Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

DOI:

10.3791/65690

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja komórkowa zależy krytycznie od metabolizmu, a funkcja podstawowych sieci metabolicznych może być badana poprzez pomiar małych cząsteczek pośrednich. Jednak uzyskanie dokładnych i wiarygodnych pomiarów metabolizmu komórkowego, szczególnie w rzadkich typach komórek, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste, tradycyjnie wymagało łączenia komórek od wielu zwierząt. Protokół umożliwia teraz naukowcom pomiar metabolitów w rzadkich typach komórek przy użyciu tylko jednej myszy na próbkę, przy jednoczesnym generowaniu wielu powtórzeń dla bardziej licznych typów komórek. Zmniejsza to liczbę zwierząt, które są potrzebne do danego projektu. Przedstawiony tutaj protokół obejmuje kilka kluczowych różnic w porównaniu z tradycyjnymi protokołami metabolomicznymi, takimi jak użycie 5 g/l NaCl jako płynu osłonowego, sortowanie bezpośrednio do acetonitrylu i wykorzystanie ukierunkowanej kwantyfikacji z rygorystycznym zastosowaniem wewnętrznych wzorców, co pozwala na dokładniejsze i bardziej kompleksowe pomiary metabolizmu komórkowego. Pomimo czasu potrzebnego na izolację pojedynczych komórek, barwienie fluorescencyjne i sortowanie, protokół może w dużym stopniu zachować różnice między typami komórek i leczeniem farmakologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolizm to niezbędny proces biologiczny, który zachodzi we wszystkich żywych komórkach. Procesy metaboliczne obejmują rozległą sieć reakcji biochemicznych, które są ściśle regulowane i wzajemnie połączone, umożliwiając komórkom wytwarzanie energii i syntezę niezbędnych biomolekuł1. Aby zrozumieć funkcję sieci metabolicznych, naukowcy mierzą poziomy małocząsteczkowych produktów pośrednich w komórkach. Te produkty pośrednie służą jako ważne wskaźniki aktywności metabolicznej i mogą ujawnić krytyczne informacje na temat funkcji komórkowych.

Spektrometria mas (MS) jest najpopularniejszym wyborem do specyficznego wykrywania metabolitów w złożonych próbkach1,2. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) ma zalety w bezwzględnej kwantyfikacji związków i wyjaśnianiu struktury, ale stwardnienie rozsiane często może rozdzielić więcej składników w złożonych mieszaninach, takich jak płyny biologiczne lub ekstrakty komórkowe. Najczęściej MS łączy się z wcześniejszym oddzieleniem związku za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE), chromatografii gazowej (GC) lub chromatografii cieczowej (LC)3. Wybór platformy separacji zależy przede wszystkim od zakresu docelowych metabolitów i rodzaju próbki, a w warunkach rzeczywistych od dostępności maszyn i wiedzy specjalistycznej. Wszystkie trzy platformy separacji mają szeroki i nakładający się na siebie zakres odpowiednich metabolitów, ale mają różne ograniczenia. Krótko mówiąc, CE może oddzielać tylko naładowane cząsteczki i wymaga dużej wiedzy specjalistycznej, aby wdrożyć solidną analizę dużej liczby próbek4. GC jest ograniczony do cząsteczek, które są wystarczająco małe i niepolarne, aby odparować przed rozkładem3. Biorąc pod uwagę wszystkie dostępne na rynku kolumny LC, dowolne dwa metabolity mogą być oddzielone za pomocą tej technologii5. Jednak wiele metod LC wykazuje mniejszą zdolność rozdzielczą niż metody CE lub GC o podobnej długości.

Typowa ilość materiału wyjściowego do pomiarów metabolomicznych wynosi zazwyczaj od 5 x 10 5 do 5 x 107 komórek na próbkę, 5-50 mg mokrej tkanki lub 5-50 μL płynu ustrojowego6. Jednak uzyskanie takich ilości materiału wyjściowego może być trudne podczas pracy z komórkami pierwotnymi rzadkich typów komórek, takich jak na przykład hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) lub krążące komórki nowotworowe. Komórki te są często obecne w bardzo małej liczbie i nie można ich hodować bez naruszenia krytycznych cech komórkowych.

HSC i multipotencjalne komórki progenitorowe (MPP) są najmniej zróżnicowanymi komórkami układu krwiotwórczego i stale wytwarzają nowe komórki krwi przez całe życie organizmu. Regulacja hematopoezy ma znaczenie kliniczne w stanach takich jak białaczka i niedokrwistość. Pomimo swojego znaczenia, HSC i MPP należą do najrzadszych komórek w układzie krwiotwórczym. Za pomocą jednej myszy można zazwyczaj odizolować około 5000 HSCs7,8,9. Ponieważ tradycyjne metody metabolomiki wymagają większej ilości materiału wejściowego, łączenie komórek wielu myszy było często konieczne do analizy rzadkich typów komórek10,11.

Tutaj naszym celem było opracowanie protokołu, który umożliwia pomiar metabolitów w zaledwie 5000 komórkach na próbkę, aby umożliwić generowanie danych metabolomicznych z HSC pojedynczego myszy12. Jednocześnie metoda ta pozwala na wygenerowanie wielu powtórzeń z jednej myszy w celu uzyskania liczniejszych typów komórek, takich jak limfocyty. Takie podejście zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do danego projektu, przyczyniając się w ten sposób do "3R" (redukcja, wymiana, udoskonalenie) doświadczeń na zwierzętach.

Metabolity w komórkach mogą mieć bardzo wysokie tempo rotacji, często rzędu sekund13. Jednak przygotowanie próbek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) może zająć godziny, a samo sortowanie FACS może zająć od kilku minut do godzin, co prowadzi do potencjalnych zmian w metabolomie spowodowanych warunkami niefizjologicznymi. Niektóre odczynniki stosowane w tym protokole (takie jak bufor do lizy chlorku amonu i potasu [ACK]) mogą mieć podobne działanie. Warunki te mogą powodować stres komórkowy i wpływać na poziomy i proporcje metabolitów w komórkach, prowadząc do niedokładnych lub tendencyjnych pomiarów metabolizmu komórkowego14,15,16. Zmiany metaboliczne spowodowane przygotowaniem próbki są czasami określane jako artefakty sortowania. Długie protokoły trawienia i ostre odczynniki, które mogą być wymagane do wytworzenia zawiesin jednokomórkowych z twardych lub twardych tkanek, mogą pogorszyć ten problem. To, jakie zmiany mogą wystąpić, prawdopodobnie zależy od typu komórki i warunków przetwarzania. Dokładny charakter zmian pozostaje nieznany, ponieważ nie można zmierzyć stanu metabolicznego niezakłóconych komórek w żywej tkance.

Protokół przedstawiony tutaj zawiera kilka kluczowych różnic w porównaniu z tradycyjnymi metodami, a mianowicie użycie 5 g/L NaCl jako płynu osłonowego, sortowanie bezpośrednio do bufora ekstrakcyjnego, wstrzykiwanie dużych objętości próbek na chromatografię cieczową z hydrofilową interakcją chromatograficzną ze spektrometrią mas (HILIC-MS) i wykorzystanie ukierunkowanej kwantyfikacji, rygorystyczne stosowanie wewnętrznych standardów i kontroli tła (Rysunek 1). Protokół ten ma potencjał, aby w dużym stopniu zachować różnice między typami komórek oraz między leczeniem farmakologicznym a kontrolą nośnika12. Nawet w przypadku hodowanych komórek wypada korzystnie w porównaniu z alternatywnymi podejściami, takimi jak bardziej ugruntowane wirowanie i ręczne usuwanie supernatantu. Jednak ze względu na to, że artefakty sortowania mogą nadal występować, dane należy interpretować z ostrożnością. Pomimo tego ograniczenia, protokół stanowi znaczącą poprawę w dziedzinie profilowania metabolicznego, pozwalając na dokładniejsze i bardziej kompleksowe pomiary metabolizmu komórkowego w rzadkich komórkach pierwotnych12.

Możliwość precyzyjnego pomiaru szerokich profili metabolicznych w rzadkich komórkach pierwotnych otwiera drzwi do nowych eksperymentów w badaniach biomedycznych z udziałem tych komórek. Na przykład wykazano, że regulacja za pośrednictwem metabolizmu w HSC wpływa na zdolność do samoodnawiania się w stanie spoczynku, co ma wpływ na niedokrwistość i białaczkę11,17. W krążących komórkach nowotworowych pochodzących od pacjenta wykazano różnice w ekspresji genów metabolicznych między guzem a sąsiednimi komórkami18,19. Protokół ten pozwala teraz naukowcom na systematyczne badanie tych różnic na poziomie metabolicznym, który jest ogólnie uważany za bliższy fenotypowi komórkowemu niż ekspresji genów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla i hodowla wszystkich myszy użytych do tego protokołu została przeprowadzona w konwencjonalnym obiekcie dla zwierząt w Instytucie Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka (MPI-IE) zgodnie z przepisami władz lokalnych (Regierungspräsidium Freiburg). Myszy zostały poddane eutanazji z użyciem CO2 i zwichnięcia szyjki macicy przez personel przeszkolony w ramach FELASA B zgodnie z wytycznymi i przepisami zatwierdzonymi przez komitet ds. dobrostanu zwierząt MPI-IE i władze lokalne. Nie przeprowadzano żadnych eksperymentów na zwierzętach, a myszy były pozbawione obciążeń zdrowotnych.

UWAGA: Wysoce czułe metody analityczne, takie jak metoda LC-MS stosowana w tym protokole, mają potencjał do wykrywania nawet bardzo drobnych zanieczyszczeń w próbce. Dlatego niezwykle ważne jest, aby zminimalizować takie zanieczyszczenia. Najważniejszym środkiem jest noszenie czystych rękawiczek za każdym razem, gdy dotyka się czegokolwiek, co ma kontakt z próbkami. Obejmuje to na przykład przygotowanie i płynu osłonowego, etykietowanie probówek z próbkami oraz czyszczenie sprzętu laboratoryjnego. Ponadto w miarę możliwości należy używać jednorazowych przyborów laboratoryjnych. Naczynia szklane należy przed użyciem spłukać rozpuszczalnikami klasy LC-MS. Czyste środowisko pracy dodatkowo przyczynia się do zmniejszenia zanieczyszczeń.

1. Ogólne przygotowania

  1. Przygotować roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego: Przygotować 6 mg/ml chlorofenyloalaniny (CLF) i 6 mg/ml kwasu aminotereftalowego (ATA) w 30% v/v 2-propanolu w ultraczystej wodzie.
  2. Przygotować bufor do rezaspensji FACS: Dodać 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultraczystej wody i 0,5 ml roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego. Schłodzić do temperatury 4 °C.
  3. Przygotuj płyn osłonowy: W zbiorniku z płynem osłonkowym rozpuść 30 g NaCl w 6 l wody dejonizowanej i podłącz do sortera komórek.
    UWAGA: Stężenie NaCl w płynie osłonkowym zostało zoptymalizowane, aby umożliwić odchylanie kropel w sortowniku, które jest tak samo wytrzymałe, jak w przypadku stosowania PBS jako płynu osłonkowego, a jednocześnie zminimalizować negatywny wpływ na wykrywanie metabolitów przez LC-MS12. Niższe stężenia NaCl są korzystne dla wykrywania metabolitów, ale pogarszają niezawodne sortowanie komórek.

2. Izolacja limfocytów B i T ze śledziony

  1. Wstępnie schłodzić 90 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na mysz w lodówce lub na lodzie do temperatury 4 °C. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Izolacja śledziony
    UWAGA: Szczególnie ważna jest szybka praca, na lodzie i z zimnymi (4 °C) podczas izolacji komórek i następujących etapów barwienia. W przeciwnym razie profil metaboliczny komórek może ulec znacznej zmianie.
    1. Przygotować 1,5 ml PBS w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml na lodzie.
    2. Poddaj mysz eutanazji myszy C57BL6/J zgodnie z wytycznymi i metodami zatwierdzonymi przez władze lokalne.
    3. Sterylizuj futro 70% etanolem.
    4. Otwórz brzuch nożyczkami i usuń śledzionę za pomocą drobnych kleszczy bez pękania narządu. Natychmiast umieścić śledzionę w zimnym PBS (4 °C).
  3. Wytwarzanie zawiesiny jednokomórkowej
    1. Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i zwilż je PBS. Przepuścić śledzionę przez siatkę, używając podpórki kciuka tłoka strzykawki i 30 ml zimnego PBS (4 °C)
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
    3. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT; 20 °C).
    4. Dodać 50 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Barwienie FACS
    1. Przygotować koktajl przeciwciał w 500 μl zimnego PBS (4 °C) na mysz: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).
    2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w koktajlu przeciwciał. Przenieść do probówki FACS o pojemności 5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Dodać 3 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu do sporządzania zawiesiny FACS (4 °C). Przefiltruj komórki przez rurkę FACS z nasadką filtrującą. Komórki są gotowe do sortowania w oparciu o cytometrię przepływową.

3. Izolacja HSC i MPP od szpiku kostnego

  1. Wypreparuj i wyizoluj szpik kostny.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać izolowane kości i komórki w niskiej temperaturze (4 °C) podczas całej procedury, aby umożliwić dokładne wyniki. Ponadto, aby zminimalizować sygnały tła, pracuj i korzystaj z czystej przestrzeni i sprzętu laboratoryjnego.
    1. Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z wytycznymi i metodami zatwierdzonymi przez władze lokalne.
    2. Rozpyl 70% etanolu na dolną część myszy.
    3. Wypreparuj nogi i kolce za pomocą nożyczek. Wykonaj nacięcie na plecach i przedłuż nacięcie wokół brzucha. Oderwij skórę od tylnych kończyn
      4. .
    4. Rozerwij lub odetnij tylne kończyny i upewnij się, że nogi zawierają kość piszczelową, kość udową i staw biodrowy.
    5. Weź nożyczki i przytnij je blisko kręgosłupa, aż zostaną całkowicie usunięte.
    6. Rozłóż nogi i kolce na płytkach 6-dołkowych zawierających zimny PBS (4 °C) i trzymaj płytki na lodzie.
    7. Oczyść kość udową, piszczel, staw biodrowy i kręgi z tkanek miękkich za pomocą skalpela i nożyczek.
    8. Oczyszczone kości rozdrobnić moździerzem i tłuczkiem w 5 ml zimnego PBS (4 °C).
    9. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 40 μm do probówki o pojemności 50 ml.
    10. Powtarzaj kroki 3.1.8-3.1.9, aż kości staną się całkowicie białe.
  2. Liza erytrocytów:
    1. Odwirować zebraną zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu ACK (4 °C). Inkubować przez 5 minut na lodzie.
    3. Dodać zimny PBS (4 °C), aby zatrzymać reakcję (opcjonalnie).
    4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  3. Uszczuplenie rodu:
    UWAGA: Aby wzbogacić komórki ujemne (Lin-) o linii ujemnej, użyto zestawu do selekcji ujemnej dla komórek CD4.
    1. Przygotuj koraliki magnetyczne:
      1. Dodaj 500 μl kulek do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Umieść probówki na magnesie i wyrzuć supernatant.
      2. Przemyć kulki 1 ml zimnego PBS (4 °C) i wyrzucić supernatant.
      3. Dodać 500 μl zimnego PBS (4 °C) i utrzymywać kulki w chłodzie (4 °C).
    2. Inkubować komórki z 500 μl koktajlu linii (50 μl przeciwciała dostarczonego przez zestaw + 450 μl PBS) przez 25 minut (wstrząsanie, 4 °C) w ciemności.
    3. Przemyć komórki zimnym PBS (4 °C).
    4. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Zawiesić komórki w 1000 μl zimnego PBS (4 °C) i przenieść zawiesinę komórek do roztworu kulek.
    6. Inkubować przez 15 minut na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.
    7. Umieść rurki na magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie. Przenieść supernatant do świeżej probówki FACS.
    8. Umyj koraliki 500 μl PBS.
    9. Umieść rurki na magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie.
    10. Przenieść supernatant do świeżej probówki FACS.
    11. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  4. Barwienie dla FACS
    1. Przygotować 300 μl mieszanki przeciwciał na mysz w zimnym PBS (4 °C).
    2. Mieszanka przeciwciał dla komórek macierzystych/progenitorowych: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)
    3. Inkubować komórki przez 40 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
    4. Umyć 1 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do reprodukcji FACS i przefiltrować komórki przez probówkę FACS z nasadką filtrującą.

4. Sortowanie FACS

  1. Skonfiguruj sortowanie komórek.
    1. Włóż końcówkę dyszy 70 μm. Aktywuj lasery 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm.
    2. Ustaw tryb sortowania na 4-kierunkową czystość: maska plonu 0, maska czystości 32, maska fazy 0
    3. Ustaw częstotliwość opadania na 90 400 Hz i dostosuj amplitudę oraz opóźnienie spadku zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw napięcie płyty na 5000 V.
    4. Zdefiniuj bramki sortujące zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. W przypadku wszystkich typów komórek najpierw wybierz pojedyncze komórki na podstawie sygnału rozproszenia do przodu i sygnału rozproszenia bocznego, a następnie wybierz na podstawie barwienia specyficznego dla typu komórki.
      2. W przypadku komórek B wybierz populację AF647-dodatnią, PE-ujemną.
      3. W przypadku limfocytów T wybierz populację PE-dodatnią, AF647-ujemną.
      4. W przypadku HSC wybierz populację PE-Cy7-niską, PE-dodatnią, APC-Cy7-dodatnią, BV605-dodatnią, BV421-ujemną.
      5. W przypadku MPP wybierz populację PE-Cy7-niską, PE-dodatnią, APC-Cy7-dodatnią, BV421-dodatnią, BV605-ujemną.
      6. W przypadku próbek szczątków wybierz zdarzenia, które są zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki na podstawie sygnału rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego. Typowe wykresy FACS przedstawiające te strategie bramkowania są pokazane na Rysunek 2 i Rysunek 3.
    5. Dostosuj natężenie przepływu, aby uzyskać mniej niż 15 000 zdarzeń/s.
  2. Przygotuj talerz zbiorczy
    1. Przygotować roztwór podstawowy ekstraktu drożdżowego: Zawiesić 1 porcję 13C ekstraktu drożdżowego w 7,5 ml ultraczystegoH2Oi 2,5 ml metanolu.
    2. Przygotować bufor ekstrakcyjny: Dodać 10 μl 13C roztworu podstawowego ekstraktu drożdżowego do 10 ml acetonitrylu i wymieszać.
    3. Przygotować płytkę zbiorczą: Dodać 25 μl buforu ekstrakcyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR, która zostanie użyta do pobrania próbki. Aby zminimalizować parowanie, przykryj studzienki pokrywkami PCR (paski pocięte w singlety).
  3. Wykonaj sortowanie komórek.
    1. W razie potrzeby otwórz studzienki zbiorcze, aby zebrać posortowane komórki i zamknij je tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie.
  4. Jeżeli próbki nie mogą być natychmiast zmierzone, należy je przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze -80 °C przez kilka dni. Po rozmrożeniu próbki należy poddać sonikacji przez 5 minut, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie metabolitów.

5. Pomiar LC-QQQ-MS

  1. Przygotowanie rozpuszczalników LC
    1. Przygotować roztwór podstawowy kwasu medronowego (100 mM): Rozpuścić 17,6 mg kwasu medronowego w 1 ml ultraczystegoH2O.
    2. Przygotować bufor A: Rozpuścić 1,92 g węglanu amonu w 1 l ultraczystegoH2Oi dodać 50 μl roztworu podstawowego kwasu medronowego.
    3. Przygotuj bufor B: Wymieszaj 50 ml buforu z 450 ml acetonitrylu.
    4. Przygotuj mieszankę testową LC: Wymieszaj po 1 ppm leucyny, izoleucyny, AMP, ADP i ATP w 80:20 acetonitryl: ultraczysty H2O.
      UWAGA: Zapas kwasu medronowego można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy; inne mogą być przechowywane w RT przez 2 dni.
  2. Zaprogramuj metodę LC-QQQ-MS
    1. Zoptymalizuj ustawienia MS specyficzne dla związku (np. energię zderzenia) zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyrządów z serii Agilent 6495 należy skorzystać z ustawień w Tabeli Uzupełniającej 1.
    2. Zoptymalizuj ustawienia MS specyficzne dla źródła zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyrządów z podgrzewanym źródłem ESI JetStream należy stosować następujące parametry: temperatura gazu: 240 °C, przepływ gazu: 15 l/min, nebulizator: 50 psi, temperatura gazu w osłonie: 400 °C, przepływ gazu w osłonie: 11 l/min, napięcie kapilary: 2000 V, napięcie dyszy: 300 V.
    3. Zoptymalizuj ustawienia optyki jonowej zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku instrumentów Agilent z optyką jonową iFunnel należy stosować następujące parametry: wysokociśnieniowe RF dodatnie: 110 V, wysokociśnieniowe RF ujemne: 90 V, niskociśnieniowe RF dodatnie: 80 V, niskociśnieniowe RF ujemne: 60 V.
    4. Zaprogramuj gradient LC: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μl/min; Czas postoju 28 min. Temperatura kolumny: 35 °C.
  3. Skonfiguruj instrument LC-MS.
    1. Podłączyć kolumnę chromatograficzną do komory kolumny o regulowanej temperaturze.
    2. Podłącz i wyczyść wszystkie linie.
    3. Uruchom co najmniej 4 ślepe próbki lub próbki zbiorcze, aby zrównoważyć kolumnę.
  4. Uruchom mieszanie testu LC, aby sprawdzić wydajność chromatograficzną. Upewnij się, że spełnione są następujące kryteria. Jeśli nie, wyczyść przyrząd lub rozwiąż problemy z nim przed uruchomieniem próbek.
    1. Upewnij się, że ciśnienie początkowe wynosi <150 bar, a maksymalne ciśnienie przeciwne wynosi <400 bar.
    2. Upewnij się, że czasy przechowywania mieszczą się w oknie ±1 min w następujący sposób: izoleucyna 6,0 min, leucyna 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min i ATP 12,7 min.
    3. Upewnij się, że dolina między leucyną a izoleucyną w przejściu +132->86 znajduje się < 20 % wysokości piku.
    4. Upewnij się, że różnica w czasie przechowywania AMP do ADP wynosi od 1,5 do 1,9 minuty, a różnica w czasie przechowywania od ADP do ATP wynosi od 1,1 do 1,9 minut.
  5. Konfigurowanie listy roboczej
    1. Zacznij od ślepej próbki, aby zminimalizować przenoszenie z mieszanki testowej LC.
    2. Uruchom próbki w kolejności losowej.
    3. Zakończ ślepą próbką, aby oczyścić kolumnę do przyszłych eksperymentów.

6. Wstępne przetwarzanie danych w automRm

UWAGA: Poniższe kroki omawiają konwersję z .d do .mzML w msconvert, przygotowanie metabdb, ładowanie danych i modeli oraz metabdb, a także ogólne strategie ręcznego przeglądu szczytów.

  1. Konwertuj surowe dane z formatu .d na format .mzML za pomocą ProteoWizard20 z następującymi ustawieniami: precyzja kodowania binarnego: 32-bitowa, MS Levels 1-2, Zaznaczono indeks zapisu, Wybrano opcję Użyj kompresji zlib.
  2. Początek R.
  3. Zainstaluj automRm21 zgodnie z dokumentacją pakietu (wymagane tylko raz przed pierwszym użyciem).
  4. Uruchom graficzny interfejs użytkownika automRm w R: automRm::automrm_gui()
  5. Przetwarzaj partię plików .d w zakładce Process > Process Batch.
    1. Wybierz plik zawierający informacje o metabolitach .xlsx. Ten plik musi być zgodny z metodą LC-QQQ-MS.
    2. wybrać. Plik RData przechowujący model uczenia maszynowego pobierania szczytowego.
    3. wybrać. Plik RData zawierający model uczenia maszynowego raportowania szczytowego.
    4. Wybierz folder projektu zawierający pliki .mzML.
    5. Rozpocznij wstępne przetwarzanie danych, klikając przycisk Przetwarzaj wsad.
  6. Po zakończeniu przetwarzania wstępnego otwórz peakoverview.pdf, aby sprawdzić poprawność wykrywania pików chromatograficznych. Opcjonalnie załaduj plik automRmdata_Review.RData z karty Review (Przegląd) graficznego interfejsu użytkownika automRm, aby ręcznie zmodyfikować filtrowanie szczytów i integrację szczytów.
  7. Otwórz peakinfo.xlsx z folderu projektu i sprawdź dane.
    1. Sprawdź sygnał wzorca wewnętrznego 13C w zakładce 13CArea: Upewnij się, że nie ma systematycznych różnic w wartościach intensywności między grupami eksperymentalnymi oraz między próbkami komórek a próbkami szczątków. Jeśli takie różnice występują, do późniejszej analizy należy używać tylko danych z kart NormArea lub NormHeight; w przeciwnym razie użyj danych z kart RawArea lub RawHeight.
    2. Sprawdź natężenie sygnału wewnętrznych wzorców ATA i CLF w zakładce RawArea. Upewnij się, że nie ma systematycznych różnic w intensywności któregokolwiek ze związków między grupami eksperymentalnymi.
    3. Dla każdego metabolitu należy porównać intensywność sygnału próbek zawierających komórki z próbkami szczątków z tej samej zawiesiny komórkowej. Należy użyć odpowiedniego testu statystycznego w celu zidentyfikowania metabolitów, w których próbki zawierające komórki mają większą intensywność niż próbki szczątków. W późniejszej analizie danych należy uwzględnić tylko metabolity, które pomyślnie przeszły ten test.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sortowanie FACS umożliwia izolację czystych populacji różnych typów komórek z tej samej zawiesiny komórkowej (Rysunek 2 i Rysunek 3). Specyfika tej metody polega na barwieniu różnych typów komórek określonymi markerami powierzchniowymi (na przykład limfocytami B i limfocytami T ze śledziony) lub określonymi kombinacjami markerów powierzchniowych (na przykład HSC i MPP). Barwienie markerów wewnątrzkomórkowych zazwyczaj wymaga przepuszczalności błony komórkowej. Może to spowodować wyciek metabolitów, dlatego ten rodzaj barwienia nie nadaje się do stosowania w tym protokole.

LC zapewnia separację metabolitów przed wykryciem przez MS (Rysunek 4). Metabolity eluują z kolumny HILIC w przybliżeniu posortowane według polarności, przy czym mniej związków polarnych eluuje wcześnie, a więcej metabolitów polarnych emuuje później. Intensywność sygnału zależy od ilości docelowego metabolitu w próbce i czynnika odpowiedzi specyficznego dla metabolitu. W związku z tym intensywność sygnału nie może być miarodajnie porównywana między metabolitami, ale tylko dla jednego metabolitu w różnych próbkach. 3 piki, które są wyróżnione w Rysunek 4 reprezentują 1: niacynamid jest wykrywany zarówno w szczątkach, jak i ekstrakcie komórkowym, choć na różnych poziomach, 2: acetylo-karnityna, która jest wykrywana prawie wyłącznie w ekstraktach komórkowych, i 3: wewnętrzny wzorzec kwasu aminotereftalicznego, który jest wykrywany na tym samym poziomie w próbkach szczątków i ekstraktach komórkowych.

Różnice metaboliczne między typami komórek z tej samej tkanki są zachowywane za pomocą połączonego protokołu FACS-LC-MS (Rysunek 5). W przypadku HSC i MPP komórki z 6 myszy musiały wygenerować 6 próbek, co doprowadziło do większej zmienności w każdej grupie w porównaniu z komórkami B i limfocytami T, które posortowano z tej samej mysiej śledziony. Próbki szczątków stanowiące próbne próby kontrolne z procesu produkcyjnego są wyraźnie oddzielane od próbek zawierających ekstrakty komórkowe. W próbkach szczątków widoczne jest wyraźne oddzielenie dwóch eksperymentów, co podkreśla różnicę w środowisku metabolicznym, którego komórki doświadczają przed sortowaniem. Po przedstawieniu na zgrupowanej mapie cieplnej (Rysunek 6) widoczne stają się dodatkowe informacje, takie jak względne poziomy metabolitów w próbkach.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd kluczowych kroków prezentowanego protokołu. Ten rysunek został przedrukowany za zgodą Schoenberger et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Izolacja czystych populacji limfocytów B i limfocytów T ze śledziony. Komórki i zdarzenia związane z odłamkami zostały wybrane na podstawie sygnałów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). Limfocyty B i limfocyty T wybrano na podstawie sygnałów barwienia specyficznych dla typu komórki. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Schoenberger et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Izolacja HSC i MPP od szpiku kostnego. Komórki i zdarzenia związane z odłamkami zostały wybrane na podstawie sygnałów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). Populacje HSC i MPP zostały wybrane na podstawie wielu etapów sygnałów barwienia specyficznych dla typu komórki. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Schoenberger et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykładowe chromatogramy. Próbki, w których stwierdzono (A) 5000 odłamków tego samego rodzaju i (B) 5000 szczątków. Zwróć uwagę, że oś ma tę samą skalę w obu panelach. Wyróżnione metabolity to: 1: nikotynamid, 2: acetylo-karnityna, 3: kwas aminotereftalowy (ATA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza głównych składowych (PCA) profili metabolicznych różnych typów komórek i próbek tła szczątków z tych samych eksperymentów. Obserwuje się dużą separację między różnymi narządami i próbkami tła szczątków z dowolnego narządu. Ponadto typy komórek są wyraźnie oddzielone w komórkach każdego narządu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Mapa termiczna przedstawiająca metabolity mierzone w różnych typach komórek i pasujące do próbek kontrolnych tła (szczątków). Brakujące wartości przypisano połowie minimalnej wartości tego samego metabolitu we wszystkich próbkach. W przypadku wykresu dane zostały znormalizowane do maksimum osobno w każdym wierszu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela zawiera ustawienia specyficzne dla związku dla wybranych metabolitów, w tym czas retencji (RT), polaryzację (Pol), prekursor m/z (Q1), fragment m/z (Q3) i energię zderzenia (CE). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszymi krokami dla pomyślnego wdrożenia ukierunkowanej metabolomiki przy użyciu tego protokołu są: 1) solidna strategia barwienia i bramkowania, która zapewni czyste populacje komórek, 2) precyzyjna obsługa objętości cieczy, 3) odtwarzalny czas wszystkich etapów eksperymentalnych, w szczególności wszystkich etapów poprzedzających ekstrakcję metabolitów. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie próbki należące do jednego eksperymentu były przetwarzane i mierzone w jednej partii, aby zminimalizować efekty partii22. W przypadku większych eksperymentów sugerujemy zebranie ekstraktów komórkowych w temperaturze -80 °C, a następnie zmierzenie wszystkich ekstraktów w jednej partii.

Podczas pracy z próbkami o niskim wkładzie należy położyć nacisk na czyste obchodzenie się ze wszystkimi materiałami, które są używane w trakcie eksperymentów23. Typowe zanieczyszczenia to resztki buforu, detergenty i produkty do pielęgnacji skóry. Najważniejszym środkiem minimalizującym zanieczyszczenie jest stosowanie odpowiednich rękawic przez cały czas trwania eksperymentu.

Aby zminimalizować potencjalne zmiany w składzie metabolitów spowodowane narażeniem komórek na warunki niefizjologiczne, kluczowe znaczenie ma przygotowanie próbek na lodzie i przy użyciu zimnych odczynników (4 °C). Ponadto, bycie tak szybkim, jak to możliwe przed etapem FACS, poprawi jakość pomiaru2. Wskazane czasy barwienia przeciwciał są tak krótkie, jak to możliwe, aby zapewnić dobrą skuteczność barwienia. Dodatkowy etap blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z receptorami Fc za pomocą przeciwciał Fc-block może być dodany przed procedurą barwienia FACS24,25. Zapobiega to zanieczyszczeniu docelowych populacji komórek i jest szczególnie wskazane podczas pracy z zawiesinami komórek, które zawierają wiele typów komórek o wysokim poziomie receptora Fc (takich jak monocyty lub makrofagi) lub komórek, które były hodowane bez surowicy. Wydłuży to jednak całkowity czas obsługi o 10-15 minut, a zatem może dodać do wyników dodatkową niefizjologiczną zmienność.

Dzięki zastosowaniu dynamicznych metod MRM w nowoczesnych spektrometrach masowych, wszystkie metabolity wymienione w ustawieniach specyficznych dla związku mogą być rejestrowane za pomocą jednego wstrzyknięcia. Ograniczenie liczby metabolitów docelowych pozwala na implementację opisanego protokołu na starszych spektrometrach masowych oraz przyspiesza wstępne przetwarzanie i analizę danych.

Pewien poziom sygnału tła w danych LC-MS jest nieunikniony. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby zidentyfikować te metabolity, które można wykryć powyżej tła. Zdarzenia sortowania, które są zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki (szczątki), generują odpowiednie próbki ślepe procesu, które reprezentują intensywność sygnału tła zależną od matrycy. Ponadto normy wewnętrzne pozwalają na identyfikację problematycznych próbek, które powinny zostać wyłączone z dalszej analizy danych26. Oba środki zapewnienia jakości działają najlepiej, jeżeli dostępna jest wystarczająco duża liczba powtórzeń. Zaleca się użycie co najmniej sześciu powtórzeń na grupę.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować ośrodku dla zwierząt Instytutu Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka za dostarczenie zwierząt wykorzystywanych w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13C Ekstrakt drożdżowyRoztwory izotopoweISO-1
40 i mikro; m sitko komórkoweCorning352340
Acetonitryl, klasa LC-MSVWR83640.32
ACK bufor do lizyGibco104921Alternatywnie: Lonza, Cat# BP10-548E
Difosforan adenozyny (ADP)Sigma AldrichA2754
Monofosforan adenozyny (AMP)Sigma AldrichA1752
Trifosforan adenozyny (ATP)Sigma AldrichA2383
Węglan amonu, klasa HPLCFisher ScientificA/3686/50
Atlantis Premier Kolumna BEH Z-HILIC (100 x 2,1 mm, 1,7 i mikro; m)Wody186009982
B220-A647Invitrogen103226
B220-PE/Cy7BioLegend103222RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7101216 BioLegendRRID:AB_312799
CD150-BV605115927 BioLegendRRID:AB_11204248
CD3-PEInvitrogen12-0031-83
CD48-BV421103428 BioLegendRRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7100422BioLegend RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7100722RRID:AB_312761
cKit-PE105808 BioLegendRRID:AB_313217
Zestaw nietkniętych komórek CD4 myszy Dynabeads Invitrogen11415D
FACSAria IIIBD
Gr1-PE/Cy7BioLegend108416RRID:AB_313381
Folia termozgrzewalnaNeolabJul-18
IsoleucineSigma Aldrich58880
JetStream ESI ŹródłoAgilentG1958B
LeucineSigma AldrichL8000
Kwas MedronowySigma AldrichM9508-1G
Metanol, klasa LC-MSCarl RothHN41.2
NaClFluka31434-1KG
PBSSigma AldrichD8537
Sca1-APC/Cy7BioLegend108126RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7BioLegend116221RRID:AB_2137789
Potrójny kwadrupolowy spektrometr masowyAgilent6495B
Twin.tec PCR płytka 96-dołkowa osłona LoBindEppendorf30129512
kolumnowy UHPLCAgilentG7157B
Pompa UHPLCAgilentG7120A
Termostat do próbek UHPLCAgilentG4761A
Autosampler Termostat Pompa UHPLC Agilent G7116B

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927(2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980(2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237(2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59(2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546(2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hematopoetyczne kom rki macierzystemetabolomika pojedynczych kom reksortowanie kom rekanaliza LC MSkwantyfikacja metabolit wbarwienie fluorescencyjnestandardy wewn trzneprzygotowanie zawiesiny kom rkowej

Powiązane artykuły