Tutaj prezentujemy protokół oferujący szybkie, łatwe i niezawodne alternatywy pobierania krwi dla modelu szczurzego. Opisujemy trzy różne metody pobierania krwi w zależności od kontekstu: nakłucie żyły ogonowej w znieczuleniu lub na przytomnym zwierzęciu oraz nakłucie żyły grzbietowej prącia w znieczuleniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej i żyły prącia do pobierania krwi w modelu szczurzym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Próbki krwi są wymagane w większości eksperymentalnych projektów zwierzęcych do oceny różnych parametrów hematologicznych. W pracy przedstawiono dwie procedury pobierania krwi u szczurów: boczne nakłucie żyły ogonowej i nakłucie żyły grzbietowej prącia, które mają znaczące zalety w porównaniu z innymi wcześniej opisanymi technikami. Badanie to pokazuje, że te dwie procedury pozwalają na szybkie pobieranie próbek (poniżej 10 minut) i dają wystarczającą objętość krwi dla większości testów (202 μl ± 67,7 μl). Nakłucie żyły grzbietowej prącia musi być wykonane w znieczuleniu, podczas gdy nakłucie bocznej żyły ogonowej można wykonać u przytomnego, skrępowanego zwierzęcia.
Naprzemienne stosowanie tych dwóch technik umożliwia pobieranie krwi w każdej sytuacji. Chociaż zawsze zaleca się, aby operator był wspomagany podczas zabiegu w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt, techniki te wymagają tylko jednego operatora, w przeciwieństwie do większości metod pobierania krwi, które wymagają dwóch. Ponadto, podczas gdy te wcześniej opisane metody (np. kij szyjny, pobranie krwi z żyły podobojczykowej) wymagają intensywnego wcześniejszego treningu, aby uniknąć uszkodzenia lub śmierci zwierzęcia, nakłucie żyły ogonowej i żyły grzbietowej prącia rzadko jest śmiertelne. Z tych wszystkich powodów i w zależności od kontekstu (np. w przypadku badań obejmujących samce szczurów, w okresie okołooperacyjnym lub bezpośrednio po operacji, w przypadku zwierząt z cienkimi żyłami ogonowymi), obie techniki mogą być stosowane naprzemiennie, aby umożliwić wielokrotne pobieranie krwi.
Wprowadzenie
Pobieranie próbek krwi jest niezbędne do większości badań na zwierzętach, zarówno in vivo, jak i in vitro. U szczurów, ponieważ częstotliwość i ilość pobierania krwi może być znacząca, pomocne jest posiadanie różnych alternatyw pobierania. W poprzednich badaniach opisano różne metody.
Najczęściej używanymi technikami są nakłuwanie żył ogonowych i pobieranie krwi z żyły odpiszczelowej. Pobieranie próbek z żył ogonowych jest odpowiednie dla wszystkich szczepów szczurów. Przy odpowiednim treningu procedura jest prosta do wykonania i powoduje minimalny stres u zwierzęcia1. Podobnie pobranie krwi z żyły odpiszczelowej, pod warunkiem, że zostanie wykonane prawidłowo, jest również szybką i prostą metodą pobrania. Żadna z metod nie wymaga znieczulenia i obie pozwalają na wielokrotne pobieranie niewielkich ilości krwi. Jednak nakłucie żyły odpiszczelowej zwykle powoduje mniejszą objętość krwi1 i wymaga obecności dwóch osób, aby pozostawić jedną tylną kończynę odsłoniętą do nakłucia2.
Jeśli konieczne jest pobranie dużej ilości krwi od jednego zwierzęcia, można zastosować nakłucie serca lub nakłucie żyły głównej (od szczura z nakłuciem serca można pobrać do 10 ml krwi (od szczura z nakłuciem serca można pobrać do 10 ml krwi2). Techniki te wymagają znieczulenia i są zabiegami terminalnymi. Zwierzę musi zostać poddane eutanazji po zastosowaniu którejkolwiek z tych dwóch technik2. Sztyft szyjny jest alternatywą, którą można zastosować, jeśli konieczne jest pobranie dużych ilości krwi w badaniu, które nie osiągnęło jeszcze punktu końcowego. Jednak technika ta wymaga również znacznych umiejętności technicznych, aby uniknąć szkód dla zwierzęcia; W związku z tym jego użycie powinno być ograniczone3.
Inne techniki, takie jak pobieranie krwi z żyły podobojczykowej, nie wymagają stosowania środków znieczulających przed pobraniem krwi i pozwalają na wielokrotne pobieranie próbek małych objętości krwi. Jednak w przypadku tej techniki wymagane jest powściągliwe obchodzenie się z igłą i odpowiednie nacięcie igły. Niewłaściwa operacja może skutkować bólem zwierząt, a nawet śmiertelnością, a szkolenie w tej metodzie może być wybredne4.
Inne anegdotyczne procedury obejmują nakłucie oczodołu i nakłucie żyły podjęzykowej, które wymagają znieczulenia i nie są zalecane ani powszechnie stosowane. Chociaż wcześniejsze badania wykazały szybsze pobieranie krwi przez nakłucie oczodołu niż przez nakłucie żyły ogonowej, stwierdzono, że nakłucie oczodołu w znieczuleniu dietylowo-eterowym było gorzej tolerowane niż ta druga metoda (na podstawie wyników wzbudzenia zwierząt i produkcji moczu)5. Co więcej, na tę metodę duży wpływ mają umiejętności osoby, która wykonuje zabieg i jest wykonywana głównie przez doświadczonych weterynarzy. Dla porównania, nakłucie żyły podjęzykowej jest mniej uciążliwe i jest zalecane do wielokrotnego pobierania krwi6. Jednak ta technika ma poważne skutki uboczne, takie jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, co może prowadzić do śmierci zwierzęcia7.
To badanie opisuje dwie metody stosowane w naszym laboratorium do wielokrotnego pobierania próbek krwi. Nakłucie żyły ogonowej można wykonać u przytomnego zwierzęcia, a uszkodzenie tkanek i działania niepożądane są minimalne. Modyfikacja tej techniki w tym badaniu obejmuje stabilizację ogona za pomocą palca wskazującego i środkowego, co pozwala jednemu operatorowi na wykonanie pobrania krwi. Nakłucie żyły grzbietowej prącia zostało już opisane dla prostych wstrzyknięć dożylnych. Technika ta jest wykonywana w znieczuleniu i pozwala na uzyskanie wiarygodnego źródła krwi w przypadku trudności z innymi metodami (np. w bezpośrednim okresie pooperacyjnym, z małym zwierzęciem, podczas wykonywania okołooperacyjnego pobierania krwi w znieczuleniu). Podobnie jak w przypadku pobierania próbek z żył ogonowych, uraz w miejscu nakłucia będzie miał niewielki ogólny wpływ na zwierzę w porównaniu z technikami wymienionymi powyżej8. Celem tego artykułu jest zaoferowanie niedoświadczonym badaczom prostych i wiarygodnych alternatyw pobierania próbek krwi w zależności od kontekstu (np. dla procedur wykonywanych w znieczuleniu, dla badań z udziałem samców szczurów, dla zwierząt z cienkimi żyłami ogonowymi).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury przeprowadzono na 3-miesięcznych samcach szczurów linii Lewis o masie ciała 300-400 g każdy. W badaniu wzięło udział łącznie 24 zwierzęta, podzielonych na trzy warunki nakłucia: 12 szczurów poddano nakłuciu żyły ogonowej bez znieczulenia (grupa TV bez znieczulenia), a pozostałe 12 szczurów znieczulono w celu wykonania zarówno nakłucia żyły ogonowej (grupa TV ze znieczuleniem), jak i nakłucia żyły prącia (grupa PV ze znieczuleniem). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Wszystkie zwierzęta zostały uśpione na koniec badania (po miesięcznej obserwacji) poprzez przedawkowanie dwutlenku węgla. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Wytyczne ogólne
- Zgodnie z wytycznymi IACUC należy upewnić się, że maksymalna objętość pobranej krwi nie przekracza 10% całkowitej objętości krwi co 2 tygodnie.9Na przykład szczur o masie 300 g powinien mieć całkowitą objętość krwi wynoszącą około 19,2 ml. W przypadku protokołu wymagającego czterech pobrań krwi w samym pierwszym tygodniu (dzień 0, dzień 1, dzień 3, dzień 7), należy ograniczyć pobieranie do maksymalnie 250 μL krwi na próbkę.
- W przypadku procedur wykonywanych w znieczuleniu, podać izofluran poprzez parownik precyzyjny do znieczulenia zwierzęcia. Indukcję znieczulenia przeprowadzić w komorze, stosując izofluran w stężeniu 3%–5% przez 5 min, a następnie utrzymać znieczulenie w trakcie procedury, podając izofluran w stężeniu 1%–3% za pomocą maski nosowej. Poziom izofluranu regulować na podstawie ciągłego monitorowania częstości oddechów. Przed rozpoczęciem procedury zweryfikować stopień sedacji za pomocą testu ucisku palca u nogi.
- Nie należy pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru podczas procedury ani do momentu, gdy odzyska ono wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję grzbietową.
- Po pobraniu krwi należy monitorować zwierzę do czasu pełnego powrotu do sprawności przed umieszczeniem go w klatce; nie należy łączyć go z innymi zwierzętami do momentu pełnego wyzdrowienia.
UWAGA: Zgodnie z ustaleniami z służbami weterynaryjnymi, po nakłuciu żyły ogonowej lub żyły prącia nie było konieczne podawanie leków przeciwbólowych.
2. Pobranie krwi z żyły prącia
- Przygotowanie
- Przygotować następujący sprzęt: sterylną gazę, rękawiczki, gaziki nasączone alkoholem, mikrokapiilarną probówkę do pobierania krwi z EDTA (fioletowy korek) oraz strzykawkę insulinową 30 G (30 U lub 50 U).
- Wyjąć szczura z klatki i umieścić go w komorze do indukcji izofluranem via precyzyjny parownik (dawka: 3%-5%). Po oszołomieniu zwierzęcia przenieść je na stół zabiegowy i położyć na plecach z nosem umieszczonym w stożku nosowym w celu utrzymania znieczulenia. Monitorować częstotliwość oddechów i odpowiednio dostosować poziom izofluranu (dawka podtrzymująca: 1%-3%). Przed rozpoczęciem procedury sprawdzić za pomocą ucisku palca u nogi, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone.
- Pobieranie krwi
- Kilkukrotnie przesunąć tłok strzykawki w przód i w tył, aby ułatwić aspirację. Stworzyć podciśnienie w strzykawce, odciągając tłok i pobierając kilka mikrolitrów powietrza.
- Pomocą niedominującej ręki odsunąć napierstek z końca prącia i utrzymać żołądź między palcem wskazującym a kciukiem, delikatnie pociągając. Żyła grzbietowa prącia będzie widoczna jako powierzchowny niebieski sznur. Patrz Rycina 1 i Rycina 2.
- Wprowadzić strzykawkę insulinową do żyły pod kątem 35°, kierując otworem igły do góry. Po wprowadzeniu igły do żyły krew zacznie wpływać do strzykawki.
- Powoli i jednostajnie odciągać tłok strzykawki, aby pobrać pożądaną objętość.
UWAGA: Nie odciągać tłoka zbyt szybko, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się żyły i zatrzymanie przepływu krwi. - Jeśli przepływ krwi zmaleje, lekko obrócić igłę zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
- Wyjąć strzykawkę. W miejscu nakłucia pojawi się kropla krwi, której aspiracja pozwoli na pobranie kilku dodatkowych mikrolitrów krwi w przypadku procedury niesterylnej.
- Jeśli pierwsze nakłucie nie powiedzie się, wprowadzić igłę ponownie w bardziej proksymalnym odcinku żyły.
UWAGA: W przeciwieństwie do pobierania krwi z żyły ogonowej, wielokrotne nakłuwanie żyły grzbietowej prącia zazwyczaj nie przynosi sukcesu. - Przyłożyć lekki ucisk do miejsca nakłucia, aby zatamować krwawienie, a następnie przetrzeć obszar nowym gazikiem nasączonym alkoholem.
- Przywrócić prącie do pozycji neutralnej.
- Wyłączyć podawanie izofluranu i monitorować szczura aż do pełnego wybudzenia. Wrócić szczura do klatki.
3. Nakłucie żyły ogonowej
- Przygotowanie
- Przygotować następujący sprzęt: plastikowy uchwyt ograniczający ruchy, sterylną gazę, rękawiczki, chusteczki nasączone alkoholem, mikrokapilarną probówkę do pobierania krwi z EDTA (fioletowy korek) oraz strzykawkę insulinową 28 G 1/2 (30 U lub 50 U).
- Wyjąć szczura z klatki i szybko unieruchomić go w plastikowym stożku ograniczającym. Zamknąć szeroki koniec stożka wokół nasady ogona. Upewnić się, że zwierzę czuje się komfortowo i że oddychanie nie jest utrudnione przez cały czas trwania procedury.
- Zanurzyć ogon w ciepłej wodzie (37 °C) na około 1 min, aby rozszerzyć żyłę. Osuszyć ogon ręcznikiem papierowym. Położyć zwierzę (w ograniczniku) brzuszkiem do dołu, tak aby ogon spoczywał na podkładce grzewczej.
- Wybrać prawą lub lewą żyłę ogonową (niebieska linia) do pobrania próbki, obracając całe zwierzę w jedną lub drugą stronę (zapobiega to skręcaniu ogona). Do nakłucia naczynia krwionośnego należy wykorzystać końcową jedną trzecią ogona, ponieważ w tej strefie naczynia stają się bardziej powierzchowne. Tętnica znajduje się brzusznie, a dwie żyły bocznie10.
- Przetrzeć miejsce nakłucia na ogonie chusteczką z 70% etanolem.
- Położyć ogon na krawędzi podkładki grzewczej, aby utworzyć kąt w końcowej jednej trzeciej ogona. Powoduje to wyniesienie żyły na powierzchnię i stwarza więcej miejsca do pobrania próbki.
- Pobieranie krwi
- Przesunąć tłok strzykawki kilka razy w przód i w tył, aby ułatwić odsysanie. Stworzyć w strzykawce podciśnienie, odciągając tłok w celu usunięcia kilku mikrolitrów powietrza.
- Pomocą palca wskazującego i środkowego niedominującej ręki unieruchomić ogon płasko na podkładce grzewczej. Palec środkowy umieścić proksymalnie, a palec wskazujący dystalnie, tak aby miejsce nakłucia znajdowało się między tymi dwoma palcami. Przyłożyć większy nacisk palcem środkowym niż wskazującym, aby ustabilizować ogon, zamykając naczynie tylko proksymalnie i umożliwiając gromadzenie się krwi. Patrz Rysunek 1 oraz Rysunek 3.
- Kierując otworem igły do góry, wsunąć strzykawkę insulinową w stronę palca wskazującego, aż zostanie wprowadzona do żyły (tworzy to kąt 35° między igłą a ogonem). Po wprowadzeniu igły do żyły krew zacznie wpływać do strzykawki. W tym momencie zwolnić nacisk palca wskazującego i środkowego, aby upewnić się, że przepływ krwi nie jest zablokowany.
- Powoli i jednostajnie odciągać tłok strzykawki, aby zebrać pożądaną objętość.
UWAGA: Nie odciągać tłoka zbyt szybko; spowoduje to zapadnięcie się żyły i zatrzymanie przepływu krwi. - Jeśli przepływ krwi zmaleje, lekko obrócić igłę w dowolnym kierunku.
- Wyjąć strzykawkę z ogona. W miejscu nakłucia powstanie kropla krwi. Aspiracja tej krwi pozwala na zebranie kilku dodatkowych mikrolitrów krwi w przypadku procedury niesterylnej.
- Jeśli pierwsze nakłucie nie powiedzie się, wprowadzić igłę ponownie bardziej proksymalnie w żyłę.
UWAGA: Żyła staje się stopniowo głębsza w miarę zbliżania się do nasady ogona. Jeśli w strzykawce nie pojawia się krew, zwiększyć kąt między strzykawką a ogonem lub obrócić igłę. - Ucisnąć miejsce nakłucia, aby zatamować krwawienie, a następnie przetrzeć ten obszar nową chusteczką nasączoną alkoholem. Wyjąć szczura z plastikowego stożka i umieścić go z powrotem w klatce.
- Nakłucie żyły ogonowej w znieczuleniu
- Wykonać krok 2.1.1 oraz krok 2.1.2 w celu indukcji i podtrzymania znieczulenia.
- Wykonać kroki 3.1.3-3.2.7 w celu pobrania krwi; patrz Rysunek 1.
- Wykonać krok 2.2.10 w celu wybudzenia zwierzęcia.
Rycina 1: Schematy różnych metod nakłucia zastosowanych w tym protokole. (A) zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej u świadomego, unieruchomionego zwierzęcia; (B) zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej oraz nakłucie żyły prącia w znieczuleniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Sukces zdefiniowano jako pobranie co najmniej 100 µL krwi w czasie krótszym niż 10 min (od momentu nakłucia do zakończenia pobierania krwi), natomiast niepowodzenie zdefiniowano jako pobranie mniej niż 100 µL krwi lub czas pobrania wymaganej objętości krwi przekraczający 10 min. Dopuszczalna maksymalna objętość krwi na próbkę wynosiła 250 µL. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowego testu ANOVA dla porównań wielokrotnych oraz testu chi-kwadrat. Dane przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nakłucie żyły ogonowej jest skuteczną metodą pozyskiwania krwi od przytomnego szczura. Jednakże, gdy zwierzę jest pod narkozą, działanie izofluranu może prowadzić do skurczów naczyń krwionośnych i sprawić, że nakłucie żyły ogonowej będzie nieodpowiednie11. Jak wykazano w tym badaniu, alternatywą w tej sytuacji jest pobranie krwi z żyły prącia, co jest bardziej skuteczne i daje znacznie większą objętość krwi w krótszym czasie. Należy pamiętać, że w przypadku niepowodzenia z tą metodą za pierwszym r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Shriners Children's Boston (B. E. U., K.U., C.L.C.). L.C. jest finansowana przez "La Bourse des Gueules Cassées", "La Bourse Année Recherche" i "La Bourse de l'Amicale des Anciens Internes des Hôpitaux de Paris". Y.B. jest finansowana przez "La Bourse des Gueules Cassées". Y.B. i I.F.v.R. są finansowane przez Shriners Hospitals for Children (identyfikator stypendiów to odpowiednio #84308-BOS-22 #84302-BOS-21). Niniejszy materiał jest częściowo oparty na pracach wspieranych przez National Science Foundation w ramach grantu nr 1. EWG 1941543. Z wdzięcznością przyjmujemy częściowe wsparcie ze strony amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (R01EB028782, R56AI171958 i R01DK114506). Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 ml | 28 g ½ Strzykawki z insuliną | BD | 329424 | do nakłucia żyły ogonowej |
| 0,5 ml | 30 G x 5/16 Strzykawki insulinowe | BD | 320468 | do nakłucia żyły prącia |
| 250 L Probówki do pobierania krwi Microtainer z | BD | 365974 | |
| Curity | 6939 | ||
| Izofluran Maszyna do znieczulenia z automatycznym przepływem | Systemy EZ-190F | do nakłucia żyły prącia | |
| Izofluran, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | do nakłucia żyły prącia |
| Nosecone do anestezjologii | World Precision Instruments | EZ-112 | do nakłucia żyły prącia |
| Stożek do krępowania gryzoni | Aparat Harvard | ST2 52-95-86 | do nakłucia żyły ogonowej |
| Podgrzewany stół operacyjny dla małych zwierząt (regulowany) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Webcol Podkładki alkoholowe | Simply Medical | 5110 |
Bibliografia
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766(2015).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266(2007).
- Luzzi, M., et al. Collecting blood from rodents: A discussion by the Laboratory Animal Refinement and Enrichment Forum. Animal Technology and Welfare. 4 (2), 99-102 (2005).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: Comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory Animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
- Nightingale, C. H., Mouravieff, M. Reliable and simple method of intravenous injection into the laboratory rat. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 860-861 (1973).
- Blood collection: The rat. IACUC Guideline. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/guidelines%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Staszyk, C., Bohnet, W., Gasse, H., Hackbarth, H. Blood vessels of the rat tail: A histological re-examination with respect to blood vessel puncture methods. Laboratory Animals. 37 (2), 121-125 (2003).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), e21-e31 (2011).
- Hernaningsih, Y., Akualing, J. S. The effects of hemolysis on plasma prothrombin time and activated partial thromboplastin time tests using photo-optical method. Medicine. 96 (38), 7976(2017).
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Jardine, L., Clubb, S., Stewart, J. Assessment of haematological and clinical pathology effects of blood microsampling in suckling and weaned juvenile rats. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69 (3), 425-433 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
