Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

27 października 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Streszczenie

Tutaj przedstawiamy standardową procedurę izolacji i identyfikacji komórek niszy rąbkowej (LNC). Do izolacji LNC wykorzystano tkankę rąbka włoska pozyskaną z banku oka. Tkankę podzielono na 12 części w warunkach aseptycznych i trawiono przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przy użyciu kolagenazy A w celu uzyskania klastrów komórek z LNC i komórkami progenitorowymi nabłonka rąbka. Klastry komórek były dalej trawione przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA w celu uzyskania pojedynczych komórek, a następnie hodowane w zmodyfikowanej pożywce dla embrionalnych komórek macierzystych (MESCM) na powierzchni z tworzywa sztucznego pokrytej 5% Matrigelem. Komórki pasażowano po 70% konfluencji, a LNC zidentyfikowano za pomocą immunofluorescencji, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i cytometrii przepływowej. Pierwotne LNC były izolowane i pasażowane więcej niż 12 razy. Aktywność proliferacyjna LNC od P4 do P6 była największa. LNC wykazywały wyższą ekspresję markerów komórek macierzystych niż BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR i PDGFRβ). Ponadto wyniki wykazały, że LNC P4 jednolicie eksprymują VIM, CD90, CD105 i PDGFRβ, ale nie Pan-CK, który można wykorzystać jako marker do identyfikacji LNC. Analiza cytometryczna przepływowa wykazała, że około 95%, 97%, 92% i 11% LNC wyrażało odpowiednio CD73, CD90, CD105 i SCF, podczas gdy wynosiły 68%, 99%, 20%. i 3% w BMMSC. Standardowy proces izolacji i identyfikacji LNC może stanowić wiarygodną podstawę laboratoryjną dla powszechnego stosowania LNC.

Wprowadzenie

Częstość występowania niedoboru komórek macierzystych nabłonka rogówki (CESD), zwanego również niedoborem rąbkowych komórek macierzystych (LSCD)1, oraz regeneracja nabłonka rogówki (CES) stają się coraz bardziej naglące z powodu infekcji i urazów rogówki. Jeśli CESD nie jest odpowiednio leczony, może prowadzić do ślepoty, która wymaga przeszczepu rogówki. W związku z tym rewitalizacja CES staje się coraz bardziej znacząca. Istnieje grupa komórek podporowych zwanych komórkami niszy rąbkowej (LNC), które zapewniają niezbędne wsparcie dla funkcji CES. Komórki macierzyste zrębu rąbka zostały po raz pierwszy wyizolowane przez Polisetty et al.2 i zidentyfikowane przez Xie et al.3 jako LNC, które są zlokalizowane w nabłonku rąbka i zrębie rąbka. LNC są kluczowymi komórkami macierzystymi podtrzymującymi brzeg rogówki, a dzięki funkcji MSC pochodzącego ze szpiku kostnego (BMMSC) mogą być indukowane do rozwoju w komórki nabłonka rogówki i komórki zrębu rogówki itp.3,4,5,6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że właściwości komórek macierzystych LNC są bardziej prymitywne niż BMMSCs8, który jest już szeroko stosowany w klinice. LNC mogą nawet stać się kolejną realną opcją po MSC, zwłaszcza w leczeniu CESD. Jako ważne komórki wspierające CES, LNC są również komórkami macierzystymi pochodzącymi z "niszowej" struktury rąbka. LNC mogą odgrywać kluczową rolę w dedyferencjacji dojrzałych komórek nabłonka rogówki (MCEC) do CES9. Jednak badania nad LNC są nadal stosunkowo niewystarczające i nie ma zgody co do terminologii, izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki LNC. Niektórzy badacze nazwali LNC rąbkowe komórki macierzyste pochodzące z biopsji rąbka10, rąbkowe mezenchymalne komórki macierzyste11, rąbkowe komórki macierzyste fibroblastów12, oraz rąbkowe mezenchymalne komórki zrębowe13. Ponieważ charakterystyka wzrostu LNC nie została szczegółowo opisana, a także ze względu na ich obiecujące zastosowania naukowe i kliniczne, które mogą być jednym z najważniejszych narzędzi klinicznych w przyszłości, konieczne jest podsumowanie izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki LNC.

Według poprzedniego badania14, LNC występują głównie w nabłonku rąbkowym i zrębie rąbka. Protokół ten obejmuje leczenie tkanki rąbka za pomocą kolagenazy A, uzyskanie klastra składającego się z LEPC i LNC i trawienie go do pojedynczych komórek za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (TE). LNC były następnie selektywnie hodowane w zmodyfikowanym pożywce dla embrionalnych komórek macierzystych (MESCM) w celu oczyszczenia. Protokół opisany w tym artykule jest prosty i ma wysoką skuteczność w pozyskiwaniu ludzkich LNC w dużych ilościach.

Szczegółowa procedura izolacji, hodowli i identyfikacji LNC została nagrana w filmie dla naukowców, którzy są zainteresowani badaniem LNC, i może być wygodnie powtarzana w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja

  1. Uzyskaj tkankę rąbka rogówki ze średnioterminowego podłoża do przechowywania rogówki i pracuj w warunkach aseptycznych na ultra czystym stole warsztatowym.
  2. Zeskrob i usuń tęczówkę i śródbłonek wokół rogówki za pomocą sterylnego okrągłego ostrza chirurgicznego.
  3. Pokrój tkankę rąbka na dwanaście równych kawałków za pomocą ostrza chirurgicznego, pozostawiając 1 mm po obu stronach rogówki i twardówki.
  4. Przenieś tkanki rąbka na 3,5 cm płytkę hodowlaną, dodaj 1 ml kolagenazy A (2 mg/ml, w pożywce DF-12), aby zanurzyć wszystkie tkanki do trawienia.
  5. Umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C, trawić tkanki rąbka przez 18 godzin
    UWAGA: Zabiegi kontrolne są zwykle wykonywane drugiego dnia.
  6. Przygotować 6-dołkową płytkę hodowlaną pokrytą 5% macierzystą błoną podstawną (Matrigel).
    1. Pokryć 5% matrycę błony podstawnej (rozpuszczoną w MESCM [Tabela 1]) na dnie studzienki.
    2. Przygotuj 200 μl i 1 ml końcówki, jedną 15 ml probówkę odśrodkową i jedną 6-dołkową płytkę w wysterylizowanej torbie.
    3. Umieścić wysterylizowaną torebkę (wraz z końcówkami i rurką odśrodkową) i nową płytkę 6-dołkową w temperaturze -20 °C lub -80 °C na 20 minut. Rozmrozić matrycę błony podstawnej w lodówce w temperaturze 4 °C.
    4. Wyjmij wstępnie schłodzone końcówki, rurkę odśrodkową i płytkę 6-dołkową ze środowiska -20 °C lub -80 °C, a następnie wykonaj następujące operacje na ultra czystym stole warsztatowym.
    5. Przenieś 50 μl 5% macierzystej membrany do 1 ml MESCM za pomocą końcówki 200 μl i delikatnie i równomiernie wymieszaj.
    6. Przenieść 5% macierzy błony podstawnej (rozpuszczonej w MESCM) do jednego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 1 ml.
    7. Delikatnie i poziomo wstrząsnąć 6-dołkową płytką, umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C na około 1 godzinę, a następnie wykonać następny krok.
  7. Po 18-godzinnym trawieniu wyjmij tkankę rąbka strawioną kolagenazą A, pozostaną tylko widoczne małe skupiska i niestrawione tkanki twardówki.
    UWAGA: Mikroskopia w dużym powiększeniu ujawnia klaster złożony z wielu gęsto upakowanych komórek (w tym LNC).
  8. Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby odłączyć klastry od niestrawionych tkanek twardówki pod mikroskopem stereoskopowym.
  9. Przenieś klastry na 3,5-centymetrową płytkę hodowlaną i zanurz je w 0,25% TE, a następnie umieść płytkę w inkubatorze komórkowym na 15 minut.
  10. Dodaj 1 ml MESCM z 10% serum nokautującym, aby zatrzymać trawienie komórek i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić klastry w pojedynczych komórkach za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
  11. Przenieść zawiesinę komórek do probówki odśrodkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
  12. Ostrożnie usunąć supernatant, nie zakłócając wytrącania się komórek, a następnie dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek.
  13. Pipetować w górę i w dół 2-3 razy, aż wytrącanie się dolnej komórki zostanie równomiernie zawieszone w MESCM za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, a następnie pobrać 20 μl zawiesiny komórek do liczenia komórek.
  14. Przenieść zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę pokrytą 5% membraną podstawną z końcówką pipety o pojemności 1 ml i zwiększyć objętość MESCM do 2,5 ml.
  15. Delikatnie potrząśnij płytką 6-dołkową poziomo, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  16. Przenieść komórki do inkubatora hodowli po ich zobrazowaniu i zarejestrowaniu. Obserwuj i fotografuj komórki codziennie i zmieniaj podłoże co 3-4 dni.

2. Identyfikacja LNC

  1. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Roztwory LNC należy roztrawić od spodu płytki przy użyciu 1 ml 0,25% TE przez 5 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37°C.
    2. Zakończyć trawienie przez dodanie 1 ml MESCM (zawierającego surowicę wykaującą), odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać supernatant.
    3. Dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek w zawiesinie. Przygotować zawiesinę komórek o objętości 80 μl (4 ×10 3 komórki na szkiełko) na 4 szkiełka (20 μl/szkiełko) i za pomocą systemu wirówkowego umieścić komórki na szkiełkach mikroskopowych zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Utrwal komórki (przyklejone do szkiełek w kroku 3) za pomocą 4% paraformaldehydu przez około 10 minut, a następnie przeniknij komórki na szkiełkach 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 minut.
    5. Zablokuj komórki na 1 godzinę za pomocą 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przed inkubacją z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, przemłukując (5 min/płukanie, 3x) szkiełka PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
    6. Inkubować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG u osła TRITC [1:1000], przeciwciało anty-królicze IgG FITC [1:500], przeciwciała anty-mysie osła IgG 488 [1:300], przeciwciała anty-królicze IgG osła 594 [1:400]) przez 1 godzinę z odpowiednimi niespecyficznymi przeciwciałami IgG IgG. Usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe za pomocą PBST (5 min/pranie, 3x).
    7. Wybarwić jądra przeciwtleowo za pomocą 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol) i uszczelnić szkiełka.
    8. Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie: 400x; Czas naświetlania: 50 ms).
  2. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)
    1. Weź zestaw do izolacji RNA, aby wyekstrahować całkowite RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Użyj zestawu do transkrypcji cDNA o dużej pojemności, aby odwrócić transkrypcję 1-2 μg całkowitego RNA na cDNA.
    3. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) i qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cykli) w 20 μl roztworze zawierającym cDNA (100 ng), mieszankę do oznaczania ekspresji genów TaqMan (1 μL), uniwersalną mieszankę Mastera PCR (10 μL) i ddH2O (do 20 μL).
    4. Użyj techniki porównawczej CT (ΔΔCT)4,9, aby zbadać względną ekspresję genów.

3. Charakterystyka LNC

  1. Zliczanie komórek (hemocytometr)
    1. Roztwory LNC należy roztrawić od spodu płytki przy użyciu 0,25% TE przez 5 minut w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C.
    2. Zakończyć trawienie przez dodanie 1 ml MESCM (zawierającego surowicę wykaującą), odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać supernatant.
    3. Dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie pobrać 10 μl zawiesiny komórek do probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać równą objętość 0,4% roztworu barwiącego błękit trypanowy.
    4. Umieścić 10 μl barwionej zawiesiny komórek na obszarze liczenia hemocytometru i przykryć go szkiełkiem nakrywkowym do liczenia.
      UWAGA: Liczba komórek w pięciu środkowych obszarach kwadratu jest zdefiniowana jako "A"; liczbę komórek w 1 ml oblicza się jako 5A × 104 × 2.
  2. Badanie markerów LNC i BMMSC za pomocą cytometrii przepływowej15
    1. Wykryj ekspresję SCF, CD73, CD90 i CD105 w LNC i BMMSC za pomocą cytometrii przepływowej15 (2-4 × 106 zdarzeń / próbkę, z każdej z próbek uzyskano 2 000 komórek, co daje łącznie 550 000 komórek, które były bramkowane jednocześnie).
    2. Zebrać i wybarwić komórki w temperaturze 20-30 °C przez 15 minut w buforze blokującym (3% BSA i 0,05% Tween-20 w PBS) przy użyciu wstępnie znakowanych przeciwciał (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] i CD105 [1:50]) zgodnie z instrukcjami zestawu.
    3. Wykonaj analizę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą cytometru przepływowego. W pracy wykorzystano oprogramowanie FACS Diva oraz oprogramowanie FlowJo. Dla każdej próbki zarejestruj 10 000 zdarzeń oraz przeanalizuj aktywne komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzrost LNC
Komórki LNC zostały skutecznie wyizolowane zgodnie z metodą trawienia tkanki brzegu rogówkowo-twardówkowego kolagenazą A (2 mg/mL), opisaną powyżej (Rysunek 1). Zgodnie z wcześniej opublikowanym badaniem3, po trawieniu kolagenazą A pod mikroskopem zaobserwowano skupiska przypominające gąsienice (Rysunek 2). Proporcja komórek wrzecionowatych stopniowo zwiększała się wraz z pasażowaniem komórek. Komórki o ksz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przezroczystość rogówki jest zwykle utrzymywana przez regularne ułożenie i rozmieszczenie małych włókien (o średnicy 25-30 nm) w zrębie rogówki, co ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej ostrości widzenia16. Na świecie jest 253 miliony osób niedowidzących, z czego 36 milionów to osobyniewidome17. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uważa ślepotę rogówki za jedno z najpoważniejszych zagrożeń dla ludzkiego wzroku, odpowiadając za 5,1% wszystkich przypadków ślepoty na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie posiada żadnych istotnych informacji finansowych.

Podziękowania

Podziękowania dla Wei Wanga, Lingjuana Xu i Rong Liu za wskazówki dotyczące tej pracy, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You i Li Guigang za dostarczenie części materiału, Guanyu Su za napisanie manuskryptu, Xiao Zhou, Yihong Xiong i Huatao Xie za poprawienie manuskryptu oraz Guigang Li za pełne wskazówki. Badanie to było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82070936, 81470606, 81570819), projekt naukowo-badawczy dotyczący zdrowia i planowania rodziny w prowincji Hubei (nr 1). WJ2017M073), Dziesięć najlepszych translacyjnych projektów badań medycznych ze szpitala Tongji (nr 2016ZHYX20), Projekt szkoleniowy młodych pionierów medycyny w mieście Wuhan (nr 2015whzqnyxggrc10), Globalny program rekrutacji talentów (G2022154028L), projekt Narodowej Komisji Zdrowia prowincji Hubei w 2022 r. (WJ2021ZH0005) oraz Fundacja Budowy Przedmiotu Departamentu Finansów Hubei w 2022 r. (42000022815T000000102)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidyno-2-fenyloindolThermoFisherD13065μ g/ml
Amfoterycyna BSigmaV9009191,25 &m; g / ml
anty-CD73Abcamab2021221:50
Albumina surowicy bydlęcejMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-IG1:200
CD105AbcamAB1140521:50
CD90Proteintech66766-1-IG1:100
CD90Abcamab3077361:50
Inkubator komórkowyShanghai LishenK1119K4644HF90(HT)
System wirówekStatSpin StatSpin CytoFuge
ARoche101035780012 mg/ml
Mikroskop konfokalnyZeiss LSM700-Płytka
hodowlana virya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
Przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) ThermoFisherA160161:1000
Przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało wtórneThermoFisher315681:1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesDrzewo Cytometr z
przepływemBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
Mikroskop fluorescencyjnyolympuscx31 
GentamycynaSigmaG191450 μ hemocytometr g/ml
MERCKZ359629
Zestaw do transkrypcji cDNA o dużej pojemnościBright-Line ThermoFisher4374966
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym  UOPDSZ2000X
ITS (insulina, transferyna, selenin sodu)SigmaI31465 μ g/ml insuliny, 5 μ g / ml transferyny, 5 ng / ml seleninu sodu
KnockOut SR Zamiennik surowicy dla ESC/iPSCgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldehydNoninBioNBS01354,00%
ParaformaldehydMKBioMM-15054%
PDGFRβAbclonalA14441:100
Ilościowy przyrząd do fluorescencji PCR w czasie rzeczywistymApplied BiosystemsStep One
Plus-Rekombinowany ludzki FGF-basicPeprotech100-18B4 ng / ml
Współistniejący czynnik hamujący ludzką białaczkę (Lif)Peprotech300-0510 ng / ml
RNeasy Mini zestaw do izolacji RNAQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
Mikroskop stereoskopowyZEISSSteREO Discovery. V8
Sterylne chirurgiczne okrągłe ostrzeCareforde29500rozmiar 10
Test ekspresji genów TaqMan MixApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000,20%
Trypan niebieskiThermoFisher152500610,40%
Trypsyna-EDTAGenviewGP31080,25%
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Vim Abcamab925471:100
12-Collagenase gwiazdowym

Bibliografia

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566(2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja LNClimbalne kom rki macierzystehodowla kom rkowatrawienie kolagenaztrypsyna EDTAbarwienie immunofluorescencyjnecytometria przep ywowamarkery kom rek macierzystychilo ciowa PCR
Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.