Udostępniamy protokół dla eksperymentalnego modelu wstrząsu endotoksemicznego u świń poprzez infuzję lipopolisacharydu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Udostępniamy protokół dla eksperymentalnego modelu wstrząsu endotoksemicznego u świń poprzez infuzję lipopolisacharydu.
Sepsa i wstrząs septyczny są często spotykane u pacjentów leczonych na oddziałach intensywnej terapii (OIOM) i są jedną z głównych przyczyn zgonów tych pacjentów. Jest to spowodowane rozregulowaną odpowiedzią immunologiczną na infekcję. Nawet przy zoptymalizowanym leczeniu wskaźniki śmiertelności pozostają wysokie, co sprawia, że konieczne jest dalsze badanie patofizjologii i nowe opcje leczenia. Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem błony komórkowej bakterii Gram-ujemnych, które często są odpowiedzialne za infekcje wywołujące sepsę i wstrząs septyczny.
Nasilenie i wysoka śmiertelność sepsy i wstrząsu septycznego uniemożliwiają przeprowadzenie standardowych badań eksperymentalnych na ludziach. W związku z tym do dalszych badań potrzebny jest model zwierzęcy. Świnia szczególnie dobrze nadaje się do tego celu, ponieważ bardzo przypomina ludzi pod względem anatomii, fizjologii i wielkości.
Ten protokół dostarcza eksperymentalny model wstrząsu endotoksemicznego u świń za pomocą infuzji LPS. Byliśmy w stanie niezawodnie wywołać zmiany często obserwowane u pacjentów ze wstrząsem septycznym, w tym niestabilność hemodynamiczną, niewydolność oddechową i kwasicę. Pozwoli to naukowcom uzyskać cenny wgląd w ten bardzo istotny stan i ocenić nowe podejścia terapeutyczne w warunkach eksperymentalnych.
Sepsa i wstrząs septyczny należą do głównych przyczyn śmiertelności u pacjentów poddawanych intensywnej terapii1,2,3. Sepsa powstaje, gdy infekcja wywołuje rozregulowaną odpowiedź immunologiczną, co prowadzi do niewydolności wielonarządowej. Charakteryzuje się objawami zagrażającymi życiu, w tym niestabilnością hemodynamiczną, niewydolnością oddechową, niewydolnością wątroby i nerek, a także upośledzeniem funkcji poznawczych4,5. Wstrząs septyczny stanowi podgrupę sepsy ze szczególnie poważnymi objawami, które znacznie zwiększają śmiertelność. Objawy te obejmują utrzymujące się niedociśnienie wymagające leczenia wazopresorowego i poziom mleczanu w surowicy przekraczający 2 mmol∙L-1 4,5. Śmiertelność u pacjentów ze wstrząsem septycznym szacuje się na 40%, nawet w przypadku leczenia szpitalnego1,3,5.
Bakterie Gram-ujemne, takie jak Pseudomonas i Escherichia coli, często wywołują infekcje wywołując rozregulowaną odpowiedź immunologiczną4. Mechanizmy patofizjologiczne leżące u ich podstaw są złożone i nie zostały jeszcze w pełni poznane. Jednym z dobrze opisanych aspektów jest aktywacja receptorów Toll-podobnych na komórkach odpornościowych przez wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), co prowadzi do uwolnienia cytokin, takich jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα) lub interleukina 1 (IL 1)4. Jednym z tych PAMP jest lipopolisacharyd (LPS), który stanowi składnik błony komórkowej u bakterii Gram-ujemnych 6. LPS został zastosowany w modelach zwierzęcych do wywoływania endotoksemii i wstrząsu endotoksemicznego7,8.
Modele zwierzęce zapewniają kontrolowane i ustandaryzowane warunki do opracowywania i badania nowych strategii leczenia. Ze względu na podobną anatomię, fizjologię immunologiczną i porównywalne parametry hemodynamiczne, model świni szczególnie dobrze nadaje się do badania skutków wstrząsu endotoksemicznego9,10. Co więcej, standardowy sprzęt medyczny powszechnie stosowany u ludzi może być łatwo stosowany u świń ze względu na podobny rozmiar ich dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, co ułatwia oprzyrządowanie i monitorowanie hemodynamiczne
.Dzięki temu protokołowi dostarczamy eksperymentalny model wstrząsu endotoksemicznego u świń poprzez dożylne podawanie LPS pochodzącego z E. coli. Aby monitorować efekty, zmierzyliśmy parametry hemodynamiczne i płucne, w tym ciśnienie tętnicze krwi, tętno, obwodowe nasycenie tlenem, ciśnienie w tętnicach płucnych i ciśnienie w drogach oddechowych. Aby ocenić wpływ endotoksemii na zaopatrzenie mózgu w tlen, zastosowaliśmy spektrometrię bliskiej podczerwieni (NIRS). Dzięki tej metodzie nasycenie mózgu tlenem można ocenić za pomocą elektrody adhezyjnej przyłożonej do czoła11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Eksperymenty opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez państwową i instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Niemcy, TVA G21-1-080). Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE. W badaniu wykorzystano sześć zdrowych samców świń rasy German Landrace w wieku 2-3 miesięcy o masie ciała 30-35 kg. Harmonogram eksperymentu przedstawiono na Ryc. 1. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów i instrumentów użytych w niniejszym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

Rysunek 1: Harmonogram eksperymentu. Pomiary bazowego stanu zdrowia wykonano po przygotowaniu zwierzęcia i 30 min okresie stabilizacji. Endotoksemię wywołano poprzez wstrzyknięcie LPS w ciągu 30 min, a pomiary dla punktu 0 h wykonano po kolejnych 30 min; następnie pomiary kontynuowano w odstępach godzinnych przez 4 h. Skróty: BLH = bazowy stan zdrowia (baseline healthy); LPS = lipopolisacharyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
1. Przygotowanie zwierząt
2. Znieczulenie i wentylacja mechaniczna
3. Instrumentarium
4. Indukcja wstrząsem
UWAGA: Podczas pracy z LPS zawsze należy nosić rękawiczki, okulary ochronne, maskę oraz fartuch laboratoryjny. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z LPS.
5. Leczenie niestabilności hemodynamicznej

Rysunek 2: Terapia niestabilności hemodynamicznej kierowana badaniem PiCCO. Po uzyskaniu pomiarów CI, GEDI i ELWI należy zastosować leczenie zgodnie z tabelą. Rysunek został zaadaptowany z podręcznika użytkownika PiCCO12. Skróty: PiCCO = rzut serca wyznaczony z analizy konturu tętna; V+ = dolewanie płynów; cat = terapia katecholaminami; V- = redukcja objętości płynów; CI = wskaźnik sercowy; GEDI = globalny wskaźnik objętości końcoworozkurczowej; ELWI = wskaźnik poziomu wody pozanaczyniowej w płucach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
6. Zakończenie eksperymentu i eutanazja
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu sześć zdrowych samców świń w wieku 2-3 miesięcy o masie ciała 30-35 kg zostało poddanych znieczuleniu, a następnie otrzymało wlew lipopolisacharydu (LPS) w celu wywołania endotoksemii. Aby ustalić odpowiednią dawkę LPS niezbędną do powtarzalnego wywołania objawów wstrząsu, świniom podano różne dawki indukcyjne LPS w zakresie od 100 µg kg-1 do 200 µg kg-1 w ciągu 30 min, a następnie dawkę podtrzymującą w ilości 1/10 dawki początkowej na godzinę przez resztę eksperymentu. U wszyst...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedstawiamy protokół indukowania eksperymentalnej endotoksemii u świń poprzez infuzję LPS, mający na celu wiarygodne wywołanie zmian powszechnie obserwowanych w sepsie i wstrząsie septycznym. W tym protokole należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Odpowiednie uspokojenie świń przed transportem ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania wywołanemu stresem wzrostowi poziomu katecholam, który mógłby potencjalnie zagrozić wynikom. Intubacja świń może stanowić wyzwanie w porównaniu z ludźmi ze względu na anatomiczne ce...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Urządzenie NIRS zostało bezwarunkowo dostarczone przez firmę Medtronic PLC, USA, do celów badań eksperymentalnych. Alexander Ziebart otrzymał honorarium za wykład od firmy Medtronic PLC. Żaden z autorów nie zgłasza żadnych finansowych lub innych konfliktów interesów. Rękopis został sprawdzony i zredagowany przez ChatGPT® (Python Software, wersja: 24 maja 2023 r.).
Autorzy pragną podziękować Dagmar Dirvonskis za doskonałe wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Atracurium Hikma 50 mg/5mL | Hikma Pharma GmbH, Martinsried | ||
| Azaperone (Stresnil) 40 mg/mL | Lilly Deutschland GmbH, Bad Homburg, Niemcy | ||
| BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL | Becton Dickinson S.A. Carretera, Mequinenza Fraga, Hiszpania | strzykawka | |
| BD Luer Connecta | Terapia infuzyjna Becton Dickinson, AB Helsingborg, Szwecja | 3-drożny kran | |
| Curafix i.v. klasyka | Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdorf, Niemcy | retencyjny kaniuli | |
| Datex Ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finlandia | hemodynamiczny | |
| Engströ m Carestation | GE Heathcare, Madison USA | respirator | |
| Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml | Janssen-Cilag GmbH, Neuss | fentanyl | |
| Fü hrungsstab, Durchmesser 4.3 | Rü Wprowadzenie | rurki dotchawiczej | |
| sch Incetomat-line 150 cm | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | linia | |
| Intrafix Primeline | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy | Linia | |
| Osłona wprowadzająca 5 Fr.Terumo | Healthcare Wprowadzenie tętnicze | ||
| INVOS | Medtronic, Dublin, Irlandia | spektrometria | |
| JOZA Einmal Nitril Untersuchungshandschuhe | JOZA, Mü nchen, Niemcy | rękawiczki | |
| Laryngoskop, 45.48.50, KL 2000 | laryngoskopu | Medicon | |
| Stetoskop Littmann Classic III | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Niemcy | stetoskop | |
| LPS (E. coli; Serotyp O111:B4) | Sigma-Aldrich, Szwajcaria | ||
| MAC Dwuczęściowy centralny zestaw dostępu żylnego | Arrow international inc. Reading, PA, USA | wprowadzanie | |
| Maims Vlieskompresse | Maims GmbH, Neuenkirchen, Niemcy | Kompres z polaru do mocowania języka | |
| Masimo LNCS Adtx SpO2 sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | nasycenie klips do ogona | |
| Masimo LNCS TC-I Czujnik klipsa na ucho | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | Klips nasycający do ucha | |
| Masimo Radical 7 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | Obwodowe nasycenie tlenem | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | B.Braun Melsungen AG, Niemcy | ||
| Midmark Maska dla psów Mała plastikowa z membraną FRSCM-0005 | Midmark Corp., Dayton, Ohio, USA | Maska | |
| Monocryl szew chirurgiczny | Johnson & Johnson, Belgia | ||
| B.Braun Melsungen AG, Niemcy | roztwór | ||
| NaCl 0,9 % | Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH | ||
| Octeniderm farblos | Schü lke & Mayr GmbH, Nordenstedt, Niemcy | Alkoholowy środek | |
| Oryginalna strzykawka Perfusor 50 ml | B.Braun Melsungen AG, Niemcy | strzykawka | |
| PA-Katheter Swan Ganz 7,5 Fr 110 cm | Edwards Lifesciences LLC, Irvine, CA, Stany Zjednoczone | Cewnik | |
| Perfusor FM Braun | B.Braun Melsungen AG, Niemcy | pompa | |
| Cewnik | PiCCOPULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Chlorek potasu 1 M | Fresenius, Kabi Germany GmbH | ||
| Propofol 2% 20 mg/ml (kolby 50 mL) | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | ||
| System do ciągłej analizy rzutu serca z konturem tętna PiCCO2 | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Rü schelit Super Safety Clear >ID 6/6,5/7,0 mm | Teleflex Medical Sdn. Bhd, rurka | dotchawicza | |
| Malezja System ultrasonograficzny Sonosite Micromaxx | Sonosite Bothell, WA, USA | ultradźwięki | |
| Nierdzewny Macintosh Grö ß e 4 | Ostrze Welch Allyn69604 | do laryngoskopu | |
| Sterofundin | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy | Zrównoważony roztwór | |
| Vasco OP sensitive | B.Braun Melsungen AG, Niemcy | sterylne rękawice | |
| Vasofix Safety 22 G-16 G | B.Braun Melsungen AG, Niemcy | Cewnik | |
| VBM Manometr mankietowy | VBM Medizintechnik GmbH, Sulz a.N., Niemcy | manometr |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.