Artykuł metodologiczny

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Streszczenie

Modele organoidowe (PDO) pochodzące od pacjentów to wielofunkcyjny system badawczy, który lepiej podsumowuje ludzką chorobę w porównaniu z liniami komórek rakowych. Modele PDO można generować poprzez hodowlę komórek nowotworowych pacjenta w zewnątrzkomórkowych ekstraktach błony podstawnej (BME) i posiewanie ich jako trójwymiarowych kopuł. Jednak dostępne na rynku odczynniki, które zostały zoptymalizowane pod kątem testów fenotypowych w hodowlach jednowarstwowych, często nie są kompatybilne z BME. W niniejszym artykule opisano metodę tworzenia modeli PDO i oceny skutków działania leku za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania żywych komórek. Ponadto stosujemy barwniki fluorescencyjne, które są zgodne z pomiarami kinetycznymi, aby jednocześnie określić ilościowo zdrowie komórek i apoptozę. Przechwytywanie obrazu można dostosować tak, aby odbywało się w regularnych odstępach czasu przez kilka dni. Użytkownicy mogą analizować efekty działania leków na pojedynczych obrazach w płaszczyźnie Z lub w projekcji Z obrazów szeregowych z wielu płaszczyzn ogniskowych. Za pomocą maskowania obliczane są określone parametry będące przedmiotem zainteresowania, takie jak liczba PDO, powierzchnia i intensywność fluorescencji. Dostarczamy dane potwierdzające słuszność koncepcji pokazujące wpływ czynników cytotoksycznych na zdrowie komórek, apoptozę i żywotność. Ta zautomatyzowana platforma obrazowania kinetycznego może zostać rozszerzona na inne odczyty fenotypowe, aby zrozumieć różnorodne efekty terapeutyczne w modelach PDO raka.

Wprowadzenie

Organoidy nowotworowe (PDO) pochodzące od pacjentów szybko stają się solidnym systemem modelowym do badania rozwoju raka i odpowiedzi terapeutycznych. PDO to trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórek, które podsumowują złożony profil genomowy i architekturę pierwotnego nowotworu1,2. W przeciwieństwie do tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kultur unieśmiertelnionych linii komórek nowotworowych, PDO wychwytują i utrzymują wewnątrznowotworową heterogeniczność3,4, co czyni je cennym narzędziem zarówno do badań mechanistycznych, jak i translacyjnych. Chociaż ChNP stają się coraz bardziej popularnym systemem modelowym, dostępne na rynku odczynniki i metody analizy efektów komórkowych, które są zgodne z kulturami PDO, są ograniczone.

Brak solidnych metod do analizy subtelnych zmian w odpowiedzi na leczenie utrudnia kliniczne tłumaczenie. Złoty standard odczynnika do zdrowia komórek w hodowlach 3D, CellTiter-Glo 3D, wykorzystuje poziomy ATP jako wyznacznik żywotności komórek5,6. Chociaż odczynnik ten jest przydatny do testów punktów końcowych, istnieje kilka zastrzeżeń, w szczególności brak możliwości wykorzystania próbek do innych celów po zakończeniu testu.

Obrazowanie żywych komórek to wyrafinowana forma mikroskopii kinetycznej, która w połączeniu z odczynnikami fluorescencyjnymi jest w stanie określić ilościowo różne odczyty zdrowia komórek w modelach PDO, w tym apoptozę7,8,9 i cytotoksyczność10. Rzeczywiście, obrazowanie żywych komórek było integralną częścią wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków na platformach 2D11,12. Systemy takie jak Incucyte sprawiły, że technologia ta stała się przystępna cenowo, a tym samym dostępna dla grup badawczych w różnych środowiskach. Jednak zastosowanie tych systemów do analizy kultur 3D jest wciąż w powijakach.

Tutaj opisujemy metodę oceny odpowiedzi na lek w modelach PDO raka za pomocą multipleksowanego obrazowania żywych komórek (Rysunek 1). Dzięki analizie obrazów w jasnym polu można kinetycznie monitorować zmiany w wielkości i morfologii PDO. Co więcej, procesy komórkowe można jednocześnie oznaczać ilościowo w czasie za pomocą odczynników fluorescencyjnych, takich jak czerwony barwnik anektyny V do apoptozy i zielony barwnik cytototoksyczny do cytotoksyczności. Przedstawione metody są zoptymalizowane pod kątem systemu obrazowania żywych komórek Cytation 5, ale protokół ten może być dostosowany do różnych platform obrazowania żywych komórek.

Protokół

Badania z użyciem próbek ludzkich nowotworów zostały sprawdzone i zatwierdzone przez University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protokół #201809807, i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszych poprawkach. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu. Kryteria włączenia obejmują diagnozę raka i dostępność próbek guza

.

1. Posiewanie nienaruszonych PDO w 96-dołkowej płytce

  1. Przygotuj odczynniki.
    1. Rozgrzej 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez noc i rozmroź BME przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj pełne pożywki do hodowli organoidów zoptymalizowane pod kątem hodowli typu nowotworu. Specyficzne pożywki hodowlane stosowane w doświadczeniach przedstawionych w niniejszym dokumencie przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.
      UWAGA: Składniki pożywki mogą wymagać modyfikacji dla różnych typów nowotworów. Na przykład pożywka do hodowli organoidów jest uzupełniana 100 nM estradiolem dla nowotworów ginekologicznych13. Przygotowane podłoże jest stabilne w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc. W celu długotrwałego przechowywania podwielokrotność pożywki należy rozmieścić w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować dwie oddzielne podwielokrotności pożywki do hodowli organoidów w temperaturze 4 °C i 37 °C. Na przykład, jeśli 60 studzienek jest sianych na 96-dołkowej płytce, użyj 6 ml ciepłych pożywek do hodowli organoidów i 150 ml lodowatych pożywek do hodowli organoidów.
  3. Przygotuj bufor do płukania organoidów: Uzupełnij 1x PBS o 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA i 10 μM Y-27632. Przechowywać w temperaturze 4 °C
  4. Zbieraj ChNP hodowane na 24-dołkowej płytce. Wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Zasysać media z każdej studzienki za pomocą systemu linii próżniowej.
    2. Dodać 500 μl lodowatego buforu do płukania organoidów i delikatnie pipetować 2-3x za pomocą pipetora o pojemności 1000 μl. Inkubować płytkę na lodzie przez 10 minut.
    3. Przenieść zawartość każdej studzienki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby upewnić się, że wszystkie ChNP są w zawiesinie, przepłukać każdą studzienkę dodatkowymi 300 μl organoidowego buforu do przemywania i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C
    4. Odessać supernatant z osadu BME/organoidu za pomocą systemu przewodów próżniowych, pozostawiając ~ 5 ml pozostałości w probówce. Dodać 20 ml organoidowego buforu do przemywania i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
    5. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C. Zassać supernatant za pomocą systemu przewodów próżniowych, uważając, aby nie naruszyć osadu PDO.
  5. Posiewanie ChNP w 96-dołkowej płytce: Wykonaj wszystkie kroki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Zawiesić osad ChNP w odpowiedniej ilości lodowatej pożywki do hodowli organoidów, aby utworzyć zawiesinę PDO. Przenieść zawiesinę PDO do lodowatej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Aby obliczyć ilość pożywek do hodowli organoidów, należy określić liczbę studzienek, które należy posiać na płytce 96-dołkowej, biorąc pod uwagę, że PDO są posiewane w kopule o pojemności 5 μl w stosunku 1:1 pożywki do hodowli organoidów i BME. Na przykład, przy posiewaniu jednej płytki 96-dołkowej i użyciu tylko 60 wewnętrznych studzienek, całkowita potrzebna ilość zawiesiny PDO wyniesie 300 μl: 150 μl pożywki do hodowli organoidów i 150 μl BME. W przypadku modeli, które wykazują optymalny wzrost przy różnych procentach BME, stosunek BME: pożywki może zostać zmodyfikowany na tym etapie, chociaż ważne jest, aby ujednolicić stosunek we wszystkich testach dla każdego konkretnego modelu. Aby uwzględnić błąd pipetowania, dodaj 10% objętości do każdego składnika.
    2. Policz liczbę ChNP.
      1. Przenieść 2,5 μl zawiesiny ChNP do lodowatej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 2,5 μl BME. Przenieść mieszaninę 5 μl na czyste szklane szkiełko mikroskopowe. Nie należy zakładać szkiełka nasującego. Mieszanina zestali się w kopułę.
      2. Wizualizacja za pomocą mikroskopu jasnego pola z 4x. Policz liczbę PDO w mieszaninie 5 μL; celem jest uzyskanie około 25-50 PDO na kopułę o pojemności 5 μl.
        UWAGA: Jeżeli pożądana gęstość nie zostanie osiągnięta w badanej mieszaninie, należy dostosować końcową objętość zawiesiny ChNP, dodając więcej pożywki do hodowli organoidów lub odwirowując zawiesinę ChNP i ponownie zawieszając osad PDO w mniejszej objętości lodowatej pożywki do hodowli organoidów. Niezależnie od tego, w jaki sposób zawiesina ChNP jest modyfikowana na tym etapie, ostateczny stosunek BME: zawiesina ChNP w kroku 1.5.3. powinno być 1:1.
    3. Używając pipetora o pojemności 200 μl z końcówkami o szerokim otworze, ostrożnie wymieszaj zawiesinę PDO z równą ilością BME, aby uzyskać stosunek pożywki do hodowli organoidów w stosunku 1:1. Unikaj pęcherzyków, które zakłócą integralność kopuł.
    4. Używając pipetora o pojemności 20 μl, wysiew 5 μl kopułki w środku każdej studzienki wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki, wysiewając tylko wewnętrzne 60 dołków. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie PDO, należy okresowo pipetować zawartość probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipetora o pojemności 200 μl z końcówkami o szerokim otworze.
    5. Po wysianiu wszystkich dołków umieść pokrywkę na talerzu i delikatnie odwróć. Inkubować odwróconą płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby umożliwić zastygnięcie kopuły.
      UWAGA: Odwrócenie płytki zapewnia, że kopuła pożywki hodowlanej BME/organoidów zachowuje strukturę 3D, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do tworzenia PDO.
    6. Obrócić płytkę tak, aby znajdowała się pokrywką do góry i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.

2. Zabiegi i dodawanie barwników fluorescencyjnych do multipleksowania

  1. Podczas gdy kopuły BME krzepną w 96-dołkowych płytkach, przygotuj rozcieńczenia odczynników do obrazowania fluorescencyjnych żywych komórek. Szczegółowe parametry multipleksowania Annexin V Red Dye i Cytotox Green Dye są podane w niniejszym dokumencie.
  2. Przygotowanie odczynnika fluorescencyjnego (Dzień -1): Oblicz odpowiednią objętość pożywki do hodowli organoidów w oparciu o liczbę dołków, które mają być poddane obróbce, zakładając, że każda studzienka zostanie potraktowana 100 μl pożywki z barwnikiem. Rozcieńczyć barwnik we wstępnie ogrzanych organoidowych pożywkach hodowlanych do pożądanego stężenia.
    UWAGA: Całkowita ilość potrzebnego nośnika będzie się różnić w zależności od eksperymentu. Dodaj 10% do końcowej objętości, aby uwzględnić błąd pipetowania. Na przykład, aby poddać działaniu wewnętrznych 60 dołków płytki 96-dołkowej, należy przygotować 6,6 ml pożywki z barwnikiem (Tabela 1).
  3. Potraktuj każdą studzienkę 100 μl 2x pożywki do hodowli organoidów z dozowaniem barwnika. Dodać 200 μl sterylnego 1x PBS do zewnętrznych pustych dołków płytki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: PBS w studzienkach obwodowych zmniejsza parowanie mediów ze studzienek wewnętrznych.
  4. Dodawanie leków/środków leczniczych (Dzień 0): Przygotować leki we wstępnie podgrzanych pożywkach do hodowli organoidów o stężeniu 2x w objętości 100 μl na basenik.
    UWAGA: DMSO może być toksyczne dla komórek w wysokich stężeniach. W eksperymentach przeprowadzonych w tym badaniu nie jest przekroczone stężenie 0,1% DMSO. Oprócz leków, niektóre odczynniki fluorescencyjne są dystrybuowane jako roztwór DMSO. Ważne jest, aby podczas pracy z takimi odczynnikami uwzględnić całkowite stężenie DMSO.
  5. Dodaj 100 μl 2x dozowanej pożywki barwiącej do każdego dołka; unikaj tworzenia pęcherzyków.

3. Ustawianie parametrów obrazowania

  1. Umieść tabliczkę w cytacji 5. otwierać Oprogramowanie Gen5. Kliknij przycisk Nowe zadanie > trybie ręcznym programu Imager. Wybierz opcję Capture Now (Przechwyć teraz) i wprowadź następujące ustawienia: Obiektyw (wybierz żądane powiększenie); Filtr (wybierz mikropłytkę); Format mikropłytki (wybierz liczbę dołków); i Typ naczynia (wybierz typ tablicy). Kliknij opcję Użyj pokrywy i Użyj wolniejszej prędkości nośnika. Kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Typ naczynia: Bądź tak szczegółowy, jak to możliwe przy wyborze informacji o płycie, ponieważ oprogramowanie jest skalibrowane do określonej odległości od obiektywu do dna płyty dla każdego typu płyty i grubości tworzywa sztucznego.
    Wolniejsza prędkość nośnika: Zaznacz to pole, aby uniknąć zakłócania pracy kopuł podczas załadunku/rozładunku płyt.
  2. Utwórz Z-Stack, który będzie obrazował całą kopułę BME.
    1. Wybierz interesujące Cię źródło do wyświetlenia (lewy panel, poniżej histogramu).
    2. Wybierz kanał Jasne pole (lewy panel, górny). Kliknij opcję Automatyczna ekspozycja i dostosuj ustawienia zgodnie z potrzebami.
    3. Ustaw dolną i górną część karty Z-Stack: Rozwiń tryb obrazowania (lewy panel, środek). Zaznacz pole Z-Stack. Używając strzałek regulacji kursu (lewy panel, środek), klikaj regulację w dół, aż wszystkie PDO znajdą się, a następnie znikną i staną się rozmyte. Ustaw to jako spód stosu Z. Powtórz w przeciwnym kierunku, używając strzałek regulacji kursu, aby ustawić górną część Z-Stack.
    4. Aby upewnić się, że ustawienia Z-Stack są odpowiednie dla innych interesujących Cię studni, wybierz inną studnię (lewy panel, poniżej histogramu) i zwizualizuj górną i dolną część Z-Stack.
    5. Aby ręcznie wprowadzić pozycje ogniskowej, kliknij trzy kropki obok precyzyjnej regulacji (lewy panel, góra). Otworzy się okno; wpisz górną wartość Z-Stack (znajdującą się w lewym panelu, pośrodku, w obszarze Tryb obrazowania). Powtórz te czynności dla dolnej wartości Z-Stack. W razie potrzeby dostosuj, aby uchwycić żądany zakres Z, powtarzając krok 3.2.3. Jeśli konieczne były korekty, wybierz inną studnię, aby zweryfikować ustawienia.
  3. Ustaw ustawienia ekspozycji dla kanałów(-ów) fluorescencyjnych. Ustawienia są opisane dla dwóch kanałów fluorescencyjnych (GFP i TRITC). Konkretna liczba kanałów fluorescencyjnych będzie zależeć od eksperymentu i od tego, które kostki fluorescencyjne są zainstalowane w systemie obrazowania żywych komórek.
    UWAGA: Jeśli przewiduje się, że intensywność sygnału będzie znacznie wyższa pod koniec eksperymentu, użytkownicy powinni rozważyć przeprowadzenie eksperymentów testowych w celu określenia optymalnych ustawień ekspozycji na końcu eksperymentu, które można następnie zastosować podczas ustawiania parametrów początkowych.
    1. Rozwiń kartę Tryb obrazowania (lewy panel, środek) i otwórz Edytuj krok obrazowania. Pojawi się wyskakujące okienko.
    2. W obszarze Kanały kliknij bąbelek dla żądanej liczby kanałów. Wyznacz jeden kanał dla jasnego pola i dodatkowe kanały dla każdego kanału fluorescencyjnego. W tym przykładzie Kanał 1 = Jasne pole; Kanał 2 = GFP; Kanał 3 = TRITC. Korzystając z rozwijanych menu Kolory, wybierz odpowiednie ustawienie dla każdego kanału. Zamknij okno edycji, klikając przycisk OK.
    3. Skonfiguruj każdy kanał fluorescencyjny.
      1. Przełącz kanał na GFP (lewy panel, górny).
      2. Kliknij opcję Automatyczna ekspozycja (lewy panel, góra). Rozwiń kartę Ekspozycja (lewy panel, środek) i dostosuj ustawienia ekspozycji, aby zminimalizować sygnał tła.
      3. Skopiuj ustawienia ekspozycji na kartę Tryb obrazu, wykonując czynności 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Kliknij ikonę Kopiuj obok pola Edytuj krok obrazowania. Kliknij Edytuj krok obrazowania, co otworzy kolejne okno.
      5. Pod kanałem GFP kliknij ikonę Schowek w wierszu Ekspozycja, aby dodać ustawienia Oświetlenie, Czas integracji i Wzmocnienie kamery do kanału.
      6. Powtórz kroki 3.3.3.4-3.3.3.5 dla kanału TRITC. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno.
  4. Skonfiguruj kroki wstępnego przetwarzania obrazu i projekcji Z, aby zautomatyzować wstępne przetwarzanie obrazu.
    1. Kliknij ikonę aparatu (lewy panel, dolny róg). Otworzy się nowe okno.
    2. W obszarze Dodaj krok przetwarzania (lewy panel, na dole) kliknij Wstępne przetwarzanie obrazu. Otworzy się nowe okno.
    3. Na karcie Jasne pole usuń zaznaczenie opcji Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu.
    4. Upewnij się, że dla każdej karty Kanał fluorescencyjny jest zaznaczona opcja Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu. Usuń zaznaczenie opcji Użyj tych samych opcji co kanał 1 i kliknij przycisk OK. Okno zostanie zamknięte.
    5. W obszarze Dodaj krok przetwarzania kliknij Projekcja Z. Otworzy się nowe okno. W razie potrzeby dostosuj zakres przekroju (np. aby zawęzić zakres Z). Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
  5. Utwórz protokół.
    1. Kliknij w Zestaw obrazów na pasku narzędzi. W menu rozwijanym kliknij Utwórz eksperyment na podstawie tego zestawu obrazów. Okno obrazowania zostanie zamknięte i otworzy się okno procedury.
      UWAGA: Parametry wybrane w trybie ręcznym Imager zostaną automatycznie załadowane do nowego okna, w którym można utworzyć protokół eksperymentalny.
    2. Ustawianie temperatury i gradientu: Kliknij w Ustaw temperaturę pod nagłówkiem Czynności (po lewej). Otworzy się nowe okno. Wybierz opcję Inkubator włączony i ręcznie wprowadź żądaną temperaturę w obszarze Temperatura. Następnie w obszarze Gradient ręcznie wprowadź wartość 1. Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
      UWAGA: Utworzenie gradientu 1 °C zapobiegnie tworzeniu się kondensatu na pokrywie płytki.
    3. Wyznacz studzienki do obrazu.
      1. Kliknij dwukrotnie krok obrazu w obszarze Opis. Kliknij opcję Pełna blacha (prawy róg, góra). Spowoduje to otwarcie okna Układ płyty.
      2. Podświetl interesujące Cię studnie za pomocą kursora. Kliknij przycisk OK. W razie potrzeby zaznacz pola Autofocus Binning (Grupowanie autofokusa) i Capture Binning (Grupowanie przechwytywania). Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno.
        UWAGA: Łączenie w kategoryzację będzie wymagało dostosowania ekspozycji, jak opisano w kroku 3.3.3.2 powyżej. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z konkretnymi scenariuszami, w których ta funkcja może być używana.
    4. Ustawianie interwałów dla obrazowania kinetycznego.
      1. Kliknij Opcje pod nagłówkiem Inne (po lewej). Zaznacz pole Nieciągła procedura kinetyczna.
      2. W polu Szacowany łączny czas wprowadź czas wykonywania eksperymentu (np. 5 dni). W polu Szacowany interwał wprowadź interwał, aby zobrazować płytę (np. co 6 godzin).
      3. Kliknij opcję Wstrzymaj po każdym uruchomieniu, aby dać czas na przeniesienie płytki do inkubatora. Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
    5. Zaktualizuj kroki redukcji danych.
      1. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno procedury. Otworzy się zakładka do aktualizacji kroków redukcji danych. Wybierz opcję Tak. Kliknij dwukrotnie Wstępne przetwarzanie obrazu. Klikaj różne kanały, aby zweryfikować ustawienia, a następnie kliknij przycisk OK.
      2. Kliknij dwukrotnie Projekcja Z. Klikaj różne kanały, aby zweryfikować ustawienia. Kliknij przycisk OK. Następnie ponownie kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Redukcja danych.
    6. Sformatuj układ blachy.
      1. Otwórz Kreatora układu blach i wyznacz typy studni, wykonując kroki 3.6.2-3.6.3.
      2. Kliknij ikonę Układ blachy na pasku narzędzi (lewy róg, góra), aby otworzyć Kreatora układu blachy.
      3. Zaznacz pola obok typów studni użytych w eksperymencie. W obszarze Kontrole testu wprowadź liczbę różnych typów kontroli za pomocą strzałek. Kliknij przycisk Dalej, aby otworzyć okno Assay Control #1.
      4. Ustawić warunki studzienki kontrolnej testu, wykonując kroki 3.6.5–3.6.8.
      5. W oknie Kontrolka testu #1 wprowadź etykietę kontrolną w polu Identyfikator układu płytki. W razie potrzeby wprowadź pełne imię i nazwisko w sąsiednim polu. Za pomocą strzałek należy wybrać liczbę powtórzeń dla odpowiedniego warunku kontrolnego.
      6. W przypadku korzystania z wielu stężeń lub serii rozcieńczeń w obrębie kontrolki, kliknij opcję Definiuj rozcieńczenia/stężenia i użyj menu rozwijanego, aby wybrać Typ. Wprowadź wartości dla każdego stężenia/rozcieńczenia w tabeli.
        UWAGA: Funkcja auto może być używana, jeśli stężenia zmieniają się o stały przyrost.
      7. Wybierz kartę Kolor na pasku narzędzi. Wybierz żądany kolor tekstu i kolor tła do sterowania z menu rozwijanego. Kliknij Dalej.
      8. Powtórz w razie potrzeby z dodatkowymi kontrolkami.
      9. Ustawić warunki studzienki próbki zgodnie z pkt 3.6.10-3.6.12.
      10. Na stronie Przykładowa konfiguracja wprowadź przykładowy prefiks identyfikatora (np. SPL). Wybierz liczbę powtórzeń za pomocą strzałek. W przypadku korzystania z próbek o różnych stężeniach poddanych działaniu substancji wybierz opcję Stężenia lub Rozcieńczenia z menu rozwijanego Typ. Wprowadź rozcieńczenia/stężenia w tabeli i wprowadź jednostki w polu Jednostka.
      11. Wybierz opcję Pola identyfikacyjne na pasku narzędzi. Wprowadź żądaną nazwę kategorii (np. identyfikator próbki, lek) w tabeli.
      12. Wybierz kartę Kolor na pasku narzędzi. Wybierz inny kolor dla każdej grupy zabiegowej/próbki. Kliknij przycisk Zakończ. Spowoduje to otwarcie strony Układ płyty.
        UWAGA: Liczby po lewej stronie są skorelowane z różnymi numerami próbek.
      13. Przypisz identyfikatory próbek, wykonując kroki 3.6.14–3.6.16.
      14. Wybierz SPL1 z lewego panelu. Użyj kursora, aby wybrać wells.
        UWAGA: Narzędzia automatycznego wyboru można dostosować w polu przypisania seryjnego. Liczba powtórzeń i orientacja układu mogą być wstępnie wyznaczone.
      15. Powtórz te czynności z innymi próbkami, aby zakończyć układ płyt. Gdy wszystko będzie zadowalające, kliknij przycisk OK.
      16. Na pasku narzędzi Plik wybierz opcję Przykładowe identyfikatory. Wypełnij kolumny Identyfikator próbki odpowiednimi informacjami dla każdej próbki (np. typem leku). Naciśnij przycisk OK.
    7. Zapisz protokół.
      1. Na pasku narzędzi kliknij opcję Plik > Zapisz protokół jako. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik. Wprowadź nazwę pliku. Kliknij przycisk Zapisz, aby zamknąć okno.
      2. Kliknij w Plik > Wyjdź na pasku narzędzi. Otworzy się zakładka, w której można zapisać zmiany w trybie ręcznym imagera. Wybierz opcję Nie.
      3. Otworzy się zakładka, w której można zapisać zmiany w eksperymencie 1. Wybierz opcję Nie. Otworzy się zakładka do aktualizacji definicji protokołu. Wybierz opcję Aktualizuj. Zamknij oprogramowanie.
  6. Zaimportuj protokół do BioSpa OnDemand i zakończ konfigurację eksperymentu.
    1. Otwórz oprogramowanie BioSpa OnDemand (oprogramowanie do planowania).
    2. Wybierz dostępne miejsce w oprogramowaniu.
    3. Wyjąć płytkę z systemu obrazowania żywych komórek. Kliknij przycisk Otwórz szufladę, aby uzyskać dostęp do odpowiedniego miejsca w oprogramowaniu do planowania i włóż płytę. Kliknij przycisk Zamknij szufladę.
      UWAGA: Ten krok można wykonać w dowolnym momencie po utworzeniu protokołu w kroku 3.5.7 powyżej. Tabliczka musi jednak znajdować się w cytacji 5, aby można było wykonać pomiar czasu w poniższym kroku 3.6.4.3.
    4. Zaimportuj protokół.
      1. Na karcie Informacje o procedurze wybierz opcję Użytkownik z menu rozwijanego. Obok miejsca Protokół kliknij przycisk Wybierz > Dodaj nowy wpis.
      2. Obok miejsca Protokół kliknij przycisk Select (Wybierz). Spowoduje to otwarcie nowego okna, w którym można przejść do żądanego protokołu w architekturze plików. Kliknij przycisk Otwórz, aby zaimportować protokół do oprogramowania do planowania.
      3. Wprowadź czas potrzebny na zobrazowanie płyty. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Lista protokołów Gen5.
        UWAGA: Ten krok jest szczególnie ważny w przypadku przeprowadzania kilku eksperymentów jednocześnie. Aby określić czas potrzebny do wykonania obrazu, kliknij przycisk Wykonaj teraz przebieg pomiaru czasu. Kliknij przycisk OK.
    5. Ustaw interwały obrazowania i zaplanuj eksperyment.
      1. W polu Interwał wprowadź interwał obrazowania wyznaczony w kroku 3.5.4.
      2. W obszarze Opcje czasu rozpoczęcia wybierz pozycję Gdy jest dostępny. W obszarze Czas trwania wybierz opcję Stały lub Ciągły.
        UWAGA: Można wyznaczyć konkretny czas rozpoczęcia zamiast uruchamiania protokołu w następnym dostępnym czasie. Wybranie opcji Stały czas trwania spowoduje ustawienie określonego punktu końcowego eksperymentu i wymaga od użytkownika wyznaczenia eksperymentalnego przedziału czasu. Ciągły czas trwania pozwoli na uruchomienie eksperymentu bez punktu końcowego i może zostać zakończony tylko przez zatrzymanie eksperymentu przez użytkownika.
      3. Kliknij opcję Blacha zestawieniowa/Zbiornik. Spowoduje to otwarcie sekwencji walidacji płyty. Otworzy się zakładka z proponowanym czasem pierwszego odczytu. Kliknij przycisk Tak, aby zaakceptować ten harmonogram.

4. Analiza obrazu w oprogramowaniu Gen5 (Rysunek 2)

  1. Otwórz moduł Analiza obrazu.
    1. Otwórz 5. kolejkę Gen5. W Menedżerze zadań wybierz pozycję Eksperymenty > Otwórz. Wybierz eksperyment, aby otworzyć plik. Kliknij opcję Blacha > Widok na pasku narzędzi.
    2. Zmień menu rozwijane Dane na Projekcja Z. Kliknij dwukrotnie interesującą Cię studnię. Wybierz opcję Analizuj > chcę skonfigurować nowy krok redukcji danych analizy obrazu. Kliknij przycisk OK.
  2. Analiza komórkowa
    1. Maska główna
      1. W obszarze Ustawienia analizy wybierz opcję Typ: Kanał analizy i detekcji komórkowej: ZProj[Tsf[Jasne pole]] (lewy panel, w środku).
      2. Kliknij przycisk Opcje. Spowoduje to otwarcie strony Maska podstawowa i liczba. W polu Próg zaznacz opcję Auto i kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij pole Podświetl obiekty (prawy panel, na dole), aby wyświetlić obiekty w wyznaczonym progu. W razie potrzeby dostosuj, aby uwzględnić interesujące obiekty.
        UWAGA: Ustawienia progowe są oparte na intensywności pikseli. Na przykład, jeśli próg jest ustawiony na 5000, piksele o intensywności większej niż 5000 zostaną uwzględnione w analizie.
      3. W obszarze Wybór obiektu określ minimalny i maksymalny rozmiar obiektu (μm). Dostosuj w razie potrzeby, aby wykluczyć zanieczyszczenia komórkowe/pojedyncze komórki.
        UWAGA: Rozmiar PDO może się znacznie różnić w zależności od modelu i typu. Użyj narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu Gen5, aby określić minimalne i maksymalne progi rozmiaru PDO dla każdego modelu. Użytkownicy mogą wybrać mniejszy minimalny próg wielkości PDO w stosunku do wartości podanej przez narzędzie pomiarowe, aby zapobiec wykluczeniu fragmentów PDO w późniejszych punktach czasowych po leczeniu odwykowym.
      4. Aby ograniczyć analizę do określonego obszaru odwiertu, usuń zaznaczenie opcji Analizuj cały obraz i kliknij przycisk Zatkaj. W oknie Image Plug (Wtyczka obrazu) użyj menu rozwijanego, aby wybrać opcję Plug shape (Kształt wtyczki). W razie potrzeby dostosuj parametry rozmiaru i położenia, aby dopasować je do obszaru zainteresowania.
        UWAGA: Ważne jest, aby zmaksymalizować liczbę PDO we wtyczce, jednocześnie wykluczając obszary wolne od PDO, aby zminimalizować tło. Wyznacz rozmiar wtyczki, który będzie konsekwentnie przechwytywał większość interesujących obiektów w replikacjach. Wygenerowanie wtyczki, która wyklucza również krawędzie kopuły, jest ważne, ponieważ wyklucza wszelkie obiekty, które mogą wydawać się zniekształcone z powodu załamania światła od ekstremalnej krzywizny kopuły wokół krawędzi. Opcja Uwzględnij obiekty krawędzi głównej może być również odznaczona, aby przechwytywać tylko całe PDO we wtyczce.
    2. Analiza subpopulacji. Przykład oznaczenia subpopulacji znajduje się w Rysunek 3.
      1. Kliknij pozycję Calculated Metrics (Metryki obliczeniowe) na pasku narzędzi Cellular Analysis (Analiza komórkowa). Kliknij Wybierz lub utwórz interesujące nas dane na poziomie obiektu (prawy róg, dół). W obszarze Dostępne metryki obiektów wybierz interesujące Cię metryki (np. cyrkularność) i kliknij przycisk Wstaw. Kliknij przycisk OK.
        UWAGA: Morfologia i gęstość każdego modelu PDO określi najlepsze wskaźniki zainteresowania w celu rozróżnienia subpopulacji.
      2. Kliknij Analiza subpopulacji na pasku narzędzi Analiza komórkowa. Kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nową subpopulację. Otworzy się wyskakujące okienko.
      3. W razie potrzeby wprowadź nazwę subpopulacji. W obszarze Metryki obiektu wybierz interesującą Cię metrykę i naciśnij Dodaj warunek. W oknie Edytuj warunek wprowadź parametry dla wybranej metryki obiektu. W razie potrzeby powtórz te czynności z dodatkowymi wskaźnikami.
        UWAGA: Parametry można regulować ręcznie lub ustawiać za pomocą wyszukiwarki. Na przykład, aby wykluczyć gruz, użytkownicy mogą dodać obszar jako metrykę obiektu i wybrać obiekty mniejsze niż 800. Kołowość jako metryka obiektu jest rutynowo używana, a wszystkie obiekty o kołowości większej niż 0,2-0,5 są uwzględniane, w zależności od modelu.
      4. W tabeli u dołu okna sprawdź żądane wyniki do wyświetlenia. Kliknij przycisk OK > Zastosuj.
      5. Aby wyświetlić obiekty w obrębie subpopulacji, użyj menu rozwijanego Szczegóły obiektu (prawy panel, środek) w celu wybrania subpopulacji. Obiekty, które mieszczą się w parametrach, zostaną wyróżnione na obrazie.
        UWAGA: Aby zmienić kolory podświetlenia maski głównej i subpopulacji, kliknij Ustawienia (prawy panel, na dole).
      6. Aby dostosować parametry subpopulacji, otwórz ponownie okno Analiza subpopulacji z paska narzędzi Analiza komórkowa. Wybierz subpopulację i kliknij przycisk Edytuj. Kliknij Dodaj krok.
        UWAGA: Spowoduje to zastosowanie tej samej analizy do wszystkich studzienek w eksperymencie we wszystkich punktach czasowych. W menu rozwijanym na stronie Macierz można wybrać różne metryki do indywidualnego wyświetlania.

5. Eksport danych z Gen5 do Excela

  1. Aby dostosować plik danych do eksportu, wybierz ikonę Kreator raportów/eksportu na pasku narzędzi. W oknie podręcznym kliknij pozycję Nowy eksport do programu Excel.
  2. Na stronie Właściwości okna podręcznego wybierz opcję Zakres > Blacha i Zawartość > Niestandardowe. Kliknij opcję Zawartość na pasku narzędzi. Kliknij Edytuj szablon, co spowoduje otwarcie programu Excel.
  3. W arkuszu kalkulacyjnym wybierz Dodatki > Tabela > Dane studni. Najedź kursorem na różne opcje, aby wyświetlić opcje eksportu. Wybierz interesującą Cię metrykę (np. Średnia obiektu[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    UWAGA: Układ płyty można dodać do szablonu analizy arkusza kalkulacyjnego, wybierając opcję Dodatki > Podsumowanie protokołu > Układ.
  4. Otworzy się okno Edycja. W polu Studnie oznacz studnie do eksportu według identyfikatora studni lub studni #. Wybierz przycisk OK. Szablon zostanie załadowany do pliku arkusza kalkulacyjnego. Zamknij arkusz kalkulacyjny. Szablon zostanie automatycznie zapisany.
  5. Kliknij przycisk OK w oknie Nowy eksport do programu Excel i zamknij okno Konstruktorzy raportu/eksportu.
  6. Kliknij ikonę Eksportuj na pasku narzędzi Gen5. Zaznacz pole obok żądanego pliku eksportu. Kliknij przycisk OK. Gen5 automatycznie wypełni szablon arkusza kalkulacyjnego i otworzy plik w programie Excel.

6. Zewnętrzna analiza danych

  1. Otwórz plik eksportu (.xlsx) w programie Excel.
  2. Dla każdej studni podziel każdą pojedynczą wartość przez wartość punktu czasowego 0:00 dla tej studni. Spowoduje to ustawienie punktu czasowego 0 równego 1, a każda wartość powyżej tego poziomu będzie względna w stosunku do początkowego odczytu.
  3. Otwórz nowy plik w oprogramowaniu do analizy danych. Wybierz opcję układu XY.
    UWAGA: W tym protokole użyto GraphPad Prism (wersja 9.5.1).
  4. Etykiety wejściowe dla każdej grupy danych. Skopiuj i wklej punkty czasowe i odpowiadające im znormalizowane wartości dla każdej grupy leczenia do tabeli Prism. Wykres danych zostanie wygenerowany automatycznie i można go znaleźć w sekcji Wykresy.

Wyniki

Naszym celem było wykazanie wykonalności zastosowania multipleksowego obrazowania żywych komórek do oceny odpowiedzi terapeutycznej organoidów pochodzących od pacjentów (PDO). Eksperymenty dowodzące koncepcji przeprowadzono w dwóch oddzielnych modelach PDO raka endometrium: ONC-10817 oraz ONC-10811 (dane dla ONC-10811 przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1 oraz Ryc. uzupełniającej 2). Kinetycznie monitorowano apoptozę (barwienie aneksyną V) oraz cytotoksyczność (wychwyt Cytotox Green) w odpowiedzi na staurosporynę, czynnik indukujący apoptozę. W szczególności PDO wysiano na płytki 96-dołkowe, potraktowano barwnikami Annexin V Red i Cytotox Green, a następnie pozostawiono w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc, zgodnie ze schematem przedstawionym na Ryc. 1. W dwóch niezależnych modelach PDO potwierdzono, że traktowanie barwnikami Annexin V i Cytotox Green nie jest toksyczne (Ryc. uzupełniająca 2). Następnego dnia PDO potraktowano zwiększającymi się stężeniami staurosporyny (0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Następnie w oprogramowaniu Gen5 opracowano protokoły i ustawiono eksperymenty na okres 5 dni, z obrazowaniem co 6 h. Dane analizowano przy użyciu funkcji Cellular Analysis w oprogramowaniu Gen5, zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Maska podstawowa (Primary Mask) została ustawiona za pomocą funkcji Auto threshold z odznaczoną opcją „Split touching objects” oraz parametrami rozmiaru: minimum: 30 µm i maksimum: 1000 µm. Subpopulację PDO zdefiniowano jako obiekty o kolistości > 0.25. Średnie intensywności obiektów w kanałach TRITC (aneksyna V, apoptoza) i GFP (Cytotox Green, cytotoksyczność) w obrębie wyznaczonej subpopulacji PDO wyeksportowano do pliku .xlsx w celu dalszej analizy. Średnią intensywność obiektów dla każdego dołka w każdym punkcie czasowym w obu kanałach, GFP i TRITC, znormalizowano do czasu 0. Znormalizowane dane fluorescencyjne przeniesiono następnie do pliku Prism i przedstawiono w formie wykresu liniowego.

Leczenie staurosporyną doprowadziło do znaczącego, zależnego od dawki wzrostu apoptozy oraz spadku żywotności komórek w czasie w porównaniu z kontrolą nośnikową, co potwierdzono poprzez wzrost średniej intensywności obiektów (Object Mean Intensity) w kanałach TRITC (anneksyna V) i GFP (Cytotox) (Rysunek 4, Rysunek 5, Wideo uzupełniające 1, Wideo uzupełniające 2, Wideo uzupełniające 3, Wideo uzupełniające 4, Wideo uzupełniające 5, Wideo uzupełniające 6, oraz Wideo uzupełniające 7). Dawki staurosporyny 500 nM, 100 nM i 10 nM spowodowały każda statystycznie istotny wzrost zarówno apoptozy, jak i cytotoksyczności w czasie (Rysunek 5A-C), a także na koniec eksperymentu (Rysunek 5E,F). Co więcej, staurosporyna w tych stężeniach skutecznie hamowała wzrost i formowanie się PDO, co objawiło się ogólnym spadkiem całkowitej powierzchni PDO, podczas gdy w studzienkach kontrolnych odnotowano wzrost całkowitej powierzchni PDO (Rysunek 4 i Rysunek 5D).

Ponieważ główną zaletą obrazowania żywych komórek jest możliwość skorygowania zmienności w wysiewaniu, przeprowadziliśmy eksperyment, w którym żywotność komórek oceniano jako parametr końcowy. Dane z testu końcowego służącego jako dowód koncepcji (proof-of-concept) zebrano z wykorzystaniem modelu PDO wygenerowanego z ksenoprzeszczepu pochodzenia pacjenta z rakiem prostaty. Obrazy w polu jasnym wykonano na początku okresu leczenia (dzień 0), po czym dodano odczyn z podwójnym barwnikiem, który mierzy zarówno żywotność (akrydyna pomarańczowa, AO), jak i śmierć komórek (jodek propidyny, PI). Komponent AO emituje zielony sygnał fluorescencyjny po związaniu się z dwuniciowym DNA, co jest wskaźnikiem żywotności komórek. Komponent PI barwi martwe komórki z jądrem i może być wykorzystany do ilościowego oznaczenia śmierci komórek w odpowiedzi na leczenie. Aby uwzględnić zmienność w wysiewaniu PDO, opracowaliśmy metodę określania liczby PDO na studzienkę w czasie 0 poprzez konwersję obrazów w polu jasnym na obrazy cyfrowego kontrastu fazowego (Rycina uzupełniająca 3 i Plik uzupełniający 1).

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) z raka prostaty traktowano daunorubicyną, chemioterapeutykiem wywołującym śmierć komórek, przez 7 dni. Po zakończeniu eksperymentu próbki barwiono AOPI zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 1, a następnie analizowano obrazy fluorescencyjne w programie Gen5. Rysunek 6A przedstawia panel obrazów z końcowego testu AOPI w 7. dniu. Porównując PDO traktowane nośnikiem (pierwszy wiersz) z PDO traktowanymi 10 µM daunorubicyny (drugi wiersz), zaobserwowano wyraźny spadek zielonej fluorescencji (miara żywotności, druga kolumna) oraz wzrost czerwonej fluorescencji (miara śmierci komórek, trzecia kolumna). Wyniki te zostały następnie poddane kwantyfikacji na Rysunku 6B, gdzie przedstawiono zestaw odczytów, jakie można uzyskać za pomocą techniki barwienia końcowego AOPI. Wykres w lewym górnym rogu przedstawia pomiar żywotności uzyskany z barwienia AO, znormalizowany do liczby PDO określonej na podstawie analizy obrazów w cyfrowym kontraście fazowym dla każdej studzienki w dniu 0. Dane te korelują z wynikiem wizualnym z Rysunku 6A, zgodnie z którym wraz ze wzrostem stężenia daunorubicyny żywotność drastycznie spadała. Potwierdza to również wykres w prawym górnym rogu, który wykazuje wzrost śmierci komórek, oznaczony zwiększoną czerwoną fluorescencją uzyskaną dzięki barwieniu PI.

Dane z barwienia PI połączono następnie z odczytem żywotności (AO), aby obliczyć stosunek komórek żywych do martwych (Rysunek 6B, wykres w lewym dolnym rogu). Stosunek ten jest przydatnym podejściem do określenia, czy lek ma działanie cytostatyczne czy cytotoksyczne. W szczególności lek cytotoksyczny osiągnie wartość znacznie bliższą 0 niż lek cytostatyczny, ponieważ lek cytostatyczny hamuje wzrost, ale może nie indukować śmierci komórek. Na koniec, pole powierzchni PDO można dokładnie obliczyć, wykorzystując zieloną fluorescencję barwnika AO, nawet gdy PDO mogą ulegać śmierci komórkowej i tworzyć pęcherzyki (blebbing). Wykres w prawym dolnym rogu przedstawia średnią powierzchnię PDO, która została obliczona jako suma powierzchni wykazanej w analizie subpopulacji podzielona przez liczbę PDO. Analiza powierzchni może dostarczyć dalszych informacji na temat tego, czy terapia jedynie hamuje wzrost PDO, czy faktycznie powoduje ich regresję. Należy zauważyć, że analiza średniej powierzchni PDO została przeprowadzona z wykorzystaniem kanału GFP i funkcji Cellular Analysis, w przeciwieństwie do Rysunku 5D, w którym do obliczenia całkowitej powierzchni PDO użyto obrazów w jasnym polu. Dane te podkreślają elastyczność potoku analitycznego w zależności od dostępności danych i zainteresowań użytkownika.

Na koniec porównaliśmy złoty standard pomiaru żywotności, CellTiter-Glo 3D, z pomiarem fluorescencyjnym żywotności z użyciem AOPI (Rycina 6C). Należy zauważyć, że dane w tym panelu nie zostały znormalizowane względem liczby PDO w czasie 0, ponieważ taka normalizacja nie jest zazwyczaj przeprowadzana przez laboratoria korzystające z zestawu CellTiter-Glo 3D. W obu testach zaobserwowaliśmy ten sam trend efektu leku, polegający na spadku żywotności PDO wraz ze wzrostem stężenia daunorubicyny. Jedyną różnicą wizualną między tymi odczytami było to, że analiza CellTiter-Glo 3D osiągnęła wartość IC50 wcześniej niż analiza AOPI i niemal całkowicie osiągnęła poziom 0. Wynik ten można wyjaśnić mechanizmem działania daunorubicyny. Daunorubicyna jest inhibitorem topoizomerazy II, który wprowadza pęknięcia dwuniciowe DNA, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego, a w konsekwencji do apoptozy14. Podczas zatrzymania cyklu komórkowego może dojść do wyczerpania ATP15. Biorąc pod uwagę, że test CellTiter-Glo 3D opiera się na reakcji ATP-lucyferazy w celu wygenerowania sygnału luminescencyjnego, stawiamy hipotezę, że silniejszy spadek żywotności komórek przy wyższych stężeniach daunorubicyny wynikał z wyczerpania ATP, a nie z całkowitej śmierci komórek. Potwierdzeniem tej tezy są obrazy na Rycynie 6A, które przedstawiają populację żyjących PDO w kulturze, co jest oznaczone zieloną fluorescencją.

Schemat obrazowania organoidów: wysiewanie organoidów, traktowanie odczynnikami fluorescencyjnymi, akwizycja obrazów, analiza.
Rycina 1: Przegląd protokołu wysiewania, obrazowania i analizy. PDO są wysiewane na płytkę 96-dołkową i traktowane barwnikami fluorescencyjnymi oraz lekami. Parametry obrazowania dla eksperymentu (np. czas ekspozycji, stos Z) są konfigurowane w oprogramowaniu Gen5. Obrazy są pozyskiwane za pomocą urządzenia Cytation 5 i przetwarzane w Gen5, a następnie dane są eksportowane do dalszej analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przebieg analizy obrazu mikroskopowego: schemat procesu segmentacji organoidów, obejmujący wyznaczanie obszaru zainteresowania (plug), ustawianie maski oraz definiowanie subpopulacji.
Rysunek 2: Przegląd funkcji Cellular Analysis. 1: Wyznaczenie obszaru (Plug): Obszar zainteresowania (plug) jest wyznaczany w celu objęcia analizą interesujących regionów. 2: Ustawienie maski podstawowej (Primary Mask): Maska podstawowa definiuje obiekty zainteresowania na podstawie ich rozmiaru oraz intensywności pikseli w wybranym kanale. Na tym reprezentatywnym obrazie obiekty zawarte w masce podstawowej są obrysowane kolorem fioletowym. 3: Definiowanie subpopulacji: Można zdefiniować dodatkową subpopulację, aby dalej doprecyzować badaną grupę obiektów. Subpopulacja na obrazie przykładowym (obrysowana kolorem żółtym) została zdefiniowana na podstawie kolistości (>0,25) oraz powierzchni (>800). Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu 4x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna, porównanie obrazowania komórek, połączone kanały TRITC i GFP w badaniu białek.
Rysunek 3: Przykłady maskowania subpopulacji z wykorzystaniem funkcji Cellular Analysis. Subpopulacje zostały zdefiniowane w kanale pola jasnego. Subpopulacja na obrazach przykładowych (obrysowana na żółto) została zdefiniowana na podstawie kołowości (>0,25) oraz powierzchni (>800). Obrazy zostały pozyskane przy użyciu obiektywu 4X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres skuteczności staurosporyny; stężenie leku vs. czas; analiza hamowania wzrostu komórek.
Rycina 4: Leczenie staurosporyną prowadzi do zależnego od dawki wzrostu apoptozy i cytotoksyczności. Przedstawiono obrazy w polu jasnym (obiektyw 4x) z nałożoną fluorescencją GFP i TRITC dla dawek staurosporyny 500 nM, 10 nM i 0,1 nM w trzech punktach czasowych: 0 h, 54 h, 114 h. Czerwony sygnał fluorescencyjny wskazuje na apoptozę (anneksyna V), a zielony sygnał fluorescencyjny wskazuje na cytotoksyczność (Cytotox). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki testu cytotoksyczności i apoptozy pokazujące intensywność GFP i TRITC w czasie podczas testu lekowego.
Rycina 5: Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek w celu oceny odpowiedzi PDO. Model PDO ONC-10817 wysiano na płytki 96-dołkowe i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C z barwnikami Annexin V Red (1:400) oraz Cytotox Green (200 nM). Następnego dnia PDO poddano działaniu zwiększających się stężeń staurosporyny i obrazowano co 6 h przez około 5 dni. (A,B) Zależny od czasu i dawki wzrost (A) cytotoksyczności lub (B) apoptozy w odpowiedzi na staurosporynę. Dane przedstawiono jako średnią intensywność obiektu (Object Mean Intensity) w kanale GFP lub TRITC. (C) Porównanie przebiegu czasowego apoptozy i cytotoksyczności w odpowiedzi na 100 nM lub 500 nM staurosporyny. Dane przedstawiono jako wartości średniej intensywności obiektu w kanałach GFP i TRITC. (D) Staurosporyna hamuje wzrost PDO. Dane przedstawiono jako średnią całkowitą powierzchnię PDO. Dane w A-D znormalizowano do liczby PDO w czasie 0 h w każdym dołku i przedstawiono jako średnią oraz błąd standardowy średniej (SEM). N=5 powtórzeń technicznych na grupę traktowaną. **** p < 0.0001 względem kontroli nośnika (vehicle control) za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (2-way ANOVA). (E) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu, GFP i TRITC organoidów PDO traktowanych 500 nM staurosporyny w porównaniu do nośnika na koniec eksperymentu (114 h). Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 4x. (F) Ilościowa ocena cytotoksyczności, apoptozy i żywotności w punkcie czasowym 114 h. Średnią intensywność obiektu GFP (lewa) i średnią intensywność obiektu TRITC (środek) obliczono dla punktu 114 h na podstawie wyników z paneli A-C. Żywotność (prawa) oceniono przy użyciu odczynnika CellTiter-Glo 3D zgodnie z protokołem producenta. Surowe wartości luminescencji (RLU) znormalizowano do całkowitej powierzchni PDO w czasie 0 h i przedstawiono jako krotność żywotności względem kontroli nośnika, którą przyjęto jako 1,0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 względem kontroli nośnika za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA) z testem post-hoc Dunnetta. N = 5 powtórzeń technicznych na grupę traktowaną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ daunorubicyny na żywotność organoidów; mikroskopia fluorescencyjna, żywotność, stosunki śmierci, wykresy stężeń leku.
Rycina 6: Wykorzystanie obrazowania żywych komórek w celu wspomagania normalizacji danych z testów końcowych. PDO traktowano zwiększającymi się stężeniami inhibitora topoizomerazy II, daunorubicyny, przez 7 dni. PDO poddano barwieniu roztworem AOPI i obrazowano zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 1. AO = pomarańcz akrydyna, miara żywotności (kanał GFP); PI = jodek propidyny, miara śmierci komórkowej (kanał Texas Red). (A) Reprezentatywne obrazy uzyskane przy użyciu barwienia AOPI po 7 dniach traktowania 10 µM daunorubicyną lub kontrolą nośnika (0,1% DMSO). (B) Różne odczyty z wykorzystaniem fluorescencji AOPI jako końcowej metody oceny żywotności/śmierci komórek. Szczegółowy opis metod analizy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. Górny lewy: analiza żywotności PDO po 7 dniach określona na podstawie barwienia AO. Górny prawy: analiza śmierci komórek za pomocą barwienia PI. Dane dla barwienia AO i PI znormalizowano do liczby PDO w czasie 0 h, a następnie do kontroli nośnika, którą ustawiono na 1,0, i przedstawiono jako średnią oraz odchylenie standardowe. Dolny lewy: obliczenie stosunku komórek żywych do martwych z wykorzystaniem średnich całek obiektów dla barwników AO i PI. Dolny prawy: powierzchnia PDO określona na podstawie barwienia AO. Analiza komórkowa została przeprowadzona w kanale GFP. (C) Porównanie dwóch metod testowania żywotności PDO. Po obrazowaniu żywotność oceniano przy użyciu odczynnika CellTiter-Glo 3D zgodnie z protokołem producenta. Krotność przeżycia względem kontroli nośnika przedstawiono dla zwiększających się stężeń daunorubicyny. Dane reprezentują średnią i odchylenie standardowe dla N = 6 powtórzeń technicznych na grupę traktowania; dane w panelu C nie zostały znormalizowane do czasu 0 h. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Leczenieliczba dołkówObjętość pożywkiAnneksyna100 µM Cytotoksyczność
RozcieńczanieTomRozcieńczanieTom
Multipleksowanie606,6 ml1:40016.5 µL200 nM13.2 µL

Tabela 1: Przykład eksperymentu z multipleksowaniem. Annexin V Red wiąże odsłoniętą fosfatydyloserynę na zewnętrznej warstwie błon komórkowych komórek apoptotycznych. Cytotox Green wnika do komórek z naruszoną integralnością błony i wiąże DNA.

Rycina uzupełniająca 1: Multipleksowe obrazowanie żywych komórek ONC-10811. PDO wysiano na płytki 96-dołkowe i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C z barwnikami Annexin V Red (1:400) oraz Cytotox Green (200 nM). Następnego dnia PDO poddano działaniu staurosporyny w rosnących stężeniach i obrazowano co 6 h przez 5 dni. (A) Zależny od czasu i dawki wzrost cytotoksyczności w odpowiedzi na staurosporynę. Dane przedstawiono jako średnią intensywność obiektu w kanale GFP. (B) Odpowiedź na dawkę staurosporyny w 114 h. Dane przedstawiono jako wartości średniej intensywności obiektu w kanale GFP w punkcie czasowym 114 h. (C) Zależny od czasu i dawki wzrost apoptozy w odpowiedzi na staurosporynę. Dane przedstawiono jako średnią intensywność obiektu w kanale TRITC. (D) Odpowiedź na dawkę staurosporyny w 114 h. Dane przedstawiono jako wartości średniej intensywności obiektu w kanale TRITC w punkcie czasowym 114 h. Dane w A i C znormalizowano do liczby PDO w czasie 0 h na poziomie dołka. N = 5 powtórzeń technicznych na jedną próbę w każdym modelu. **** p < 0.0001 vs. kontrola nośnika (vehicle control) za pomocą 2-way ANOVA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Traktowanie Annexin V i Cytotox nie wpływa na żywotność PDO. PDO wysiano na płytki 96-dołkowe i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C z barwnikami Annexin V Red (1:400) i Cytotox Green (200 nM). Po 24 h inkubacji żywotność oceniono za pomocą testu CellTiter-Glo 3D zgodnie z protokołem producenta. (A) Żywotność w PDO traktowanych barwnikami oraz w PDO nietraktowanych w punkcie czasowym 24 h. Przedstawiono zarówno wartości relatywnych jednostek światła (RLU), jak i wartości znormalizowane do sumarycznej powierzchni PDO. W szczególności wartość CellTiter-Glo3D RLU dla każdego dołka znormalizowano do sumy powierzchni PDO w tym dołku w momencie wysiewania (tj. bezpośrednio po dodaniu barwnika). Całkowitą powierzchnię PDO określono za pomocą obliczeń „Object Sum Area” w programie Cellular Analysis. N = 10. (B) Żywotność w PDO traktowanych barwnikami oraz w PDO nietraktowanych w punkcie czasowym 114 h. Przedstawiono zarówno surowe wartości luminescencji, jak i wartości znormalizowane do całkowitej powierzchni PDO. Wartość CellTiter-Glo3D RLU dla każdego dołka znormalizowano do sumy powierzchni PDO 24 h po wysiewaniu, co odpowiada czasowi 0 h w eksperymentach z obrazowaniem kinetycznym. N = 5. Istotność w A i B oceniono za pomocą nieparzystego testu t; wartości p są podane na wykresach. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 3: Analiza PDO bez użycia znaczników z wykorzystaniem cyfrowego kontrastu fazowego. Rycina ta zawiera reprezentatywne obrazy (obiektyw 2,5x) przedstawiające analizę bez użycia znaczników, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 1: Konfiguracja parametrów obrazowania dla analizy w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej (obrazy w polu jasnym/cyfrowym kontraście fazowym) oraz analiza obrazów cyfrowego kontrastu fazowego w oprogramowaniu Gen5. (A) Przykład obrazu w polu jasnym modelu PDXO raka prostaty w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej. (B) Obraz w polu jasnym z punktu A został przekształcony w obraz cyfrowego kontrastu fazowego. Obiekty ciemne na obrazie w polu jasnym stają się jasne na obrazie cyfrowego kontrastu fazowego i odwrotnie. (C) Przykład maskowania PDO z wykorzystaniem obrazu cyfrowego kontrastu fazowego. Należy zauważyć, że krawędzie interesujących obiektów stają się znacznie bardziej wyraźne w porównaniu z obrazami w polu jasnym. Na tym reprezentatywnym obrazie obiekty w masce głównej są obrysowane na żółto. Subpopulacja w punkcie (C) (obrysowana na różowo) została zdefiniowana na podstawie kolistości (>0,3), powierzchni (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 oraz Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. Parametry użyte na tej reprezentatywnej rycinie zostały zastosowane do danych na Rycini 6 w celu normalizacji do liczby komórek w dniu 0. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Modele PDO mogą różnić się morfologią i spójnością wysiewu. Panel górny: Przykłady różnego stopnia dyspersji PDO w kopułkach BME. Panel dolny: Reprezentatywne obrazy PDO niespójnych w porównaniu do PDO okrągłych. Wszystkie obrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopu EVOS. Powiększenia są zaznaczone. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Przykładowe obrazy z zastosowaniem analizy komórkowej (Cellular Analysis) w porównaniu do statystyk obrazu (Image Statistics) do kwantyfikacji fluorescencji. Dzięki funkcji analizy komórkowej użytkownicy mogą definiować konkretne populacje w obrębie obrazu i mierzyć fluorescencję w tych obszarach. Do pomiaru fluorescencji na obrazie można również wykorzystać statystyki obrazu, definiując próg pozwalający na wykluczenie sygnałów tła. Ograniczenia stosowania statystyk obrazu opisano w sekcji Dyskusja. Obrazy przedstawiono przy powiększeniu 4x. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Składniki pośrodka do hodowli organoidów. Należy zauważyć, że odczynniki zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli PDO z raka ginekologicznego. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 1: Film poklatkowy z traktowania 500 nM staurosporyną z obrazami uzyskanymi co 6 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 2: Film time-lapse z przebiegu traktowania 100 nM staurosporyną z obrazami pobieranymi co 6 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 3: Film poklatkowy z traktowania 10 nM staurosporyną z obrazami rejestrowanymi co 6 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 4: Film poklatkowy z obrazowaniem co 6 h podczas traktowania 1 nM staurosporyną. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 5: Film poklatkowy z obrazowaniem co 6 h podczas traktowania 0,1 nM staurosporyną. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 6: Film poklatkowy z traktowania 0.01 nM staurosporyną z obrazami pozyskiwanymi co 6 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 7: Film poklatkowy grupy kontrolnej (0,06% DMSO) z obrazami uzyskanymi co 6 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokoły uzupełniające. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Hodowle PDO stają się coraz bardziej popularnym systemem modelowym in vitro ze względu na ich zdolność do odzwierciedlania reakcji i zachowań komórkowych2. Poczyniono znaczne postępy w wytwarzaniu, hodowli i technikach ekspansji PDO, jednak metody analizy odpowiedzi terapeutycznych pozostają w tyle. Dostępne na rynku zestawy do oceny żywotności 3D są testami litycznego punktu końcowego, w których brakuje potencjalnie cennych danych dotyczących odpowiedzi kinetycznej i ogranicza się do późniejszych analiz za pomocą innych metod8. W nowych badaniach stosuje się obrazowanie żywych komórek do oceny odpowiedzi leków w modelach PDO. W tym miejscu przedstawiamy metodę oceny odpowiedzi terapeutycznych PDO w czasie z wykorzystaniem multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Multipleksowanie barwników fluorescencyjnych pozwala na jednoczesne ilościowe określenie różnych odpowiedzi komórkowych. Oprócz apoptozy i cytotoksyczności przewidujemy, że podejście to może zostać rozszerzone w przyszłych badaniach w celu zbadania innych efektów fenotypowych w PDO.

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół ma na celu uzyskanie kinetycznych obrazów jasnego pola i fluorescencyjnych PDO pokrytych jako kopuły w 96-dołkowej płytce. Kluczowe kroki obejmują 1) powlekanie, 2) leczenie barwnikiem i lekiem, 3) definiowanie parametrów obrazowania, 4) wstępne przetwarzanie i analizę obrazu po zakończeniu akwizycji obrazu kinetycznego oraz 5) eksport danych do analizy w innym oprogramowaniu statystycznym (rysunek 1). Nienaruszone PDO są siane na 96-dołkowej płytce w postaci kopułek BME o pojemności 5 μl składających się z predefiniowanego stosunku pożywki BME i pożywki do hodowli organoidów (zwykle 1:1). Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje UltiMatrix jako BME ze względu na minimalną zmienność między partiami i doskonałe właściwości optyczne do obrazowania. Konieczne mogą być modyfikacje w celu zbierania ChNP hodowanych w innych BME, takich jak Matrigel, a także w przypadku modeli, które są grudkowate i trudne do dysocjacji (zob. przykłady na rysunku uzupełniającym 4). Następnie barwniki fluorescencyjne dodaje się do pożywki do hodowli organoidów w czasie posiewu (dzień -1) w stężeniu 2x w objętości 100 μl i inkubuje przez noc w celu określenia wyjściowej śmierci komórki. Następnego dnia (dzień 0) leki lub inne zabiegi dodaje się do pożywki do hodowli organoidów w stężeniu 2x w objętości 100 μl, a następnie dodaje się do każdej studzienki do końcowej objętości 200 μl. Ostateczna objętość 200 μl zmniejsza efekt łąkotki podczas obrazowania. Obrazy kinetyczne są pozyskiwane za pomocą czytnika płytek Cytation 5 współpracującego z inkubatorem stołowym BioSpa. Inkubator BioSpa pozwala na inkubację płytek doświadczalnych w stałej temperaturze 37 °C i środowisku 5%CO2 . W BioSpa można przechowywać do 8 płytek, dzięki czemu można jednocześnie przeprowadzić 8 eksperymentów. Parametry obrazowania dla każdej płytki są ustawiane w oprogramowaniu Gen5 przy użyciu "Trybu ręcznego imagera" i zapisywane jako protokół. Protokół jest następnie wczytywany do oprogramowania do planowania (BioSpa OnDemand). Oprogramowanie BioSpa OnDemand automatyzuje proces pozyskiwania obrazów kinetycznych, w tym fizyczny transfer płytki z inkubatora BioSpa do Cytation 5 i dyktowanie, który protokół ma być uruchamiany w Gen5 w celu zbierania danych. Obrazy są analizowane przy użyciu funkcji analizy komórkowej w oprogramowaniu Gen5 (rysunek 2). Opisujemy konkretne metody analizy projekcji Z obrazów fluorescencyjnych i obrazów w jasnym polu. Szczegółowe metody analizy pojedynczych płaszczyzn Z i/lub tylko obrazów jasnego pola są podane w pliku uzupełniającym 1. Na koniec użytkownicy mogą zdefiniować określone cechy danych, takie jak obszar PDO, liczba i średnia intensywność fluorescencji, aby wyeksportować je jako arkusz kalkulacyjny Excel w celu późniejszej analizy statystycznej skutków działania leków.

Biorąc pod uwagę, że modele PDO są stosunkowo nowym systemem modelowym do badania skutków stosowania leków, wciąż pojawiają się metody uwzględniające warunki hodowli, w szczególności wzrostBME16. Większość badań oceniających odpowiedź PDO na leczenie farmakologiczne opiera się na testach końcowych opartych na ATP jako substytucie zdrowia komórek (CellTiter-Glo 3D). Metoda ta wymaga lizy komórek, co wyklucza późniejsze analizy. Alternatywne testy punktów końcowych, takie jak barwienie fluorescencyjne, obrazowanie w pojedynczym punkcie czasowym i śledzenie morfologiczne, dostarczyły innych wskaźników do scharakteryzowania odpowiedzi na lek, umożliwiając jednocześnie wykorzystanie próbki do dodatkowych celów. Na przykład protokoły utrwalania punktów końcowych w płytce zastosowano do wysokoprzepustowej analizy skutków działania leku17,18. Zaletą tej metody jest to, że omija ona obszerne przetwarzanie wymagane w typowej immunohistochemii i obrazowaniu immunofluorescencyjnym19 i jest szczególnie przydatna, gdy próbka jest ograniczona, jak ma to miejsce w przypadku modeli PDO. Jest również podatny na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej. Innym testem końcowym, który nie wymaga lizy komórek, jest obrazowanie żywych komórek za pomocą odczynników, takich jak jodek propidyny lub oranż akrydynowy. Nasza analiza porównawcza CellTiter-Glo 3D i AOPI, z których ten ostatni nie wymaga lizy komórek, w celu oceny żywotności i śmierci komórek (ryc. 6C) podkreśla zalety stosowania barwników do obrazowania żywych komórek w modelach PDO. Metoda ta została zastosowana przez kilka grup, w tym naszą, do oceny efektów fenotypowych na zakończenie eksperymentu 18,19,20. Jednak akwizycja danych kinetycznych przy użyciu metody fiksacji w studni lub obrazowania żywych komórek w punkcie końcowym wymaga znacznej próbki. Bezznacznikowa ocena morfologiczna PDO w czasie częściowo przezwycięża to ograniczenie i może być oceniana przy użyciu szerokiego zakresu metod obrazowania 8,10,17,18, jednak zmiany w morfologii mogą nie być reprezentatywne dla spektrum potencjalnych skutków leku, takich jak apoptoza i zmiany w żywotności komórek. Zaobserwowaliśmy znaczącą zmienność między modelami w zakresie zmian morfologicznych w odpowiedzi na leki. Na przykład niektóre ChNP zwiększą swoją powierzchnię, ponieważ przechodzą apoptozę, podczas gdy inne modele mogą się zmniejszyć. Kinetyczne oceny morfologiczne zostały zmultipleksowane za pomocą testów końcowych fluorescencyjnych komórek stałych lub żywych komórek w ograniczonej liczbie badań18,20. Przedstawione w niniejszym dokumencie metody są jednymi z pierwszych, które multipleksują różne barwniki fluorescencyjne w celu jednoczesnej oceny wielu efektów komórkowych w systemie o wysokiej przepustowości.

Jednym z największych ulepszeń zapewnionych przez kinetyczne obrazowanie żywych komórek jest to, że pokonuje ono kluczowe ograniczenia związane z testami punktów końcowych. Na przykład posiew równej liczby PDO na studzienkę jest technicznie trudny, ponieważ większość automatycznych liczników komórek jest bramkowana dla obiektów mniejszych niż 60 μm. Obrazowanie żywych komórek pozwala na normalizację do liczby lub obszaru PDO w czasie 0 h w każdym dołku, który można następnie wykorzystać do dostosowania do zmian w posiewie między studzienkami. Złotym standardem testu końcowego dla PDO jest zestaw CellTiter-Glo 3D, który mierzy ATP jako substytut żywotności komórek. Szeroko stosowaliśmy ten test w naszych badaniach ginekologicznych i raka prostatyPDO 13,21,22,23,24. Oprócz konieczności lizy komórek do pomiarów ATP, leki i inne metody terapeutyczne mogą zmieniać poziomy ATP, potencjalnie zapewniając niedokładną ocenę odpowiedzi terapeutycznej. Wykorzystanie barwników do obrazowania żywych komórek pozwala na ilościowe określenie szerszego zakresu określonych odpowiedzi komórkowych, takich jak apoptoza i cytotoksyczność. Co ważne, odczynniki te nie zaburzają żywotności komórek ani nie wywołują uszkodzeń DNA, jak ma to miejsce w przypadku jodku propidyny; pozwala to na wielokrotną ocenę odpowiedzi PDO w czasie. Chociaż nie badaliśmy zastosowania oranżu akrydynowego (AO) do pomiarów kinetycznych, mechanizm działania AO nie powinien wykluczać takiego zastosowania w przyszłości.

Guzy składają się z kilku odrębnych populacji komórek o różnych profilach genomowych i morfologiach. Ze względu na złożoną heterogeniczność modeli PDO, poszczególne reakcje PDO mogą się różnić, a śledzenie tych reakcji jest trudne. Nasz protokół zapewnia metodę oceny wielu wskaźników odpowiedzi PDO na zasadzie well-by-well. Jednak pewne względy techniczne nadal mają zastosowanie do obrazowania żywych komórek. Liczba dołków na płytce 24-dołkowej potrzebnej do zasiania płytki 96-dołkowej będzie zależeć od gęstości i tempa wzrostu każdego modelu PDO. Ponieważ zbrylanie się może zakłócić analizę obrazu (rysunek uzupełniający 4), modele PDO mogą wymagać dodatkowych etapów przetwarzania przed posiewem. W razie potrzeby ChNP mogą być mechanicznie ścinane podczas przetwarzania poprzez energiczne pipetowanie końcówką p200 o nieszerokim otworze. Trawienie enzymatyczne przy użyciu TrypLE Express może być również stosowane przed posiewem, aby promować dysocjację PDO i zmniejszać zbrylanie. Z naszego doświadczenia wynika, że długość inkubacji TrypLE jest bardzo zmienna w zależności od modelu. Dlatego inkubacja TrypLE powinna być zoptymalizowana dla każdego modelu, szczególnie jeśli naukowcy chcą uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Czas rekonwalescencji przed rozpoczęciem leczenia może być konieczny w przypadku modeli PDO, które są szczególnie wrażliwe na trawienie enzymatyczne.

Przedstawiamy metody dla konkretnych odczynników do obrazowania żywych komórek. Ograniczeniem w szerokim zastosowaniu przedstawionych tu metod jest brak odczynników, które są kompatybilne z BME. W przypadku innych barwników/odczynników, które nie zostały jeszcze zoptymalizowane do stosowania w PDO, może być konieczne dodatkowe rozwiązywanie problemów w celu określenia optymalnego stężenia i zminimalizowania wpływu rozpuszczalnika. W zależności od interesującego odczytu (np. apoptoza lub cytotoksyczność), w celu optymalizacji warunków odczynnika należy zastosować leczenie związkiem, o którym wiadomo, że indukuje śmierć komórki, takim jak staurosporyna lub daunorubicyna13 . Dodatkową kwestią jest optymalny czas integracji barwnika z kopułą BME. W naszych eksperymentach przeprowadzamy nocną inkubację przed zabiegiem, aby umożliwić całkowite wchłonięcie barwnika do kopuł, a także określić wyjściowy stan zdrowia komórek. Ponieważ intensywność sygnału będzie rosła z czasem, naukowcy powinni przeprowadzić badania pilotażowe z barwnikami, aby określić idealny czas ekspozycji pod koniec eksperymentu, aby uniknąć prześwietlenia obrazów. Wreszcie, odczynniki nie powinny zakłócać procesów komórkowych. Na przykład barwniki, które interkalują w DNA, nie są kompatybilne z obrazowaniem kinetycznym. Jednak obrazowanie żywych komórek może być wykorzystywane do normalizacji danych w testach punktów końcowych. Rzeczywiście, przedstawiamy dodatkową metodę ilościowego określania żywotności komórek i stosunku żywotności do martwych komórek za pomocą AOPI. W tym eksperymencie sygnał fluorescencyjny jest normalizowany do liczby PDO dla każdej studzienki, określanej przez obrazowanie żywych komórek w dniu 0 (dzień leczenia, ryc. 6).

Innym ograniczeniem tego artykułu jest poleganie na ręcznym pipetowaniu w eksperymentach, co może prowadzić do większej zmienności w powtórzeniach technicznych. Dalszą poprawę odtwarzalności danych można osiągnąć poprzez dodanie automatyzacji do innych etapów procesu doświadczalnego, takich jak zastosowanie zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy do powlekania i dozowania leków, jak wykazano na przykładzie innych 8,10. Wymaga to jednak dodatkowych inwestycji w infrastrukturę badawczą, która może nie być dostępna dla wszystkich badaczy. Biorąc pod uwagę niejednorodność obszaru PDO dla każdego modelu, normalizacja wyników do początkowej liczby lub obszaru PDO w czasie 0 h jest nadal użytecznym podejściem z automatycznym siewem.

Kluczową przewagą Cytation 5 nad innymi platformami obrazowania żywych komórek jest możliwość dostosowania funkcji obrazu i analizy. Jednak oprogramowanie Cytation 5/Gen5 ma stromą krzywą uczenia się i zakłada, że użytkownicy mają podstawową wiedzę na temat obrazowania. Jednym z celów tego artykułu jest dostarczenie instrukcji krok po kroku, jak zmniejszyć barierę dla innych badaczy w włączaniu zaawansowanych technik obrazowania żywych komórek do swoich programów badawczych PDO. Chociaż konkretne kroki analizy przedstawione w niniejszym dokumencie dotyczą jednego systemu, użytkownicy mogą zastosować zasady multipleksowania do innych platform, przy założeniu, że dalsza analiza może wymagać użycia oprogramowania innych firm, takiego jak NIH ImageJ.

Metryki analizy powinny być wybierane zarówno na podstawie celów eksperymentalnych, jak i warunków posiewu. Na przykład, jeśli eksperyment jest przeprowadzany przy użyciu barwnika fluorescencyjnego do ilościowego określenia śmierci komórki, intensywność fluorescencji jest skutecznym odczytem. Najbardziej efektywna metryka fluorescencji (całkowita fluorescencja w stosunku do średniej intensywności obiektu) będzie zależeć od warunków posiewu (rysunek uzupełniający 4). Jeśli ChNP są równomiernie rozproszone i mają bardziej okrągłą, spójną morfologię, fluorescencję można określić w określonej subpopulacji PDO. Specyficzną funkcją w oprogramowaniu Gen5 jest analiza komórkowa, a dane wyjściowe to średnia intensywność obiektu. Jeśli jednak model PDO jest grudkowaty lub ma morfologię dyskorezyjną, zalecamy ilościowe określenie sygnału fluorescencji na poziomie obrazu; tę funkcję można znaleźć w obszarze Statystyki obrazu, a dane wyjściowe to Całkowita intensywność fluorescencji. Chociaż metoda ta jest przydatna do obserwacji zmian na poziomie pojedynczego odwiertu, metryka ta nie jest specyficzna dla obiektów zainteresowania i może ulec błędnej zmianie, jeśli PDO wyjdą poza wyznaczony korek w czasie trwania eksperymentu. W scenariuszach, w których występują znaczne ilości szczątków lub martwe pojedyncze komórki, sugeruje się użycie analizy komórkowej w celu wyeliminowania dowolnego sygnału fluorescencyjnego, który nie jest konkretnie związany z PDO. Przykład wyników różnicowych z wykorzystaniem analizy komórkowej i statystyki obrazu przedstawiono na rysunku uzupełniającym 5.

Aby określić optymalny próg dla funkcji Statystyka obrazu, można użyć narzędzia linii. Za pomocą narzędzia linii użytkownicy mogą określić zakres intensywności fluorescencji na obrazie. Dolny próg ustawiamy jako 25% wartość szczytowej intensywności na obrazie. Aby wyświetlić obszary fluorescencyjne, które są uwzględnione w wyznaczonym progu, zaznacz pole "Wartości odstające progu". Może być konieczne dodatkowe dostrojenie dolnej wartości progowej.

Istotnym wyzwaniem w obrazowaniu żywych komórek jest przechowywanie ogromnej ilości danych generowanych w każdym eksperymencie. Jest to szczególnie istotne w przypadku kultur PDO, w których stosy Z są używane do obrazowania w kilku płaszczyznach ogniskowych i generowania projekcji Z. Istnieje wiele metod rozwiązania tego problemu. Po pierwsze, zapewnij odpowiednią pojemność magazynu. Zainstalowaliśmy trzy półprzewodnikowe dyski twarde o łącznej pojemności 17 TB. Inne opcje obejmują przesyłanie plików eksperymentalnych na zewnętrzne dyski twarde lub sieciową pamięć masową. Nie zaleca się bezpośredniego zapisywania plików w pamięci masowej w chmurze. Aby przeanalizować dane, które zostały zapisane na dysku zewnętrznym, po prostu przenieś eksperyment i pliki obrazu do komputera wyposażonego w oprogramowanie Gen5 (UWAGA: przesyłanie dużych plików może zająć więcej czasu). Przed analizą obrazy muszą zostać ponownie połączone z eksperymentem. Otwórz plik eksperymentu, kliknij w Protokół na pasku narzędzi, wybierz Opcje protokołu. Kliknij Opcje zapisywania obrazu, a następnie kliknij Wybierz nowy folder obrazów. Znajdź plik obrazu i kliknij Wybierz folder, aby ponownie połączyć.

W zależności od celów eksperymentu może być również odpowiednie użycie funkcji kategoryzacji w usłudze Gen5. Umieszczanie w kategoryzacji zmniejsza rozmiar pliku poprzez zmniejszenie liczby pikseli, co prowadzi do obniżenia rozdzielczości obrazu (patrz krok 3.5.3.2). Dlatego kategoryzacja nie jest zalecana, jeśli wymagane są obrazy o wysokiej rozdzielczości. Podczas korzystania z funkcji łączenia w grupy ustawienia ekspozycji będą musiały zostać dostosowane. Po utworzeniu pliku eksperymentalnego kliknij dwukrotnie sekcję Obraz, a następnie kliknij ikonę mikroskopu, aby ponownie otworzyć tryb ręczny wywoływacza. Użyj funkcji automatycznej ekspozycji lub ręcznie dostosuj ekspozycję w razie potrzeby.

Podsumowując, przedstawiono metody oceny apoptozy i zdrowia komórek PDO w odpowiedzi na czynniki cytotoksyczne. Przyszłe badania są niezbędne do optymalizacji metod i opracowania dodatkowych strategii analizy obrazowania kinetycznego PDO, takich jak inne fenotypy i działanie leków, które są cytostatyczne, a nie cytotoksyczne. Główną przeszkodą jest komercyjna dostępność barwników i odczynników, które są kompatybilne z BME. Wciąż potrzeba więcej pracy, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób kinetyczne obrazowanie żywych komórek może być w pełni wykorzystane do wydobycia jak największej ilości danych z tych modeli.

Oświadczenia

KWT jest współwłaścicielem firmy Immortagen Inc. CJD jest pracownikiem firmy Agilent. JSdB zasiadał w radach doradczych i otrzymywał honoraria od firm Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo i Vertex Pharmaceuticals; jest pracownikiem Instytutu Badań nad Rakiem (ICR), który otrzymał finansowanie lub inne wsparcie na swoje prace badawcze od AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer i Vertex, i który ma interes komercyjny w abirateronie, hamowaniu PARP w naprawie DNA wadliwych nowotworów, oraz inhibitory szlaku PI3K/AKT (brak dochodu osobistego); został wymieniony jako wynalazca, bez interesu finansowego w odniesieniu do patentu 8 822 438, złożonego przez Janssen, który obejmuje stosowanie octanu abirateronu z kortykosteroidami; był CI/PI w wielu sponsorowanych przez przemysł badaniach klinicznych; i jest starszym badaczem w Narodowym Instytucie Badań nad Zdrowiem (NIHR). Żadni inni autorzy nie mają do ujawnienia żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Dyrektorowi ds. Pozyskiwania Tkanek i dr Kristen Coleman z Uniwersytetu Iowa za dostarczenie próbek guzów od pacjentów oraz dr Sofii Gabrilovich z Wydziału Położnictwa i Ginekologii za pomoc w generowaniu modeli PDO. Dziękujemy również dr Valerie Salvatico (Agilent, USA) za krytyczną analizę manuskryptu. Uznajemy następujące źródła finansowania: NIH/NCI CA263783 i DOD CDMRP CA220729P1 do KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation i Medical Research Council do JSdB. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu lub analizie eksperymentów ani w podejmowaniu decyzji o publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówekDot Scientific Inc1008113
15 ml stożkowa probówka wirówkowaSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
96-dołkowa płytkaCorning Costar3596Podgrzana do 37 stopni; C
Płytka 96-dołkowaAgilent204626-100Podgrzana do 37 stopni C
A83-01Tocris2939Stężenie końcowe wynosi 500 nM (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Zaawansowany DMEM/F-12Gibco12634-010składnik pożywek do hodowli organoidów
B27 SuplementGibco17504044Stężenie końcowe wynosi 1x (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Automatyczny inkubator BioTek BioSpa 8AgilentBIOSPAG-SNInkubator stołowy; Oprogramowanie do planowania BioSpa OnDemand komunikuje się z Gen5 w celu przesyłania płytek między BioSpa a Cytation 5 w celu obrazowania (ten protokół wykorzystuje wersję 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNCzytnik płytek; Dla tego urządzenia używane jest oprogramowanie Gen5 (ten protokół używa wersji 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostuR& D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035Odtworzony w DMSO
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2438
EDTA (0,5 M)Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099Końcowe stężenie wynosi 10 &mikro; M (składnik pożywek do hodowli organoidów)
GlutamaxGibco35050-061Końcowe stężenie wynosi 1x (składnik pożywki do hodowli organoidów)
HEPESGibco15630-080Stężenie końcowe wynosi 10 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzki EGF, Białko rekombinowane bez zwierzątGibcoAF-100-15-1MGStężenie końcowe wynosi 0,5 ng/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzkie białko rekombinowane FGF-10Gibco100-26-1MGKońcowe stężenie wynosi 10 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzkie białko rekombinowane R-Spondin 1Gibco120-38-5UGKońcowe stężenie wynosi 250 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Roztwór podstawowy hydrokortyzonuStemCell Technologies7926Końcowe stężenie wynosi 500 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Kostka filtra obrazowania - GFPAgilent1225101
Kostka filtra obrazowania - TRITCAgilent1225125
Obrazowanie LED GFP / CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Czerwony barwnikSartorius4641Rozpuszczony w pożywce do hodowli organoidów
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633DMSO roztwór
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA7250Końcowe stężenie wynosi 1,25 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Roztwór do barwieniaFisher-Scientific13366169Dodaj 1:50 objętości
NikotynamidSigma-AldrichN0636Końcowe stężenie wynosi 10 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
NogginR& D Systems6057-NGStężenie końcowe wynosi 100 ng/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Stężenie końcowe wynosi 10 jednostek/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05Stężenie końcowe wynosi 100 &mikro; g/ml (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Rekombinowana ludzka heregulinaβ-1Pepro Tech100-03Końcowe stężenie wynosi 37,5 ng/ml (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Roztwór staurosporyny ze Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000Końcowe stężenie wynosi 5 &mikro; M (składnik pożywki do hodowli organoidów)
β-EstradiolSigma-AldrichE2758Stężenie końcowe wynosi 100 nM (składnik pożywki do hodowli organoidów)

Bibliografia

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy pochodzące od pacjentaanaliza odpowiedzi na lekiobrazowanie multipleksoweprzesiewowe badanie leków na organoidachbarwniki fluorescencyjneobrazowanie kinetyczneobrazowanie w stosie Zkwantyfikacja apoptozyfenotypowanie komórkowe
Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.