek podstawowych pokrywających insert podczas hodowli w zanurzeniu. (Ec) Graficzne przedstawienie zróżnicowanej warstwy komórek nabłonka uzyskanej po hodowli w warunkach ALI w obecności zwiększonych stężeń EC 23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Namnażanie z wykorzystaniem hodowli zanurzeniowej
Stosując przedstawioną tutaj metodę, z jednej płytki 6-dołkowej można uzyskać średnio osiem krioprobek zawierających 400 000 komórek na krioprobówkę do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie (Rycina 2A). Aby to osiągnąć, izolowane PBEC hoduje się w płytkach 6-dołkowych przez minimum 7 dni i maksymalnie 14 dni (Rycina 2B) w obecności Primocinu, aby wykluczyć zanieczyszczenie drobnoustrojami (zwłaszcza mycoplasmas). Rycina 2A,B zapewnia wgląd w liczbę uzyskanych komórek oraz wymagany czas hodowli w przypadku różnych izolacji od wielu dawców. Przed zebraniem komórek poprzez trypsynizację w celu przechowywania w ciekłym azocie, stopień konfluencji musi przekraczać 80%. Jeśli nie zostanie to osiągnięte w ciągu 14 dni, komórek nie należy krio konserwować. Co ważne, podczas zbioru do przechowywania oraz pasażowania, konfluencja warstwy komórkowej nie powinna przekraczać ok. 95% (Rysunek 2C). Po przechowywaniu w ciekłym azocie komórki można rozmrozić i hodować w celu ich namnożenia, aż do uzyskania liczby komórek wystarczającej do hodowli ALI. Medium stosowane na tym etapie do namnażania komórek to c-KSFM, analogicznie jak podczas wstępnej hodowli po pobraniu z pierścienia oskrzela.18Na tym etapie nie ma jednak potrzeby stosowania Primocinu, ponieważ ryzyko dodatkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego pochodzącego z tkanki płucnej jest nieobecne, w związku z czym Primocin można zastąpić penicyliną/streptomycyną. Pożywka ta sprzyja wzrostowi komórek nabłonkowych w stosunku do fibroblastów, co zapobiega możliwości przerostu kultury przez szybciej proliferujące fibroblasty.19,20,21Stosując medium c-KSFM, komórki rozprzestrzeniają się w kolbie i nie łączą się ze sobą, co wyraźnie różni się od morfologii komórek hodowanych w warunkach zanurzenia w medium cBD na tym etapie (Rycina 2D,E). Po 5 lub 6 dniach hodowania rozmrożonych komórek w kolbie T75, warstwa komórkowa powinna osiągnąć 80%–95% konfluencji, co odpowiada około 3 x 106 łącznie komórek (Rysunek 2F). Z tej ilości można przygotować około 75 wkładników (w rozmiarze do płytki 12-dołkowej) do hodowli ALI.

Opisana w niniejszym opracowaniu metoda izolacji i hodowli może zostać również dostosowana do wykorzystania biopsji oskrzeli lub wymazów z oskrzeli jako materiału wyjściowego.

Wykresy rozrzutu liczby komórek względem dawcy (A, F), obrazy mikroskopowe kultur komórkowych (C, D, E), dane badania.
Rysunek 2: Ekspansja komórek podstawowych przed i po kriokonserwacji. Komórki izolowano zgodnie z opisanym protokołem i hodowano w c-KSFM. Monitorowano liczbę komórek uzyskanych od każdego dawcy; zliczanie żywych komórek przeprowadzono za pomocą automatycznego licznika komórek (A) podczas zbierania komórek pasażu 0 (P0) z płytek 6-dołkowych (krok 2 protokołu), n = 123 dawców; liczba komórek została przedstawiona jako liczba komórek zebranych z jednego dołka; każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a medianę zaznaczono poziomą kreską. (B) W ramach kontroli jakości monitorowano czas, w jakim komórki P0 osiągnęły 80% do 90% konfluencji w płytkach 6-dołkowych, przedstawiony jako liczba dni po rozpoczęciu hodowli zanurzeniowej w c-KSFM (n = 127 różnych dawców). Każdy pojedynczy dawca jest oznaczony kropką, a wszystkie kropki przypadające na ten sam dzień zlewają się w linię; im szersza linia, tym więcej dawców ona reprezentuje; medianę liczby dni przebywania komórek w kulturze zaznaczono cieńszą poziomą kreską. (C) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P0 hodowanych zanurzeniowo w c-KSFM w momencie zbierania komórek do długoterminowej kriokonserwacji. (D) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P1 hodowanych zanurzeniowo w c-KSFM w momencie zbierania komórek i przenoszenia ich do insertów oraz (E) komórek P1 hodowanych zanurzeniowo w medium cBD. (F) Liczbę żywych komórek uzyskanych od każdego dawcy monitorowano za pomocą automatycznego licznika komórek podczas zbierania komórek P1 z kolby T75 (sekcja 4 protokołu), n = 63 różnych dawców; liczba komórek jest przedstawiona jako liczba komórek na kolbę T75, każdego dawcę oznacza kropka, a medianę liczby komórek zaznaczono poziomą kreską. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Kultura na granicy faz powietrze-ciecz (ALI)
W 7. dniu po rozpoczęciu kultury ALI mierzy się oporność elektryczną warstwy komórkowej, która powinna wynosić ponad 300 Ω (Rysunek 3A); jeśli taka wartość nie zostanie osiągnięta, kulturę uznaje się za nieudaną ze względu na możliwy brak formowania się połączeń ścisłych. Zaleca się wykluczenie możliwości uzyskania niskich wartości TEER spowodowanych uszkodzeniem warstwy nabłonkowej w poszczególnych insertach, wynikającym na przykład z uszkodzenia warstwy komórkowej podczas mycia i aspiracji. Można to sprawdzić poprzez wizualną inspekcję mikroskopową insertów z kulturą. W naszym doświadczeniu zmienność międzyodonorowa oporności elektrycznej może być znaczna (Rysunek 3B), co jest również zgłaszane w literaturze14, a jak zaobserwowano, jest ona także wyraźnie zależna od pochodzenia stosowanego DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) (Rysunek 3C).

Wykresy pomiarów TEER; Dni po ALI vs. TEER; analiza różnych warunków hodowli komórkowej.
Rycina 3: Transepitelialna oporność elektryczna jako kontrola jakości hodowli ALI-PBEC. Komórki PBEC zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. W kilku punktach czasowych podczas hodowli mierzono oporność elektryczną, a następnie obliczano TEER (Ω·cm2). (A) Oporność elektryczną mierzono w ciągu 14 dni po ALI. n = 4 różnych dawców. Dane przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD). (B) W ramach kontroli jakości hodowli komórkowych ALI-PBEC oporność elektryczną mierzono w 7. dniu (n = 50) i 14. dniu po ALI (n = 25); każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a mediana TEER (Ω·cm2) jest zaznaczona poziomym paskiem. Istotność danych sprawdzono za pomocą nieparametrycznego testu Mann-Whitney, nie stwierdzając istotnych różnic. (C) Przebadano pożywki od trzech różnych dostawców DMEM, aby ocenić ich wpływ na tworzenie TEER. n = 4 różnych dawców; wartości średnie przedstawiono ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Podczas tworzenia dobrze zróżnicowanej hodowli ALI-PBEC, od momentu ekspozycji na powietrze, stężenie RA wzrasta22. W ten sposób komórki przechodzą z proliferacji do różnicowania śluzowo-rzęskowego, co jest widoczne już 9 dni (zależnie od dawcy) po ekspozycji na powietrze w badaniu za pomocą mikroskopii w polu jasnym. W tym punkcie widoczny jest ruch pierwszych rzęsek, a nieco wcześniej w oparciu o ekspresję genów markerów zróżnicowanych komórek światła23 (Rycina 4).

Zgodnie z opisem w protokole, produkcję śluzu można zaobserwować również podczas płukania powierzchni apikalnej podczas wymiany medium. RA jest bardzo wrażliwe na światło, co prowadzi do znacznych różnic w aktywności przy tym samym stężeniu roztworu roboczego. Z tego powodu RA zastąpiono syntetycznym analogiem RA, EC 23, stosowanym w tym samym stężeniu, co pozwoliło uzyskać podobne wyniki w badaniach eksperymentalnych. Ze względu na to oraz aby uniknąć zmiany procedury, wybrane stężenie EC 23 utrzymano na poziomie stężenia RA (tj. 50 nM) stosowanego wcześniej24,25 (Rysunek 5). Rysunek 5A przedstawia wartości TEER uzyskane przy zastosowaniu różnych stężeń EC 23, wykazując maksymalny TEER przy 50 nM w badanym zakresie stężeń. Wyniki przedstawione na Rysunku 5B potwierdzają, że ekspresja genów markerów dla komórek rzęskowych i kubkowych jest podobna przy zastosowaniu 50 nM EC 23 lub RA. EC 23 jest również wymagane podczas hodowli w fazie zanurzonej (choć w znacznie niższym stężeniu), ponieważ pominięcie go w tej fazie i dodanie go dopiero na etapie ALI skutkuje kulturą, która nigdy nie osiąga pełnej konfluencji. Czas potrzebny do wygenerowania dobrze zróżnicowanej kultury ALI-PBEC z widoczną aktywnością ruchów rzęsek i produkcją śluzu wynosi około 14 dni, dlatego większość eksperymentów rozpoczyna się na kulturach ALI w dniach 14-21 (Rysunek 4). Wszystkie główne typy komórek (komórki podstawowe, rzęskowe, kubkowe i komórki Club) są obserwowane po 14 dniach hodowli ALI, choć poziomy ekspresji są w dużym stopniu zależne od dawcy. Wykazano to poprzez ocenę ekspresji genów TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1 za pomocą RT-qPCR lub ekspresji białek przy użyciu przeciwciał przeciwko p63, α-tubulinie, Muc5AC i CC-16 w barwieniu immunofluorescencyjnym (IF), aby wykryć odpowiednio markery komórek podstawowych, rzęskowych, kubkowych i komórek Club25,26. Jednak o ile okres 14-21 dni można uznać za ogólną zasadę dla większości eksperymentów, o tyle w wybranych badaniach można rozważyć dłuższy czas różnicowania, co stwierdzono w przypadku metabolizmu ksenobiotyków, zakażenia SARS-CoV-2 oraz oceny transportu śluzowo-rzęskowego27,28,29.

Wykresy ekspresji genów dla komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i komórek Clara; dni po ALI; analiza porównawcza.
Rycina 4: Hodowla na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). PBECs zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. Hodowle ALI-PBEC monitorowano przez 14 dni po ALI. Kultury komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA w 0, 7 i 14 dniu po ALI. Przedstawiono dane od dwóch różnych dawców; każda kropka reprezentuje jednego indywidualnego dawcę monitorowanego w czasie, a mediana jest zaznaczona poziomą kreską. Ekspresję genów markerów komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i komórek Clara (TP63, FOXJ1, MUC5B oraz SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono za pomocą qPCR i znormalizowano względem ekspresji genów RPL13A i ATP5B (szczegóły patrz w referencji 23). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Opór transepitelialny i różnicowanie komórek, pomiar TEER, wykres słupkowy, wyniki badań komórkowych.
Rysunek 5: Porównanie kwasu retinowego (RA) i jego syntetycznego analogu EC 23. Komórki PBEC zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. W momencie rozpoczęcia ekspozycji hodowli PBEC na powietrze, RA (50 nM) zastąpiono różnymi stężeniami EC 23. (A) Opór elektryczny zmierzono w 14. dniu po ALI, a następnie obliczono TEER (Ω·cm2), n = 2 dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. (B) W 14. dniu po ALI hodowle komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA i późniejszej analizy ekspresji genów markerów komórek rzęskowych oraz kubkowych (FOXJ1, MUC5AC) za pomocą qPCR, z normalizacją względem RPL13A (n = 3 dawców). Przedstawiono krotność wzrostu w stosunku do ALI-PBEC hodowanych z 50 nM RA jako wartość średnią ± SD. (Szczegóły znajdują się w referencji 23) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W ciągu ostatnich lat badano wydajność alternatywnych produktów w systemie hodowli, takich jak pożywki i tworzywa sztuczne do hodowli. Przyczyn takich ocen było wiele, w tym zmiany w składzie pożywek wprowadzane przez producentów, wprowadzenie nowych mediów, a także niedobory produktów podczas pandemii COVID-19 (2020-2022). Zaobserwowano, że podobne produkty od różnych dostawców prowadzą do zróżnicowania hodowli komórek nabłonkowych na podstawie oceny markerów typów komórek nabłonkowych, choć końcowy skład komórkowy może się znacznie różnić (Rysunek 6A), podczas gdy różnice w TEER były mniej wyraźne (Rysunek 6B). Z drugiej strony, pożywki od różnych dostawców rzeczywiście powodowały istotne różnice w składzie komórkowym; w przypadku zastosowania insertów różnych marek różnice te były ograniczone (Rysunek 6C). W szczególności, przy zastosowaniu pożywki do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych PneumaCult firmy STEMCELL Technologies, zaobserwowano inną morfologię i szybsze powstanie widocznej aktywności rzęsek. Oprócz tych obserwacji odnotowano również różnicę w wartościach TEER oraz różnicę w składzie komórkowym ALI-PBEC w porównaniu z pożywką cBD (Rysunek 6D).

Wykresy słupkowe i liniowe porównujące znormalizowaną ekspresję TP63, FOXJ1, MUC5AC, SCGB1A1 w typach komórek.
Rycina 6: Porównanie różnych dostawców pożywki do komórek nabłonkowych i insertów do hodowli komórkowych. Wyizolowano PBEC, przeprowadzono ich ekspansję i ustanowiono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. (A) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawkowych, rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A oraz ATP5B. n = 2 dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. (B) W ciągu 9 dni po ALI mierzono oporność elektryczną, a następnie obliczono TEER (Ω·cm2). n = 3 różnych dawców; przedstawiono wartości średnie ± SD. (C) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni, używając insertów do hodowli komórkowych zakupionych od trzech różnych dostawców, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A. n = 18 różnych dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. Dane przetestowano pod kątem istotności statystycznej za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa (jednoczynnikowa ANOVA) i nie stwierdzono istotnych różnic. (D) ALI-PBEC hodowano albo w pożywce cBD, albo w pożywce PneumaCult (STEMMCELL technologies) przez 14 dni po ALI, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawkowych, rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (TP63, FOXJ1, MUC5B i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A (słupki przedstawiają wartość średnią ± SD), a oporność elektryczną mierzono w 5. i 12. dniu po ALI i wykorzystano do obliczenia TEER (Ω·cm2). n = 2; przedstawiono wartość średnią ± SD (szczegóły w referencji 23). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Skład roztworów i pożywek użytych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje izolację ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli z wyresekowanej tkanki płucnej, metodę optymalnej ekspansji komórek bez utraty potencjału różnicowania, procedurę kriokonserwacji oraz procedurę generowania dobrze zróżnicowanych kultur ALI-PBEC. Ponadto zamieszczono opis kontroli jakości, a także instrukcje monitorowania i oceny zróżnicowanych komórek ALI-PBEC.

Opisany protokół rozpoczyna się od makroskopowo prawidłowego, wolnego od nowotworu pierścienia oskrzeli, wyciśniętego z płata płuca pacjentów poddawanych operacji w związku z diagnozą raka płuca. Należy zatem zaznaczyć, że pierścienie te nie mogą być ściśle uznane za tkankę zdrową, co może wpływać na charakterystykę hodowli komórkowych. Alternatywne źródła pozyskiwania komórek nabłonka oskrzeli obejmują wykorzystanie biopsji oskrzeli, szczoteczkowania oskrzeli lub tkanek od dawców transplantacyjnych lub z płuc biorców. Niezależnie od źródła, przy użyciu tkanki płucnej należy brać pod uwagę ryzyko kontaminacji mikrobiologicznej, dlatego w różnych pożywkach stosuje się antybiotyki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego hodowli komórkowych. W szczególności mycoplasma stanowi wysokie i częste ryzyko w hodowlach komórkowych ze względu na szeroki wachlarz oddziaływań na hodowlę, oporność na antybiotyki powszechnie stosowane w kulturach komórkowych oraz fakt, że kontaminację mycoplasma można potwierdzić jedynie za pomocą testów detekcji mycoplasma. Dlatego w początkowej fazie hodowli komórkowej, po izolacji komórek z tkanki płucnej, stosuje się przeciwmikrobowy preparat o szerokim spektrum Primocin, a w trakcie procesu hodowli losowo wybrane próbki są badane pod kątem obecności mycoplasma.

Procedura izolacji rozpoczynająca się od pierścienia oskrzelowego dostarcza wystarczającego materiału wyjściowego, aby stopień ekspansji tych komórek pierwotnych, niezbędny do rozpoczęcia hodowli w warunkach ALI, nie upośledzał zdolności do różnicowania. Jednakże rozpoczęcie ekspansji izolowanych komórek nabłonkowych z ograniczoną liczbą komórek może stwarzać problemy z uzyskaniem wystarczającej liczby insertów z odpowiednią ilością komórek, które można zasiać do hodowli ALI. Przedłużona hodowla i wielokrotne pasażowanie komórek pierwotnych mogą prowadzić do senescencji replikacyjnej. W celu przezwyciężenia tego ograniczenia zaproponowano różne rozwiązania. Horani i wsp. wykazali, że inhibitor kinazy Rho (ROCK) Y-27632 zwiększa proliferację komórek podstawnych30, Mou i wsp. zastosowali podwójną inhibicję Smad w celu ekspansji macierzystych komórek podstawnych przy zachowaniu charakterystyki zróżnicowanej warstwy komórek nabłonkowych31, a Sachs i wsp. opracowali system organoidów dróg oddechowych, który może być wykorzystany do ekspansji komórek nabłonkowych dróg oddechowych i zachowania ich potencjału różnicowania w trakcie wielu pasażowań32. Tę ostatnią metodę stosowano również do ekspansji komórek z materiałów o bardzo niskiej liczbie komórek, takich jak aspiraty z tchawicy (TAs) od wcześniaków (<28. tydzień wieku poczęciowego) i płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), przed przeniesieniem do hodowli ALI opisanej w niniejszym protokole33. Stwierdzono, że komórki izolowane z BAL i TAs wykazywały zdolność do różnicowania podobną do komórek uzyskanych z tkanki oskrzelowej, choć zaobserwowano różnice, gdy różnicowanie było przesunięte w stronę kultur z większą liczbą komórek rzęsistych lub komórek kubkowych przy użyciu inhibicji sygnalizacji Notch lub cytokiny Th2 IL-1333. Zaleca się zatem, aby w przypadku hodowania ALI-PBECs z materiału wyjściowego o niskiej liczbie komórek nabłonkowych przy użyciu podobnych podejść, zawsze sprawdzać kultury pod kątem podstawowych kryteriów jakości opisanych w sekcji 6 protokołu. Co ważne, zastosowanie komórek zasilających może również pomóc w uzyskaniu większej liczby komórek, co jest kluczowe w kontekście inżynierii rusztowań do transplantacji, gdzie czas i liczba komórek są istotne. Ilustruje to badanie, w którym autologiczne komórki nabłonkowe hodowano z biopsji pobranych od pacjenta z chorobą tchawicy, a komórki szybko powielano w obecności mysiej embrionalnej warstwy zasilającej (mitotycznie inaktywowanych fibroblastów 3T3-J2) oraz wspomnianego wcześniej inhibitora szlaku Rho/ROCK (Y-27632)34. Stwierdzono, że otrzymana hodowla komórkowa była użyteczna do repopulacji rusztowań tchawiczych, co sprawia, że można ją uznać za odpowiedni protokół dla modelu transplantacyjnego.

Podczas stosowania protokołu opisanego w niniejszym opracowaniu, a także przy korzystaniu z innych protokołów hodowli, nieuchronnie wprowadza się błąd selekcji. Należy zdać sobie sprawę, że różnice w szczegółach protokołu, takie jak pochodzenie komórek użytych do zainicjowania hodowli, skład pożywki oraz inne detale metodyczne, mogą prowadzić do zmian w składzie komórkowym hodowli, a tym samym do zmian w odpowiedzi hodowli ALI33,35. Ponadto zaobserwowano różnice we właściwościach komórek podczas porównywania różnych pożywek do różnicowania komórek dróg oddechowych10,11. Przy porównaniu pożywki PneumaCult i cBD odnotowano różnice w markerach mRNA komórek kubkowych i komórek Club, wartościach TEER oraz grubości warstwy komórkowej. Na podstawie tych obserwacji, pomimo braku podstaw statystycznych wynikającego z niskiej liczby wykorzystanych dawców, nieznajomości składu pożywki dla klientów oraz wyższych kosztów pożywki PneumaCult, w naszym laboratorium podjęto decyzję o zastosowaniu pożywki cBD.

Jak wspomniano, komórki można początkowo namnażać w hodowli organoidów, a następnie przenieść do 2D systemu wkładkowego ALI. Jest to istotne, ponieważ organoidy nabłonka dróg oddechowych nie nadają się do ekspozycji na substancje przenoszone drogą powietrzną, podczas gdy zastosowanie systemu 2D ALI umożliwia ocenę wpływu takich substancji jak dym papierosowy23,36 na hodowane komórki nabłonka dróg oddechowych. Innym podejściem do tworzenia hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych w systemie ALI jest generowanie tych komórek poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs)37. W takich protokołach, na końcowym etapie różnicowania, po uzyskaniu progenitorów proksymalnych dróg oddechowych, komórki mogą być różnicowane w hodowli ALI przy użyciu procedur podobnych do opisanych w niniejszej pracy.

W niniejszym protokole do hodowli w warunkach ALI stosowane jest pożywka cBD. Pożywka cBD to medium bezsurowicze, przygotowywane poprzez dodanie mieszaniny różnych suplementów, opracowanej na podstawie prac Fulcher i wsp.38 oraz innych badań. Roztwór suplementów zawiera 52 µg/mL ekstraktu z przysadki wołowej (BPE), 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 0,5 ng/mL ludzkiego EGF, 0,5 µg/mL epinefryny, 10 µg/mL transferyny, 5 µg/mL insuliny, 6,5 ng/mL trijodotyroniny oraz 0,1 ng/mL RA39. Ponieważ BPE jest ekstraktem tkankowym i charakteryzuje się zmiennością między partiami, pożywka ta nie może być uznana za medium w pełni zdefiniowane ani za wolne od składników pochodzenia zwierzęcego. W celu zminimalizowania różnic między partiami preferowane są pożywki do hodowli komórkowej w pełni zdefiniowane. W związku z przejściem na badania bez użycia produktów zwierzęcych, istotne jest podejmowanie wysiłków w celu opracowania zdefiniowanych pożywek, które nie zawierają produktów odzwierzęcych i są przystępne cenowo dla społeczności naukowej.

W zależności od pytania badawczego można zastosować różne układy eksperymentalne oparte na modelu ALI. Na przykład, aby zbadać wpływ związków, które mogą oddziaływać na proces różnicowania, można dodać te związki do hodowli na różnych etapach hodowli zanurzeniowej, podczas różnicowania lub na etapie pełnego zróżnicowania. Skład komórkowy hodowli ALI-PBEC może być modyfikowany poprzez dodawanie określonych związków; na przykład różnicowanie ALI-PBEC w obecności IL-13 prowadzi do powstania hodowli z większą liczbą komórek kubkowych i mniejszą liczbą komórek rzęskowych, natomiast zastosowanie inhibitora γ-sekretazy DAPT (stosowanego do blokowania sygnalizacji Notch) podczas różnicowania skutkuje hodowlą z większą liczbą komórek rzęskowych kosztem komórek kubkowych23,40,41,42.

Ponadto substancje stymulujące komórki lub blokujące określone procesy można aplikować albo do komory podstawnej, albo (w bardzo małej objętości) do komory szczytowej hodowli. Komórki mogą być również eksponowane na substancje przenoszone drogą powietrzną od strony szczytowej. Takie schematy ekspozycji stosowano w celu zbadania wpływu spalin diesla lub całego dymu papierosowego na PBECs23,43,44. Pożywkę można zbierać przy każdej zmianie medium, aby monitorować białka wydzielane po stronie podstawnej; to samo dotyczy strony szczytowej komórek, którą przemywa się PBS podczas odświeżania pożywki podstawnej. Tak zwany płukanie szczytowe (apical wash) jest zbierane, a opcjonalnie dodaje się ditionerytrytol (DTE), aby skuteczniej rozbić śluz produkowany przez komórki kubkowe. Lizaty komórkowe można uzyskać w celu izolacji całkowitego białka, RNA oraz chromosomalnego i mitochondrialnego DNA. Komórki można dalej badać przy użyciu przeciwciał przeciwko specyficznym markerom, wycinając membranę z politereftalanu etylenu (PET) z plastikowego insertu, a następnie dzieląc tę membranę na mniejsze kawałki do wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego45. Ponadto po trypsynizacji komórek w insertach można zastosować cytometrię przepływową lub FACS. W fazie ALI rozwój bariery komórkowej można monitorować, mierząc oporność elektryczną i obliczając na tej podstawie TEER, gdzie oporność elektryczna jest odwrotnie proporcjonalna do powierzchni wkładki membranowej. Obliczenia opierają się na prawie Ohma przy użyciu następującego wzoru: Obliczanie TEER: wzór na transepithelialną oporność elektryczną, równania naukowe., gdzie Rm to zmierzona oporność elektryczna, Rb to bazowa oporność elektryczna insertu bez powłoki i komórek, a SA to powierzchnia membrany insertu. Pomiar oporności elektrycznej przy użyciu EVOM2 i elektrod STX/chopstick jest prosty, ale w dużym stopniu zależy od procedur postępowania podczas wprowadzania elektrody do dołka. Sugerowano również, że kształt elektrody może wpływać na pomiar funkcji bariery w przypadku stosunkowo dużej powierzchni17.

Dalsze ulepszenia systemu hodowli komórkowych ALI, mające na celu zwiększenie dokładności reprezentacji tkanek, obejmują kokulturę z dodatkowymi typami komórek, takimi jak leukocyty, fibroblasty lub komórki śródbłonka46,47,48. Zaobserwowano, że kokultura ALI-PBEC z makrofagami różnicowanymi za pomocą czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub M-CSF znacząco wpływa na wrodzone odpowiedzi nabłonkowe i procesy naprawcze48. Należy zauważyć, że w takich modelach kokultury problemem może być kompatybilność pożywki. Ponieważ pożywka stosowana do hodowli komórek nabłonkowych dróg oddechowych jest opracowana specjalnie dla PBEC i może nie być optymalnie dostosowana do innych typów komórek, niezbędna jest optymalizacja. Innym rodzajem postępów w dziedzinie biologii dróg oddechowych, w których można wykorzystać izolowane PBEC, jest zastosowanie technologii Organ-on-a-Chip (OoC)49,50. Dzięki zastosowaniu tej technologii można badać wpływ mechanicznych sił oddychania i przepływu krwi, takich jak rozciąganie, przepływ powietrza i pożywki 29.

Zmienność międzydańcy może być znacząca podczas stosowania PBEC od różnych dawców, dlatego w badaniach nad hodowlami komórek nabłonkowych ważne jest uwzględnienie komórek pochodzących od kilku dawców, aby zniwelować tę zmienność. Ponieważ hodowla ALI-PBEC jest czasochłonna i wiąże się z wysokimi kosztami, zbadano możliwość tworzenia kultur ALI-PBEC poprzez mieszanie komórek od różnych dawców w jednym insercie hodowlanym. W ten sposób można łatwo przeprowadzać eksperymenty pilotażowe z wykorzystaniem komórek pierwotnych przed analizą odpowiedzi kultur pochodzących od poszczególnych dawców. Ponadto w badaniach eksploracyjnych można grupować dawców o różnych charakterystykach (np. z różnych grup wiekowych lub różnej płci). Przy stosowaniu mieszanin dawców ważne jest zapewnienie obecności równej liczby komórek od różnych dawców, aby uniknąć sytuacji, w której jeden dawca dominuje w wynikach ze względu na wyższą szybkość proliferacji. W związku z tym komórki od poszczególnych dawców są namnażane oddzielnie i wysiewane do insertu w większej gęstości niż w przypadku wysiewu komórek od pojedynczego dawcy, co ma na celu zminimalizowanie proliferacji w insercie przed przejściem na ALI. Odpowiedzi mieszanin dawców i odpowiadających im pojedynczych dawców porównano, badając kinetykę infekcji SARS-CoV-2. Przy użyciu RT-qPCR i barwienia immunofluorescencyjnego zaobserwowano, że mieszanina dawców stanowi dobrą reprezentację poszczególnych dawców, wykazując podobną liczbę wyprodukowanych cząsteczek wirusa oraz podobną liczbę zakażonych komórek28.

Aby stać się akceptowalną alternatywą dla modeli zwierzęcych, edycja genów w hodowlach komórek nabłonkowych oskrzeli powinna być wykonalna51. Badano technologię interferencji RNA z wykorzystaniem małych interferujących RNA (siRNA) w ALI-PBECs, jednak ponieważ komórki muszą zostać przetransfekowane siRNA podczas fazy zanurzenia hodowli, wyciszenie genów nie jest utrzymywane w stopniu wystarczającym podczas hodowli ALI ze względu na długi czas trwania hodowli, chyba że transfekcja siRNA jest często powtarzana w trakcie procesu52. Niemniej jednak, siRNA mogą być z powodzeniem stosowane do modyfikacji ekspresji genów w zanurzonych komórkach podstawnych. Inni badacze z powodzeniem wykorzystali technologię CRISPR/Cas9 do edycji genów w pierwotnych hodowlach komórek nabłonkowych dróg oddechowych w warunkach ALI poprzez dostarczanie rybonukleoprotein (RNP)53. Przy stosowaniu takich technik kluczowe jest, aby komórki zachowały pełną zdolność do różnicowania. Ponieważ pierwotne hodowle komórek dróg oddechowych nie mogą być pasażowane w nieskończoność, klonalna ekspansja komórek poddanych edycji genów nie jest łatwa, a dodawanie pożywki do selekcji przetransfekowanych komórek jest uciążliwe. W związku z tym trudno jest osiągnąć pożądane wyciszenie we wszystkich hodowanych komórkach. Alternatywą w celu generowania klonów z nokautem jest zastosowanie strategii nokautu w hiPSCs54 i wykorzystanie tych komórek do generowania komórek nabłonkowych dróg oddechowych. Inną, choć suboptymalną alternatywą, jest ustanowienie unieśmiertelnionej linii PBEC w celu klonalnej ekspansji komórek z edytowanymi genami55.

Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu jest jednym ze sposobów generowania dobrze zróżnicowanych, rzekomo warstwowych kultur ALI-PBEC, jednak opracowano również inne protokoły pozwalające na ustanowienie takiej hodowli, wykazujące mniejsze lub większe różnice w porównaniu z zaprezentowaną metodą. Naszym zdaniem walidacja metod hodowli w różnych laboratoriach oraz rygorystyczna kontrola jakości są niezbędne, aby system ALI-PBEC oraz podobne systemy hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych mogły stać się wiarygodną alternatywą dla eksperymentów na zwierzętach.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują u nich istotne konflikty interesów.

Podziękowania

Badania wykorzystujące model opisany w tym artykule były wspierane przez różne organizacje finansujące, w tym Lung Foundation Netherlands, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia (ZonMw, COVID-19 MKMD grant), Holenderskie Towarzystwo Wymiany Testów na Zwierzętach (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), a także granty badawcze od firm takich jak Boehringer Ingelheim i Galapagos. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rezystor testowy 1,000 omówWorld Precision InstrumentsN/ASłuży do kalibracji woltoomomierza nabłonkowego EVOM2
Kwas 4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)etynylo)-benzoesowy (EC 23)Tocris4011Stosowany w pożywce z bBD
6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe traktowane TCCorning3506Stosowany w pierwszym etapie do wzrostu komórek wyizolowanych z oskrzeli pierścień 
Zestaw do pomiaru wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowychPromoCellC-21160Używany do porównania z pożywką do kąpieli
perełkowej cBD 20 litrówLab Armor74220-720Służy do wstępnego podgrzewania roztworów do hodowli komórkowych
BEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeliBulletKit LONZACC-3170Służy do porównania z pożywką cBD
Frakcja albuminy bydlęcej V (BSA)Thermo Fisher Scientific15260037Stosowany w roztworze powlekającym
Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)Thermo Fisher Scientific37000-015Stosowany w c-KSFM
Suplement wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEpiCGS)Laboratoria badawcze ScienCell3262Stosowany w podłożu cBD
Komórka nabłonka oskrzeli średnio podstawna (BEpiCM-b)Laboratoria Badawcze ScienCellSCC3211-bStosowany w podłożu
cBDWkładki do hodowli komórkowych; 12 mm Transwell z 0,4 i mikro; Wkładka z membrany poliestrowej o m porachCorning3460Wkładki do hodowli komórkowych stosowane w protokole
Wkładki do hodowli komórkowych; Wkładki 12-dołkowe, 0,4 i mikro; m Bezbarwny PETCellQART firmy SABEU9310412Wkładki do hodowli komórkowych używane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning
Wkładki do hodowli komórkowych; 12-dołkowe wkładki do hodowli tkankowych ThinCertGreiner Bio-One82050-032Wkładki do hodowli komórkowych stosowane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning
Kolba CELLSTAR, TC, PS, 250 ml, 75 cm2Greiner Bio-One658170Służy do rozszerzania komórek liczbowych
CFX Maestro 1.0Bio-RadN/AProgram do analizy danych qPCR generowanych za pomocą systemu CFX384
CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym System wykrywaniaBio-Rad1855484qPCR
Zestaw elektrod pałeczkowychWorld Precision InstrumentsSTX2Służy do pomiaru oporu elektrycznego w inkubatorze ALI-PBEC
CO2-InkubatorPHCbiMCO-170AICUV-PEInkubator do hodowli komórkowych używany do hodowli komórek wolnych od mycplazmy
Inkubator CO2HereausHeracell 150Inkubator do hodowli komórkowych zakażonych mycplazmą
Pojemnik CoolcellCorning432006Służy do kriokonserwacji komórek w temperaturze -80 ° C przed przeniesieniem do cieczy N2
Hrabina 3 Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX2000Służy do liczenia komórek i określania stężenia komórek
KriowialneNalgene479-3224Służy do kriokonserwacji komórek w
D-GlucoseAvantor VWR BDH CHEMICALS101174YStosowany w miękkiej trypsynie
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Avantor VWR0231Stosowany w pożywce do zamrażania komórek
dNTP (10 mM)PromegaU1515Stosowany w syntezie cDNA
Zmodyfikowane podłoże Eagle'a (DMEM) firmy Dulbecco + 4500 mg/l D-GlucoseSTEMCELL Technologies36250Stosowany w pożywce cBD
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 4,5 g/l glukozy z l-glutaminąLONZALOBE12-604FStosowany w pożywce z CBD w porównaniu z DMEM innych producentów 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, pirogronianuThermo Fisher Scientific41966029Stosowany w pożywce z CBD, aby porównać z DMEM innych producentów 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Thermo Fisher Scientific37000-015Stosowany w c-KSFM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Avantor VWR BDH CHEMICALS443885JStosowany w miękkiej trypsyny
EVOM2 Woltoomomierz nabłonkowyWorld Precision Instruments91799Używany z zestawem elektrody pałeczki do pomiaru oporu elektrycznego w
roztworze fibronektyny ALI-PBEC, Człowiek PromoCellC-43060Stosowany w roztworze powlekającym
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Stosowany w podłożu cBD
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)ScienCell Research LaboratoriesSCC0313Służy do rozpuszczania proteazy XIV 
IQ SYBR Green Super mixBio-Rad170887odczynnik qPCR
Chlorowodorek izoproterenolu, (-)-Sigma-AldrichI-6504Stosowany w c-KSFM
Keratynocyty-SFM (KSFM)Thermo Fisher Scientific17005-034Stosowany w c-KSFM
Maxwell RSC InstrumentPromegaAS4500Zautomatyzowany system izolacji RNA
Maxwell RSC po prostu Zestaw tkanek RNAPromegaAS1340Służy do izolacji całkowitego RNA za pomocą Maxwell RSC Instrument
M-MLV Odwrotna transkryptazaPromegaM5301Stosowany w syntezie cDNA
M-MLV Odwrotna transkryptaza 5X bufor reakcyjnyPromegaM531AStosowany w syntezie cDNA
MycoStripInvivoGenrep-mys-10Używany do wykrywania obecności mykoplazmy w próbkach hodowli komórkowych
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630056Stosowany w pożywce cBD
Oligo(dT)15Qiagen79237Stosowany w syntezie roztworu
cDNA Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep)ScienCell Research LaboratoriesSCC0513Stosowany jako antybiotyk w pożywce c-KSFM i cBD
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)LUMC aptekaNie dotyczyStosowany w różnych etapach protokołu
Pneumacult-ALI MediumSTEMCELL Technologies05002Służy do hodowli komórek w fazie różnicowania w porównaniu z pożywką CBD
Pneumacult-Ex Plus MediumSTEMCELL Technologies05040Służy do hodowli komórek w fazie zanurzonej w celu porównania z pożywką CBD
, Starter, ATP5B, naprzódZintegrowane DNA TechnologieNie dotyczySekwencja nukleotydowa: TCACCCAGGCTGGTTCAGA
Primer, ATP5B, odwrotnyIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT
Primer, FOXJ1, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: GGAGGGGACGTAAATCCCTA
Primer, FOXJ1, odwrotnaIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC
Primer, MUC5AC, naprzódZintegrowane technologie DNANieSekwencja nukleotydowa: CCTTCGACGGACAGAGCTAC
Primer, MUC5AC, odwrotnaZintegrowana Technologia DNA NiedotyczySekwencja nukleotydowa: TCTCGGTGACAACACGAAAG
Primer, MUC5B, naprzódZintegrowane technologie DNANie dotyczySekwencja nukleotydowa: GGGCTTTGACAAGAGAGT
Primer, MUC5B, odwrotnasekwencja nukleotydowa Integrated Integrated DNA TechnologiesN/A: AGGATGGTCGTGTTGATGCG
Primer, RPL13A, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG
Primer, RPL13A, reverseIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC
Primer, SCGB1A1, naprzódIntegrated DNA TechnologiesNie dotyczySekwencja nukleotydowa: ACATGAGAGGAGGCAGGGGCTC
Primer, SCGB1A1, odwrotnaZintegrowane technologie DNANieSekwencja nukleotydowa: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA
Starter, TP63, naprzódIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: CCACCTGGACGTATTCCACTG
Primer, TP63, odwrotnaIntegrated DNA TechnologiesN/ASekwencja nukleotydowa: TCGAATCAAATGACTAGGGGGG
PrimocinInvivoGenant-pm-2Stosowany jako środek przeciwdrobnoustrojowy przeciwko bakteriom, mykoplazmom i grzybom w pożywce c-KSFM
Proteaza XIVSigma-AldrichP5147Stosowany do enzymatycznego leczenia pierścienia oskrzelowego
RNAsin Rekombinowany inhibitor rybonukleazyPromegaN2515Stosowany w syntezie cDNA
Inhibitor trypsyny sojowej ( SBTI)Sigma-AldrichT9128Służy do hamowania działania miękkiej trypsyny
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096Stosowany w syntezie cDNA
TissueSAFE plusMILESTONE MEDICALN/ASystem transferu próżniowego do próbek biologicznych
Roztwór błękitu trypanowegoThermo Fisher Scientific15250061Służy do liczenia żywych i martwych komórek 
Trypsyna 1:250Thermo Fisher Scientific27250-018Stosowany w miękkim
roztworze kolagenu trypsyna typu I (PureCol)Advanced BioMatrix5005-BStosowany w roztworze do powlekania
Pojemnik uniwersalny, PP, z nakrętką PEAvantor VWR216-2053Stosowany w protokole leczenia proteazy XIV pierścienia oskrzelowego
, dotyczy dotyczy

Bibliografia

  1. Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112(2022).
  2. de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  3. Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914(2022).
  4. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  5. Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128(2021).
  6. Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
  7. Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
  8. Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
  9. Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742(2019).
  10. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137(2020).
  11. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  12. Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540(2022).
  13. Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
  14. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
  15. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
  16. Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511(2022).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
  19. Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
  20. Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
  21. Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
  22. van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
  23. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).
  24. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
  25. Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
  26. Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
  27. Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
  28. Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
  29. Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
  30. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  31. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  32. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  33. Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
  34. Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
  36. Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071(2022).
  37. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  38. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
  39. Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
  40. Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
  41. Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
  42. Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347(2017).
  43. Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
  44. vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227(2022).
  45. Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278(2020).
  46. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013(2022).
  47. Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386(2017).
  48. van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
  49. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  50. Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
  51. Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
  52. Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
  53. Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
  54. Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
  55. Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotna hodowla kom rekbiobankowanie tkanki p ucnejizolacja kom rek nab onkowychr nicowanie luzowo rz skowepomiar TEERprotok kriokonserwacjianaliza ekspresji gen wcharakterystyka typ w kom rek
Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.