Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65126

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  , 
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, Netherlands Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Streszczenie

Mikrotubule są ważną częścią cytoszkieletu i biorą udział w organizacji wewnątrzkomórkowej, podziale komórek i migracji. W zależności od modyfikacji potranslacyjnych mikrotubule mogą tworzyć kompleksy z różnymi oddziałującymi białkami. Te kompleksy mikrotubulowo-białkowe są często związane z chorobami ludzi. Zrozumienie struktury takich kompleksów jest przydatne do wyjaśnienia ich mechanizmów działania i może być badane za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Aby uzyskać takie kompleksy do badań strukturalnych, ważne jest wyodrębnienie mikrotubul zawierających lub pozbawionych określonych modyfikacji potranslacyjnych. W tym miejscu opisujemy uproszczony protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z genetycznie zmodyfikowanych komórek ssaków, obejmujący polimeryzację mikrotubul, a następnie sedymentację za pomocą ultrawirowania. Wyekstrahowaną tubulinę można następnie wykorzystać do przygotowania siatek mikroskopu krioelektronowego z mikrotubulami, które są związane z oczyszczonym białkiem wiążącym mikrotubule, które jest przedmiotem zainteresowania. Jako przykład pokazujemy ekstrakcję w pełni tyrozynowych mikrotubul z linii komórkowych zmodyfikowanych tak, aby nie miały trzech znanych enzymów detyrozynowych tubuliny. Te mikrotubule są następnie wykorzystywane do wytwarzania kompleksu białkowego z enzymatycznie nieaktywną detyrozynazą tubulinową związaną z mikrotubulami na siatkach krio-EM.

Wprowadzenie

Mikrotubule są kluczową częścią cytoszkieletu; biorą udział w różnych funkcjach, takich jak migracja i podział komórek, ale także przyczyniają się do organizacji wewnątrzkomórkowej. Aby przystosować się do różnych losów funkcjonalnych, mikrotubule oddziałują z różnymi białkami związanymi z mikrotubulami (MAP), enzymami i innymi białkami, które będziemy zbiorczo nazywać "białkami oddziałującymi z mikrotubulami". Wiązanie mikrotubul tych białek może być kierowane przez różne modyfikacje tubuliny, powszechnie określane jako "kod tubuliny"1. Przykładami tej preferencji są kinezyna związana z centromerem mitotycznym (MCAK)2 i domena CAP-Gly dyneina-dynaktyna p1503, które korzystnie kojarzą się z tubuliną tyrozynową, podczas gdy białko E związane z centromerem silników kinezyny (CENP-E)4 i kinesin-25 preferują tubulinę, która nie ma C-końcowej tyrozyny.

Podczas gdy do badania oddziaływań mikrotubula-białko można zastosować różne metody, często używa się mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) do badania tych oddziaływań w rozdzielczości zbliżonej do atomowej6,7. W ostatnich latach struktury cryo-EM ujawniły, w jaki sposób duże białka motoryczne, takie jak dynein8,9,10 i kinesin11, +TIP białka, takie jak EB312,13 i MCAK14, inne białka, takie jak Tau15,16, a nawet małe cząsteczki, takie jak paklitaksel, pelorozyd i zampanolide17 oddziałują z mikrotubulami. Aby zbadać interakcje mikrotubula-białko, mikrotubule są zwykle ekstrahowane z mózgu świni 18. Następnie większość badań in vitro, w tym struktury mikrotubul krio-EM, przeprowadza się przy użyciu tubuliny mózgu świni. Wyniki tych badań zaciemniają zatem znaczenie niejednorodnej natury modyfikacji tubuliny19 między tkankami i typami komórek. Stwarza to szczególny problem podczas badania białka, które wymaga lub preferuje określoną modyfikację wiązania się z mikrotubulami. Można to zilustrować za pomocą tubuliny tyrozynowanej, substratu dla detyrozynazy mikrotubul MATCAP.

Detyrozynacja to modyfikacja tubuliny, w której brakuje C-końcowego aminokwasu tyrozyny α-tubuliny, co jest związane z funkcją mitotyczną, sercową i neuronalną20. Podczas gdy w pełni tyrozynowe mikrotubule są idealnym substratem dla MATCAP, jest on w dużej mierze nieobecny w dostępnych na rynku mikrotubulach z mózgu świni ze względu na funkcję vasohibins21,22 i MATCAP23 detyrozynazy w tej tkance22,23,24,25,26. Chociaż dostępna na rynku tubulina HeLa zawiera głównie tyrozynowe mikrotubule, może dojść do detyrozyny, a zatem to źródło tubuliny jest mniej odpowiednie do tworzenia jednolitej próbki do analizy krio-EM.

Aby stymulować wiązanie MATCAP z mikrotubulami i stworzyć jednorodną próbkę do analizy strukturalnej, szukaliśmy źródła mikrotubul, które jest w pełni tyrozynowane. W tym celu stworzono linię komórkową MATCAP i z niedoborem wazohibiny, która została wykorzystana do ekstrakcji w pełni tyrozynowych mikrotubul. Procedura ekstrakcji została oparta na dobrze ugruntowanych protokołach, które wykorzystują powtarzające się cykle polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul w celu ekstrakcji tubuliny z tkanki mózgowej lub komórek18,27,28,29,30, z tylko jednym etapem polimeryzacji i odwirowaniem nad poduszką glicerolową. Na przykładzie MATCAP pokazujemy, w jaki sposób te mikrotubule można wykorzystać do badań krio-EM. Aby przygotować siatki krio-EM, opisano dwuetapowy protokół aplikacji przy niskim stężeniu soli. Metody opisane w tym artykule opisują ekstrakcję konfigurowalnych mikrotubul w ilościach i czystości wystarczających do przeprowadzenia analizy krio-EM oraz zapewniają szczegółowy protokół wykorzystania tych mikrotubul do tworzenia kompleksów białko-mikrotubula na siatkach krio-EM.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym protokole.

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe powinny być przeprowadzane w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.

  1. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, najpierw rozmrozić fiolkę z zamrożonymi komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Tutaj używamy genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej HCT116, która nie ma trzech znanych enzymów detyrozynowych, VASH1, VASH2 i MATCAP, do wytworzenia tubuliny tyrozynowanej.
  2. Przygotować płytkę Ø 10 cm zawierającą 10 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco) uzupełnione 10% v/v FCS (płodowa surowica cielęca) i antybiotyk penicylina/streptomycyna (pożywka hodowlana) dla genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej HCT116.
  3. Policz komórki i wysiewaj ~2,5 × 106 żywotnych komórek (~20% konfluencji) na przygotowanej 10 cm płytce. Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, zagazowanym 5% (v/v) CO2 , aż komórki osiągną zbieżność 80%-90%.
    UWAGA: Zazwyczaj zajmuje to 3 dni w przypadku komórek HCT116, ale czas ten może zależeć od konkretnej gęstości wysiewu i użytej linii komórkowej.
  4. Wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety lub aspiratora próżniowego i umyć naczynie 2 x 5 ml PBS.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie dozować PBS zbyt mocno na monowarstwę komórek, ponieważ może to spowodować oderwanie komórek od płytki.
  5. Dodaj 1-2 ml trypsyny i inkubuj komórki w inkubatorze przez 2-5 minut, aby odłączyć komórki.
  6. Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej na płytkę, aby ugasić trypsynę.
  7. Podziel zawiesinę komórkową na trzy do pięciu równych części i zasiej je ponownie, aby rozszerzyć komórki w pożywce hodowlanej, aż do uzyskania 6-12 zlewających się płytek o średnicy 15 cm.

2. Żniwa

  1. Delikatnie umyj komórki 10 ml PBS (1x), aby usunąć wszelkie pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Oderwać komórki od płytek, inkubując je przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 3 ml lodowatego PBS uzupełnionego 5 mM EDTA (sterylnego/przefiltrowanego), a następnie za pomocą skrobaka do komórek.
  3. Zebrać komórki w probówce o pojemności 50 ml na lodzie i odwirować (10 min, 250 × g).
    1. Zanotuj objętość zebranych komórek za pomocą skali objętościowej na probówce 50 ml.
      UWAGA: Oczekiwana objętość może wynosić od ~0,5 ml do 4 ml. ETAP PAUZY: Błyskawicznie zamrozić osad komórkowy w LN2 i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Należy pamiętać, że osad komórkowy może być przechowywany tylko przez kilka tygodni lub miesięcy. Jeśli osad jest przechowywany dłużej, może to spowodować zmniejszenie wydajności lub całkowity brak mikrotubul.

3. Ekstrakcja mikrotubul

UWAGA: Wszystko do kroków 3.1-3.5 trzymaj na lodzie; wszystko od kroku 3.6 powinno być utrzymywane w cieple (30-37 °C).

  1. Przygotuj 10 ml lodowatego buforu do lizy zawierającego 100 mM RUREK/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF i jedną tabletkę inhibitora proteazy (mini).
  2. Ponownie zawiesić zebrany osad komórkowy w buforze do lizy 1:1 v/v (jeśli masz wątpliwości co do dokładnej objętości, weź mniej buforu do lizy, a nie więcej).
  3. Liza komórek za pomocą sonikacji: 15 s włączenia, 45 s wyłączenia, amp 30, cztery cykle (określ warunki eksperymentalnie i zmień w zależności od sonikatora).
    1. Po sonikacji pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE: 2 μL lizatu + 18 μL wody + 5 μL 5x bufor próbki SDS.
      UWAGA: Sprawdź pod standardowym mikroskopem świetlnym, czy komórki rzeczywiście uległy pełnej lizie.
  4. Odpipetować zlizowane komórki do probówki odśrodkowej. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w wirniku ultrawirówki w celu oczyszczenia lizatu.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie kieszenie w wirniku są suche i czyste, aby zapewnić prawidłowe wyważenie wirówki.
  5. Użyj strzykawki, aby usunąć oczyszczony lizat. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu, a także pływającej warstwy na wierzchu.
    1. Pobrać próbkę oczyszczonego lizatu: 2 μl lizatu + 18 μl wody + 5 μl buforu do próbek 5x SDS.
    2. Ostrożnie opłucz osad i nabierz trochę osadu, przekręcając przez niego końcówkę pipety P10; dodać 200 μl wody i 50 μl buforu SDS.
  6. Uzupełnij supernatant z poprzedniego etapu 1 mM GTP i 20 μM paklitakselu w celu polimeryzacji mikrotubul; dla objętości 1 ml dodaj 10 μl 2 mM paklitakselu i 10 μL 100 mM GTP.
    UWAGA: Paklitaksel może powodować podrażnienie skóry, poważne uszkodzenie oczu, podrażnienie dróg oddechowych, wady genetyczne, uszkodzenie nienarodzonego dziecka i uszkodzenie narządów. Długotrwałe lub powtarzające się narażenie powoduje uszkodzenie narządów. Nie wdychać, nie rozpylać ani w żaden sposób nie pylić substancji. Nosić gumowe rękawice nitrylowe, aby zapobiec kontaktowi ze skórą.
  7. Inkubować supernatant z dodatkiem GTP/paklitakselu przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić zebranie się mikrotubul.
  8. Na tym etapie inkubacji należy pozostawić rotor i ultrawirówkę do ogrzania do temperatury 30 °C.
  9. Przygotować bufor poduszkowy: Dodać 0,6 ml glicerolu do 0,4 ml buforu do lizy i uzupełnić mieszaninę 20 μM paklitakselem. Rozgrzej bufor poduszki do temperatury 37 °C.
  10. Dodać 800 μl buforu poduszkowego do probówki ultrawirówkowej. Ostrożnie odpipetować lizat z dodatkiem GTP/paklitakselu na wierzchu buforu poduszkowego.
    UWAGA: Zapobiegać mieszaniu się buforu poduszkowego i lizatu poprzez bardzo delikatne pipetowanie.
  11. Wirować przez 30 minut w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 30 °C w wirniku ultrawirówkowym. Zaznacz skierowaną na zewnątrz krawędź probówki wirówkowej, aby łatwo rozpoznać, gdzie powinien powstać osad mikrotubuli.
  12. Ostrożnie usunąć bufor poduszki za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu mikrotubul.
    1. Pobrać próbkę buforu poduszkowego: 2 μl + 18 μl wody + 5 μl buforu do próbek 5x SDS.
  13. Dokładnie umyj granulkę 3x ciepłym buforem do lizy, aby usunąć glicerol. Delikatnie dozuj ciepły bufor obok granulki (nie spłukując płynu bezpośrednio nad granulką), obróć rurkę kilka razy, aby usunąć jak najwięcej glicerolu z osadu i ścianek probówki, a następnie odessać i powtórzyć.
    UWAGA: Jeśli glicerol nie zostanie odpowiednio zmyty, siatka bardzo szybko stopi się pod wpływem oświetlenia elektronowego. Może to świadczyć o dużym ruchu cząstek, tworzącym rozmyte obrazy.
  14. Przygotować bufor do reprodukcji z następującymi składnikami: 100 mM RURY/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH i 1 mM MgCl2 i ogrzać bufor do temperatury 37 °C.
  15. Delikatnie zawiesić przemyty osad z odciętą końcówką w ~50 μl wstępnie podgrzanego buforu do sporządzania zawiesiny i utrzymywać probówkę w temperaturze 37 °C.
    1. Pobrać próbkę zawieszonej frakcji osadów: 2 μL + 18 μL wody + 5 μL 5x bufor do próbek SDS.
      WSKAZÓWKA: Wycięta końcówka zapobiega pękaniu mikrotubul. Przygotować metalowy blok grzewczy o temperaturze 37 °C i przechowywać go w styropianowym pudełku, tak aby probówki z próbkami można było łatwo transportować bez schładzania ich do temperatury pokojowej.

4. Przygotowanie siatki Cryo-EM

  1. Przygotuj zamrażarkę wgłębną, instalując bibułę. Podgrzej zamrażarkę do 30 °C i ustaw wilgotność na 100%. Odczekaj ~30 minut, aby zrównoważyć temperaturę i wilgotność.
  2. Przygotuj ustawienia zamrażarki wgłębnej do dwóch aplikacji i uruchom cały program raz, aby upewnić się, że ustawienia są ustawione prawidłowo. Upewnij się, że pierwsza aplikacja ma siłę 10, czas blot 2 s i czas oczekiwania 0 s, a druga aplikacja ma siłę 10, 6,5 s czasu blot i 10 s czasu oczekiwania.
  3. Wyładowanie jarzeniowe siatek cryo-EM przy natężeniu 30 mA przez 60 s.
  4. Schłodzić zespół pojemnika z polistyrenu za pomocą LN2 i przygotować ciekły etan w metalowym kubku, skraplając etan w zimnym metalowym kubku.
  5. Przygotować bufor rozcieńczający z następującymi składnikami: 100 mM RURY/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH i 1 mM MgCl2 i ogrzać go do temperatury 37 °C.
  6. Rozcieńczyć białko oddziałujące z mikrotubulami w stosunku 1:1 v/v buforem rozcieńczającym tuż przed nałożeniem go na siatki, aby zapewnić obniżenie stężenia soli (użyliśmy końcowego stężenia soli 50 mM NaCl). Przechowywać mieszaninę w temperaturze 37 °C.
  7. Chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety wgłębnej i wciśnij ją do zamrażarki wgłębnej.
  8. Umieść pojemnik z polistyrenu z ciekłym etanem w zamrażarce wgłębnej i uruchom przygotowany program: najpierw nałóż 3,5 μl roztworu mikrotubul na siatkę, pozwól zamrażarce wgłębnej osuszyć siatkę, a następnie natychmiast nałóż 3,5 μl świeżo rozcieńczonego białka, a na koniec pozwól tłokowi osuszyć i zanurz siatkę w ciekłym etanie.
  9. Przenieś siatki do skrzynki do przechowywania siatki i przechowuj je w dewarze LN2 do czasu obrazowania.

Wyniki

Badaliśmy tubulinę detyrozynazę MATCAP związaną z tyrozynowanymi mikrotubulami za pomocą krio-EM. W tym celu wyekstrahowaliśmy w pełni tyrozynowane mikrotubule z genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej HCT116 pozbawionej wszystkich trzech znanych enzymów detyrozynujących: VASH1/2 oraz MATCAP. Użyliśmy 6–12 konfluencyjnych szalek o średnicy 15 cm, aby wyekstrahować mikrotubule z około 0,5–4 mL osadu komórkowego (Rycina 1). Po drugim etapie wirowania (krok 3.11) otrzymano widoczny, lecz mały i przezroczysty osad (Rycina 1I). Wydajność mikrotubul wynosi zazwyczaj ~75 µg. Jeśli osad nie jest widoczny, może to wskazywać na problem w jednym z poprzednich etapów, takich jak niewłaściwa temperatura polimeryzacji mikrotubul, problemy z jakością użytego GTP lub paklitakselu lub dodanie zbyt dużej ilości buforu lizującego, co skutkuje zbyt niskim stężeniem tubuliny do polimeryzacji. Aby ocenić jakość i stężenie wyekstrahowanych mikrotubul, przeanalizowaliśmy próbki na żelu SDS barwionym Coomassie (Rycina 2A). Analizy te wykazały, że wyekstrahowane mikrotubule były stosunkowo czyste. Interpolowane stężenie mikrotubul wyznaczone na podstawie kwantyfikacji BSA wyniosło ~1,4 mg/mL. Jest to zgodne z wartością zmierzoną spektrofotometrem (Rycina 2B,C).

Świeżo wyizolowane mikrotubule można bezpośrednio wykorzystać do przygotowania próbek do krio-EM. Na mikrografiach mikrotubule powinny wyglądać na nienaruszone i występować w obfitej ilości. W celu dalszej analizy krio-EM kluczowe jest uzyskanie niskiej gęstości mikrotubul na mikrografię, aby uniknąć ich krzyżowania się (Rysunek 3A). Połamane mikrotubule lub takie, które nie są widoczne, mogą wskazywać na depolimeryzację mikrotubul (np. z powodu niskiej temperatury lub hydrolizy GTP) lub na nieprawidłowo ustawione parametry odsączania (blottingu) i mrożenia szokowego (plunge freezing). Tło wokół mikrotubul jest gęste, prawdopodobnie z powodu obecności niepolimeryzowanej tubuliny.

Masa cząsteczkowa MATCAP wynosi 53 kDa, a białko to posiada globularną domenę katalityczną o rozmiarze nieco mniejszym niż monomer tubuliny. Dekoracja MATCAP na mikrotubuli może zatem być wykrywalna wizualnie. Mikrotubule, które nie związały MATCAP, wykazywały „gładkie” krawędzie, podczas gdy mikrotubule z związanym MATCAP miały krawędzie „chropowate”, charakteryzujące się obecnością elektronowo gęstych kropek na powierzchni mikrotubuli (Rysunek 3B). Mikrotubule z związanym i bez związanego MATCAP można było również rozróżnić w obliczonych klasach 2D, choć ze względu na kształt i rozmiar może to być inne w przypadku innych białek oddziałujących z mikrotubulami (Rysunek 3C). Aby potwierdzić, że gęstość rzeczywiście należy do białka będącego przedmiotem zainteresowania, można wykorzystać struktury wyznaczone eksperymentalnie lub przewidziane obliczeniowo. Sugerujemy również przygotowanie siatki kontrolnej zawierającej wyłącznie mikrotubule w celu porównania. Pozwala to ocenić, czy mikrotubule zostały spolimeryzowane i wyekstrahowane w całości przy wystarczająco wysokim stężeniu oraz czy proces mrożenia gwałtownego (plunge freezing) został przeprowadzony prawidłowo. Zauważyliśmy, że liczebność mikrotubul uległa zmniejszeniu w siatkach po drugiej aplikacji MATCAP.

Proces wytrącania DNA; eksperyment laboratoryjny; strzykawka, probówki, widoczny osad w probówkach.
Rysunek 1: Wizualny przewodnik po krokach eksperymentalnych. (A) Osad komórkowy przed lizą; (B) sonikowane komórki w probówce do ultrawirówki przed wirowaniem; (C) sonikowane komórki w probówce do ultrawirówki po wirowaniu; (D) strzykawka z oczyszczonym supernatantem; (E) pozostały osad po usunięciu supernatantu, w tym „biała warstwa pływająca”; (F) końcówka P10 z osadem szczątków komórkowych do żelu SDS Coomassie; (G) supernatanty uzupełnione o GTP/paclitaxel przed inkubacją; (H) supernatanty inkubowane z GTP/paclitaxel na poduszce glicerolowej w probówce do ultrawirówki; (I) czysty osad mikrotubul po drugim etapie wirowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz żelu SDS-PAGE z prążkami białkowymi; wykresy stężenia BSA i wyniki analizy statystycznej.
Rycina 2: Wyznaczanie czystości i stężenia mikrotubul. (A) Żel SDS-PAGE barwiony Coomassie, przedstawiający próbki pobrane podczas protokołu ekstrakcji oraz porównanie stężeń BSA. S1 i P1 odpowiadają odpowiednio nadosadowi i osadowi po pierwszym etapie wirowania. S2 i P2 analogicznie odpowiadają drugiemu etapowi wirowania. (B) Linia regresji nieliniowej dla względnych ilości BSA wyznaczonych na podstawie części A. Interpolacja prążka mikrotubul w okolicy 50 kDa w ścieżce P2 (mikrotubule) wskazuje na stężenie końcowe 1,42 mg/mL. (C) Analiza spektrofotometryczna resuspensowanych mikrotubul (P2) przeprowadzona przez dwie osoby i skorygowana o łączny współczynnik ekstynkcji TUBA1A i TUBB3 (0,971) wskazuje na średnie stężenie i odchylenie standardowe wynoszące 1,46 mg/mL ± 0,14 mg/mL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia elektronowa, obrazowanie nanostruktur; schemat; badanie rozmieszczenia i analizy nanocząstek.
Rycina 3: Przykładowe mikrografie. (A) Przykładowe mikrografie przedstawiające mikrotubule związane z MATCAP. Mikrotubule zaznaczone zieloną ramką są nienaruszone, udekorowane i mogą zostać wykorzystane do analizy cryo-EM. Mikrotubula zaznaczona pomarańczową ramką jest nienaruszona i udekorowana, ale znajduje się blisko mikrotubul po jej lewej stronie; w związku z tym jest mniej odpowiednia do włączenia do analizy cryo-EM. Mikrotubule w czerwonej ramce nakładają się na siebie i są przerwane. Powinny one zostać wykluczone z analizy cryo-EM. (B) Powiększony widok mikrotubuli otoczonej zielonym okręgiem z lewego panelu. Czerwone groty strzałek wskazują czarne kropki, które pojawiły się wyłącznie na mikrotubulach na mikrografiach z zastosowaniem MATCAP, a zatem prawdopodobnie odpowiadają MATCAP związanemu z mikrotubulą. (C) Przykładowe klasy 2D cząsteczek mikrotubul wybranych z panelu A, które wykazały wysoki i niski stopień dekoracji, oraz klasa 2D z innego zestawu danych, w którym nie zaobserwowano dekoracji przez MATCAP (panel skrajnie prawy). Paski skali = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza dot blot; przeciwciała antytubulinowe; detekcja białek; wyniki eksperymentalne; TKO HCT116, HeLa.
Rycina 4: Analiza immunoblot mikrotubul pochodzących z komórek HCT116 z potrójnym nokautem (TKO) deficientnych w MATCAP i VASH1/2, komercyjnego mózgu świni oraz tubuliny z komórek HeLa. Skróty: TKO = potrójny nokaut; mAb = przeciwciało monoklonalne; pAb = przeciwciało poliklonalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ta metoda opisuje, jak szybko wyekstrahować endogenną tubulinę z linii komórkowych, a następnie ozdobić te mikrotubule na siatkach krio-EM. Mikrotubule są wrażliwe na temperaturę. Depolimeryzują w zimnym środowisku i polimeryzują w ciepłym środowisku31. Dlatego tak ważne jest przeprowadzenie wirowania sonikacji i klirensu (kroki 1.1-1.5) w temperaturze 4 °C w celu rozpuszczenia tubuliny. Gdyby jakiekolwiek czynniki stabilizowały mikrotubule tak dobrze, że nie uległyby one depolimeryzacji na tym etapie, te mikrotubule i czynniki stabilizujące zostałyby wyrzucone do granulki po początkowym wirowaniu luzu. Po (ponownej) polimeryzacji mikrotubul ważne jest, aby roztwór zawierający spolimeryzowane mikrotubule był przez cały czas ciepły. Wyodrębniliśmy mikrotubule z komórek HCT116, które mają niedobór białek VASH1, VASH2 i MATCAP. Inne linie komórkowe, a także tkanki, mogą być używane do ekstrakcji mikrotubul29, chociaż zanieczyszczenia, izotypy tubuliny i wydajność mogą się bardzo różnić od opisanych tutaj. Nadekspresja plazmidów, które zawierają enzymy modyfikujące, może być również wykorzystana do wprowadzenia określonych modyfikacji tubuliny.

Inne protokoły 18,27,28,29,30 wykorzystują wiele cykli polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul w celu uzyskania mikrotubul pozbawionych innych oddziałujących białek. Tutaj uprościliśmy te protokoły i polimeryzujemy mikrotubule tylko raz. Możliwe, że z powodu tej pojedynczej polimeryzacji mikrotubule te mogą współosadzać się z innymi białkami oddziałującymi z mikrotubulami. Odkryliśmy jednak, że protokół ten daje wystarczająco czyste mikrotubule do celów krio-EM. Jeśli do określonych testów potrzebna jest czystsza próbka, dodatkowe cykle polimeryzacji i depolimeryzacji mogą dać czystszą próbkę, chociaż może się to odbyć kosztem wydajności mikrotubul. W tym protokole użyliśmy paklitakselu do polimeryzacji mikrotubul. Jednak paklitaksel może odchylać siatkę mikrotubul w kierunku pewnego skrętu i wzrostu, co może zakłócać powinowactwo białka do mikrotubul. Inne odczynniki stabilizujące mikrotubule mogą być stosowane, jeśli paklitaksel jest nieodpowiedni; przykładami tych odczynników są cząsteczki nietaksanowe, takie jak pelorozyd lub nieulegające hydrolizie warianty GTP, takie jak GMPCPP17,32.

Aby strukturalnie zbadać białka, które wiążą się z mikrotubulami na siatkach krio-EM, należy związać wystarczającą ilość interesującego białka z mikrotubulami. Często występującym problemem jest to, że kompleksy białkowe, które są stabilne w roztworze, rozpadają się na siatce. Aby utworzyć kompleks białkowy na siatce, kluczowe było najpierw ułożenie mikrotubul warstwami, a następnie nałożenie białka wiążącego mikrotubule o niskim stężeniu soli na siatkę pokrytą mikrotubulami, składając w ten sposób kompleks białkowy bezpośrednio na siatce. Inni podobnie zgłaszali protokół o niskiej zawartości soli33,34 i dwuetapowy protokółaplikacji 34,35,36 w celu udanej dekoracji mikrotubul. Jest prawdopodobne, że niższe stężenie soli skłania kompleks białkowy w kierunku bardziej stabilnej interakcji ze względu na zmniejszone ładunki elektrostatyczne. Jednak ze względu na niskie stężenie soli białko będące przedmiotem zainteresowania jest zagrożone wytrącaniem. Dlatego zdecydowanie zaleca się utrzymywanie białka na poziomie lub w pobliżu fizjologicznie istotnych stężeń soli na krótko przed zeszkleniem siatek. Ten dwuetapowy protokół aplikacji prawdopodobnie zapobiega rozpadaniu się kompleksu białkowego podczas etapów osuszania lub zamrażania wgłębnego. W tym protokole użyliśmy Vitrobota. Jednak szybsze metody witryfikacji (VitroJet) lub stosowanie siatek wolnych od plam (Puffalot) lub urządzeń, które mają obie właściwości (kameleon) mogą potencjalnie przezwyciężyć dwuetapową aplikację, ale obecnie nie są one powszechnie dostępne do testowania.

Na ostateczną rozdzielczość zrekonstruowanej gęstości krio-EM może mieć wpływ szereg czynników, w tym ruch białka wiążącego mikrotubule względem mikrotubuli oraz poziom dekoracji, który można osiągnąć. Wyższa dekoracja mikrotubul jest prawdopodobnie korzystna dla końcowej rozdzielczości uzyskanej w rekonstrukcji gęstości 3D. Może to być ograniczone przez kilka czynników, takich jak najwyższe stężenie białka, które uzyskuje się podczas oczyszczania białka wiążącego mikrotubule, najniższe stężenie soli, które białko oddziałujące z mikrotubulami może wytrzymać bez agregacji, oraz tryb wiązania białka oddziałującego z mikrotubulami (np. białko może obejmować więcej niż jeden dimer tubuliny, utrudniając w ten sposób stosunek wiązania 1:1). Chociaż rozdzielczość rekonstrukcji krio-EM może być zagrożona przez słabo zdobione mikrotubule, analiza obliczeniowa może obejść wiele problemów, czego przykładem jest niedawno opisana struktura kompleksu mikrotubula i białko, która była niezwyklesłabo zdobiona8.

Opisany przez nas protokół przedstawia szybką i tanią metodę otrzymywania mikrotubul odpowiednich do celów krioelektromagnetycznych. W przeciwieństwie do komercyjnie dostępnej tubuliny mózgu świni, mikrotubule pochodzące z komórek HCT116 z niedoborem MATCAP i wazohibiny są w pełni tyrozynowane (Figura 4). Komercyjna tubulina HeLa, drogi odczynnik, jest w zasadzie stosunkowo jednorodnie tyrozynowana i zawiera niewiele innych modyfikacji4 , takich jak glutamylacja, ale partie mogą się różnić, a modyfikację można osiągnąć tylko in vitro. Zaletą ekstrakcji mikrotubul z niestandardowych linii komórkowych jest elastyczność, jaką trzeba uzyskać w przypadku nadekspresji lub usunięcia enzymów modyfikujących tubulinę, takich jak detyrozynazy tubuliny, w celu stworzenia bardziej jednorodnej puli mikrotubul. Może to korzystnie wpłynąć na dekorację i jednorodność próbki cryo-EM, a ostatecznie wpłynie korzystnie na łatwość i jakość map gęstości cryo-EM i struktur molekularnych pochodzących z tej próbki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom grup Sixma, Brummelkamp i Perrakis za ich owocne dyskusje naukowe i za zapewnienie przyjemnego środowiska pracy, a w szczególności dziękujemy Janowi Sakoltchikowi ("osoba 2") za pomoc w określeniu stężenia białka przedstawionego na rysunku 3C. Chcielibyśmy również podziękować ośrodkowi kriogenicznemu NKI oraz Holenderskiemu Centrum Nanoskopii Elektronowej (NeCEN) na Uniwersytecie w Lejdzie za ich wsparcie. Prace te zostały wsparte grantem NWO Vici 016.Vici.170.033 przyznanym T.R.B. A.P. i T.R.B. są badaczami Oncode i otrzymują finansowanie od NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. otrzymał dofinansowanie z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF JB4448-B). Badania te zostały wsparte grantem instytucjonalnym Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego oraz holenderskiego Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Sportu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
Gibco25300-054Kultura komórkowa
10 cm płytkaFalcon353003Hodowla komórkowa
Płytka 15 cmThermo FisherScientific168381Hodowla komórkowa
50 ml probówkiSarstedt62.547255Hodowla
komórkowa300 mesh quantifoil dziurawa siatka węglowo-miedziana R1.2/1.3Quantifoil Micro ToolsN1-C14nCu30-01Przygotowanie siatki Cryo-EM
Skrobaki komórkoweFalcon353085Hodowla komórkowa
DMEMGibco41966-029Hodowla komórkowa
EDTAMerck108418Hodowla komórkowa
EGTASigma AldrichE3899Ekstrakcja mikrotubul
Etan gazowyPrzygotowanie siatki Cryo-EM
FCSSeranas-FBS-EU-015Hodowla komórkowa
GlicerolVWR24.397.296Ekstrakcja mikrotubul
GTPFisher ScientificG8877-1GEkstrakcja mikrotubul
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO komórkiprodukcjiKomórki HCT116 typu dzikiego RRID: CVCL_0291Cell kultura
KOHMerck1.05033Ekstrakcja mikrotubul
MgCl2Merck105833Ekstrakcja mikrotubul
Białko wiążące mikrotubulesamodzielnie wykonanePrzygotowanie siatki Cryo-EM
IgłaBD mikrolance300600Ekstrakcja mikrotubul
PaklitakselSanta Cruz Biotechnologysc-212517Uwaga toksyczny, ekstrakcja mikrotubul
PBSFisher ScientificBP399Hodowla komórkowa
Penicylina i streptomycynaSigma AldrichP0781-100mLHodowla komórkowa
RURYMerckP8203Ekstrakcja mikrotubul
PMSF (w EtOH)Roche16837091001Ekstrakcja mikrotubul
Bufor próbki SDSwłasnej produkcjiOcena jakości
StrzykawkaBD plastipak309658Ekstrakcja mikrotubul
Stoły ultra proteazy miniFisher ScientificNC0975224Ekstrakcja mikrotubul
Bibuła Whatman Whatman47000-100Przygotowanie siatki Cryo-EM
Sprzęt
Kaptur przepływowyhodowla komórkowa
GloQubeQuorumPrzygotowanie siatki Cryo-EM
Skrzynka do przechowywania w siatceSWISSCI41018Magazynowanie w siatce Cryo-EM
Blok grzewczy, elektryczny lub metalowydo ogrzewania
Inkubator, hodowla komórkowaNUAIRHodowla komórkowa
LN2 dewarMagazynowanie w siatce Cryo-EM
Pęseta wgłębnaMikroskopia elektronowa Sciences0508-L5-PSPrzygotowanie siatki Cryo-EM, otwór wywiercony u góry, aby pasował do vitrobota
Pudełko z polistyrenu aby utrzymać ciepło
SonicatorQsonicaQ700Ekstrakcja mikrotubul
Standardowy mikroskop świetlnyOlympusCKX 41Ocena jakości
Rotor TLA 100.3 RotorBeckman CoulterEkstrakcja mikrotubul
TLA 120.2 rotorBeckman CoulterEkstrakcja mikrotubul
Rurki do wirnika TLA 100.3Beckman Coulter326819Ekstrakcja mikrotubul
Rurki do rotora TLA 120.2Beckman Coulter347356Ekstrakcja mikrotubul
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima MAX-XPEkstrakcja mikrotubul
VitrobotFEI, ThermoFischer Scientificmark IVPrzygotowanie siatki Cryo-EM
Vitrobot montaż pojemnika polistyrenowego z metalowy kubek na etanThermoFisher Scientific200703Przygotowanie siatki Cryo-EM
Hodowla komórek w kąpieli
0,05% trypsyna-EDTA własnej wodnej

Bibliografia

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
  3. McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
  4. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  5. Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
  6. Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
  7. Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
  8. Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
  9. Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145(2019).
  10. Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477(2021).
  11. Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
  12. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  13. Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
  14. Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662(2018).
  15. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic model of microtubule-tau interactions. Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).
  16. Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
  17. Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
  18. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  19. Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J. Posttranslational modifications of tubulin and cilia. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), 028159(2017).
  20. Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
  21. Nieuwenhuis, J., et al. Vasohibins encode tubulin detyrosinating activity. Science. 358 (6369), 1453-1456 (2017).
  22. Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
  23. Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
  24. Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
  25. Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
  26. Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
  27. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
  28. Gell, C., et al. Purification of tubulin from porcine brain. Methods in Molecular Biology. 777, 15-28 (2011).
  29. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826(2020).
  30. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  31. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  32. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  33. Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
  34. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
  35. Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
  36. Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja mikrotubulmodyfikacje potranslacyjneultrawirowaniepolimeryzacja mikrotubulanaliza SDS PAGEbia ko wi ce mikrotubulestrukturalna biologia kom rki
Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.