Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastycznej do badania przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów

DOI:

10.3791/65613

⸱

21 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie dostarcza protokołu do wykorzystania indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów do badania przebudowy kości pod wpływem siły ortodontycznej i opisuje metody analizy przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów, rzucając tym samym światło na biologię mechaniczną szkieletu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość wyrostka zębodołowego, o wysokim współczynniku rotacji, jest najaktywniej przebudowującą się kością w ciele. Ortodontyczny ruch zębów (OTM) jest powszechnym sztucznym procesem przebudowy kości wyrostka zębodołowego w odpowiedzi na siłę mechaniczną, ale mechanizm leżący u jego podstaw pozostaje nieuchwytny. Wcześniejsze badania nie były w stanie ujawnić dokładnego mechanizmu przebudowy kości w dowolnym czasie i przestrzeni ze względu na ograniczenia związane z modelami zwierzęcymi. Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest ważny w metabolizmie kości, ale jego rola w osteoblastach podczas OTM jest niejasna. Aby dostarczyć dowodów in vivo, że STAT3 uczestniczy w OTM w określonych punktach czasowych, aw szczególności w komórkach podczas OTM, wygenerowaliśmy indukowany tamoksyfenem model myszy Stat3 z nokautem specyficzny dla linii osteoblastów, zastosowaliśmy siłę ortodontyczną i przeanalizowaliśmy fenotyp kości wyrostka zębodołowego.

Mikrotomografia komputerowa (Micro-CT) i mikroskopia stereoskopowa były używane do uzyskania dostępu do odległości OTM. W analizie histologicznej wybrano obszar znajdujący się w obrębie trzech korzeni pierwszego zęba trzonowego (M1) w przekroju poprzecznym kości szczęki jako obszar zainteresowania (ROI) w celu oceny aktywności metabolicznej osteoblastów i osteoklastów, wskazując wpływ siły ortodontycznej na kość wyrostka zębodołowego. Krótko mówiąc, przedstawiamy protokół wykorzystania indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów do badania przebudowy kości pod wpływem siły ortodontycznej i opisujemy metody analizy przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas OTM, rzucając w ten sposób nowe światło na biologię mechaniczną szkieletu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie wiadomo, że kość jest nieustannie rekonstruowana przez całe życie, w odpowiedzi na siły mechaniczne zgodnie z prawem Wolffa1,2. Odpowiednia stymulacja mechaniczna, taka jak grawitacja i codzienne ćwiczenia, utrzymuje masę i siłę kości oraz zapobiega utracie masy kostnej poprzez stymulację zarówno osteoblastów, jak i osteoklastów. Osteoklasty, odpowiedzialne za resorpcję kości3,4,5,6,7, oraz osteoblasty, odpowiedzialne za tworzenie kości8,9,10, utrzymują homeostazę kości i wspólnie funkcjonują w biologicznym procesie przebudowy kości. W przeciwieństwie do tego, przy braku bodźców obciążających, jak u astronautów w długotrwałej mikrograwitacji, kości cierpią z powodu 10% utraty gęstości mineralnej kości, zwiększając w ten sposób ryzyko osteoporozy11,12. Ponadto nieinwazyjne i wygodne terapie mechaniczne, w tym ortodoncja i osteogeneza dystrakcyjna, pojawiły się jako metody leczenia chorób kości13,14. Wszystko to wykazało, że siła mechaniczna odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu jakości i ilości kości. Ostatnie badania generalnie analizowały przebudowę kości w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne przy użyciu czasochłonnych modeli, takich jak testy zawieszenia kół jezdnych i ogonowych, które zwykle zajmowały 4 tygodnie lub więcej, aby symulować obciążenie lub odciążenie siły15,16. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na wygodny i wydajny model zwierzęcy do badania przebudowy kości napędzanej obciążeniem siłowym.

Kość wyrostka zębodołowego jest najbardziej aktywna pod względem przebudowy kości, z wysokim wskaźnikiem rotacji17. Ortodontyczny ruch zębów (OTM), powszechna metoda leczenia wad zgryzu, to sztuczny proces przebudowy kości wyrostka zębodołowego w odpowiedzi na siłę mechaniczną. Jednak OTM, który indukuje szybką przebudowę kości18, jest również oszczędzającym czas sposobem badania wpływu siły mechanicznej na przebudowę kości w porównaniu z innymi modelami o długim okresie eksperymentalnym. Dlatego OTM jest idealnym modelem do badania przebudowy kości pod wpływem bodźców mechanicznych. Warto zauważyć, że mechanizm przebudowy kości wyrostka zębodołowego jest często wrażliwy na czas i konieczne jest obserwowanie zmian w przebudowie kości wyrostka zębodołowego w określonych punktach czasowych po modelowaniu. Dzięki podwójnym zaletom czasowej i przestrzennej kontroli rekombinacji DNA i swoistości tkankowej, indukowalny model myszy z warunkowym nokautem genowym jest odpowiednim wyborem do badań OTM.

Konwencjonalnie, przebudowa kości wyrostka zębodołowego za pośrednictwem OTM została podzielona na strefy napięcia związane z tworzeniem kości i strefy nacisku związane z resorpcją kości19,20,21, co jest bardziej szczegółowe, ale trudne do regulacji. Ponadto Yuri i wsp. stwierdzili, że czas tworzenia się kości w OTM różnił się po stronie napięcia i ściskania22. Ponadto poprzednie badanie wykazało, że pierwszy ząb trzonowy może zainicjować szeroką przebudowę kości wyrostka zębodołowego szczęki pod wpływem siły ortodontycznej, która nie była ograniczona do stref napięcia i nacisku23. W związku z tym wybraliśmy obszar znajdujący się w obrębie trzech korzeni M1 w przekroju poprzecznym kości szczęki jako obszar zainteresowania (ROI) i opisaliśmy metody oceny aktywności osteoblastów i osteoklastów w tym samym obszarze w celu oceny przebudowy kości wyrostka zębodołowego w ramach OTM.

Jako jądrowy czynnik transkrypcyjny, przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) okazał się kluczowy dla homeostazy kości24,25. Poprzednie badania wykazały niską gęstość mineralną kości i nawracające patologiczne złamania u myszy z mutacją Stat326,27. Nasze poprzednie badanie wykazało, że delecja Stat3 w osteoblastach Osx+ powodowała wady rozwojowe twarzoczaszki i osteoporozę, a także spontaniczne złamania kości28. Niedawno dostarczyliśmy dowody in vivo z indukowalnym, specyficznym dla osteoblastów modelem myszy z delecją Stat3 (Col1α2CreERT2; Stat3fl/fl, zwany dalej Stat3Col1α2ERT2), że STAT3 ma kluczowe znaczenie w pośredniczeniu w efektach siły ortodontycznej napędzającej przebudowę kości wyrostka zębodołowego29. W tym badaniu przedstawiamy metody i protokoły wykorzystania indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów do badania przebudowy kości pod wpływem siły ortodontycznej i opisujemy metody analizy przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas OTM, rzucając w ten sposób światło na biologię mechaniczną szkieletu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez komisję etyki Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr 82101048).

1. Ustanawianie indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów

UWAGA: myszyStat3 fl/fl zostały pozyskane komercyjnie; szczep Col1α2CreERT2 był prezentem (szczegóły w Tabeli Materiałów). Dla wszystkich zwierząt zapewniono znormalizowane pokarmy i wodę w postaci granulatu laboratoryjnego oraz standardowe warunki środowiskowe (temperatura pokojowa od 22 °C do 26 °C i wilgotność 50%-55%).

  1. Umieść jednego dojrzałego płciowo samca myszy z dwiema samicami myszy w tej samej klatce. Po 18 dniach codziennie sprawdzaj, czy nie ma noworodków. Przenieś ciężarne samice myszy do pustej klatki i w razie potrzeby trzymaj je w spokoju. Umieść samce myszy w innych różnych klatkach hodowlanych, jeśli samice myszy nie są w ciąży w ciągu 30 dni.
  2. Generuj Stat3fl/+; Myszy Col1α2CreERT2 poprzez hybrydyzację myszyStat3 fl / fl z myszami Col1α2CreERT2; utrzymuj wszystkie te myszy na tle C57BL/6. Zbierz 2-5 mm końcówki ogona do genotypowania i zachowaj samca Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 myszy, dopóki nie osiągną dojrzałości płciowej (F1).
  3. Hybrydyzacja 6-tygodniowego samca Stat3fl/ +; Myszy Col1α2CreERT2 z samicami myszy Stat3 fl / fl. Zbierz końcówki ogona o średnicy 2-5 mm, gdy myszy mają 2 tygodnie, aby uzyskać genotypowanie, i utrzymuj samca Stat3fl / fl; Col1α2CreERT2 (Stat3Col1α2ERT2) myszy, dopóki nie osiągną dojrzałości płciowej (F2).
  4. Hybrydyzacja 6-tygodniowego samca Stat3fl / fl; Myszy Col1α2CreERT2 z samicami myszy Stat3 fl / fl (F3). Zbierz końcówki ogona o średnicy 2-5 mm, gdy myszy mają 2 tygodnie, do genotypowania i użyj młodszych myszy o tym samym genotypie, aby w razie potrzeby zastąpić starsze myszy hodowlane (F3 + N).
    UWAGA: Zdolność reprodukcyjna myszy zmniejsza się po 8 miesiącu życia, dlatego myszy w klatkach hodowlanych muszą być dokładnie monitorowane i wymieniane w razie potrzeby. Ponadto, zgodnie z wymogami doświadczalnymi, liczba klatek hodowlanych powinna zostać odpowiednio zwiększona, aby uniknąć wyginięcia myszy z docelowym genem.

2. Indukowana delecja Stat3 w osteoblastach wykazujących ekspresję Col1α2 przez tamoksyfen

  1. Rozpuścić tamoksyfen w oleju kukurydzianym do 20 mg/ml w probówce wirówkowej i chronić przed światłem, zawijając w folię. Umieść pokrytą folią probówkę wirówkową na mieszalniku obrotowym i mieszaj w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Tamoksyfen był uzyskiwany w handlu i przechowywany w ciemności w temperaturze 4 °C.
  2. Wybierz dziesięć 6-tygodniowych samców myszy i podziel je na grupy Stat3fl/fl i Stat3Col1α2ERT2 po pięć myszy w każdej grupie. Tamoksyfen (100 mg·kg-1·bw) należy podawać co 2 dni przez 1 tydzień we wstrzyknięciu dootrzewnowym.

3. Model ortodontycznego ruchu zębów (OTM)

  1. Przygotuj wysterylizowaną plastikową platformę do preparowania myszy jako stół operacyjny do unieruchomienia myszy.
    UWAGA: Stół do preparacji myszy został uzyskany komercyjnie i składał się z czterech regulowanych gumowych słupków i jednego metalowego pręta do unieruchamiania myszy. Przez cały czas trwania zabiegu należy używać sterylnych narzędzi i narzędzi.
  2. Przymocuj elastyczną opaskę do każdego gumowego słupka, aby zamocować kończynę.
  3. Zawiąż jedną elastyczną taśmę między dwoma górnymi gumowymi słupkami; przywiąż nić do elastycznej taśmy, aby przytrzymać dolne siekacze; i przywiąż kolejną nić do metalowego pręta, aby przytrzymać górne siekacze.
  4. 7-tygodniowe samce myszy należy znieczulić 0,1 ml roztworu chlorowodorku deksmedetomidyny (0,1 mg·kg-1·m.bw) i zoletilu (chlorowodorek tiletaminy na 20 mg·kg-1·m.c. i chlorowodorek zolazepamu na 20 mg·kg-1·m.bw) rozpuszczonych w soli fizjologicznej przez wstrzyknięcie dootrzewnowe przed operacją. Upewnij się, że myszy są pod odpowiednią narkozą przez cały czas trwania operacji.
    UWAGA: Zwróć uwagę na datę skutecznego użycia leków i nie używaj przeterminowanych leków. Zoletil wykazuje silne właściwości przeciwbólowe i znieczulenia chirurgicznego.
  5. Upewnij się, że myszy są w odpowiednim znieczuleniu, ściskając palcami palce kończyn tylnych palcami.
    UWAGA: Jeśli myszy nie reagują na test, oznacza to, że są nieprzytomne, a znieczulenie osiągnęło pożądaną głębokość. W tym czasie myszy są w stanie rozluźnienia mięśni kończyn, z płynnym oddechem i tętnem, a operację można rozpocząć.
  6. Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Użyj czterech elastycznych opasek na gumowych słupkach, aby przymocować kończyny, jednej nici przymocowanej do metalowego pręta, aby przytrzymać górne siekacze, a drugiej przymocowanej do elastycznej opaski między dwoma górnymi gumowymi słupkami, aby zaczepić o dolne siekacze, aby utrzymać dolną szczękę otwartą.
  7. Przygotuj sprężyny cewkowe o średnicy 0,25 mm, średnicy 0,76 mm, długości 1 mm) do ortodontycznego aparatu siłowego.
    UWAGA: Wytnij osiem gwintów sprężyny dla każdej myszy. Cztery gwinty o długości 1 mm pośrodku do użycia siły i dwa gwinty na każdym końcu do ligaturowania za pomocą stalowego drutu ligaturowego.
  8. Podwiązywać jeden koniec sprężyny przygotowany do szczęki lewy pierwszy trzonowiec. Drugi koniec do siekacza środkowego należy podwiązać stalowym drutem ligaturowym o średnicy 0,1 mm wzmocnionym światłoutwardzalną żywicą odbudowującą po nałożeniu kleju na siekacze za pomocą końcówki Q, aby wytworzyć stabilną siłę o wielkości 10 g mierzoną za pomocą dynamometru.
  9. Po zakończeniu operacji umieść myszy w klatce z innymi osobami tego samego szczepu w ramach rekonwalescencji lub umieść każdą mysz w pustej klatce samodzielnie. Upewnij się, że myszy nie są pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności 2-4 godziny po operacji, aby utrzymać leżącą mostek. Przez kilka następnych dni karm myszy miękką dietą i obserwuj je regularnie, aby upewnić się, że nie wystąpią żadne komplikacje i ustalić stopień bólu pooperacyjnego; W razie potrzeby podawać leki przeciwbólowe.
    UWAGA: Myszy, które przeszły operację, nie powinny być zwracane do towarzystwa innych myszy, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone. Nie należy umieszczać myszy pooperacyjnych w rekonwalescencji z myszami, które nie są znieczulone. Myszy muszą być utrzymywane w cieple podczas rekonwalescencji.
  10. Codziennie sprawdzaj aparat ortodontyczny i wyklucz wszelkie myszy doświadczalne z przemieszczeniem.

4. Pobieranie próbek

  1. Eutanazja myszy w trzech różnych punktach czasowych poprzez zwichnięcie szyjki macicy: 4 dni (d4), 7 dni (d7) i 10 dni (d10) po rozpoczęciu OTM.
  2. Za pomocą nożyczek okulistycznych odetnij skórę pionowo od odcinka szyjki macicy, a następnie oddziel głowę od ciała, wycinając całą skórę głowy.
  3. Odetnij skórę i mięśnie buccinatora od obustronnego angulus oris do tylnej części żuchwy. Całkowicie odłącz mięśnie policzkowe i ścięgna przyczepione do kruków, aby usunąć żuchwę i przyciąć dodatkowe kości, aby uzyskać pełne szczęki. Następnie usuń kość za obustronnymi trzecimi zębami trzonowymi i oderwij błonę śluzową podniebienia. Na koniec należy odłączyć aparat ortodontyczny i odciąć kość między siekaczami wzdłuż środkowego szwu podniebiennego, aby uzyskać kość wyrostka zębodołowego po prawej i lewej stronie.
    UWAGA: Upewnij się, że obszar od siekaczy do trzeciego zęba trzonowego jest nienaruszony po obu stronach.

5. Przygotowanie do sekcji parafinowej

  1. Utrwalenie: Zanurzyć pobraną kość wyrostka zębodołowego w 4% paraformaldehydzie na 48 godzin i przyciąć nożyczkami okulisowymi w dygestorium dla sekcji 6 i 7.
  2. Odwapnienie: Delikatnie umyj próbki 1x PBS przez 3 x 10 min. Odwapniaj próbki w uniwersalnym utrwalaczu tkankowym (pH 8,0), zastępowanym świeżym roztworem co 2 dni, przez 5 tygodni, aż kości będą mogły być łatwo penetrowane przez końcówkę igły.
  3. Odwodnienie: Umyj próbki w 1x PBS przez 3 x 10 min, a następnie sekwencyjnie zanurz je w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie, na 2 x 1 h każdy roztwór.
  4. Zanurzyć próbki w mieszaninie ksylenu i parafiny w stosunku 1:1 na 30 minut, a następnie w parafinie w temperaturze 65 °C na noc.
  5. Osadzanie: Wybierz odpowiednie zbiorniki do osadzania. Ułóż kość wyrostka zębodołowego równomiernie z zębami do góry na tym samym poziomie. Wyjąć próbki ze zbiornika do zatapiania i przenieść je do zamrażarki o temperaturze -20 °C, a następnie ponumerować je, gdy parafina jest całkowicie schłodzona i stała.
  6. Za pomocą mikrotomu wyciąć w sposób ciągły w płaszczyźnie poprzecznej od dwudziestu do czterdziestu odcinków o grubości 4 μm i unosić się na wodzie o temperaturze 37 °C. Przyklej skrawki do szkiełek mikroskopowych i piecz w temperaturze 42 °C przez noc.

6. Pomiar odległości OTM

  1. Sfotografuj próbki z trzech punktów czasowych pionowo od płaszczyzny zgryzowej za pomocą mikroskopii stereoskopowej.
  2. Zeskanuj kość wyrostka zębodołowego za pomocą skanera Micro-CT. Rekonstrukcja obrazów 3D maksymalnej płaszczyzny strzałkowej kości wyrostka zębodołowego szczęki, w której całkowicie widoczne są trzy zęby trzonowe, za pomocą oprogramowania pomocniczego skanera zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zmierz odległość OTM za pomocą oprogramowania ImageJ:
    1. Otwórz oprogramowanie ImageJ i użyj narzędzia Linia prosta, aby utworzyć segment linii o znanej odległości.
    2. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Ustaw skalę, aby wprowadzić wartość narysowanej odległości linii w polu Znana odległość i wprowadzić jednostki w polu Jednostka długości.
    3. Narysuj linię między punktami środkowymi mezjalnego grzbietu brzeżnego M2 a dystalnym grzbietem brzeżnym M1 i kliknij przycisk Pomiar. Wyniki wyświetlane w kolumnie Length (Długość) reprezentują odległość OTM.

7. Analiza histologiczna

  1. Wybór obszaru zainteresowania (ROI): Zdefiniuj kość wyrostka zębodołowego pierwszego zęba trzonowego (M1) jako ROI, znajdującą się dokładnie w obrębie trzech korzeni M1 w przekroju poprzecznym kości szczęki. Obszar ten nie tylko dociera do kości korowej pierwszego zęba trzonowego w kierunku policzkowo-językowym, ale także rozciąga się do środka długiej osi korzenia mezjalno-policzkowego, w tym do połowy obszaru między korzeniem dystalno-policzkowym a korzeniem podniebiennym.
  2. Analiza osteogenezy
    1. Podwójne znakowanie i analiza kalceiny i alizaryny w czerwieni
      1. Preparat kalceiny i czerwieni alizarynowej: Rozpuścić kalceinę w 2% roztworze NaHCO3 do 1 mg/ml i czerwień alizarynową S wH2Odo 2 mg/ml.
        UWAGA: W tym badaniu kalceina i czerwień alizarynowa były uzyskiwane komercyjnie.
      2. Kalceinę (20 mg-1·m.c.) należy podawać w 1. dniu i czerwień alizarynową S (40 mg·kg-1·m.c.) w 8. dniu we wstrzyknięciu dootrzewnowym po rozpoczęciu OTM. Poddaj myszy eutanazji w 10 dniu i zbierz kość wyrostka zębodołowego.
      3. Przygotuj próbki i osadź je, wykonując kroki 5.1 i 5.3-5.5. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z artykułem Yang et al.30.
      4. Za pomocą mikrotomu obrotowego ciąć odcinki o grubości 5 μm w sposób ciągły w płaszczyźnie poprzecznej. Przyklej skrawki do szkiełek mikroskopowych i zamocuj za pomocą szkiełek nakrywkowych za pomocą neutralnego balsamu.
        UWAGA: Pozostałe próbki muszą być przechowywane ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej.
      5. Zbadaj i sfotografuj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym i oblicz szybkość osadzania minerałów (MAR) i szybkość tworzenia kości (BFR/BS) zgodnie z wcześniej opisaną metodą30.
    2. Immunofluorescencji
      1. Wybierz odpowiednie sekcje parafiny i piecz w temperaturze 65 °C przez 30 minut.
      2. Odparafinowanie: Zanurz skrawki w ksylenie na 5 minut i powtórz dwa razy ze świeżym ksylenem za każdym razem.
      3. Nawodnienie: Zanurz sekcje kolejno w 95% etanolu, 75% etanolu, 50% etanolu i ddH2O, każda na 5 minut.
      4. Delikatnie umyj sekcje 1 x PBS przez 2 x 5 min.
      5. Pobieranie antygenu: Zanurzyć skrawki w mieszaninie Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) i proteazy K (10 μg/ml) w ddH2O i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
      6. Delikatnie umyj sekcje 1 x PBS przez 3 x 5 min.
      7. Blok: Usuń nadmiar płynu z sekcji i narysuj okrąg wokół obszaru docelowego za pomocą markera hydrofobowego. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, przykryć buforem blokującym zawierającym 10% albuminy surowicy bydlęcej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h,
        UWAGA: Uważaj, aby nie suszyć skrawków zbyt długo, aby nie wpłynąć na wyniki.
      8. Inkubacja przeciwciał pierwotnych: Rozcieńczyć przeciwciało anty-osteopontyny (OPN) rozcieńczalnikiem przeciwciał do zalecanego stężenia i dodać 30-50 μl do każdej próbki; inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
        UWAGA: Pamiętaj, aby zostawić trochę wody w komorze i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu płynu przeciwciała.
      9. Delikatnie umyć sekcje 1 x PBS przez 3 x 10 min.
        UWAGA: Kroki 7.2.2.10-7.2.2.12 należy wykonywać w ciemności.
      10. Inkubacja fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych: Wybierz odpowiednie fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe odpowiadające przeciwciału pierwszorzędowemu i rozcieńcz je do zalecanego stężenia. Dodać 30-50 μl do każdej próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      11. Delikatnie umyj sekcje 1 x PBS przez 2 x 10 min.
      12. Do zamontowania próbek należy użyć podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu z 4'6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Przechowuj sekcje w ciemności i sfotografuj je tak szybko, jak to możliwe.
      13. Przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną z użyciem aparatu cyfrowego, aby zbadać i sfotografować skrawki oraz policzyć dodatnie komórki w obszarach zainteresowania (ROI).
  3. Analiza osteoklastogenezy
    1. Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP)
      1. Wybierz odpowiednie sekcje parafinowe. Odwoskować i ponownie uwodnić zgodnie z krokami 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Przygotuj świeży roztwór barwiący za pomocą zestawu do barwienia TRAP zgodnie z instrukcjami producenta i podgrzej do 37°C.
      3. Do każdej próbki dodać 30-50 μl roztworu barwiącego i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 20-30 minut. Sprawdzać co 5 minut, aż pod mikroskopem świetlnym pojawią się czerwone osteoklasty wielojądrowe. Zatrzymaj reakcję za pomocą ddH2O.
      4. Przeciwbarwić w roztworze hematoksyliny przez 30 s i zanurzyć w 1% roztworze amoniaku na 1 minutę, aby uzyskać stabilny niebieski kolor. Spłucz pod wolno płynącą wodą z kranu.
      5. Zamontuj sekcje z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą neutralnego balsamu i wysusz przez noc.
      6. Zrób zdjęcia pod mikroskopem i policz liczbę komórek TRAP-dodatnich z więcej niż trzema jądrami, zgodnie z naszym poprzednim protokołem30.
    2. Immunofluorescencja: Należy zastosować przeciwciało katepsyny K (CTSK) w stężeniu zalecanym do immunofluorescencji i postępować zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 7 powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, stworzyliśmy indukowalny model myszy z nokautem Stat3 specyficzny dla linii osteoblastów (Stat3Col1α2ERT2), aby zbadać wpływ delecji STAT3 na ortodontyczną przebudowę kości wyrostka zębodołowego pod wpływem siły ortodontycznej (Rysunek 1A,B). Delecja STAT3 w osteoblastach została potwierdzona przez barwienie immunofluorescencyjne kości wyrostka zębodołowego (Figura 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ wady zgryzu są jednymi z najczęstszych zaburzeń jamy ustnej upośledzających oddychanie, żucie, mówienie, a nawet wygląd, zapotrzebowanie na ortodoncję rośnie z dnia na dzień, a częstość występowania wzrosła z 70% do 93%, zgodnie z poprzednim badaniem epidemiologicznym31,32. Jak przyspieszyć przebudowę kości wyrostka zębodołowego, aby bezpiecznie zwiększyć skuteczność leczenia ortodontycznego, stało się gorącym tematem w tej dziedzinie; dlatego konieczne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Fundacji Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (21ZR1436900, 22ZR1436700); Program Lidera Badań Akademickich/Technologicznych w Szanghaju (20XD1422300); Plan Badań Klinicznych SHDC (SHDC2020CR4084); Interdyscyplinarny Fundusz Badawczy Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (JYJC201902, JYJC202116); Zespół ds. Badań nad Innowacjami Lokalnych Uniwersytetów Wysokiego Szczebla w Szanghaju (SSMUZLCX20180501); Fundusz Dyscypliny Naukowej nr KQYJXK2020 z Dziewiątego Szpitala Ludowego, Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju oraz Wyższej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju; Oryginalny projekt eksploracyjny Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Projekt Dwustu Talentów Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju; Wspólny Projekt Badawczy Instytutu Biomateriałów i Medycyny Regeneracyjnej Szkoła Medyczna Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (2022LHB02); Projekt Biobanku Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBSPekin Solarbio Nauka & Technology Co., Ltd. P1020
4% paraformaldehydWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Przeciwciało anty-CTSKSanta Cruzsc-48353
Przeciwciało anty-OPNR& D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
Sprężyny śrubowe z zamkniętymiInnowacyjny materiał i urządzenia, Szanghaj, ChinyCS1006B
Col1α Myszy 2CreERT2 Prezentod Bin Zhou, Szanghajskiego Instytutu Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk.
Chlorowodorek deksmedetomidynyOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTABeyotime BiotechanologyST069
Zbiorniki do osadzaniaCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
Oprogramowanie ImageJNIH, Bethesda, MD, USA
Podłoże montażowe z DAPIBeyotime BiotechanologyP0131
Platforma preparcyjna myszyShanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
ParafinaSangon biotech Co., Ltd.
Startery do genotypowaniaStat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Proatease KSigma-Aldrich539480
Samoutwardzalna żywica regeneracyjna3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035
Stat3fl/fl myszkiGemPharmatech Co., LtdD000527
Tamoxifen
TRAPSigma-Aldrich387A
Tris-HClBeyotime BiotechanologyST780
Uniwersalny utrwalacz tkanekWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1105
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
ZoletilVIRBAC 
100092183A601889 Zestaw do barwienia Sigma-Aldrich T5648 10023418

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143(2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468(2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129(2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032(2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609(2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974(2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265(2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593(2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891(2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390(2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stat3 Knockout MiceAlveolar Bone RemodelingOrthodontic Tooth MovementOsteoblastic LineageMechanical ForceMicro Computed TomographyImmunofluorescence StainingOsteoblast ActivityBone MetabolismTamoxifen Induction

Powiązane artykuły