Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.
Artykuł metodologiczny
Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.
Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich warstw grasicy i dokumentowanie zdarzeń istotnych dla rozwoju tymocytów. Aby śledzić migrację pojedynczych komórek w skupiskach tymocytów, tworzymy chimery noworodkowe, w których mniej niż jeden procent tymocytów pochodzi od dawcy transgenicznego pod kątem powszechnie ekspresowanego białka fluorescencyjnego. W celu wytworzenia tych częściowych chimer hematopoetycznych, noworodkowe biorniki otrzymują wstrzyknięcia szpiku kostnego w wieku od 3 do 7 dni. Po 4-6 tygodniach mysz jest uśmiercana, a grasica zostaje starannie wypreparowana i przecięta na pół w sposób zachowujący architekturę tkanki przeznaczonej do obrazowania. Grasica zostaje przyklejona do szkiełka nakrywki w celu przygotowania do obrazowania ex vivo za pomocą TPM. Podczas obrazowania grasicę utrzymuje się w pożywce DMEM bez czerwieni fenolowej, nasyconej 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla i ogrzanej do 37°C. Stosując to podejście, możemy badać zdarzenia niezbędne do wytworzenia zróżnicowanego repertuaru limfocytów T.
Transfer adopcyjny
Wstrzyknij noworodkom 50-100ul szpiku kostnego za pomocą strzykawki insulinowej 2-4 razy w ciągu pierwszych 3-7 dni życia, zachowując końcowy stosunek dawcy do biorcy 1:1. Wybierz miejsce wstrzyknięcia poniżej mostka i klatki piersiowej, lecz powyżej jelit i żołądka. Wprowadź igłę na taką głębokość, aby przebić otrzewną, uważając, by nie przebić przepony. Często zdarza się, że część szpiku kostnego zostaje utracona podczas wstrzykiwania. Można zmniejszyć te straty, rozluźniając chwyt pupila podczas iniekcji, aby umożliwić rozciągnięcie skóry, a następnie powoli wyjmując igłę.
Disekcja grasicy
Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej i odetnij lub oderwij skórę, aby odsłonić klatkę piersiową. Chwyć mostek i przetnij otrzewną oraz przeponę. Przetnij boki klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Grudmorucz znajduje się nad sercem. Aby zachować strukturę grasicy, podczas jej preparowania przytrzymuj otaczające tkanki. Płucz grasicę roztworem PBS, aby zapobiec jej wysychaniu podczas sekcji. Delikatnie usuń nadmiar tkanki z powierzchni torebki grasicy i przedziel oba płaty.
Przygotowanie tkanki do obrazowania
Użyj weterynaryjnego kleju tkankowego, aby przykleić grasicę do kwadratowego szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety automatycznej nanieś ułamek mikrolitra kleju. Rozprowadź klej na powierzchni odpowiadającej w przybliżeniu długości i szerokości grasicy. Unieruchom grasicę przy szkiełku nakrywkowym i przesuń ją na odpowiednią pozycję.
Obrazowanie dwufotonowe
Tkanka jest zanurzona w DMEM bez czerwieni fenolowej, który jest napowietrzony mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla oraz podgrzany do 37°C. Wzbudzenie dwufotonowe osiągnięto za pomocą lasera Spectra-Physics MaiTai nastrojonego na 900nm, a światło emisji CFP, GFP, YFP oraz Texas Red oddzielano za pomocą luster dichroicznych 495, 515, 560 i zbierano za pomocą detektorów PMT.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Obrazowanie dwufotonowe w grasicy pozwala na badanie w żywych, nienaruszonych organach interakcji i migracji, które leżą u podstaw procesów selekcji wewnątrz grasicy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Dziękujemy Mattowi Paulowi i Jimmy'emu Wu za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie