Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65137

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Streszczenie

Jednocząsteczkowe pęsety magnetyczne (MT) służyły jako potężne narzędzia do przenikliwego badania biomolekuł, takich jak kwasy nukleinowe i białka, i dlatego są gotowe do wykorzystania w dziedzinie mechanobiologii. Ponieważ metoda ta powszechnie opiera się na obrazowym śledzeniu kulek magnetycznych, ograniczenie prędkości w rejestrowaniu i analizowaniu obrazów, a także fluktuacje termiczne kulek, od dawna utrudniają jej zastosowanie w obserwacji małych i szybkich zmian strukturalnych w cząsteczkach docelowych. W artykule opisano szczegółowe metody budowy i działania układu MT o wysokiej rozdzielczości, który może rozwiązać nanoskalową, milisekundową dynamikę biomolekuł i ich kompleksów. Jako przykłady zastosowań przedstawiono eksperymenty ze spinkami do włosów DNA i kompleksami SNARE (maszyneria fuzji błonowej), koncentrując się na tym, w jaki sposób można wykryć ich stany przejściowe i przejścia w obecności sił w skali Piconewtona. Oczekujemy, że szybkie MT będą nadal umożliwiać wysoce precyzyjne pomiary nanomechaniczne cząsteczek, które wyczuwają, przenoszą i generują siły w komórkach, a tym samym pogłębią nasze zrozumienie mechanobiologii na poziomie molekularnym.

Wprowadzenie

Komórki aktywnie wyczuwają i reagują na bodźce mechaniczne. W ten sposób wiele biomolekuł wykazuje właściwości zależne od siły, które umożliwiają dynamiczne zmiany strukturalne. Cenionymi przykładami są mechanowrażliwe kanały jonowe i elementy cytoszkieletu, które dostarczają komórkom kluczowych informacji mechanicznych z otaczającego je środowiska.

Ponadto, cząsteczki, które wykazują unikalną naturę przenoszącą siłę, mogą być również uważane za mechanowrażliwe w szerszym sensie. Na przykład lokalne tworzenie i topnienie dupleksów kwasów nukleinowych, a także struktur wyższego rzędu, takich jak G-kwadrupleksy, odgrywają kluczową rolę w replikacji, transkrypcji, rekombinacji, a ostatnio w edycji genomu. Co więcej, niektóre białka neuronalne biorące udział w komunikacji synaptycznej pełnią swoje funkcje, generując siły fizyczne, które przekraczają poziomy typowych oddziaływań międzycząsteczkowych. Bez względu na to, który przykład badamy, badanie nanomechaniki zaangażowanych biomolekuł z wysoką precyzją czasoprzestrzenną okaże się bardzo przydatne w odkrywaniu mechanizmów molekularnych powiązanych procesów mechanobiologicznych1,2,3.

Metody spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek posłużyły jako potężne narzędzia do badania właściwości mechanicznych biomolekuł2,4,5,6. Mogą monitorować zmiany strukturalne w kwasach nukleinowych i białkach równocześnie z przyłożeniem siły, badając w ten sposób właściwości zależne od siły. Dwie dobrze znane konfiguracje to pęseta optyczna i pęseta magnetyczna (MT), które wykorzystują kulki o rozmiarach mikronów do manipulowania cząsteczkami5,6,7,8. W tych platformach polistyren (do pęsety optycznej) lub kulki magnetyczne (do MT) są przywiązane do docelowych cząsteczek (np. kwasów nukleinowych i białek) za pomocą molekularnych "uchwytów", zwykle wykonanych z krótkich fragmentów dwuniciowego DNA (dsDNA). Kulki są następnie przesuwane w celu wywierania siły i obrazowane w celu śledzenia ich lokalizacji, które informują o zmianach strukturalnych w cząsteczkach docelowych. Pęseta optyczna i magnetyczna są w dużej mierze wymienne w swoich zastosowaniach, ale istnieją istotne różnice w ich podejściu do kontrolowania siły. Pęseta optyczna to z natury przyrządy z zaciskiem pozycyjnym, które zatrzymują koraliki w miejscu, dzięki czemu przyłożona siła zmienia się, gdy docelowa konstrukcja ulega zmianom kształtu; Zwiększenie wydłużenia, na przykład z rozłożenia, rozluźnia więź i zmniejsza napięcie i odwrotnie. Chociaż aktywne sprzężenie zwrotne może być zaimplementowane do kontrolowania siły w pęsetach optycznych, MT w przeciwieństwie do nich naturalnie działają jako urządzenie zaciskowe, wykorzystując stabilne, dalekosiężne siły magnetyczne magnesów trwałych, które mogą również wytrzymać zakłócenia środowiskowe.

Pomimo swojej długiej historii i prostej konstrukcji, MT pozostają w tyle za pęsetami optycznymi w swoich zastosowaniach do precyzyjnych pomiarów, głównie z powodu technicznych wyzwań związanych z szybkim śledzeniem ściegów. Ostatnio jednak kilka grup wspólnie prowadziło wieloaspektowe ulepszenie zarówno sprzętu, jak i oprogramowania dla przyrządów MT2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. W niniejszej pracy przedstawiamy przykład takiego układu działającego z częstotliwością 1,2 kHz i opisujemy, jak go używać do wykonywania pomiarów nanomechanicznych na biomolekułach wrażliwych na siłę. Jako systemy modelowe wykorzystujemy spinki do włosów DNA i neuronalne kompleksy SNARE i badamy ich szybkie, strukturalne zmiany w reżimie pikonewtonu. Spinki do włosów DNA wykazują proste dwustanowe przejścia w dobrze zdefiniowanym zakresie siły20,21, a zatem służą jako modele zabawek do weryfikacji wydajności zestawu pęsety. Ponieważ białka SNARE łączą się w wrażliwy na siłę kompleks, który napędza fuzję błonową22, były one również intensywnie badane za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek14,23,24,25. Przedstawiono standardowe podejścia do analizy danych i wydobywania przydatnych informacji z zakresu termodynamiki i kinetyki. Mamy nadzieję, że ten artykuł ułatwi zastosowanie precyzyjnych MT w badaniach mechanobiologicznych i zmotywuje czytelników do zbadania własnych systemów wrażliwych na siły.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie materiały i urządzenia opisane w niniejszym protokole wymieniono w Tabeli materiałów. Oprogramowanie LabVIEW do obsługi opisanego poniżej zestawu wysokich prędkości MT, a także skrypty MATLAB do analizy danych z próbek, zostały zamieszczone w serwisie GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) i są ogólnodostępne.

1. Budowa aparatury

UWAGA: Ogólna zasada konstrukcji szybkich systemów MT jest podobna do standardowych, konwencjonalnych systemów MT, z wyjątkiem zastosowania szybkiej kamery CMOS (complementary metal oxide semiconductor) oraz wysokowydajnego, koherentnego źródła światła (Rycina 1). Szczegółowe opisy standardowych instrumentów MT znajdują się w innych źródłach5,26,27.

  1. Przygotuj mikroskop odwrócony na optycznym stole antywibracyjnym. Zainstaluj szybką kamerę CMOS oraz kartę przechwytującą obraz (frame grabber).
  2. Zbuduj stół translacyjny do manipulacji magnesami w 3D. Zamontuj zmotoryzowany moduł liniowy (>20 mm skoku) pionowo na ręcznym stole XY.
    UWAGA: Ruch pionowy kontroluje siłę, natomiast stół XY służy do ręcznego ustawiania magnesów względem osi optycznej podczas początkowej konfiguracji zestawu.
  3. Zainstaluj obrotowy silnik krokowy oraz system pasowo-kołowy do obracania magnesami.
    UWAGA: Pas przenosi ruch obrotowy z wału silnika na magnesy oddalone o kilka centymetrów. Obrót magnesów odbywa się wewnątrz układu manipulacji translacyjnej.
  4. Zamontuj magnesy. Użyj uchwytu akrylowego (zamówionego w firmie produkcyjnej; patrz Rycina uzupełniająca S1), który może ciasno pomieścić dwa identyczne magnesy równolegle, z precyzyjnie zdefiniowaną 1 mm szczeliną między magnesami (Rysunek 1B). Aby uzyskać maksymalną siłę możliwą dla danej pary magnesów, dostosuj pionową pozycję stołu translacyjnego tak, aby dolna powierzchnia magnesów pokrywała się z płaszczyzną próbki w najniższym położeniu.
    UWAGA: Więcej informacji na temat konstrukcji uchwytu i konfiguracji magnesów znajduje się w pracy Lipfert i wsp.28. Wysokość i orientacja magnesów są kontrolowane przez oprogramowanie LabVIEW w połączeniu z akwizycją danych.
  5. Obserwując przez obiektyw o małym powiększeniu, ustaw magnesy w centrum pola widzenia. Sprawdź, czy obrót magnesów nie powoduje znacznego przemieszczenia środka pary magnesów.
    UWAGA: Jeśli punkt środkowy między magnesami obraca się wokół osi obrotu, prawdopodobnie magnesy są przesunięte z powodu niedoskonałości uchwytu. Niewielki stopień rozcentrowania w stosunku do wielkości szczeliny jest dopuszczalny, ponieważ obrót magnesów służy jedynie do sprawdzania wiązań i przyłożenia momentów obrotowych w konkretnych zastosowaniach.
  6. Zainstaluj superluminescencyjną diodę (SLD) do oświetlenia kulek. Przeprowadź wiązkę przez 1 mm szczelinę między dwoma magnesami. Upewnij się, że wiązka jest odpowiednio skolimowana, aby zmieścić się w szczelinie i że magnesy nie rzucają cienia na obszar oświetlenia.
  7. Zainstaluj piezoelektryczny skaner soczewek na rewolwerze i zamontuj obiektyw immersyjny 100x (apertura numeryczna [NA]: 1.45) do śledzenia kulek. Aby uniknąć potencjalnych artefaktów w wynikach śledzenia, upewnij się, że oświetlenie pozostaje jednorodne podczas przemieszczania magnesów. Na koniec dostosuj poziom światła do maksymalnej jasności, nie powodując nasycenia pikseli.
    ​UWAGA: W celu porównania różnych źródeł światła do szybkiego śledzenia kulek zapoznaj się z pracą Dulin i wsp.29.

2. Kalibracja siły magnetycznej

  1. Za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR; patrz Tabela 1) przygotuj fragmenty dsDNA o długości 5 kbp (używając Startera B, Startera Z_5k oraz λ-DNA), które są znakowane biotyną na jednym końcu (do przytwierdzenia do powierzchni) i azotkiem na drugim końcu (do przytwierdzenia do kuleczki).
  2. Zgodnie z sekcją 6 przygotuj komorkę przepływową z cząsteczkami o długości 5 kbp.
  3. Zgodnie z sekcją 7 zidentyfikuj odpowiedni konstrukt z przytwierdzoną kuleczką, weryfikując jej rozciągnięcie i rotację. W szczególności należy wybrać kuleczkę o minimalnej trajektorii rotacyjnej (tj. o promieniu <200 nm), aby zminimalizować przesunięcie wysokości kuleczki wynikające z niecentralnego przytwierdzenia30,31. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego połączenia rozpocznij śledzenie kuleczki, odnosząc się do sekcji 9.
  4. Jeśli układ jest nowy, określ jego szum i stabilność w celu uzyskania wiarygodnych pomiarów o wysokiej rozdzielczości. Umieść magnes w odległości ~3 mm od powierzchni komórki przepływowej (aby przyłożyć siłę >10 pN i stłumić ruchy Browna kuleczki), śledź pozycję z kuleczki z częstotliwością 1,2 kHz i oblicz odchylenie Allana (AD) z szeregu czasowego współrzędnej z32,33 (Rysunek 2C). Sprawdź, czy w reżimie wysokich prędkości (<0,1 s) możliwe jest uzyskanie wartości AD rzędu kilku nanometrów oraz czy śledzenie różnicowe (pozycja kuleczki magnetycznej względem kuleczki referencyjnej) redukuje AD w dłuższych skalach czasowych.
    UWAGA: Zazwyczaj otrzymujemy AD <3 nm przy maksymalnej prędkości (rozdzielczość 1,2 kHz lub 0,83 ms), a AD nadal maleje przynajmniej do 10 s, co wskazuje na minimalny dryft. Inni autorzy raportowali podobne wartości w analogicznych układach9,10,11,12,34.
  5. Przy magnesach w pozycji spoczynkowej (F ~ 0 pN) zarejestruj współrzędne x i y przytwierdzonej kuleczki z częstotliwością 1,2 kHz. Rejestruj pozycję przez dostatecznie długi czas (tj. znacznie dłuższy niż charakterystyczny czas relaksacji fluktuacji35), aby ruchy Browna zostały odpowiednio próbkowane.
    UWAGA: Tutaj kierunek x przebiega wzdłuż linii pola magnetycznego, natomiast ruch w kierunku y reprezentuje ruch poprzeczny prostopadły do pola.
  6. Przesuń magnesy bliżej komórki przepływowej i powtarzaj pomiary pozycji kuleczki, aż magnesy delikatnie dotkną górnej części komórki. Przesuwaj w dużych krokach (np. 1-2 mm), gdy magnesy znajdują się dalej niż 7 mm od płaszczyzny próbki (ponieważ przyłożona siła rośnie powoli w polu dalekim magnesów), a następnie stopniowo zmniejszaj wielkość kroku (np. 0,1-0,5 mm) w miarę zbliżania się, aby uzyskać precyzyjniejszą kalibrację przy wyższych poziomach siły (Rysunek 2B).
  7. Oblicz siłę dla każdej pozycji magnesu, d, korzystając z jednej z dwóch alternatywnych metod (do dyspozycji jest skrypt MATLAB „force calibration.m” zawierający obie metody; patrz Plik uzupełniający 1).
    1. Zmierz wariancję współrzędnych y kuleczki, Równanie statycznej równowagi ⟨δy²⟩, reprezentacja wzoru dla analizy wariancji, koncepcja matematyczna. (Rysunek 2D) oraz średnią pozycję z Kwantowa wartość oczekiwana, symbol ⟨Z⟩, stosowany w równaniach mechaniki statystycznej i fizyki kwantowej. kuleczki względem najniższej pozycji (Rysunek 2B, dół). Następnie użyj równania (1)7,27,36 do oszacowania siły (przy stałym promieniu kuleczki R = 1 400 nm i energii termicznej kRT = 4,11 pN∙nm):
      Wzór na siłę F=kB*T/<δy²>*(<z>+R) diagram równania fizycznego dla badania fluktuacji termicznych.    (1)
    2. Alternatywnie oblicz gęstość widmową mocy (PSD) współrzędnych y, Sy (Rysunek 2E). Wyznacz przyłożoną siłę F poprzez dopasowanie modelu podwójnego Lorentza37 do zmierzonej wartości Sy przy użyciu równania (2).
      Równanie gęstości widmowej dla analizy stabilności częstotliwości, zawierające formułę matematyczną.    (2)
      Tutaj Równanie dla częstotliwości rezonansowej; matematyczny symbol; zastosowanie w analizie widmowej; zastosowanie badawcze., R jest promieniem kuleczki, a γy oraz γφ to odpowiednio współczynniki oporu translacyjnego i rotacyjnego (oszacowane z równania Stokesa-Einsteina), kRT to energia termiczna, a f+ i f- to dwie częstotliwości charakterystyczne uzyskane za pomocą równania (3).
      Równanie częstotliwości rezonansowych układu dynamicznego, zawierające zmienne i ułamki w formule. (3)
      UWAGA: Ponieważ rozciągnięcie połączenia L jest funkcją siły zgodną z uznanym modelem łańcucha przypominającego robaka (WLC), powyższe wyrażenia pozostawiają F jako jedyny parametr dopasowania (dla uproszczenia przyjmujemy R = 1 400 nm, ponieważ jest ono wspólne dla wszystkich poziomów siły, a dokładna wartość nie wpływa znacząco na wyniki). W razie potrzeby należy uwzględnić rozmycie ruchu i aliasing wynikający z akwizycji obrazu za pomocą kamery38,39, jednak efekt ten jest pomijalny w naszych pomiarach wysokiej prędkości powyżej 1 kHz z połączeniami 5 kbp.
  8. Powtórz kroki 2.4-2.7 dla kilku kolejnych konstruktów. Przebadaj od trzech do pięciu różnych kuleczek, aby uśrednić zmienność siły między kuleczkami magnetycznymi.
    UWAGA: Aby określić właściwą liczbę konstruktów do uśredniania, należy wziąć pod uwagę zmienność siły między używanymi kuleczkami magnetycznymi. Zmienność ta jest niewielka, ale może prowadzić do błędu pomiaru siły przekraczającego 1 pN, nawet w przypadku produktów komercyjnych31. W większości zastosowań, w których absolutne wyznaczenie sił nie jest kluczowe, uśrednienie wyników kalibracji trzech do pięciu kuleczek jest zazwyczaj wystarczające. Alternatywnym podejściem do uwzględnienia tej zmienności jest pomiar siły dla poszczególnych połączeń na początku eksperymentu, co może być czasochłonne. Inną opcją jest wbudowanie w każdy konstrukt struktur spinek do włosów, które rozplatają się przy znanych poziomach siły31.
  9. Przedstaw zmierzoną siłę jako funkcję odległości magnesu i dopasuj do danych funkcję podwójnej wykładniczej (Rysunek 2F) przy użyciu równania (4).
    Wzór na zanik wykładniczy F(d)=F₀+A₁exp(-d/d₁)+A₂exp(-d/d₂) do analizy dopasowania danych.    (4)
    Tutaj F0 (linia bazowa), A1 i A2 (amplitude) oraz d1 i d2 (stałe zaniku) są parametrami dopasowania. Upewnij się, że wartości siły z obu metod, a także wynikające z nich dopasowania podwójnie wykładnicze, są w dużej mierze zgodne (Rysunek 2F,G).
    UWAGA: Aby potwierdzić prawidłowość kalibracji siły, zweryfikuj relację siła-rozciągnięcie badanych konstruktów, wykreślając rozciągnięcie w funkcji zmierzonej siły.
  10. Aby skorygować przesunięcie wysokości kuleczki zoff wynikające z zależnego od siły przechylenia kuleczek magnetycznych30,31, oszacuj zoff z przesunięcia bocznego xoff, uwzględniając geometrię niecentralnego połączenia z promieniem kuleczki za pomocą równania (5), a następnie zastosuj te wartości do zmierzonych wartości rozciągnięcia. Ten krok jest zaimplementowany w skrypcie MATLAB „force calibration.m” (linie 252-254).
    Wzór statycznej równowagi, \(z_{off}(F)=R(1-\sqrt{1-(x_{off}(F)/R)^2})\), równanie fizyczne.    (5)
    UWAGA: Chociaż ta korekta wprowadza niewielkie zmiany w rozciągnięciu, zwłaszcza dla kuleczek o małym promieniu rotacji (<200 nm), przesunięcie to często krytycznie wpływa na odpowiedź sprężystą, co widać w zmianie z Rysunku 2H na Rysunek 2I30,31.
  11. Sprawdź długość persystencyjną Lp poprzez dopasowanie modelu rozciągalnego WLC do danych przy użyciu równania (6).
    Równanie statycznej równowagi dla analizy sił molekularnych, pokazujące szczegółowe komponenty formuły.    (6)
    Tutaj L0 to długość konturowa (1,7 µm dla 5 kbp), a K0 to moduł rozciągania entalpicznego.
    UWAGA: Chociaż powszechnie przyjmuje się, że Lp dla dsDNA wynosi 40-50 nm w typowym buforze, takim jak roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS), wzór WLC zastosowany do krótkich cząsteczek (<5 kbp) systematycznie niedoszacowuje Lp wraz ze spadkiem L031,40. Dzieje się tak, ponieważ klasyczny model WLC zakłada polimer, którego długość łańcucha jest wystarczająco większa od jego długości persystencyjnej. W tym przypadku otrzymaliśmy Lp = 40 ± 3 nm dla konstruktu 5 kbp (Rysunek 2H), a korekta rozciągnięcia pozwoliła uzyskać jednorodną wartość K0 wynoszącą 1 100 ± 200 pN (Rysunek 2I). Zastosowanie skończonego modelu WLC31,40, a także korekty na niegaussowskość rozkładu rozciągnięcia41, nieco zwiększy wartość Lp.
  12. Po zweryfikowaniu kalibracji siły wprowadź uzyskane parametry dopasowania modelu podwójnie wykładniczego do dostarczonego oprogramowania LabVIEW (Plik uzupełniający 2) i poczekaj, aż oprogramowanie obliczy aktualną siłę w czasie rzeczywistym na podstawie odczytów silników (tj. pozycji magnesu). Ponieważ analityczny wzór dla funkcji odwrotnej d(F) nie jest dostępny, przygotuj tabelę wyszukiwania d w funkcji F w krokach 0,1 pN poprzez numeryczne szacowanie dla docelowych poziomów siły d. Przechowuj tę tabelę również w oprogramowaniu w celu sterowania siłą.

3. Synteza spinek DNA

UWAGA: Konstrukcje spinek DNA do eksperymentów MT są przygotowywane poprzez amplifikację PCR regionu o długości 510 bp w λ-DNA z użyciem dwóch specjalnie zaprojektowanych starterów, z których jeden zawiera strukturę spinki na końcu 5′ (Rycina 3A). W ten sposób motyw spinki zostaje umieszczony na jednym końcu produktu PCR.

  1. Przygotować startery.
    1. Starter prawy: Starter B_hp z biotyną na końcu 5′ w celu przytwierdzenia do powierzchni szklanej, wiążący się z λ-DNA. Starter ten zawiera motyw spinki do włosów z łodygą o długości 8 bp i pętlą o długości 6 nt, położoną na 5′ względem regionu wiążącego λ.
    2. Starter lewy: Starter Z_hp z azotkiem na końcu 5′ w celu przytwierdzenia do kulek magnetycznych, wiążący się z λ-DNA w odległości 1 kbp od startera prawego.
  2. Przygotować i przeprowadzić reakcję PCR z wykorzystaniem λ-DNA (matryca), polimerazy nTaq oraz standardowych warunków PCR (patrz Tabela 1). Produkt oczyścić za pomocą komercyjnego zestawu do puryfikacji.
  3. Zmierzyć stężenie DNA poprzez absorpcję UV przy 260 nm (A260) i przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym (żel 2%) (patrz Tabela 2) w celu weryfikacji wielkości produktu. Typowa wydajność to ~35 µL roztworu o stężeniu ~600 nM.

4. Przygotowanie białek SNARE

UWAGA: Neuronalne kompleksy SNARE są montowane poprzez połączenie trzech oczyszczonych białek szczura wyekspresowanych w E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaktyny-1A oraz SNAP-25 (Rysunek 3B). Aby ułatwić ich montaż, syntaktynę i SNAP-25 koekspresuje się z fragmentem VAMP2 (pozbawionym regionu N-końcowego; zwanym „ΔN-VAMP2”) w strukturę zwaną „kompleksem ΔN”, a następnie miesza się ją z pełnowymiarowym VAMP2 po przyłączeniu uchwytu DNA w celu utworzenia pełnych kompleksów.

  1. Przygotować plazmidy zawierające cDNA do ekspresji białek SNARE (sekwencje DNA dla wszystkich plazmidów podano w Tabeli Materiałów).
    1. Przygotować VAMP2 z oznakowaniem 6×His pozbawiony domeny transbłonowej (2-97; L32C/I97C dla wiązań disiarczkowych) sklonowany do wektora pET28a.
    2. Przygotować syntaksynę-1A pozbawioną domeny Habc oraz domeny transbłonowej (191-267, substytucje I202C/I266C dla wiązań disiarczkowych) sklonowaną wraz z ΔN-VAMP2 (49-96) z oznakowaniem 6×His do wektora pETDuet-1.
    3. Przygotować pełnowymiarową izoformę b SNAP-25 (2-206, wszystkie C na A) sklonowaną do wektora pET28a. Będzie ona wykorzystywana do przygotowania kompleksów ΔN.
    4. Przygotować pełnowymiarową izoformę b SNAP-25 (1-206, wszystkie C na A) z oznakowaniem 6×His sklonowaną do wektora pET28a w celu bezpośredniego dodania do buforu testowego MT, aby zrekonstruować kompleksy SNARE po rozfałdowaniu.
  2. Przygotować dwie probówki z komórkami E. coli szczepu Rosetta (DE3). Jedną grupę poddać transformacji plazmidami VAMP2 (z kroku 4.1.1), jedną plazmidami syntaksyny-1A/ΔN-VAMP2 oraz nieoznakowanymi plazmidami SNAP-25 (z kroków 4.1.2 i 4.1.3) w celu ekspresji kompleksu ΔN, a kolejną plazmidami SNAP-25 z oznakowaniem His (z kroku 4.1.4).
  3. Przenieść transformowane komórki do bulionu Luria-Bertani (LB) z odpowiednimi antybiotykami (w tym przypadku kanamycyną i chloramfenikolem dla VAMP2 i SNAP-25 z oznakowaniem His; kanamycyną, chloramfenikolem i ampicyliną dla kompleksu ΔN). Hodować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 rpm) do momentu, aż gęstość optyczna (OD) bulionu osiągnie wartość 0,7-0,9.
  4. Dodać 1 mM izopropyl-β-d-1-tiogalakopiranozydu (IPTG), aby indukować ekspresję białek, a następnie inkubować komórki przez 3-4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 rpm).
  5. Osadzić komórki, wirując kulturę przy 4 500 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować bufory do oczyszczania białek (patrz Tabela 2).
  7. Resuspender osady komórkowe eksponujące SNARE w 40 mL lodowatego buforu do lizy i zlizować komórki poprzez sonikację na lodzie (amplituda 15%, 5 s włączania i 5 s przerwy, łącznie 30 min).
  8. Odwirować lizat przy 15 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych materiałów.
  9. Przepuścić nadsącz przez kolumnę grawitacyjną wypełnioną 1 mL żywicy Ni-NTA. Przemyć żywicę buforem do mycia A, następnie buforem do mycia B, a następnie eluować białka 10 mL buforu do elucji.
  10. Usunąć tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP) i imidazol z eluatu, używając kolumny odsalającej (zgodnie z instrukcją producenta). Eluować próbkę buforem PBS.
  11. Skoncentrować białka za pomocą filtrów wirówkowych (odcięcie 10 kDa) do stężenia ~70 µM, utrzymując białka w buforze PBS (zazwyczaj daje to 2 mL). Zmierzyć stężenie białka za pomocą absorpcji ultrafioletowej (UV) przy 280 nm (A280) lub testem Bradforda.
  12. Przygotować małe alikwoty, zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Pełne kompleksy SNARE zostaną zmontowane po sprzężeniu kompleksu ΔN z uchwytem DNA (patrz poniżej).

5. Przyłączanie uchwytów DNA

UWAGA: Dwa uchwyty dsDNA o długości 510 bp zawierające grupy aminowe na jednym końcu są najpierw przygotowywane za pomocą PCR, a następnie grupy aminowe są przekształcane w grupy maleimidowe przy użyciu bifunkcyjnego łącznika SM(PEG)2. Następnie oba uchwyty są kowalencyjnie łączone z kompleksami SNARE via ich grupy cysteinowe w celu koniugacji specyficznej dla miejsca (Rysunek 3B).

  1. Przygotuj startery.
    1. Przygotuj startery forward: Starter B (do amplifikacji uchwytu B), który jest znakowany biotyną na końcu 5′ w celu przyłączenia do powierzchni szklanej i wiąże się z λ-DNA; Starter Z (do amplifikacji uchwytu Z), który jest znakowany azotkiem na końcu 5′ w celu przyłączenia do kulek magnetycznych i posiada taką samą sekwencję jak Starter B.
    2. Przygotuj starter reverse: Starter N (wspólny dla uchwytu B i uchwytu Z), który jest znakowany aminą na końcu 5′ w celu konjugacji z białkiem i wiąże się z λ-DNA w odległości 510 bp od startera forward.
  2. Przygotuj i przeprowadź dwa zestawy reakcji PCR (18 probówek o objętości 200 µL każdej reakcji dla każdego uchwytu) z użyciem λ-DNA (matryca), polimerazy nTaq oraz standardowych warunków PCR (patrz Tabela 1). Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i eluuj każdy uchwyt w 45 µL wody ultrapure. Użyj minimalnej objętości wody, aby uzyskać wysokie stężenia uchwytów, co zapewni efektywność reakcji w późniejszych krokach.
  3. Zmierz stężenie DNA za pomocą A260. Typowa wydajność to ~650 µL roztworu o stężeniu ~2 µM dla każdego uchwytu. Odstaw niewielkie próbki do późniejszej weryfikacji w elektroforezie żelowej na agarozy.
  4. Poddaj każdy uchwyt (1 µM w PBS) reakcji z 5 mM SM(PEG)2. Inkubuj w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu rotacyjnym. Po 1 h użyj zestawu do oczyszczania DNA, aby usunąć niezwiązany SM(PEG)2. Eluuj każdy uchwyt w 250 µL PBS, aby uzyskać roztwory o stężeniu ~2 µM.
  5. Zmieszaj roztwory uchwytu B i kompleksu ΔN w stosunku molarnym 1:16 (np. 1 µM uchwytu B i 16 µM kompleksu ΔN) w PBS i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej przy mieszaniu. Odstaw niewielką próbkę do elektroforezy żelowej na agarozy.
  6. Dodaj roztwór VAMP2 w 2,5-krotnym nadmiarze molarnym względem kompleksu ΔN użytego w poprzednim kroku. Inkubuj mieszaninę przez kolejne 1 h w temperaturze pokojowej przy mieszaniu. Na tym etapie montowane są pełne kompleksy SNARE.
  7. Usuń wolne białka poprzez wymianę buforu na świeży PBS za pomocą filtra odśrodnikowego (odcięcie 100 kDa): odwiruj przy 14 000 × g przez 5 min w 4 °C, powtórz co najmniej 6 razy, a ostatnie wirowanie przeprowadź przez 15 min. Monitoruj usuwanie wolnych białek, mierząc wzrost stosunku A260/A280. Odstaw niewielką próbkę do elektroforezy żelowej na agarozy.
  8. Dodaj uchwyt Z do roztworu w 15-krotnym nadmiarze molarnym względem uchwytu B. Utrzymaj stężenie uchwytu Z powyżej 1 µM, aby ułatwić reakcję. Inkubuj mieszaninę przez noc w 4 °C przy mieszaniu.
  9. Zweryfikuj produkty pośrednie (uchwyt B i jego konjugaty białkowe) oraz produkt końcowy (kompleks SNARE z dwoma uchwytami) za pomocą elektroforezy żelowej na agarozy (Rysunek 3B, wstawka) (patrz Tabela 2).
    UWAGA: Jeśli białka zostaną pomyślnie przyłączone do uchwytu B, zostanie wykryta zmiana mobilności. W szczególności formowanie pełnych kompleksów SNARE na uchwytach DNA można potwierdzić ich odpornością na dodecylsiarczan sodu (SDS), w przeciwieństwie do kompleksów ΔN, które rozpadają się w SDS, pozostawiając jedynie syntaksynę związaną z DNA (porównaj b i c na Rysunku 3B).
  10. Przygotuj małe alikwoty, zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w -80 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Chociaż końcowy roztwór zawiera niezwiązane uchwyty, podczas montażu próbek w komórce przepływowej zostaną wyselekcjonowane tylko pożądane konstrukty podwójnie znakowane biotyną i azotkiem.

6. Wykonanie komór przepływowych

UWAGA: Komory przepływowe do pomiarów MT są konstruowane z dwóch szkiełek nakrywkowych połączonych dwustronną taśmą klejącą (Rysunek 3C). Jedno szkiełko jest pokryte mieszaniną PEG i biotynilowanego glikolu polietylenowego (PEG), aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i umożliwić specyficzne zakotwiczenie cząsteczek docelowych via wiązanie biotyna-NeutrAvidin (Rysunek 3D). Następnie roztwory materiałów do eksperymentów MT są sekwencyjnie wprowadzane do komory przepływowej za pomocą pompy strzykawkowej (Rysunek 3C,D).

  1. Przygotować dwa szklane szkiełka nakrywki, jedno dla powierzchni górnej (24 mm × 50 mm, grubość nr 1,5) i jedno dla dolnej (24 mm × 60 mm, grubość nr 1,5). Oczyścić szkiełka nakrywki poprzez sonikację w 1 M KOH przez 30 min. Po sonikacji opłukać szkiełka nakrywki wodą destylowaną i przechowywać w wodzie do następnego kroku.
  2. Przeprowadzić PEGylację dolnego szkiełka nakrywki zgodnie z opublikowanymi protokołami42,43. Do silanizacji użyć N-[3-(trimetoksysylo)propyl]etylenodiaminy oraz mieszaniny biotyna-PEG-SVA i mPEG-SVA w stosunku 1:100 (ww) w 100 mM buforze wodorowęglanowym. Przechowywać PEGylowane szkiełka nakrywki w stanie suchym w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  3. W dniu przeprowadzania eksperymentów wyjąć PEGylowane szkiełka nakrywki i osuszyć je pistoletem azotowym. Sprawdzić wizualnie pod kątem zanieczyszczeń, aby upewnić się, że są czyste.
  4. Aby utworzyć kanały dla próbek, przygotować paski taśmy dwustronnej o szerokości ~2 mm i przykleić cztery paski do dolnego szkiełka nakrywki (powierzchnią PEGylowaną do góry), równolegle i w odstępach ~5 mm od siebie (Rysunek 3C).
    UWAGA: W ten sposób w jednej komorze przepływowej można stworzyć trzy kanały dla próbek o szerokości 5 mm.
  5. Umieścić górne szkiełko nakrywki na środku dolnego szkiełka nakrywki, pozostawiając ~5 mm wolnej przestrzeni na krótkich krawędziach dla wlotów i wylotów kanałów. Delikatnie docisnąć tył górnego szkiełka nakrywki pęsetą, aby szczelnie zamknąć kanały.
  6. Aby wykonać zbiornik wlotowy, przyciąć krawędź końcówki pipety 200 µL. Odciąć ~10 mm od szerszego otworu, aby umożliwić pomieszczenie ~200 µL roztworu. Przygotować trzy takie końcówki dla trzech kanałów przepływowych. Aby skonfigurować wyloty, przygotować trzy igły strzykawki pasujące do przewodów pompy strzykawkowej.
  7. Używając epoksydu 5-minutowego, przykleić zbiorniki i gniazda igieł do komory przepływowej. Upewnić się, że uzyskano całkowitą szczelność, aby uniknąć wycieków, oraz że kanały nie są zablokowane nadmiarem kleju. Pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 30 min.

7. Składanie konstruktów przywiązanych do kulek

UWAGA: Roztwory materiałów do eksperymentów z MT, w tym roztwory konstruktów z przywiązanymi kuleczkami, są wprowadzane sekwencyjnie do komór przepływowych przy użyciu pompy strzykawkowej (Rysunek 3C,D).

  1. Przygotowanie kulek magnetycznych. Odmierzyć 5 mg kulek M270-epoxy z roztworu zapasowego (~3,3 × 108 kulek w 167,5 µL dimetyloformamidu) i wymienić rozpuszczalnik na bufor fosforanowy (patrz Tabela 2) poprzez separację magnetyczną kulek.
  2. Przygotować kulki w stężeniu ~1,1 × 109 kulek mL−1 w buforze fosforanowym z 1 M siarczanem amonu i poddać je reakcji z 2 mM dibenzocyklooktynem (DBCO)-NH2. Inkubować mieszaninę przez 3 h na mieszalniku obrotowym w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji przemyć kulki 3x świeżym buforem fosforanowym, aby usunąć nieprzereagowane cząsteczki.
    UWAGA: Przemyte kulki można przechowywać bez dodatkowego mieszania w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni przed użyciem.
  3. Połączyć igłę na wylocie kanału komory przepływowej z pompą strzykawkową za pomocą rurki polietylenowej. Równoważyć kanały za pomocą PBS.
  4. Wprowadzać kolejno następujące roztwory do kanału poprzez zasysanie pompą: NeutrAvidin, konstrukty docelowe (spinki DNA lub kompleksy SNARE z uchwytami DNA), referencyjne kulki polistyrenowe oraz kulki magnetyczne pokryte DBCO. Przed użyciem dokładnie wymieszać roztwory kulek w wirówce typu vortex, aby rozproszyć ewentualne agregaty kulek.
  5. Wypłukać niezwiązane kulki, przykładając siłę 0,1 pN.
    UWAGA: Przyłożenie niewielkiej siły skierowanej w górę ułatwia usuwanie niezwiązanych kulek i pomaga uniknąć zerwania specyficznie związanych konstruktów zakotwiczonych na kulkach.
  6. W przypadku eksperymentów z kompleksami SNARE, do końcowego buforu dodać 1,5 µM SNAP-25.
    ​UWAGA: Wolne cząsteczki SNAP-25 mogą ponownie wiązać się z kompleksami SNARE po ich rozfałdowaniu, co umożliwia wielokrotne pomiary na pojedynczym kompleksie.

8. Identyfikacja konstruktów docelowych

  1. Na powierzchni kanału celi przepływowej wyszukaj kuleczki magnetyczne przytwierdzone za pomocą pojedynczych cząsteczek konstruktu docelowego. Upewnij się, że w pobliżu znajduje się kuleczka referencyjna.
  2. Obróć kandydowaną kuleczkę i sprawdź, czy obraca się ona swobodnie. Jeśli kuleczka jest przytwierdzona przez wiele cząsteczek, jej ruch będzie ograniczony.
  3. Obróć kuleczkę o kilka pełnych obrotów i wyznacz promień rotacji (funkcja ta jest zaimplementowana w dostarczonym oprogramowaniu). Preferowane jest wybranie kuleczki o małym promieniu rotacyjnym.
    UWAGA: Promień ten wskazuje, w jakim stopniu kuleczka jest przesunięta z osi przytwierdzenia, co jest determinowane losowo podczas procesu montażu kuleczki i więzi30,31. W przypadku wszystkich eksperymentów minimalne przesunięcie kuleczki z osi pozwala ograniczyć wiele artefaktów związanych z wysokim stosunkiem promienia kuleczki do długości rozciągnięcia więzi, stosowanym w tej metodzie.
  4. Zwiększ siłę od 0 do 5 pN, aby zidentyfikować odpowiednie kuleczki przytwierdzone za pomocą pojedynczej więzi. Szukaj znacznej zmiany w wzorcu dyfrakcyjnym kuleczki, wynikającej z rozciągania więzi o długości 1 kbp (lub równoważnych dwóch uchwytów o długości 510 bp). Jeśli wzorzec dyfrakcyjny nie zmienia się znacząco, zmniejsz siłę do zera i wyszukaj inną kandydowaną kuleczkę.
    ​UWAGA: Uniesienie kuleczki o ok. 300 nm można łatwo zauważyć na surowych obrazach bez konieczności uruchamiania procesu śledzenia.

9. Śledzenie kulek w celu pomiaru wydłużenia

UWAGA: Śledzenie kulek odbywa się poprzez analizę obrazów kulek w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu LabVIEW dostarczonym do niniejszego artykułu. Metoda śledzenia oraz jej warianty były stosowane w większości konwencjonalnych systemów MT i zostały wyjaśnione w poprzedniej literaturze2,5,7,26. Dzięki pomiarowi pozycji kulki magnetycznej względem stałej kulki referencyjnej (tj. śledzeniu różnicowemu), pomiary pozycji stają się niezwykle odporne na zewnętrzne zakłócenia.

  1. Po zlokalizowaniu odpowiedniego koralika magnetycznego wraz z koralikiem referencyjnym, kliknij przycisk Calibrate, aby rozpocząć przygotowania do śledzenia koralików.
  2. Kliknij koraliki na obrazie, aby zdefiniować ich położenie. Obrazy zostaną następnie przycięte do obszarów zainteresowania (ROI) (np. 150 x 150 pikseli dla koralika 3 µm) wokół koralików, a następnie poddane dalszej analizie w celu wyodrębnienia precyzyjnych współrzędnych koralików.
  3. Poczekaj na zakończenie obrotu magnesu. Proces ten rejestruje współrzędne x i y koralika (poprzez obliczanie dwuwymiarowej korelacji wzajemnej44 lub wykorzystanie symetrii radialnej45 obrazów koralików, przy porównywalnej wydajności) podczas obracania magnesów, aby udokumentować pozaosiowe przytwierdzenie koralika31.
  4. W przypadku śledzenia w kierunku z, poczekaj, aż oprogramowanie wygeneruje tabelę wyszukiwania (lookup table) obrazów dyfrakcyjnych koralików w różnych odległościach od płaszczyzny ogniskowej. Jest to realizowane poprzez przesuwanie obiektywu za pomocą skanera piezoelektrycznego w równych odstępach i rejestrowanie obrazów koralików uśrednionych z fluktuacji w każdej pozycji. Następnie współrzędne z koralików w rzeczywistych eksperymentach są wyznaczane poprzez porównanie obrazów koralików w czasie rzeczywistym z tabelą wyszukiwania z zastosowaniem interpolacji7.
  5. Po zakończeniu generowania tabeli wyszukiwania, włącz śledzenie i autofokus (naciśnij przyciski Track? i AF?), a następnie kliknij przycisk Acquire, aby rozpocząć rejestrację pozycji koralików.
    UWAGA: Autofokus jest opcjonalny, ale zalecany w celu skorygowania dryftu stolika w osi z podczas akwizycji.

10. Schematy aplikowania siły

  1. Eksperymenty z rampą siły: Aby zweryfikować zależność siła-rozciągnięcie konstruktu, zastosuj rampę siły w górę i w dół przy stałej prędkości obciążania (± 1,0 pN s−1) (Rysunek 4A). Na przykład zastosuj trzy cykle 0-20-0 pN w celu weryfikacji całkowitej długości konstruktu oraz krzywej siła-rozciągnięcie uchwytów.
  2. Określając parametry powiązania w oprogramowaniu, nałóż krzywą siła-rozciągnięcie WLC na zmierzone dane i ustal, czy docelowa kuleczka jest powiązana z rzeczywistym konstruktem próbkowym z odpowiednimi uchwytami DNA. Jako punkt wyjścia przyjmij znaną długość konturową (np. ~340 nm dla 1 kbp dsDNA) oraz długość persistencyjną WLC (30-45 nm dla krótkiego dsDNA31) konstruktu. W razie potrzeby zastosuj metodę korekcji rozciągnięcia opisaną w kroku 2.11.
  3. Jeśli konstrukt zostanie zweryfikowany, szczegółowo zbadaj odpowiedź siła-rozciągnięcie, aby zidentyfikować dodatkowe rozciągnięcie wynikające z obecności cząsteczek docelowych — spinek do włosów lub kompleksów SNARE.
  4. Eksperymenty ze stałą siłą: Stopniowo zmieniaj przyłożoną siłę w dyskretnych krokach, aby zbadać wrażliwość cząsteczek docelowych na siłę (Rysunek 4B).
    UWAGA: MT umożliwiają proste i skuteczne eksperymenty ze stałą siłą, ponieważ przyłożona siła pozostaje stała, gdy magnesy są nieruchome.
    1. W przypadku spinek DNA zastosuj siłę 4-8 pN w krokach 0,2-0,5 pN i mierz pozycję kuleczki przez ~10 s dla każdego poziomu siły.
    2. W przypadku kompleksów SNARE zastosuj siłę 14-16 pN w krokach 0,1-0,2 pN i mierz pozycję kuleczki przez ~10 s dla każdego poziomu siły.
  5. Eksperymenty ze skokiem siły: Obserwuj zdarzenia przejścia kompleksów SNARE.
    UWAGA: Eksperymenty ze skokiem siły, podobnie jak eksperymenty ze stałą siłą, obejmują zmiany poziomów siły. Jednak skoki siły wykorzystują bardziej gwałtowne zmiany przyłożonej siły, co pozwala na monitorowanie zdarzeń wyzwalanych siłą w badanych cząsteczkach, takich jak nagłe rozerwanie kompleksów białkowych. Na przykład, ponieważ kompleksy SNARE wykazują histerezę strukturalną podczas cykli siły23, informacyjne jest przeprowadzenie eksperymentów ze skokiem siły i pomiar czasu oczekiwania na przejście (Rysunek 4C).
    1. Rozpinanie (Unzipping): Oddzielenie cząsteczki VAMP2 od nienaruszonego, trójskładnikowego kompleksu SNARE, co pozostawia dwuskładnikowy kompleks syntaksyny-1A i SNAP-25.
    2. Zapinanie (Rezipping): Zapinanie rozpiętej cząsteczki VAMP2 w celu regeneracji nienaruszonego kompleksu SNARE.
      1. Rozwijanie (Unfolding): Całkowity rozpad kompleksu SNARE połączony z pełną dysocjacją SNAP-25. Po rozwinięciu w konstrukcie pozostają jedynie cząsteczki VAMP2 i syntaksyny.
      2. Zwijanie (Refolding): Regeneracja kompleksu SNARE po związaniu wolnej cząsteczki SNAP-25 z buforu.
  6. Przy 2 pN indukuj montaż nienaruszonego kompleksu SNARE, oczekując (~30 s) na asocjację wolnej cząsteczki SNAP25. Po utworzeniu kompleksu SNARE obserwuje się nagły spadek rozciągnięcia.
  7. Aby zaobserwować zdarzenia rozpinania, odczekaj kilka sekund przy 10-12 pN, a następnie gwałtownie przejdź do 14-15 pN z maksymalną możliwą prędkością silnika. W zależności od siły docelowej, kompleks SNARE wykaże albo odwracalne przejście między częściowo rozpiętymi przejściami (jak w eksperymentach ze stałą siłą), albo skok o ~25 nm do wyższego, rozpiętego stanu po losowym czasie oczekiwania (latencji).
  8. Aby zaobserwować zdarzenia zapinania, obniż siłę do 10-12 pN natychmiast po zaobserwowaniu rozpinania. Ponownie, kompleks SNARE wykazuje stochastyczne przejście do niższego, zapiętego stanu po pewnym losowym czasie oczekiwania. Jeśli po rozpinaniu nastąpiło rozwijanie, kompleks nie zapnie się ponownie, ponieważ będzie brakować cząsteczki SNAP-25.
  9. Aby zaobserwować zdarzenia rozwijania, odczekaj dłuższy czas po zaobserwowaniu rozpinania, aby wykryć dalszy wzrost rozciągnięcia (~2 nm).

11. Analiza danych

UWAGA: Rodzaje analiz, jakie można przeprowadzić przy użyciu danych MT, zależą od badanego układu. Istnieją jednak wspólne podejścia do wyodrębniania przydatnych informacji z poszczególnych eksperymentów opisanych na Rysunku 4. Wszystkie analizy wykonano w programie MATLAB (R2021a), korzystając z dostarczonych do niniejszego artykułu specjalistycznych kodów. Kody te generują wykresy na podstawie danych przedstawionych w artykule. Należy zauważyć, że o ile surowe dane z trackingu 100 Hz były bezpośrednio przekazywane do analizy, o tyle dane z trackingu 1.2 kHz były zazwyczaj poddawane filtrowaniu medianowemu (z pięciopunktowym oknem przesuwnym) przed analizą w celu redukcji szumów (z wyjątkiem analizy szumów).

  1. Eksperymenty z rampą siły: Analiza zależności siły od wydłużenia (np. elastyczności polimerów) oraz przejść siłowych w celu uzyskania informacji o właściwościach nanomechanicznych.
  2. Eksperymenty z siłą stałą: Analiza populacji stanów i czasu przebywania (lub szybkości przejść) w funkcji siły w celu wyznaczenia parametrów strukturalnych (np. obszarów zaangażowanych w przejście), termodynamicznych (np. różnicy energii swobodnej) oraz kinetycznych (np. bariery energetycznej) zmian konformacyjnych.
  3. Eksperymenty ze skokiem siły: Analiza kinetyki rozerwania (np. oddziaływań białko-białko i wiązania receptor-ligand) lub czasu życia przejściowych produktów pośrednich (np. rozwijania biomolekuł) w celu określenia stabilności cząsteczek docelowych i ich stanów.
  4. W ramach reprezentatywnych zastosowań należy przeanalizować dane próbne dla spinek DNA oraz kompleksów SNARE:
    1. Przejścia dwustanowe spinki DNA: siła rozplatania, odległość otwarcia, zależność przesunięcia populacji od siły, a także przypisanie stanów i pomiary szybkości przejść z użyciem ukrytego modelu Markowa (HMM) (dołączono kody MATLAB).
    2. Zmiany konformacyjne kompleksów SNARE: siła rozplatania, zależność stanów pośrednich i latencji rozplatania od siły, histereza podczas ponownego zaplatania oraz zachowanie podczas rozwijania/zwijania.
      UWAGA: Modele siła-wydłużenie dla uchwytów DNA, spinek DNA i konformacji kompleksu SNARE zostały podane w poprzednich referencjach14,31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kalibracja siły
Wyniki uzyskane za pomocą dwóch metod pomiaru siły (wariancji bocznego przemieszczenia kulek oraz analizy widma mocy) różniły się o 0-2 pN (Rycina 2G). Zgodnie z wynikami przedstawionymi na Rycinie 2F, przy użyciu zwykłych magnesów neodymowych możemy niezawodnie osiągnąć siłę do 30 pN.

Przejścia dwustanowe spinki DNA o długości 8 bp
W pierwszej kolejności zbadaliśmy nanomechani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiliśmy układ spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, który umożliwia obserwację zmian strukturalnych biomolekuł z wysoką precyzją czasowo-przestrzenną. Wykorzystana szybka kamera CMOS rejestruje 1 200 klatek s−1 przy rozdzielczości 1 280 x 1 024, co pozwala na śledzenie kulek z częstotliwością 1,2 kHz. Obecnie szybkość pomiarów jest jednak ograniczona przez oprogramowanie do śledzenia kulek, dlatego w pomiarach wysokiej częstotliwości obszar ROI jest zazwyczaj ograniczany do mnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 i NRF- 2021R1A6A1A10042944). Projekt S.-H.R. otrzymał wsparcie z grantu NRF (2021R1C1C2009717).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do syntezy konstruktu
Agaroza system elektroforezy w żeluAdvanceMupid-2plus
Drabinka DNABioneerD-1037
Polimeraza nTaqEnzynomicsP050A
Zestaw do oczyszczania PCRLaboPassCMR0112
PEGylowany Środek sieciujący SMCC / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102Do SNARE– Sprzężenie DNA
Primer BBioneer5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'Dokonstrukcji kalibracji siły 5-kbp i uchwytów DNA
Podkład B_hpIDT5'-Biotyna/TTTTTTTTTTTTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'Do		konstrukcji spinki do włosów
Primer NBioneer5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'Douchwytów DNA
Primer ZBioneer5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'Douchwytów DNA
Podkład Z_5kBioneer5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'Do		konstrukcji kalibrującej siłę 5 kbp
Podkład Z_hpBioneer5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'Dokonstrukcji spinki do włosów
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermoFisher Naukowamatrycowa S33102
λ-DNABioneerD-2510do sekwencji PCR
DNA dla białek SNARE
6&razy; His-taged SNAP-25b (2-206; pisane wielką literą) w pET28adomowej robotytggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcgggggtgttacgcgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcttctctctttctttc/ gcccgctcttccctttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggg
atttagtgctttacggcaccgaccccaaa
aaacttgattagggatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactctttttccaaactggaacaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaacaatttaacg
c cct gaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggaaatgtggc
ggaacccctatttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccgggc
aggaacactgccaggcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtgaccatcatctct
gtaacattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatccatggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagactttccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcacagttttatttttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaa
ggatcttcttgagatcctttctgcg
taatctgctgcttgcaaaccacc
gctaccagggtggtgtttgtgccatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagtgccaccacac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcgggggctgaacggggg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgccacgaggcttcca
gggggaaa acgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcagg
tatggaaaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggtggcctttt
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgatgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagtgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcgatgggattttctccttac
gcatccatcgatggatttctccttacbr/ gcatccatcgagt ctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactggcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgccctgacgccctga
cgggcttgtctgctccccccatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccggggctgcat
gtgtcagaggttttcacccatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagggattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggtttg
tttggtcactgatgcctccgtaagggg
tttctgttcatggggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacaggggg Tagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagcagc
tcacgttcgctcgcgtatcgtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagcc
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgacccgtgggccatgccatgccggg
atggcctgcttctcgccgaaacgtgtggtgg
6&razy; His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; pisane wielką literą) w pET28adomowej robotytggcgaatgggacgccccctgtagcggcgca
ttaagcgggggggttacgcgcca
gcgtgaccgctacacttgccagcgcctagc
gcccccttcttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggtcgaccccaaa
aaacttgattagggatggttcacgta ggccatcgccctgatagacggtttcgccc
ggactctttttccaaactggaacaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaacaatttaacg
c cct gaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggaaatgtggc
ggaacccctatttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccgggc
aggaacactgccaggcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtgaccatcatctct
gtaacattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatccatggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagactttccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcacagttttatttttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaa
ggatcttcttgagatcctttctgcg
taatctgctgcttgcaaaccacc
gctaccagggtggtgtttgtgccatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagtgccaccacac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcgggggctgaacggggg
cacacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagccccacgcttcccgaagggagaaaa
ggcggacaggtatcctaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcgaggcttcca
gggggaaa acgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttccccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcagg
tatggaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggttttgctgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatggggattttctccttac
gcatatcctctcttacbr/ gcatatccgagccatccatcggc. ctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactggcatggcatgccccccg
acacccgccaacacccgctgacgcccctga
cgggcttgtctgctccccccatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccggggctgcat
gtgtcagaggttttcacccatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagggattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggtttg
tttggtcactgatgcctccgtaagggg
tttctgttcatggggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacaggggg Tagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagcagc
tcacgttcgctcgcgtatcgtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagcc
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgacccgtgggccatgccatgccggg
atggcctgcttctcgccgaaacgtgtggtgg
6&razy; Jego-oznaczony Δ N-VAMP2 (49– 96; pisane wielką literą) i Syntaksyna-1A (191– 267, I202C/I266C; pisane wielkimi literami) w pETDuet-1domowej robotyggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGGGTAATGTGGACAC aaggt
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCACAbr/ ATGGCCCTCACA gtgagatcgaga
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcatggactcgtggt ctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcggggggg
gtgtggtggtggttacgccagccgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gcttttccctttctcgccacgt ccggctttccgtcaagctctttccatcgg
gctccctttagggttccgattgt
br/ cggcacctcgaccaaaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacacactctcggt
ctattcttttgatttttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaggatcttcac
ctagatccttttaaaattaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactcccccccgtgt
Agataactacgatacggggggctcatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagagggggaaggggagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaaa. ttgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgttttttttatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtgtaagatgcttttctgtgactg
gtga™α gtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcattggaaa
acgttcttcggggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagggtttctgggggagcaaa
aacaggaaggcaaatgccgcaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
< catactcttcctttttcaatcatgattgaagbr/> catttatcattatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtattatagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcccaaa
caaaaaaccaccgctaccagggtggtgtg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtcttcagaggcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgctgcgataagtc
gtgtcttaccggtggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggctgaaa
cggggggggttcgtgcacacacagccttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggacacaggtatccgggat
agcggcagggtcggaacaggagagcgc
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttttgtgatgctcgtca
ggggggggcggagtatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttttacggttcctggttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgc
agccgaacgaccgagcgcagccagcgagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctcctctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagag
tacactccgctatcgtacgtgactgggtca
tggctgcgccccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacggggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctggaccgtctct
ccgggagctgcatgtgtcagaggtgttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaaagcgggcatgttaaggg
cggtttttcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatggggg
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcgggggaccagagaaaaaa
tcactactgtgggacagagaaaaaabr/ tcact. cagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccagag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggctgacttccgcgtttccagag
actttacgaaacggaacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagtagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
< ccaccggaaggagctgactgggttgaaggctbr/> ctcaagggcatcggggagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccaggggggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggggagaggggtgtggtattgg
gcgccagggtgtggtttttcttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccccagcagggaaaatcctg
tttgatggtggttaacgggggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcggcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccaggg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgggggagagg
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgccggccgg/ cccgg gctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaatacaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttg
gaagattgtgaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagtcagttgatcggatt
taatcc. gccgcgacacaatttgcgacgcgtg
cagggccagactggaggtcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcgggggaattttcagctccgc
catcgcttccccactttttccgtgttc
gcagaaacgtggctggtggtggttctcc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccatgcgaaaggtt
gccatcatgcgaaaggttttbr/ gccatgcgaaggttttt cgccattcgatggtgtccgggatctcgacgg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgagggttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagagtcccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgattc
cccatcggtgatgatgtcgatataggcgcca
gcaaccgacctgtgggggtgatgccgggg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgggaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1– 206, wszystkie od C do A; pisane wielką literą) w pET28adomowej robotytggcgaatgggacgccccctgtagcggcgca
ttaagcgggggggt
gcgtgaccgctacacttgccaggcctagc
gcccccttc ctcgccac gttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttaggg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactctttttccaaactggaacaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaacaatttaacg
c cct gaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggaaatgtggc
ggaacccctatttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccgggc
aggaacactgccaggcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtgaccatcatctct
gtaacattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatccatggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagactttccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcacagttttatttttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaa
ggatcttcttgagatcctttctgcg
taatctgctgcttgcaaaccacc
gctaccagggtggtgtttgtgccatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagtgccaccacac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcgggggctgaacggggg
cacacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagccccacgcttcccgaagggagaaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgccgaggcttcc
agggggaaagg acgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttccccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcagg
tatggaaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggttttgctgctggccttttgt
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatggggattttctccttac
gcatatcctctcttacbr/ gcatatccgagccatccatcggc. ctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactggcatggcatgccccccg
acacccgccaacacccgctgacgcccctga
cgggcttgtctgctccccccatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccggggctgcat
gtgtcagaggttttcacccatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagggattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggtttg
tttggtcactgatgcctccgtaagggg
tttctgttcatggggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacaggggg Tagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagcagc
tcacgttcgctcgcgtatcgtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagcc
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgacccgtgggccatgccatgccggg
atggcctgcttctcgccgaaacgtgtggtgg
Materiały do oczyszczania białek
2-merkaptoetanolSIGMAM3148-25ML
Roztwór agaruLPSAGA500
Ampicylina, sól sodowaPLSAC1043-005-00
ChloramfenikolPLSCR1023-050-00
Kompetentne komórki ( E. coli)Novagen70956Rosetta(DE3)pLysS
GlicerolSIGMAG5516-500ML
HEPESSIGMAH4034-100G
Kwas solny / HClSIGMA320331-500ML
ImidazolSIGMAI2399-100G
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd / IPTGSIGMA
Siarczan KanamycynyPLSKC1001-005-02
Luria-Bertani (LB)Bulion LPS RoztwórLB-05
Żywica Ni-NTAQiagen30210
PD MiniTrap G-25 (kolumna odsalająca)CytivaGE28-9180-07Aby uzyskać instrukcje, zobacz: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Fluorek fenylometylosulfonylu / PMSFThermoFisher Scientific36978
Plazmidy do białek SNAREklonowane w domuNie dotyczyDostępne na żądanie
Koktajl inhibitorów proteazygenDEPOTP3100
Chlorek soduSIGMAS5886-500G
Fosforan sodu dwuzasadowy / Na2HPO4SIGMAS7907-100G
Fosforan sodu jednozasadowy / NaH2PO4SIGMAS3139-250G
Tris(2-karboksyetylo)fosfina / TCEPSIGMAC4706-2G
Podstawa trizmaSIGMAT1503-250G
Materiały do składania próbek
Biotin-PEG-SVALAYSAN BIOBIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1gDo PEGylacji
Dibenzocyklooktynoamina / DBCO-NH2SIGMA761540-10MGDo powlekania ściegów
Taśma dwustronna3M136Do montażu komór przepływowych
Klej epoksydowyDEVCONS-208Do montażu komory przepływowej
Szkiełko nakrywkowe szklane do dolnej powierzchniVWR48393-251Prostokątny, 60 razy; 24 mm, #1.5
Szkiełko nakrywkowe do powierzchni górnejVWR48393-241Prostokątne, 50&krotne; 24 mm, #1.5
Koralik magnetycznyThermoFisher Scientific14301Dynabeads M-270 Żywica epoksydowa, 2.8 μ
m mPEG-SVALAYSAN BIOmPEG-SVA 1gDo PEGylacji
N,N-dimetyloformamidu / DMFSIGMAD4551-250MLDo powlekania kulek
N-[3-(trimetoksysililo)propylo]etylenodiaminaSIGMA104884-100MLDo PEGylacji
NeutrawidynaThermoFisher Scientific31000Do wiązania próbki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami / PBS, pH 7,2PLSPR2007-100-00
Plastikowa strzykawkaNorm-jectA55 ml, końcówka typu luer
Rurka polietylenowaSCIBB31695-PE/4PE-60
Koralik referencyjnySPHEROTECHSVP-30-5Cząstki polistyrenu pokryte streptawidyną; 3,0-3,4 &mikro; m
Igła strzykawkowaKovax21G-1 1/4''21 G
Pompka strzykawkowaKD SCIENTIFIC788210
Sprzęt do pęsety magnetycznej
1-osiowy zmotoryzowany stolik do mikrotranslacjiPIM-126. PD1Do pionowego pozycjonowania magnesów
2-osiowy ręczny stolik translacyjnyST1LEE400Do ustawiania magnesów względem osi optycznej
Akrylowy uchwyt do magnesówDaiKwang Precyzyjnezamówienie klientaRysunek dostępny na życzenie
Frame grabberActive SiliconAS-FBD-4XCXP6-2PE8
Szybka kamera CMOSMikrotronEoSens 3CXP
Mikroskop odwróconyOlympusIX73P2F-1-2
Magnesy neodymoweMagnes LGND 10x10x12tWymiar: 10 mm i razy; 10 mm & czasy; 12 mm; potrzebne dwa Soczewka
obiektywuOlympusUPLXAPO100XOOlej, NA 1.45
Nanopozycjoner soczewek obiektywowychMad City LabsNano-F100S
silnikAUTONICSA3K-S545WDo obracania magnesów
Dioda superluminescencyjnaQPHOTONICSQSDM-680-2680 nm
Software
LabVIEWNational Instrumentsv20.0f1
MATLABMathWorksv2021a
nić 10724815001 Krokowiec obrotowy

Bibliografia

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25(2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301(2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712(2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885(2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639(2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083(2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348(2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335(2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302(2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697(2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115(2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397(2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114(2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920(2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271(2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152(2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028(2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7(2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Siła pojedynczej cząsteczkispinki DNAkompleksy SNAREśledzenie kulekkalibracja siłybiałka mechanosensytywneobrazowanie wysokiej prędkościrozplatanie DNA
Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.