Zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej i żyły prącia do pobierania krwi w modelu szczurzym

Pobieranie próbek krwi jest niezbędne do większości badań na zwierzętach, zarówno in vivo, jak i in vitro. U szczurów, ponieważ częstotliwość i ilość pobierania krwi może być znacząca, pomocne jest posiadanie różnych alternatyw pobierania. W poprzednich badaniach opisano różne metody.

Najczęściej używanymi technikami są nakłuwanie żył ogonowych i pobieranie krwi z żyły odpiszczelowej. Pobieranie próbek z żył ogonowych jest odpowiednie dla wszystkich szczepów szczurów. Przy odpowiednim treningu procedura jest prosta do wykonania i powoduje minimalny stres u zwierzęcia¹. Podobnie pobranie krwi z żyły odpiszczelowej, pod warunkiem, że zostanie wykonane prawidłowo, jest również szybką i prostą metodą pobrania. Żadna z metod nie wymaga znieczulenia i obie pozwalają na wielokrotne pobieranie niewielkich ilości krwi. Jednak nakłucie żyły odpiszczelowej zwykle powoduje mniejszą objętość krwi¹ i wymaga obecności dwóch osób, aby pozostawić jedną tylną kończynę odsłoniętą do nakłucia².

Jeśli konieczne jest pobranie dużej ilości krwi od jednego zwierzęcia, można zastosować nakłucie serca lub nakłucie żyły głównej (od szczura z nakłuciem serca można pobrać do 10 ml krwi (od szczura z nakłuciem serca można pobrać do 10 ml krwi²). Techniki te wymagają znieczulenia i są zabiegami terminalnymi. Zwierzę musi zostać poddane eutanazji po zastosowaniu którejkolwiek z tych dwóch technik². Sztyft szyjny jest alternatywą, którą można zastosować, jeśli konieczne jest pobranie dużych ilości krwi w badaniu, które nie osiągnęło jeszcze punktu końcowego. Jednak technika ta wymaga również znacznych umiejętności technicznych, aby uniknąć szkód dla zwierzęcia; W związku z tym jego użycie powinno być ograniczone³.

Inne techniki, takie jak pobieranie krwi z żyły podobojczykowej, nie wymagają stosowania środków znieczulających przed pobraniem krwi i pozwalają na wielokrotne pobieranie próbek małych objętości krwi. Jednak w przypadku tej techniki wymagane jest powściągliwe obchodzenie się z igłą i odpowiednie nacięcie igły. Niewłaściwa operacja może skutkować bólem zwierząt, a nawet śmiertelnością, a szkolenie w tej metodzie może być wybredne⁴.

Inne anegdotyczne procedury obejmują nakłucie oczodołu i nakłucie żyły podjęzykowej, które wymagają znieczulenia i nie są zalecane ani powszechnie stosowane. Chociaż wcześniejsze badania wykazały szybsze pobieranie krwi przez nakłucie oczodołu niż przez nakłucie żyły ogonowej, stwierdzono, że nakłucie oczodołu w znieczuleniu dietylowo-eterowym było gorzej tolerowane niż ta druga metoda (na podstawie wyników wzbudzenia zwierząt i produkcji moczu)⁵. Co więcej, na tę metodę duży wpływ mają umiejętności osoby, która wykonuje zabieg i jest wykonywana głównie przez doświadczonych weterynarzy. Dla porównania, nakłucie żyły podjęzykowej jest mniej uciążliwe i jest zalecane do wielokrotnego pobierania krwi⁶. Jednak ta technika ma poważne skutki uboczne, takie jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, co może prowadzić do śmierci zwierzęcia⁷.

To badanie opisuje dwie metody stosowane w naszym laboratorium do wielokrotnego pobierania próbek krwi. Nakłucie żyły ogonowej można wykonać u przytomnego zwierzęcia, a uszkodzenie tkanek i działania niepożądane są minimalne. Modyfikacja tej techniki w tym badaniu obejmuje stabilizację ogona za pomocą palca wskazującego i środkowego, co pozwala jednemu operatorowi na wykonanie pobrania krwi. Nakłucie żyły grzbietowej prącia zostało już opisane dla prostych wstrzyknięć dożylnych. Technika ta jest wykonywana w znieczuleniu i pozwala na uzyskanie wiarygodnego źródła krwi w przypadku trudności z innymi metodami (np. w bezpośrednim okresie pooperacyjnym, z małym zwierzęciem, podczas wykonywania okołooperacyjnego pobierania krwi w znieczuleniu). Podobnie jak w przypadku pobierania próbek z żył ogonowych, uraz w miejscu nakłucia będzie miał niewielki ogólny wpływ na zwierzę w porównaniu z technikami wymienionymi powyżej⁸. Celem tego artykułu jest zaoferowanie niedoświadczonym badaczom prostych i wiarygodnych alternatyw pobierania próbek krwi w zależności od kontekstu (np. dla procedur wykonywanych w znieczuleniu, dla badań z udziałem samców szczurów, dla zwierząt z cienkimi żyłami ogonowymi).

Procedury zostały przeprowadzone na 3-miesięcznych samcach szczurów Lewis, każdy o wadze 300-400 g. W sumie 24 zwierzęta zostały włączone do badania, z trzema warunkami nakłucia: 12 szczurów przeszło nakłucie żyły ogonowej bez znieczulenia (grupa TV bez znieczulenia), a kolejne 12 szczurów zostało znieczulonych w celu poddania się zarówno nakłuciu żyły ogonowej (grupa TV ze znieczuleniem), jak i nakłuciu żyły prącia (grupa PV ze znieczuleniem). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC). Wszystkie zwierzęta zostały poddane eutanazji pod koniec badania (po 1 miesiącu obserwacji) z powodu przedawkowania dwutlenku węgla. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Ogólne wytyczne

1. Zgodnie z wytycznymi IACUC upewnij się, że maksymalna pobrana objętość krwi nie przekracza 10% całkowitej objętości krwi co 2 tygodnie⁹. Na przykład szczur o wadze 300 g powinien mieć całkowitą objętość krwi około 19,2 ml. W przypadku protokołu wymagającego czterech pobrań krwi tylko w pierwszym tygodniu (dzień 0, dzień 1, dzień 3, dzień 7) należy ograniczyć pobieranie do maksymalnie 250 μl krwi na próbkę.
2. W przypadku zabiegów wykonywanych w znieczuleniu należy podać izofluran za pomocą precyzyjnego waporyzatora w celu znieczulenia zwierzęcia. Wywołać znieczulenie w komorze z dawką 3%-5% izofluranu przez 5 minut i kontynuować stosowanie dawki 1%-3% izofluranu przez stożek nosowy podczas zabiegu. Stężenie izofluranu należy dostosować w oparciu o ciągłe monitorowanie częstości oddechów. Przed rozpoczęciem zabiegu sprawdź, czy sedacja jest wystarczająca przez uszczypnięcie palca u nogi.
3. Nie należy pozostawiać zwierzęcia bez opieki podczas zabiegu lub do momentu, gdy odzyska ono wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
4. Po pobraniu krwi należy obserwować zwierzę aż do pełnego wyzdrowienia przed powrotem do klatki i nie wprowadzać go do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
   UWAGA: W porozumieniu ze służbami weterynaryjnymi, po nakłuciu żyły ogonowej lub prącia nie było konieczne stosowanie leków przeciwbólowych po zabiegu.

2. Pobranie krwi z żyły prącia

1. preparat
   1. Przygotuj następujący sprzęt: sterylną gazę, rękawiczki, chusteczki nasączone alkoholem, probówkę EDTA do pobierania krwi mikrokapilarnej (fioletowa nakrętka) i strzykawkę insulinową 30 G (30 J lub 50 U).
   2. Wyjmij szczura z klatki i umieść go w komorze do indukcji izofluranem za pomocą precyzyjnego waporyzatora (dawka: 3%-5%). Gdy zwierzę zostanie uspokojone, przenieś je na stół zabiegowy i połóż zwierzę na plecach z nosem umieszczonym w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie. Monitorować częstość oddechów i odpowiednio dostosować poziom izofluranu (dawka podtrzymująca: 1%-3%). Przed rozpoczęciem zabiegu sprawdź, czy zwierzę jest wystarczająco uspokojone przez uszczypnięcie palca u nogi.
2. Pobieranie próbek krwi
   1. Kilkakrotnie przesunąć tłok strzykawki w przód i w tył, aby ułatwić odjmowanie. Wytworzyć podciśnienie w strzykawce, pociągając za tłok, aby usunąć kilka mikrolitrów.
   2. Za pomocą ręki niedominującej odsuń napletek od końca penisa i przytrzymaj żołądź między palcem wskazującym a kciukiem, delikatnie pociągając. Żyła grzbietowa prącia pojawi się jako powierzchowny niebieski sznur. Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2.
   3. Ucho igły skierowane do góry wprowadzić strzykawkę z insuliną do żyły pod kątem 35°. Gdy igła wejdzie do żyły, krew zacznie napływać do strzykawki.
   4. Powoli wyjmować tłok strzykawki z powolną i stałą szybkością, aby zebrać żądaną objętość.
      UWAGA: Nie należy wyjmować tłoka zbyt szybko, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się żyły i zatrzymanie przepływu krwi.
   5. Jeśli przepływ krwi zmniejszy się, obróć igłę lekko zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
   6. Wyjąć strzykawkę. W miejscu wkłucia utworzy się kropla krwi, której aspiracja pozwoli na pobranie kilku dodatkowych mikrolitrów krwi w przypadku zabiegu niesterylnego.
   7. Jeśli pierwsze nakłucie nie powiedzie się, ponownie włóż igłę bardziej proksymalnie do żyły.
      UWAGA: W przeciwieństwie do pobierania próbek z żył ogonowych, iteracyjne nakłucie żyły grzbietowej prącia jest zwykle nieudane.
   8. Lekko dociśnij miejsce wkłucia, aby zatrzymać krwawienie, a następnie przetrzyj obszar nowym wacikiem nasączonym alkoholem.
   9. Umieść penisa z powrotem w neutralnej pozycji.
   10. Wyłącz izofluran i monitoruj szczura aż do całkowitego wyzdrowienia. Wróć szczura do klatki.

3. Nakłucie żyły ogonowej

1. preparat
   1. Przygotuj następujący sprzęt: plastikowy uchwyt krępujący, sterylną gazę, rękawiczki, chusteczki nasączone alkoholem, probówkę EDTA do pobierania krwi mikrokapilarnej (fioletowa nasadka) oraz strzykawkę insulinową 28 G 1/2 (30 J lub 50 U).
   2. Wyjmij szczura z klatki i szybko zabezpiecz go w plastikowym stożku ograniczającym. Zamknij duży koniec stożka wokół podstawy ogona. Upewnij się, że zwierzę czuje się komfortowo, a oddychanie jest nieskrępowane przez cały czas trwania zabiegu.
   3. Zanurz ogon w ciepłej wodzie (37 °C) na około 1 minutę, aby rozszerzyć żyłę. Osusz ogon ręcznikiem papierowym. Ułóż zwierzę (w unieruchomieniu) twarzą w dół, z ogonem leżącym na poduszce grzewczej.
   4. Wybierz prawą lub lewą żyłę ogonową (niebieska linia) do pobrania próbki, obracając całe zwierzę w dowolną stronę (pozwala to uniknąć skręcania ogona). Użyj końcowej trzeciej części ogona do nakłuwania naczyń krwionośnych, ponieważ naczynia stają się bardziej powierzchowne w tej strefie. Tętnica jest brzuszna, a dwie żyły są boczne¹⁰.
   5. Przetrzyj ogon chusteczkami z 70% etanolu w miejscu nakłucia.
   6. Umieść ogon na krawędzi poduszki grzewczej, aby utworzyć kąt w końcowej jednej trzeciej ogona. W ten sposób żyła wydostaje się na powierzchnię i tworzy więcej miejsca do pobrania próbki.
2. Pobieranie próbek krwi
   1. Kilkakrotnie przesunąć tłok strzykawki w przód i w tył, aby ułatwić odjmowanie. Wytworzyć podciśnienie w strzykawce, pociągając za tłok, aby usunąć kilka mikrolitrów.
   2. Za pomocą niedominującego palca wskazującego i środkowego przymocuj ogon płasko do poduszki grzewczej. Ułóż środkowy palec proksymalnie, a palec wskazujący dystalnie, w miejscu nakłucia między tymi dwoma palcami. Wywieraj większy nacisk na środkowy palec niż na palec wskazujący, aby zabezpieczyć ogon, zamykając naczynie tylko proksymalnie i pozwalając na gromadzenie się krwi. Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 3.
   3. Trzymając ucho igły skierowane do góry, wsunąć strzykawkę z insuliną w palec wskazujący, aż zostanie włożona do żyły (w ten sposób utworzy się kąt 35° między igłą a ogonkiem). Gdy igła wejdzie do żyły, krew zacznie napływać do strzykawki. W tym momencie zwolnij nacisk na palec wskazujący i środkowy, aby upewnić się, że przepływ krwi nie jest zablokowany.
   4. Powoli wyjmować tłok strzykawki ze stałą prędkością, aby zebrać żądaną objętość.
      UWAGA: Nie należy wyjmować tłoka zbyt szybko; Spowoduje to zapadnięcie się żyły i zatrzymanie przepływu krwi.
   5. Jeśli przepływ krwi zmniejszy się, obróć igłę lekko w dowolnym kierunku.
   6. Wyjąć strzykawkę z ogona. W miejscu nakłucia ogona utworzy się kropla krwi. Aspiracja tej krwi pozwala na pobranie kilku mikrolitrów krwi więcej w przypadku zabiegu niesterylnego.
   7. Jeśli pierwsze nakłucie nie powiedzie się, ponownie włóż igłę bardziej proksymalnie do żyły.
      UWAGA: Żyła staje się coraz głębsza w miarę zbliżania się do podstawy ogona. Jeśli w strzykawce nie ma przepływu krwi, należy zwiększyć kąt między strzykawką a ogonkiem lub obrócić igłę.
   8. Uciskaj miejsce wkłucia, aby zatrzymać krwawienie, i przetrzyj obszar nowym wacikiem nasączonym alkoholem. Usuń szczura z plastikowego stożka i włóż go z powrotem do klatki.
3. Nakłucie żyły ogonowej w znieczuleniu
   1. Wykonaj kroki 2.1.1 i 2.1.2 w celu wywołania i utrzymania znieczulenia.
   2. Wykonaj kroki 3.1.3-3.2.7 w celu pobrania krwi; zobacz Rysunek 1.
   3. Wykonaj krok 2.2.10 w celu odzyskania zwierząt.

Rysunek 1: Schematy różnych metod nakłuwania w tym protokole. (A) Zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej u przytomnego, skrępowanego zwierzęcia; (B) zmodyfikowane nakłucie żyły ogonowej i nakłucie żyły prącia w znieczuleniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Powodzenie zostało zdefiniowane jako pobranie krwi dające co najmniej 100 μL krwi w czasie poniżej 10 minut (od momentu nakłucia do końca pobrania krwi), a niepowodzenie zostało zdefiniowane jako pobranie krwi dające mniej niż 100 μL krwi lub trwające więcej niż 10 minut pobranie wymaganej objętości krwi. Dopuszczalna była maksymalna ilość 250 μl krwi na próbkę. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowego testu ANOVA do wielokrotnych porównań oraz testu chi-kwadrat. Dane przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe, a jako granicę do wyznaczenia istotności statystycznej przyjęto p < 0,05.

Porównanie wskaźników sukcesu wykazało podobne wyniki dla nakłucia żyły ogonowej u przytomnych szczurów (92%) i nakłucia żyły prącia w znieczuleniu (83%)(p = 0,0543), jak pokazano w Rysunek 4. Co ciekawe, pod narkozą żyła ogonowa stała się bardzo zawodna, a nakłucie żyły ogonowej w znieczuleniu miało tylko 25% wskaźnik powodzenia w tym badaniu, prawdopodobnie z powodu ścieńczenia żyły. W przypadku znieczulenia nakłucie żyły prącia było bardziej skuteczne niż nakłucie żyły ogonowej w celu pobrania próbki (p < 0,0001).

Porównaliśmy objętości pobranej krwi i czas trwania zabiegu pomiędzy nakłuciem żyły ogonowej i grzbietowej żyły prącia wykonanym na szczurach w znieczuleniu oraz nakłuciem żyły ogonowej wykonanym na przytomnych szczurach. Rysunek 5 pokazuje, że nakłucie żyły ogonowej bez znieczulenia (217,5 μL ± 69,04 μL) oraz żyła prącia w znieczuleniu (185,8 μL ± 66,4 μL) dały porównywalne ilości krwi (p = 0,4966), a te objętości krwi były znacznie większe niż objętość pobrana po nakłuciu żyły ogonowej w znieczuleniu (54,4 μL ± 68,8 μL) (p < 0,0001).

Czas trwania zabiegu był podobny w grupie nakłucia żyły prącia w znieczuleniu (315,2 s ± 160 s) i nakłuciu żyły ogonowej bez znieczulenia (262,5 s ± 171 s) (p = 0,6632). Rysunek 6 pokazuje, że próbkowanie zostało wykonane w czasie krótszym niż 6 minut w obu grupach, podczas gdy nakłucie żyły ogonowej w znieczuleniu trwało ponad 8 minut (500,8 s ± 196 s) z powodu wielokrotnych niepowodzeń (p < 0,0382).

Rysunek 2: Metoda nakłucia żyły grzbietowej prącia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zmodyfikowana metoda nakłuwania żył ogonowych. Zwróć uwagę, że ogon jest przytrzymany w dół, a miejsce nakłucia znajduje się między palcem wskazującym a środkowym. Strzykawka powinna spoczywać i przesuwać się po palcu wskazującym, aby utrzymać stabilny kąt nakłucia. Użycie ręki niedominującej pozwala na stabilizację ogona na przytomnym zwierzęciu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wskaźniki sukcesu z nakłuciem żyły ogonowej w znieczuleniu, nakłuciem żyły prącia w znieczuleniu i nakłuciem żyły ogonowej bez znieczulenia. **** p < 0,0001 z testem chi-kwadrat. Skróty: TV = żyła ogonowa; PV = żyła prącia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Porównanie objętości krwi (w μL) uzyskanych w trzech grupach. ***p < 0,001; p < 0,0001 z analizą ANOVA dla wielokrotnych porównań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Porównanie czasu pobierania próbek (w sekundach), zdefiniowanego jako czas od momentu nakłucia do zakończenia pobierania krwi, w trzech grupach. Niepowodzenie definiowano jako czas pobierania krwi trwający dłużej niż 600 s (10 min). *p < 0,05; **p < 0,01 z analizą ANOVA dla wielokrotnych porównań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.