Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66060

⸱

3 maja 2024

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Streszczenie

Ultrakrótkie samoorganizujące się peptydy (SAP) mogą spontanicznie tworzyć nanowłókna, które przypominają macierz zewnątrzkomórkową. Włókna te umożliwiają tworzenie hydrożeli, które są biokompatybilne, biodegradowalne i nieimmunogenne. Wcześniej udowodniliśmy, że SAP, gdy są biofunkcjonalizowane motywami pochodzącymi z białek, mogą naśladować cechy macierzy zewnątrzkomórkowej, które wspierają tworzenie organoidów jelita grubego. Te biofunkcjonalne hydrożele peptydowe zachowują właściwości mechaniczne, przestrajalność i drukowalność oryginalnego peptydu macierzystego, jednocześnie zawierając wskazówki, które umożliwiają interakcje komórka-macierz w celu zwiększenia adhezji komórek. W artykule przedstawiono protokoły potrzebne do oceny i scharakteryzowania wpływu różnych biofunkcjonalnych hydrożeli peptydowych na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu linii komórkowej raka gruczolakoraka zdolnej do tworzenia organoidów raka jelita grubego w sposób opłacalny. Protokoły te pomogą ocenić wpływ biofunkcjonalnego hydrożelu peptydowego na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu barwienia immunologicznego i analizy obrazu fluorescencyjnego. Linia komórkowa wykorzystana w tym badaniu była wcześniej wykorzystywana do generowania organoidów w matrycach pochodzenia zwierzęcego.

Wprowadzenie

W ostatnich latach samoorganizujące się peptydy (SAP) okazały się obiecującymi biomateriałami do zastosowań w inżynierii tkankowej. SAP posiadają unikalne właściwości, w tym spontaniczne tworzenie nanowłókien, biokompatybilność, biodegradowalność i nieimmunogenność, co czyni je atrakcyjnymi kandydatami do rozwoju rusztowań1. SAP były wcześniej używane razem z różnymi typami komórek, a w szczególności zgłoszono, że ultrakrótkie SAP ułatwiły enkapsulację komórek macierzystych, jednocześnie utrzymując ich pluripotencję przez długi czas obejmujący ponad 30 pasaży i przy minimalnym występowaniu aberracji chromosomowych2,3,4. W związku z tym dostosowanie SAP do ich stosowania w hodowlach organoidów stanowiło racjonalny kolejny krok.

Organoidy to złożone trójwymiarowe struktury, które powstają z pojedynczych komórek pluripotencjalnych. Struktury te dają początek różnym typom komórek, które następnie samoorganizują się, aby odtworzyć procesy rozwojowe wzrostu embrionalnego i tkankowego in vitro5. Ta innowacyjna struktura przekształciła się w potężne narzędzie do badań in vitro, skutecznie zachowując genetyczne, fenotypowe i behawioralne atrybuty charakterystyczne dla narządów in vivo6. Niemniej jednak główną przeszkodą w przejściu od laboratorium do łóżka pacjenta w przypadku wyników opartych na organoidach jest potrzeba odtwarzalności7. Ta różnica w wynikach jest przede wszystkim przypisywana trudnościom w pełnym różnicowaniu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyspecjalizowane linie komórkowe, spotęgowane brakiem autentycznej architektury tkankowej i nieodłączną złożonością spotykaną w modelach organoidowych. Biorąc pod uwagę wzrost popularności badań opartych na komórkach macierzystych i organoidach8, wzrosło zapotrzebowanie na biomateriały o dynamicznych właściwościach mechanicznych i miejscach adhezji podobnych do integryn lub rusztowaniach o kontrolowanej degradacji7,9. Atrybuty te można skutecznie dostroić poprzez strategiczne wykorzystanie biofunkcjonalizowanych SAP.

SAP to krótkie sekwencje aminokwasów z wrodzoną zdolnością do spontanicznego organizowania się w dobrze zdefiniowane struktury10. Peptydy te często zawierają naprzemienne reszty hydrofobowe i hydrofilowe, które napędzają ich samoorganizację poprzez oddziaływania niekowalencyjne, w tym wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i efekty hydrofobowe11,12. Proces samoorganizacji tych peptydów jest napędzany przede wszystkim potrzebą zminimalizowania swobodnej energii układu. W środowisku wodnym pozostałości hydrofobowe mają tendencję do grupowania się, aby zminimalizować ich narażenie na wodę, podczas gdy pozostałości hydrofilowe oddziałują z otaczającymi cząsteczkami wody. Zjawisko to prowadzi do powstawania różnych nanostruktur. W tym przypadku ultrakrótkie, samoorganizujące się peptydy tworzą nanowłókna o właściwościach zależnych od sekwencji peptydów i warunków środowiskowych2,12,13,14,15,16. Peptydy te przyjmują konformację β-zwojową, w której poszczególne nici peptydowe ustawiają się równolegle lub antyrównolegle do siebie, stabilizowane wiązaniami wodorowymi (Rysunek 1). Obecność jonów dodatnich przyspiesza procesy samoorganizacji, które prowadzą do powstawania nanowłókien.

Nanowłókna peptydowe zostały zidentyfikowane jako posiadające wrodzoną zdolność do zatrzymywania znacznych ilości wody. Ta cecha ułatwia wytwarzanie hydrożelu, który następnie objawia się jako biokompatybilna i biodegradowalna trójwymiarowa przestrzeń sprzyjająca proliferacji i wzrostowi komórek. Te samoorganizujące się nanowłókna peptydowe misternie naśladują cechy topograficzne nieodłącznie związane ze środowiskiem naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)1. To podobieństwo nadaje komórkom środowisko, które imituje ich fizjologiczne środowisko, dodatkowo promując optymalną aktywność komórkową17. Co więcej, wszechstronność nieodłącznie związana z tymi peptydami pozwala na znaczny stopień przestrajalności4. Taka zdolność adaptacji umożliwia zmiany właściwości matrycy, takich jak sztywność, kinetyka żelowania i porowatość. Adaptacje te osiąga się poprzez modyfikacje sekwencji peptydowej. W związku z tym samoorganizujące się peptydy (SAP) stały się kluczowymi składnikami współczesnej nauki o biomateriałach, szeroko stosowanymi jako rusztowania do regeneracji tkanek i hodowli komórkowych13,17.

Jedną z kluczowych zalet peptydów samoorganizujących się jest ich zdolność do łatwej syntezy i modyfikacji na poziomie molekularnym. Ta zaleta pozwala na włączenie określonych grup funkcyjnych lub motywów bioaktywnych do sekwencji peptydowej, umożliwiając projektowanie peptydów o dostosowanych właściwościach i funkcjonalnościach18,19,20 (Rysunek 1B). Na przykład biofunkcjonalizowane SAP można zaprojektować tak, aby naśladować ECM i promować różnicowanie za pomocą peptydu RGD19,21. Doniesiono również, że peptyd Ben-IKVAV znacznie zwiększa ekspresję markerów specyficznych dla neuronów ze względu na jego specyficzną dla ligandu motiety22. Peptydy te mogą być również zmodyfikowane tak, aby wyświetlały bioaktywne cząsteczki, takie jak peptydy wiążące integryny, w celu zwiększenia przeżywalności komórek23. Wreszcie, inne biofunkcjonalizowane SAP zostały opracowane w celu promowania angiogenezy poprzez włączenie motywów IKVAV i YIGSR do ich struktur24.

Biofunkcjonalizowane SAP opisane we wcześniejszej publikacji pokazują, że samoorganizacja może być dalej modyfikowana poprzez włączenie naiwnego peptydu, z którego pochodzi biofunkcjonalizowany SAP25. Te mieszaniny SAP mogą również zapewnić szeroką gamę preparatów SAP, które różnią się aktywnością biochemiczną i właściwościami fizykochemicznymi. Na przykład amfifilowy peptyd IIFK jest ultrakrótkim SAP, który może wytrzymać biofunkcjonalizację z różnymi motywami, czego przykładem jest włączenie motywu IKVAV (Rysunek 1B). Oba peptydy mogą tworzyć nanowłókna, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu. W wyniku każdej formuły powstają hydrożele o różnych właściwościach fizycznych (Rysunek 2)

Jednakże, ze względu na szeroki wachlarz potencjalnych permutacji i alternatyw uzyskanych dzięki biofunkcjonalizacji SAP, istnieje potrzeba zapewnienia szybkiej i opłacalnej opcji do testowania organoidów. Jednym z kandydatów do tak intensywnej i opłacalnej oceny organoidów jest linia komórkowa SW1222, pochodząca z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego26,27. Komórki SW1222 posiadają cechy, które umożliwiają ich agregację w struktury 3D przypominające organoidy, co czyni je idealnym modelem do badania rozwoju tkanek i zastosowań medycyny regeneracyjnej. Komórki SW1222 zostały zidentyfikowane jako zdolne do generowania organoidów ze względu na ich wewnętrzną nadekspresję genu LGR5 27. Tworzenie organoidów z pojedynczych komórek macierzystych LGR5+ zostało już wcześniej przekonująco wykazane, podobnie jak skłonność komórek SW1222 do osiągania cech morfologicznych organoidu raka jelita grubego28.

W tym artykule metodycznym prezentujemy szczegółowe protokoły oceny i charakterystyki wpływu różnych biofunkcjonalnych peptydów na adhezję komórek i tworzenie światła przy użyciu komórek SW1222 (Rysunek 3). Przedstawiając procedury krok po kroku i metody analizy obrazowej, mamy nadzieję zaoferować cenne informacje na temat biofabrykacji organoidów i oceny uproszczonych matryc SAP do hodowli organoidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i roztworu

UWAGA: Wszystkie podane stężenia są stężeniami końcowymi.

  1. Dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę-streptomycynę w końcowym stężeniu odpowiednio 10% i 1%, aby przygotować kompletną modyfikowaną pożywkę Dulbecco (IMDM) firmy Iscove. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. Zmieszać MgCl2 (3 mM), sacharozę (300 mM) i Triton X-100 (0,5%) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) w celu przygotowania buforu permeabilizacyjnego. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
  3. Połączyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 1%), glicynę (0,3 M) i Tween-20 (0,1%) w PBS, aby przygotować bufor blokujący. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
  4. Rozcieńczyć 10x do 2x PBS ultraczystą wodą w sterylnych warunkach. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez ponad 6 miesięcy.
  5. Sterylizować 3 mg proszku peptydowego w świetle ultrafioletowym przez 30 minut. Dodać 500 μl ultraczystej wody do rozpuszczenia za pomocą mieszalnika wirowego.
    UWAGA: Końcowe stężenie musi być dwukrotnie większe niż stężenie docelowe, tj. 6 mg/ml, ponieważ stężenie 1x wyniesie 3 mg/ml.

2. Wytwarzanie organoidów raka jelita grubego z SW1222 w peptydzie

  1. Rozmrażać podwielokrotność przez noc w temperaturze 4 °C i przechowywać ją w lodzie do czasu, gdy będzie potrzebna do przygotowania kontroli matrycy podstawowej.
  2. Umieść 10 μl kropli 2x roztworu peptydu na środku każdej studzienki na 24-dołkowej płytce. Pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Alternatywnie, umieść 8-10 kropelek na studzience na płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: Próbki przeznaczone do stosowania w mikroskopii konfokalnej i elektronowej są bardziej dostępne do manipulowania, jeśli zostaną umieszczone na sterylnym szkiełku nakrywkowym.
  3. Dodać 10 μL 2x PBS. Delikatnie wymieszaj roztwór PBS za pomocą końcówki. Pozwól żelom ustabilizować się przez co najmniej 20 minut, upewniając się, że kropelki pozostają prawie nienaruszone.
    UWAGA: Celem dodawania PBS i delikatnego mieszania jest utrzymanie integralności kropli i uniknięcie rozprowadzania hydrożelu na warstwie.
  4. Odłącz komórki SW1222 za pomocą 0,125% roztworu trypsyny-EDTA (5 ml). Inkubować komórki z trypsyną w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż oderwą się od kolby. Powstrzymaj się od stukania w kolbę, aby uniknąć zlepiania się komórek.
  5. Dodaj 5 ml kompletnego podłoża, aby dezaktywować trypsynę. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 30 μm. Alternatywnie, użyć strzykawki z igłą 25 G, aby rozbić agregaty.
  6. Przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 0,4 × 106 komórek/ml i wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórek do każdej kropli peptydu za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.
  7. Inkubować kropelki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Dodać 0,5 ml uzupełnionej pożywki do każdego dołka po inkubacji.
  8. Podczas oczekiwania należy przygotować kontrolę matrycy błony podstawnej, rozcieńczając główny zapas (8-12 mg/ml, w zależności od partii) do końcowego stężenia 3 mg/ml przy użyciu uzupełnionej pożywki. Dodaj komórki do tego roztworu (800 komórek na 25 μl).
    UWAGA: Manipulacja membraną podstawną musi być zawsze wykonywana na lodzie. Końcówki należy wypłukać w lodowatym PBS przed dotknięciem hydrożelu. W przeciwnym razie wewnątrz końcówek nastąpi polimeryzacja.
  9. Umieść 20 μl kropelek roztworu membrany podstawnej w każdej studzience. Pozostawić kropelki do zżelowania przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po zżelowaniu materiału dodać 0,5 ml kompletnego podłoża.
  10. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni. Obserwuj, jak komórki organizują się i wykazują sygnały tworzenia światła już w 4 dniu.
  11. Zobrazuj komórki w jasnym polu w dniu 1, dniu 4 i dniu 7, aby ocenić wzrost organoidów.

3. Żywotność i proliferacja

  1. Przygotować trzy płytki doniknikowe do badania żywotności i trzy płytki doniknikowe do tezy proliferacji. Dodać 25 μl 2x roztworu peptydu do dołka i żelować, używając tej samej objętości 2x PBS. Zasiej komórki zgodnie z powyższym opisem.
  2. Przygotuj trzy studzienki dla każdej formuły hydrożelu peptydowego, który ma być użyty jako ślepe próby na płytce proliferacyjnej. Nie rozsiewaj na nich komórek.
  3. Usunąć pożywkę z płytki studzienki żywotności i przemywać 1x PBS przez 3 x 5 min.
  4. Rozcieńczyć homodimer kalceiny-AM i etydyny do 8 μM z zestawu do żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków (patrz tabela materiałów) do tej samej stożkowej probówki chronionej przed światłem. Aby przygotować 2 ml tego roztworu do 2 ml PBS w stożkowej probówce zabezpieczonej przed światłem, dodać 4 μl roztworu podstawowego Calcein-AM i 8 μl roztworu podstawowego homodimeru etydyny-1.
  5. Dodać roztwór homodimeru kalceiny/etydyny przygotowany w kroku 3.4 do płytki 96-dołkowej. Dodać 100 μl na studzienkę. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Myć przez 3 x 5 min z 1x PBS. Wyobraź sobie co najmniej trzy pola (środek, góra, dół) w przypadku korzystania z obiektywu 4x lub co najmniej pięć pól (środek, lewy górny róg, prawy górny róg, lewy dolny róg, prawy dolny róg) w przypadku korzystania z obiektywu 10x i 20x pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  7. Usunąć pożywkę z płytki studzienki proliferacyjnej, aby uzyskać końcową objętość 90 μl.
  8. Dodać 10 μl roztworu Alamar Blue (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 10%.
  9. Chronić przed światłem i inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2
  10. Użyj czytnika płytek dołkowych, aby zmierzyć fluorescencję (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) lub absorbancję (570 nm). Uśrednij wartości uzyskane dla pustych miejsc i odejmij je od wartości z każdej studzienki zawierającej komórki.
  11. Oblicz wartości proliferacji, uśredniając sygnał każdego stanu i odejmując średnią z ich odpowiednich ślepych prób. Twórz wykresy, generując indeksowany wykres pudełkowy sygnału względnej absorbancji/fluorescencji w funkcji czasu.

4. Test przylegania komórek do matrycy

  1. Przygotuj 100 μl hydrożeli peptydowych w dwóch niezależnych płytkach 96-dołkowych.
  2. Wysiej 20 000 komórek w każdym dołku i dodaj 100 μl pożywki. Inkubować płytki przez 90 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Po inkubacji należy wziąć tylko jedną płytkę i ostrożnie ponownie zawiesić podłoże za pomocą mikropipety P200 przez 20-30 s. Należy uważać, aby nie zakłócić działania hydrożelu, trzymając końcówkę z dala od żelu. Alternatywnie, jeśli pozwalają na to właściwości mechaniczne hydrożelu (G' > 8,000 Pa), postukaj w cztery strony płytki studzienki za pomocą ruchomego wiru.
    UWAGA: Ponowne zawieszenie pożywki (lub stuknięcie wirem w płytkę studzienki) usunie zarówno nieprzyłączone komórki, jak i komórki o słabej przyczepności do powierzchni matrycy. Przyłączenie komórkowe nastąpi w ciągu 90 minut, chociaż siła tego przyłączenia będzie się różnić w zależności od konkretnych hydrożeli peptydowych oraz ich właściwości adhezyjnych i wiążących. Wiadomo, że wzrost organoidów jelita grubego jest preferowany w matrycach o wartościach sztywności poniżej 2,000 Pa. Stąd, ponieważ hydrożele przedstawione w tym protokole są miękkie i kruche, staramy się stosować delikatne naprężenia mechaniczne.
  4. Usuń 100 μl pożywki z obu płytek dołkowych i dodaj raz przepłukać 1x PBS.
  5. Przygotować roztwór DAPI o stężeniu 1 μg/mL. Dodać 100 μl roztworu DAPI do wszystkich studzienek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Zobrazuj reprezentatywną liczbę pól pod mikroskopem fluorescencyjnym. Upewnij się, że wszystkie obrazy zostały uzyskane przy użyciu tego samego obiektywu, aby zachować stały stosunek pikseli do odległości.
    UWAGA: Obraz dziewięciu pól dla obiektywu 10x lub 15 pól dla obiektywu 20x.
  7. Załaduj obrazy fluorescencji do oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ) i przeanalizuj cząstki na wszystkich obrazach.
    1. Z menu Obraz wybierz Typ i kliknij 8-bitowy.
    2. Z menu Obraz wybierz Dostosuj i kliknij Jasność/Kontrast. Kliknij przycisk Auto | Złóż wniosek.
    3. Z menu Obraz wybierz Dostosuj i kliknij Próg. Kliknij przycisk Auto i zamknij okno.
    4. W menu Analizuj kliknij Analizuj cząstki. Zaznacz opcję podsumowania i kliknij OK.
    5. W oknie Podsumowanie najedź kursorem na menu Plik i kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać wartości podsumowania.
  8. Eksportuj wyniki dla wszystkich obrazów do standardowego oprogramowania statystycznego.
  9. Oblicz procent powierzchni pokrytej przez komórki przed i po stresie. Utwórz indeksowany wykres pudełkowy przedstawiający procent powierzchni względem każdego warunku.

5. Barwienie immunologiczne organoidów w hydrożelu peptydowym

  1. Wysiewaj 800 komórek w 20 μl kropelkach hydrożelu peptydowego przez 4 dni, jak opisano w krokach 2.1-2.10.
  2. W dniu 4 usuń pożywkę i umyj każdą studzienkę 2x za pomocą 1x PBS.
  3. Dodać 400 μl 4% roztworu formaldehydu. Inkubować płytkę studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń roztwór formaldehydu za pomocą P1000 i umyj raz 1x PBS.
  5. Dodać 1 ml buforu do permeabilizacji i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usuń bufor przepuszczalny za pomocą P1000 i przemyj raz 1x PBS.
  7. Dodać 0,5 ml buforu blokującego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usuń bufor blokujący za pomocą P1000 i umyj 1x PBS.
  9. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodaj 200 μl do dwóch studzienek.
  10. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Usuń roztwór barwiący za pomocą P200 i umyj raz 1x PBS.
  12. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodać koniugat falloidyny w stosunku 1:40 do roztworu przeciwciała drugorzędowego.
  13. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 3 godziny. Usunąć roztwór barwiący za pomocą P200 i przemyć raz 1x PBS.
  14. Przygotować roztwór DAPI o stężeniu 1 μg/ml w buforze blokującym. Dodaj 300 μl roztworu DAPI do każdej studzienki.
  15. Chronić przed światłem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Usuń roztwór barwiący za pomocą P200 i umyj raz 1x PBS.
  17. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 7 dni.

6. Obrazowanie i analiza obrazu organoidów w matrycy

  1. Zobrazuj barwione próbki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z 10-krotnym powiększeniem. Używaj tylko kanałów falloidyny i DAPI.
  2. Otwórz oprogramowanie Cellopose i naciśnij ctrl + L, aby załadować obraz. Ponieważ oprogramowanie będzie miało dostęp do wszystkich plików w lokalizacji wybranego obrazu, pamiętaj, aby zapisać wszystkie obrazy fluorescencyjne w dokładnej lokalizacji bez żadnych podfolderów.
  3. Wpisz średnią średnicę kolonii w panelu Segmentacja i kliknij ENTER.
  4. Wybierz niestandardowy model organoidów okrężnicy i kliknij przycisk Uruchom model.
    UWAGA: W tym miejscu sugerujemy użycie dwóch modeli od podstaw w Cellpose2.029,30
  5. Naciśnij ctrl + s, aby zapisać maski jako plik .npy.
  6. Użyj strzałek na klawiaturze, aby poruszać się po obrazach folderu i uruchom model organoidów okrężnicy na wszystkich obrazach w folderze.
  7. Zrób kopię folderu i powtórz kroki 6.2-6.6, używając modelu światła organoidu okrężnicy.
  8. Otwórz ImageJ i kliknij Wtyczka | Makra | Uruchom..., aby uruchomić plik imagej_roi_converter.py dostępny w witrynie Cellpose Github i poczekaj, aż pojawi się okno.
  9. Wybierz pierwszy plik z folderu organoidów dwukropka i kliknij przycisk Otwórz.
  10. Wybierz plik seg.npy odpowiadający pierwszemu plikowi i kliknij Open.
    UWAGA: ImageJ przekonwertuje maski na obszary zainteresowania i nałoży je na odpowiadające im obrazy fluorescencyjne.
  11. Kliknij opcję Zaznacz wszystko w oknie Menedżer zwrotu z inwestycji, a następnie kliknij przycisk Zmierz.
  12. Kliknij pozycję Plik | Zapisz jako... w oknie Wyniki i zapisz wyniki.
    UWAGA: Spowoduje to utworzenie pliku .csv zawierającego wszystkie właściwości kształtu każdej kolonii w polu.
  13. Powtórz kroki 6.8-6.12 dla tego samego obrazu w folderze dla światła organoidu okrężnicy.
  14. Załaduj OriginPro i naciśnij ctrl + 3, aby otworzyć Kreatora importu. Kliknij przycisk z trzema kropkami i wybierz oba .csv pliki odpowiadające właściwościom organoidu i kształtu światła dla tego samego obrazu.
  15. Skopiuj i wklej wyniki z właściwości kształtu światła w jednej kolumnie obok wyników kolonii, aby upewnić się, że każdy pomiar strumienia świetlnego jest sparowany z odpowiednią kolonią.
  16. W nowej kolumnie podziel obszary światła i kolonii, aby uzyskać względny obszar światła kolonii, która ją zawiera.
  17. Wybierz kolumnę odpowiadającą okrągłości każdej kolonii i obszarowi światła. Kliknij na Działka | Podstawowe 2D | Rozproszenie.
  18. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno działki i wybierz Szczegóły działki. Kliknij kartę Centroid (PRO) i zaznacz opcje czytające Pokaż punkt środka ciężkości dla podzbioru, Połącz z punktami danych i Pokaż elipsę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej kolejności oceniliśmy komórki hodowane w płytce 24-dołkowej przez 7 dni, wykorzystując obrazowanie w polu jasnym. Zidentyfikowano małe skupiska komórek łączące się w organoidy w ciągu tygodnia, co przedstawiono na Rysunku 4. Metoda kontrolowanego skanowania pozwala śledzić mobilność komórek i organoidów pomiędzy poszczególnymi dniami. Ogólnie analizowano ewolucję morfologii komórek w ciągu całego tygodnia. Organoidy pochodzące z linii SW1222 powinny mieć okrągłą morfologię i jasn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ogromny potencjał SAP w badaniach biomedycznych podkreśla ich plastyczność i zdolność adaptacji poprzez biofunkcjonalizację. Przy tak szerokim wachlarzu permutacji pojawia się wyzwanie w efektywnym testowaniu i określaniu najbardziej obiecujących konfiguracji dla konkretnych zastosowań, zwłaszcza w badaniach nad organoidami. Szybkie i ekonomiczne rozwiązanie ma kluczowe znaczenie. Linia komórkowa SW1222, wywodząca się z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego, staje się kluczowym kandydatem do tak intensywnej oceny. W ty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha. Autorzy dziękują za przyznanie Funduszu Zalążkowego KAUST oraz Funduszu Innowacji KAUST przyznane przez Dział Innowacji i Rozwoju Gospodarczego KAUST. Autorzy pragną podziękować Laboratoriom Nauk Biologicznych i Obrazowania KAUST za wsparcie w zakresie charakterystyki biologicznej i analiz mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBSGibco14190144
płytka 6-dołkowa, poddana obróbce kultur tkankowychCorning07-200-83
10x PBS, bez wapnia, bez magnezuGibco70011044
16% formaldehyd (w/v), bez metanoluThermo Scientific28906
Płytka 24-dołkowa, poddana obróbce kultur tkankowychCorning09-761-146
96-dołkowa płytka, poddana hodowli tkankowejCorning07-200-565
alamarBlue Odczynnik do żywotności komórekInvitrogenDAL1025
Przeciwciało anty-Ezrin, monoklonalne króliczeAbcamab40839Wtórne zastosowanie: anty-królik Dylight 633
Przeciwciało anty-pan Kadheryna, poliklonalne królikAbcamab16505Wtórne zastosowanie: anty-królik Alexa 488
Przeciwciało o ścisłym połączeniu anty-ZO1, koza poliklonalnaAbcamab190085Wtórnie stosowane: anty-koza Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAOtrzymane z
konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego https://github.com/MouseLand/cellpose z AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Przeciwciało drugorzędowe przeciw koziej IgG (H+L) osła, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlicynaCytivaGE17-1323-01
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Drugorzędowe, DyLight 633Invitrogen35562
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
ŻYWY/MARTWY zestaw żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssakówInvitrogenL3224
Chlorek magnezu, sześciowodny (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel do hodowli organoidów, wolny od czerwieni fenolowejCorning356255Określany w manuskrypcie jako Matrigel lub matryca błony podstawnej.
Mikroskop, mikroskop jasnego pola
, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bitowy) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)LaboratoryjnyNAMoże być wykonany na zamówienie przez peptyd producentów takich jak Bachem.
Peptyd P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Laboratoryjnie wyprodukowanyNAMoże być wytwarzany na zamówienie przez producentów peptydów, takich jak Bachem.
Peptyd P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)Wyprodukowany w laboratoriumNAMoże być wytwarzany na zamówienie przez producentów peptydów, takich jak Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Szkiełko nakrywkowe okrągłe, średnica 10 mmVWR631-0170
Skaningowy mikroskop elektronowyThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterylne 30 μ m sitkoSysmex04-004-2326
sacharozaSigma-AldrichS1888
SW1222 linia komórkowaECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0,25%Gibco25200056 Tween
20Sigma-AldrichP1379
UltraPure wodaInvitrogen10977015

Bibliografia

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Samoupkładające się peptydyhydrożel peptydowyhodowla organoidówhydrożele biofunkcjonalizowaneanaliza immunostainingumikroskopia fluorescencyjnabiodruk 3Danaliza ImageJ
Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.