Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Rozważania i przygotowania do eksperymentu
- Należy użyć odpowiedniego duplikatora tętna (PD) do symulacji rzutu serca przez zastawkę AV. PD musi być przystosowany do kontaktu z materiałami biologicznymi i umożliwiać czyszczenie.
- Należy zastosować ustawienia PD odpowiednie do testowania zastawki AV: objętość wyporu 70 mL i 70 uderzeń na minutę (rzut serca 5 L/min), 35% cyklu serca w fazie skurczu, średni gradient ciśnienia przez zastawkowy 100 mmHg, maksymalny gradient ciśnienia 120 oraz minimalny gradient ciśnienia 80.
- Jako medium płynne należy zastosować sól fizjologiczną (0,9% NaCl) w temperaturze pokojowej (RT).
- Należy zlokalizować lub stworzyć (za pomocą druku 3D lub podobnej metody) odpowiednie uchwyty do montażu świńskiej zastawki AV w celu testowania na PD.
- Należy użyć uchwytów opracowanych na podstawie uchwytów dostarczonych z duplikatorem tętna, zgodnie z następującymi specyfikacjami: należy upewnić się, że średnica wewnętrzna uchwytu jest zbliżona do średnicy badanej zastawki AV, długość mocowania wynosi co najmniej 2 cm, a użytkowa szerokość mocowania co najmniej 4 cm (Rysunek 1).
- Na końcach uchwytów należy zastosować gumowe pierścienie O-ring jako uszczelki.
- Należy pozyskać preparat serca po kardiektomii (Rysunek 2A).
- Należy użyć preparatów serc świńskich z rzeźni lub tkanek odpadowych od zwierząt zdrowych, które nie uczestniczyły w żadnych protokołach eksperymentalnych mogących wpłynąć na stan ich serc.
- Preparat należy pozyskać po kardiektomii lub przeprowadzić kardiektomię pośmiertną, obejmującą przecięcie żyły głównej górnej, żyły głównej dolnej, głównej tętnicy płucnej (PA), wszystkich żył płucnych oraz aorty w dystalnej części łuku aorty.
UWAGA: Do tego eksperymentu należy używać preparatów świeżych, pobranych mniej niż 6 h po śmierci lub przechowywanych w sterylnej soli fizjologicznej z 1% roztworem antybiotyków (penicylina i streptomycyna) w lodówce w temperaturze 4 oC przez maksymalnie 7 dni. Tkanki utrwalone w formalinie lub glutaraldehydzie spowodują zmianę wyników hydrodynamicznych ze względu na zwiększoną sztywność.

Rycina 1: Specjalistyczne uchwyty wydrukowane w technologii 3D do montażu świńskich zastawek aortalnych w duplikatorze tętna.Zgodnie z protokołem, długość mocowania powinna wynosić co najmniej 2 cm, a użyteczna szerokość mocowania co najmniej 4 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Resekcja struktur prawostronnych
- Odseparować tętnicę płucną od aorty za pomocą nożyczek Metzenbauma, aż do momentu odsłonięcia tkanki komorowej (Rysunek 2B).
- Wydzielić i podwiązać jedwabnymi nićmi obie tętnice wieńcowe u ich ujścia z zatok aorty, uważając, aby nie zwęzić samych zatok.
- Przeciąć tętnice wieńcowe dystalnie względem jedwabnych podwiązań.
- Naciąć prawą komorę (RV) pomiędzy aortą a tętnicą płucną u podstawy zastawki płucnej, używając nożyczek Metzenbauma (Rysunek 2C).
- Zacząć od strony przedniej i kontynuować nacięcie okrężnie wzdłuż przegrody międzykomorowej, aby usunąć wolną ścianę prawej komory (Rysunek 2D, E).
- Kontynuować nacięcie w kierunku tylnym przez pierścień zastawki trójdzielnej wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć całą tkankę prawego przedsionka (Rysunek 2F).

Rycina 2: Preparat po kardiektomii i resekcja struktur prawostronnych. (A) Preparat po kardiektomii. (B) Główny pień tętnicy płucnej oddzielony od aorty do momentu uwidocznienia tkanki komory. (C) Nacięcie prawej komory (RV) u podstawy zastawki płucnej. (D) Kontynuowanie nacięcia wzdłuż przegrody międzykomorowej w kierunku przednim. (E) Usunięcie wolnej ściany RV poprzez kontynuowanie nacięcia okrężnie wzdłuż przegrody międzykomorowej. (F) Preparat po usunięciu struktur prawostronnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
3. Przygotowanie drogi odpływu z lewej komory (LVOT) do kaniulacji z użyciem uchwytu PD
- Naciąć lewy przedsionek (LA) przez ujście prawej żyły płucnej równolegle do aorty, używając nożyczek Metzenbauma (Rysunek 3A).
UWAGA: Mimo niewielkiej zmienności, anatomia żył płucnych u świń zazwyczaj kończy się dwiema żyłami płucnymi wprowadzającymi się do LA8.
- Kontynuować nacięcie w kierunku przednio-bocznego komisury zastawki mitralnej (MV), pozostawiając co najmniej 3 mm mankietu tkanki przedsionkowej po stronie aorty.
- Ociąć nadmiar tkanki LA, zachowując 3 mm mankietu tkanki przedsionkowej przy aorcie oraz pierścień zastawki MV obwodowo (Rysunek 3B).
- Przedłużyć nacięcie na lewą komorę (LV) przez przednio-boczną komisurę MV, dbając o zachowanie przednio-bocznego mięśnia papilarnego (Rysunek 3C).
- Przeciąć chordae tendineae od przednio-bocznego mięśnia papilarnego do tylnej płatka zastawki MV, zachowując przyczepy do przedniego płatka MV.
- Kontynuować nacięcie aż do wierzchołka serca.
- Ociąć nadmiar tkanki LV poniżej mięśni papilarnych, zachowując oba mięśnie papilarne (Rysunek 3D).

Rycina 3: Przygotowanie drogi odpływu lewej komory do kaniulacji za pomocą uchwytu duplikatora tętna. (A) Nacięcie lewego przedsionka (LA) przez ujście prawej żyły płucnej. (B) Odcięcie nadmiaru tkanki LA, przy zachowaniu co najmniej 3 mm mankietu tkanki przedsionka na aorcie oraz zachowaniu obwodowego pierścienia zastawki mitralnej. (C) Przedłużenie nacięcia na lewą komorę (LV) przez przednio-boczną komisurę zastawki mitralnej. (D) Usunięcie nadmiaru tkanki LV poniżej mięśni brodawkowatych. Nożyczki są widoczne w prawym górnym rogu obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Przygotowanie aorty do kaniulacji z użyciem uchwytu PD
- Odetnij wszelkie nadmiarowe tkanki limfatyczne, łączną lub tkankę tętnicy płucnej z aorty (Rysunek 4A).
- Za pomocą nożyczek Metzenbauma wykonaj nacięcie górnej części łuku aorty, od aorty zstępującej do lewej tętnicy podobojczykowej (Rysunek 4B).
- Kontynuuj nacięcie górnej części łuku aorty od lewej tętnicy podobojczykowej do pnia ramionno-głowowego (Rysunek 4C, D).
UWAGA: Odnogi łuku aorty świni, licząc od dystalnej do proksymalnej, obejmują lewą tętnicę podobojczykową oraz pień ramionno-głowowy, z którego odchodzą prawa tętnica podobojczykowa, prawa tętnica szyjna oraz lewa tętnica szyjna9.

Rysunek 4: Przygotowanie aorty do kaniulacji za pomocą uchwytu duplikatora tętna. (A) Łuk aorty po usunięciu nadmiaru tkanek. Zwróć uwagę na dwa naczynia łuku w aorcie świni: pień ramienno-głowowy oraz lewą tętnicę podobojczykową. (B) Rozpoczęcie nacięcia wzdłuż górnej części łuku aorty, od aorty zstępującej do lewej tętnicy podobojczykowej. (C) Kontynuacja nacięcia wzdłuż górnej części łuku aorty, od lewej tętnicy podobojczykowej do pnia ramienno-głowowego. (D) Zakończone nacięcie łuku aorty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
5. Kanulacja LVOT z użyciem uchwytu PD
- Sprawdzić ułożenie uchwytu w LVOT i odciąć nadmiar tkanki LV.
- Wprowadzić uchwyt do LVOT pod przednią płatkę MV.
- Owinąć wolną ścianę LV wokół uchwytu.
- Odciąć nadmiar tkanki LV, aby zapewnić ciasne owinięcie wokół uchwytu.
- Usunąć połowę grubości wolnej ściany LV, zaczynając od przegrody międzykomorowej, pozostawiając co najmniej 1 cm epikardium na krawędzi wolnej w celu zachowania szczelności linii szwów (Rysunek 5A).
- Odciąć 1 cm tkanki z górnego rogu owinięcia wolnej ściany LV (Rysunek 5A).
- Ułożyć uchwyt w LVOT tak, aby otwór mocowania pręta wspierającego znajdował się 1 cm za nacięciem LV (Rysunek 5B).
- Należy uważać, aby nie wprowadzić uchwytu zbyt głęboko do LVOT, co mogłoby spowodować rozszerzenie pierścienia AV.
- Przymocować przednią płatkę MV do uchwytu za pomocą jednej lub dwóch 6-calowych opasek zaciskowych umieszczonych pomiędzy chordae tendineae płatki (Rysunek 5C).
- Zszyć wolną ścianę LV wokół uchwytu (Rysunek 5D).
- Rozpocząć od zszycia mankietu tkanki LA na aorcie z pierścieniem MV, stosując prosty szew ciągły z igłą stożkowatą.
- Kontynuować szew ciągły na LV, uważając, aby nie przerwać tkanki LV.

Rysunek 5: Kanulacja drogi odpływu z lewej komory za pomocą uchwytu duplikatora tętna. (A) Usunięcie połowy grubości wolnej ściany LV z zachowaniem 1 cm epikardium na wolnym brzegu. Linia przerywana wskazuje obszar o wielkości 1 cm, który należy usunąć z górnego narożnika owijki wolnej ściany LV. (B) Otwór mocowania pręta wspierającego umieszczony 1 cm za nacięciem wolnej ściany LV. (C) Opaska zaciskowa mocująca przedni płatek MV do proksymalnego uchwytu. (D) Wolna ściana LV zaszyta wokół uchwytu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
6. Kanulacja aorty z zastosowaniem uchwytu PD oraz końcowe przygotowanie do testów PD
- Zmierzyć średnicę AV za pomocą rozszerzaczy Hegara, aby wspomóc interpretację wyników testów PD.
- Wyznaczyć pozycję neutralną aorty, unosząc preparat znad stołu poprzez uchwycenie aorty (Ryc. 6A).
- Wprowadzić uchwyt PD do aorty, dbając o to, aby otwory mocowania prętów znajdowały się w pozycji neutralnej aorty.
- Sprawdzić długość preparatu poprzez włożenie prętów wsporczych.
- Zamocować uchwyt PD do aorty za pomocą jednej lub dwóch 6-calowych opasek zaciskowych (Ryc. 6B).
- Zamocować LVOT wokół uchwytu PD za pomocą jednej lub dwóch 8-calowych opasek zaciskowych.
- Unieruchomić pręty wsporcze za pomocą śrub dołączonych do zestawu PD.
- Umieścić preparat w urządzeniu PD i rozpocząć test (Ryc. 6C, Wideo 1, oraz Wideo 2).
- W razie potrzeby zaszyć wszelkie nieszczelności.

Rycina 6: Kanulacja aorty i badania w duplikatorze tętna. (A) Podnoszenie preparatu ze stołu za aortę w celu zidentyfikowania pozycji neutralnej aorty. (B) Mocowanie dystalne zabezpieczone w aorcie za pomocą opasek zaciskowych. (C) Preparat zamontowany w duplikatorze tętna do badań hydrodynamicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
7. Wykonanie procedury eksperymentalnej
UWAGA: Procedury eksperymentalne, takie jak procedura Ozaki, należy przeprowadzić zgodnie z wcześniejszymi opisami5,6,7, a następnie powtórzyć testy PD.
- Jeśli podczas procedury tkanka uległa wysuszeniu, zaciśnij opaski zaciskowe i w razie potrzeby wzmocnij linię szwów.
8. Długoterminowe przechowywanie preparatu (opcjonalnie)
- Umieścić preparat w 10% formalinie na 168 h (1 tydzień)10,11.
- Po utrwaleniu tkanki przemyć preparat wodą dejonizowaną i umieścić w 70% etanolu do długoterminowego przechowywania.