Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Streszczenie

Modele organoidowe (PDO) pochodzące od pacjentów to wielofunkcyjny system badawczy, który lepiej podsumowuje ludzką chorobę w porównaniu z liniami komórek rakowych. Modele PDO można generować poprzez hodowlę komórek nowotworowych pacjenta w zewnątrzkomórkowych ekstraktach błony podstawnej (BME) i posiewanie ich jako trójwymiarowych kopuł. Jednak dostępne na rynku odczynniki, które zostały zoptymalizowane pod kątem testów fenotypowych w hodowlach jednowarstwowych, często nie są kompatybilne z BME. W niniejszym artykule opisano metodę tworzenia modeli PDO i oceny skutków działania leku za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania żywych komórek. Ponadto stosujemy barwniki fluorescencyjne, które są zgodne z pomiarami kinetycznymi, aby jednocześnie określić ilościowo zdrowie komórek i apoptozę. Przechwytywanie obrazu można dostosować tak, aby odbywało się w regularnych odstępach czasu przez kilka dni. Użytkownicy mogą analizować efekty działania leków na pojedynczych obrazach w płaszczyźnie Z lub w projekcji Z obrazów szeregowych z wielu płaszczyzn ogniskowych. Za pomocą maskowania obliczane są określone parametry będące przedmiotem zainteresowania, takie jak liczba PDO, powierzchnia i intensywność fluorescencji. Dostarczamy dane potwierdzające słuszność koncepcji pokazujące wpływ czynników cytotoksycznych na zdrowie komórek, apoptozę i żywotność. Ta zautomatyzowana platforma obrazowania kinetycznego może zostać rozszerzona na inne odczyty fenotypowe, aby zrozumieć różnorodne efekty terapeutyczne w modelach PDO raka.

Wprowadzenie

Organoidy nowotworowe (PDO) pochodzące od pacjentów szybko stają się solidnym systemem modelowym do badania rozwoju raka i odpowiedzi terapeutycznych. PDO to trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórek, które podsumowują złożony profil genomowy i architekturę pierwotnego nowotworu1,2. W przeciwieństwie do tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kultur unieśmiertelnionych linii komórek nowotworowych, PDO wychwytują i utrzymują wewnątrznowotworową heterogeniczność3,4, co czyni je cennym narzędziem zarówno do badań mechanistycznych, jak i translacyjnych. Chociaż ChNP stają się coraz bardziej popularnym systemem modelowym, dostępne na rynku odczynniki i metody analizy efektów komórkowych, które są zgodne z kulturami PDO, są ograniczone.

Brak solidnych metod do analizy subtelnych zmian w odpowiedzi na leczenie utrudnia kliniczne tłumaczenie. Złoty standard odczynnika do zdrowia komórek w hodowlach 3D, CellTiter-Glo 3D, wykorzystuje poziomy ATP jako wyznacznik żywotności komórek5,6. Chociaż odczynnik ten jest przydatny do testów punktów końcowych, istnieje kilka zastrzeżeń, w szczególności brak możliwości wykorzystania próbek do innych celów po zakończeniu testu.

Obrazowanie żywych komórek to wyrafinowana forma mikroskopii kinetycznej, która w połączeniu z odczynnikami fluorescencyjnymi jest w stanie określić ilościowo różne odczyty zdrowia komórek w modelach PDO, w tym apoptozę7,8,9 i cytotoksyczność10. Rzeczywiście, obrazowanie żywych komórek było integralną częścią wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków na platformach 2D11,12. Systemy takie jak Incucyte sprawiły, że technologia ta stała się przystępna cenowo, a tym samym dostępna dla grup badawczych w różnych środowiskach. Jednak zastosowanie tych systemów do analizy kultur 3D jest wciąż w powijakach.

Tutaj opisujemy metodę oceny odpowiedzi na lek w modelach PDO raka za pomocą multipleksowanego obrazowania żywych komórek (Rysunek 1). Dzięki analizie obrazów w jasnym polu można kinetycznie monitorować zmiany w wielkości i morfologii PDO. Co więcej, procesy komórkowe można jednocześnie oznaczać ilościowo w czasie za pomocą odczynników fluorescencyjnych, takich jak czerwony barwnik anektyny V do apoptozy i zielony barwnik cytototoksyczny do cytotoksyczności. Przedstawione metody są zoptymalizowane pod kątem systemu obrazowania żywych komórek Cytation 5, ale protokół ten może być dostosowany do różnych platform obrazowania żywych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z użyciem próbek ludzkich nowotworów zostały sprawdzone i zatwierdzone przez University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protokół #201809807, i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszych poprawkach. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu. Kryteria włączenia obejmują diagnozę raka i dostępność próbek guza

.

1. Posiewanie nienaruszonych PDO w 96-dołkowej płytce

  1. Przygotuj odczynniki.
    1. Rozgrzej 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez noc i rozmroź BME przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj pełne pożywki do hodowli organoidów zoptymalizowane pod kątem hodowli typu nowotworu. Specyficzne pożywki hodowlane stosowane w doświadczeniach przedstawionych w niniejszym dokumencie przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.
      UWAGA: Składniki pożywki mogą wymagać modyfikacji dla różnych typów nowotworów. Na przykład pożywka do hodowli organoidów jest uzupełniana 100 nM estradiolem dla nowotworów ginekologicznych13. Przygotowane podłoże jest stabilne w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc. W celu długotrwałego przechowywania podwielokrotność pożywki należy rozmieścić w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować dwie oddzielne podwielokrotności pożywki do hodowli organoidów w temperaturze 4 °C i 37 °C. Na przykład, jeśli 60 studzienek jest sianych na 96-dołkowej płytce, użyj 6 ml ciepłych pożywek do hodowli organoidów i 150 ml lodowatych pożywek do hodowli organoidów.
  3. Przygotuj bufor do płukania organoidów: Uzupełnij 1x PBS o 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA i 10 μM Y-27632. Przechowywać w temperaturze 4 °C
  4. Zbieraj ChNP hodowane na 24-dołkowej płytce. Wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Zasysać media z każdej studzienki za pomocą systemu linii próżniowej.
    2. Dodać 500 μl lodowatego buforu do płukania organoidów i delikatnie pipetować 2-3x za pomocą pipetora o pojemności 1000 μl. Inkubować płytkę na lodzie przez 10 minut.
    3. Przenieść zawartość każdej studzienki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby upewnić się, że wszystkie ChNP są w zawiesinie, przepłukać każdą studzienkę dodatkowymi 300 μl organoidowego buforu do przemywania i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C
    4. Odessać supernatant z osadu BME/organoidu za pomocą systemu przewodów próżniowych, pozostawiając ~ 5 ml pozostałości w probówce. Dodać 20 ml organoidowego buforu do przemywania i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
    5. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze 4 °C. Zassać supernatant za pomocą systemu przewodów próżniowych, uważając, aby nie naruszyć osadu PDO.
  5. Posiewanie ChNP w 96-dołkowej płytce: Wykonaj wszystkie kroki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Zawiesić osad ChNP w odpowiedniej ilości lodowatej pożywki do hodowli organoidów, aby utworzyć zawiesinę PDO. Przenieść zawiesinę PDO do lodowatej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Aby obliczyć ilość pożywek do hodowli organoidów, należy określić liczbę studzienek, które należy posiać na płytce 96-dołkowej, biorąc pod uwagę, że PDO są posiewane w kopule o pojemności 5 μl w stosunku 1:1 pożywki do hodowli organoidów i BME. Na przykład, przy posiewaniu jednej płytki 96-dołkowej i użyciu tylko 60 wewnętrznych studzienek, całkowita potrzebna ilość zawiesiny PDO wyniesie 300 μl: 150 μl pożywki do hodowli organoidów i 150 μl BME. W przypadku modeli, które wykazują optymalny wzrost przy różnych procentach BME, stosunek BME: pożywki może zostać zmodyfikowany na tym etapie, chociaż ważne jest, aby ujednolicić stosunek we wszystkich testach dla każdego konkretnego modelu. Aby uwzględnić błąd pipetowania, dodaj 10% objętości do każdego składnika.
    2. Policz liczbę ChNP.
      1. Przenieść 2,5 μl zawiesiny ChNP do lodowatej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 2,5 μl BME. Przenieść mieszaninę 5 μl na czyste szklane szkiełko mikroskopowe. Nie należy zakładać szkiełka nasującego. Mieszanina zestali się w kopułę.
      2. Wizualizacja za pomocą mikroskopu jasnego pola z 4x. Policz liczbę PDO w mieszaninie 5 μL; celem jest uzyskanie około 25-50 PDO na kopułę o pojemności 5 μl.
        UWAGA: Jeżeli pożądana gęstość nie zostanie osiągnięta w badanej mieszaninie, należy dostosować końcową objętość zawiesiny ChNP, dodając więcej pożywki do hodowli organoidów lub odwirowując zawiesinę ChNP i ponownie zawieszając osad PDO w mniejszej objętości lodowatej pożywki do hodowli organoidów. Niezależnie od tego, w jaki sposób zawiesina ChNP jest modyfikowana na tym etapie, ostateczny stosunek BME: zawiesina ChNP w kroku 1.5.3. powinno być 1:1.
    3. Używając pipetora o pojemności 200 μl z końcówkami o szerokim otworze, ostrożnie wymieszaj zawiesinę PDO z równą ilością BME, aby uzyskać stosunek pożywki do hodowli organoidów w stosunku 1:1. Unikaj pęcherzyków, które zakłócą integralność kopuł.
    4. Używając pipetora o pojemności 20 μl, wysiew 5 μl kopułki w środku każdej studzienki wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki, wysiewając tylko wewnętrzne 60 dołków. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie PDO, należy okresowo pipetować zawartość probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipetora o pojemności 200 μl z końcówkami o szerokim otworze.
    5. Po wysianiu wszystkich dołków umieść pokrywkę na talerzu i delikatnie odwróć. Inkubować odwróconą płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby umożliwić zastygnięcie kopuły.
      UWAGA: Odwrócenie płytki zapewnia, że kopuła pożywki hodowlanej BME/organoidów zachowuje strukturę 3D, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do tworzenia PDO.
    6. Obrócić płytkę tak, aby znajdowała się pokrywką do góry i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.

2. Zabiegi i dodawanie barwników fluorescencyjnych do multipleksowania

  1. Podczas gdy kopuły BME krzepną w 96-dołkowych płytkach, przygotuj rozcieńczenia odczynników do obrazowania fluorescencyjnych żywych komórek. Szczegółowe parametry multipleksowania Annexin V Red Dye i Cytotox Green Dye są podane w niniejszym dokumencie.
  2. Przygotowanie odczynnika fluorescencyjnego (Dzień -1): Oblicz odpowiednią objętość pożywki do hodowli organoidów w oparciu o liczbę dołków, które mają być poddane obróbce, zakładając, że każda studzienka zostanie potraktowana 100 μl pożywki z barwnikiem. Rozcieńczyć barwnik we wstępnie ogrzanych organoidowych pożywkach hodowlanych do pożądanego stężenia.
    UWAGA: Całkowita ilość potrzebnego nośnika będzie się różnić w zależności od eksperymentu. Dodaj 10% do końcowej objętości, aby uwzględnić błąd pipetowania. Na przykład, aby poddać działaniu wewnętrznych 60 dołków płytki 96-dołkowej, należy przygotować 6,6 ml pożywki z barwnikiem (Tabela 1).
  3. Potraktuj każdą studzienkę 100 μl 2x pożywki do hodowli organoidów z dozowaniem barwnika. Dodać 200 μl sterylnego 1x PBS do zewnętrznych pustych dołków płytki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: PBS w studzienkach obwodowych zmniejsza parowanie mediów ze studzienek wewnętrznych.
  4. Dodawanie leków/środków leczniczych (Dzień 0): Przygotować leki we wstępnie podgrzanych pożywkach do hodowli organoidów o stężeniu 2x w objętości 100 μl na basenik.
    UWAGA: DMSO może być toksyczne dla komórek w wysokich stężeniach. W eksperymentach przeprowadzonych w tym badaniu nie jest przekroczone stężenie 0,1% DMSO. Oprócz leków, niektóre odczynniki fluorescencyjne są dystrybuowane jako roztwór DMSO. Ważne jest, aby podczas pracy z takimi odczynnikami uwzględnić całkowite stężenie DMSO.
  5. Dodaj 100 μl 2x dozowanej pożywki barwiącej do każdego dołka; unikaj tworzenia pęcherzyków.

3. Ustawianie parametrów obrazowania

  1. Umieść tabliczkę w cytacji 5. otwierać Oprogramowanie Gen5. Kliknij przycisk Nowe zadanie > trybie ręcznym programu Imager. Wybierz opcję Capture Now (Przechwyć teraz) i wprowadź następujące ustawienia: Obiektyw (wybierz żądane powiększenie); Filtr (wybierz mikropłytkę); Format mikropłytki (wybierz liczbę dołków); i Typ naczynia (wybierz typ tablicy). Kliknij opcję Użyj pokrywy i Użyj wolniejszej prędkości nośnika. Kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Typ naczynia: Bądź tak szczegółowy, jak to możliwe przy wyborze informacji o płycie, ponieważ oprogramowanie jest skalibrowane do określonej odległości od obiektywu do dna płyty dla każdego typu płyty i grubości tworzywa sztucznego.
    Wolniejsza prędkość nośnika: Zaznacz to pole, aby uniknąć zakłócania pracy kopuł podczas załadunku/rozładunku płyt.
  2. Utwórz Z-Stack, który będzie obrazował całą kopułę BME.
    1. Wybierz interesujące Cię źródło do wyświetlenia (lewy panel, poniżej histogramu).
    2. Wybierz kanał Jasne pole (lewy panel, górny). Kliknij opcję Automatyczna ekspozycja i dostosuj ustawienia zgodnie z potrzebami.
    3. Ustaw dolną i górną część karty Z-Stack: Rozwiń tryb obrazowania (lewy panel, środek). Zaznacz pole Z-Stack. Używając strzałek regulacji kursu (lewy panel, środek), klikaj regulację w dół, aż wszystkie PDO znajdą się, a następnie znikną i staną się rozmyte. Ustaw to jako spód stosu Z. Powtórz w przeciwnym kierunku, używając strzałek regulacji kursu, aby ustawić górną część Z-Stack.
    4. Aby upewnić się, że ustawienia Z-Stack są odpowiednie dla innych interesujących Cię studni, wybierz inną studnię (lewy panel, poniżej histogramu) i zwizualizuj górną i dolną część Z-Stack.
    5. Aby ręcznie wprowadzić pozycje ogniskowej, kliknij trzy kropki obok precyzyjnej regulacji (lewy panel, góra). Otworzy się okno; wpisz górną wartość Z-Stack (znajdującą się w lewym panelu, pośrodku, w obszarze Tryb obrazowania). Powtórz te czynności dla dolnej wartości Z-Stack. W razie potrzeby dostosuj, aby uchwycić żądany zakres Z, powtarzając krok 3.2.3. Jeśli konieczne były korekty, wybierz inną studnię, aby zweryfikować ustawienia.
  3. Ustaw ustawienia ekspozycji dla kanałów(-ów) fluorescencyjnych. Ustawienia są opisane dla dwóch kanałów fluorescencyjnych (GFP i TRITC). Konkretna liczba kanałów fluorescencyjnych będzie zależeć od eksperymentu i od tego, które kostki fluorescencyjne są zainstalowane w systemie obrazowania żywych komórek.
    UWAGA: Jeśli przewiduje się, że intensywność sygnału będzie znacznie wyższa pod koniec eksperymentu, użytkownicy powinni rozważyć przeprowadzenie eksperymentów testowych w celu określenia optymalnych ustawień ekspozycji na końcu eksperymentu, które można następnie zastosować podczas ustawiania parametrów początkowych.
    1. Rozwiń kartę Tryb obrazowania (lewy panel, środek) i otwórz Edytuj krok obrazowania. Pojawi się wyskakujące okienko.
    2. W obszarze Kanały kliknij bąbelek dla żądanej liczby kanałów. Wyznacz jeden kanał dla jasnego pola i dodatkowe kanały dla każdego kanału fluorescencyjnego. W tym przykładzie Kanał 1 = Jasne pole; Kanał 2 = GFP; Kanał 3 = TRITC. Korzystając z rozwijanych menu Kolory, wybierz odpowiednie ustawienie dla każdego kanału. Zamknij okno edycji, klikając przycisk OK.
    3. Skonfiguruj każdy kanał fluorescencyjny.
      1. Przełącz kanał na GFP (lewy panel, górny).
      2. Kliknij opcję Automatyczna ekspozycja (lewy panel, góra). Rozwiń kartę Ekspozycja (lewy panel, środek) i dostosuj ustawienia ekspozycji, aby zminimalizować sygnał tła.
      3. Skopiuj ustawienia ekspozycji na kartę Tryb obrazu, wykonując czynności 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Kliknij ikonę Kopiuj obok pola Edytuj krok obrazowania. Kliknij Edytuj krok obrazowania, co otworzy kolejne okno.
      5. Pod kanałem GFP kliknij ikonę Schowek w wierszu Ekspozycja, aby dodać ustawienia Oświetlenie, Czas integracji i Wzmocnienie kamery do kanału.
      6. Powtórz kroki 3.3.3.4-3.3.3.5 dla kanału TRITC. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno.
  4. Skonfiguruj kroki wstępnego przetwarzania obrazu i projekcji Z, aby zautomatyzować wstępne przetwarzanie obrazu.
    1. Kliknij ikonę aparatu (lewy panel, dolny róg). Otworzy się nowe okno.
    2. W obszarze Dodaj krok przetwarzania (lewy panel, na dole) kliknij Wstępne przetwarzanie obrazu. Otworzy się nowe okno.
    3. Na karcie Jasne pole usuń zaznaczenie opcji Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu.
    4. Upewnij się, że dla każdej karty Kanał fluorescencyjny jest zaznaczona opcja Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu. Usuń zaznaczenie opcji Użyj tych samych opcji co kanał 1 i kliknij przycisk OK. Okno zostanie zamknięte.
    5. W obszarze Dodaj krok przetwarzania kliknij Projekcja Z. Otworzy się nowe okno. W razie potrzeby dostosuj zakres przekroju (np. aby zawęzić zakres Z). Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
  5. Utwórz protokół.
    1. Kliknij w Zestaw obrazów na pasku narzędzi. W menu rozwijanym kliknij Utwórz eksperyment na podstawie tego zestawu obrazów. Okno obrazowania zostanie zamknięte i otworzy się okno procedury.
      UWAGA: Parametry wybrane w trybie ręcznym Imager zostaną automatycznie załadowane do nowego okna, w którym można utworzyć protokół eksperymentalny.
    2. Ustawianie temperatury i gradientu: Kliknij w Ustaw temperaturę pod nagłówkiem Czynności (po lewej). Otworzy się nowe okno. Wybierz opcję Inkubator włączony i ręcznie wprowadź żądaną temperaturę w obszarze Temperatura. Następnie w obszarze Gradient ręcznie wprowadź wartość 1. Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
      UWAGA: Utworzenie gradientu 1 °C zapobiegnie tworzeniu się kondensatu na pokrywie płytki.
    3. Wyznacz studzienki do obrazu.
      1. Kliknij dwukrotnie krok obrazu w obszarze Opis. Kliknij opcję Pełna blacha (prawy róg, góra). Spowoduje to otwarcie okna Układ płyty.
      2. Podświetl interesujące Cię studnie za pomocą kursora. Kliknij przycisk OK. W razie potrzeby zaznacz pola Autofocus Binning (Grupowanie autofokusa) i Capture Binning (Grupowanie przechwytywania). Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno.
        UWAGA: Łączenie w kategoryzację będzie wymagało dostosowania ekspozycji, jak opisano w kroku 3.3.3.2 powyżej. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z konkretnymi scenariuszami, w których ta funkcja może być używana.
    4. Ustawianie interwałów dla obrazowania kinetycznego.
      1. Kliknij Opcje pod nagłówkiem Inne (po lewej). Zaznacz pole Nieciągła procedura kinetyczna.
      2. W polu Szacowany łączny czas wprowadź czas wykonywania eksperymentu (np. 5 dni). W polu Szacowany interwał wprowadź interwał, aby zobrazować płytę (np. co 6 godzin).
      3. Kliknij opcję Wstrzymaj po każdym uruchomieniu, aby dać czas na przeniesienie płytki do inkubatora. Zamknij okno, wybierając przycisk OK.
    5. Zaktualizuj kroki redukcji danych.
      1. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno procedury. Otworzy się zakładka do aktualizacji kroków redukcji danych. Wybierz opcję Tak. Kliknij dwukrotnie Wstępne przetwarzanie obrazu. Klikaj różne kanały, aby zweryfikować ustawienia, a następnie kliknij przycisk OK.
      2. Kliknij dwukrotnie Projekcja Z. Klikaj różne kanały, aby zweryfikować ustawienia. Kliknij przycisk OK. Następnie ponownie kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Redukcja danych.
    6. Sformatuj układ blachy.
      1. Otwórz Kreatora układu blach i wyznacz typy studni, wykonując kroki 3.6.2-3.6.3.
      2. Kliknij ikonę Układ blachy na pasku narzędzi (lewy róg, góra), aby otworzyć Kreatora układu blachy.
      3. Zaznacz pola obok typów studni użytych w eksperymencie. W obszarze Kontrole testu wprowadź liczbę różnych typów kontroli za pomocą strzałek. Kliknij przycisk Dalej, aby otworzyć okno Assay Control #1.
      4. Ustawić warunki studzienki kontrolnej testu, wykonując kroki 3.6.5–3.6.8.
      5. W oknie Kontrolka testu #1 wprowadź etykietę kontrolną w polu Identyfikator układu płytki. W razie potrzeby wprowadź pełne imię i nazwisko w sąsiednim polu. Za pomocą strzałek należy wybrać liczbę powtórzeń dla odpowiedniego warunku kontrolnego.
      6. W przypadku korzystania z wielu stężeń lub serii rozcieńczeń w obrębie kontrolki, kliknij opcję Definiuj rozcieńczenia/stężenia i użyj menu rozwijanego, aby wybrać Typ. Wprowadź wartości dla każdego stężenia/rozcieńczenia w tabeli.
        UWAGA: Funkcja auto może być używana, jeśli stężenia zmieniają się o stały przyrost.
      7. Wybierz kartę Kolor na pasku narzędzi. Wybierz żądany kolor tekstu i kolor tła do sterowania z menu rozwijanego. Kliknij Dalej.
      8. Powtórz w razie potrzeby z dodatkowymi kontrolkami.
      9. Ustawić warunki studzienki próbki zgodnie z pkt 3.6.10-3.6.12.
      10. Na stronie Przykładowa konfiguracja wprowadź przykładowy prefiks identyfikatora (np. SPL). Wybierz liczbę powtórzeń za pomocą strzałek. W przypadku korzystania z próbek o różnych stężeniach poddanych działaniu substancji wybierz opcję Stężenia lub Rozcieńczenia z menu rozwijanego Typ. Wprowadź rozcieńczenia/stężenia w tabeli i wprowadź jednostki w polu Jednostka.
      11. Wybierz opcję Pola identyfikacyjne na pasku narzędzi. Wprowadź żądaną nazwę kategorii (np. identyfikator próbki, lek) w tabeli.
      12. Wybierz kartę Kolor na pasku narzędzi. Wybierz inny kolor dla każdej grupy zabiegowej/próbki. Kliknij przycisk Zakończ. Spowoduje to otwarcie strony Układ płyty.
        UWAGA: Liczby po lewej stronie są skorelowane z różnymi numerami próbek.
      13. Przypisz identyfikatory próbek, wykonując kroki 3.6.14–3.6.16.
      14. Wybierz SPL1 z lewego panelu. Użyj kursora, aby wybrać wells.
        UWAGA: Narzędzia automatycznego wyboru można dostosować w polu przypisania seryjnego. Liczba powtórzeń i orientacja układu mogą być wstępnie wyznaczone.
      15. Powtórz te czynności z innymi próbkami, aby zakończyć układ płyt. Gdy wszystko będzie zadowalające, kliknij przycisk OK.
      16. Na pasku narzędzi Plik wybierz opcję Przykładowe identyfikatory. Wypełnij kolumny Identyfikator próbki odpowiednimi informacjami dla każdej próbki (np. typem leku). Naciśnij przycisk OK.
    7. Zapisz protokół.
      1. Na pasku narzędzi kliknij opcję Plik > Zapisz protokół jako. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik. Wprowadź nazwę pliku. Kliknij przycisk Zapisz, aby zamknąć okno.
      2. Kliknij w Plik > Wyjdź na pasku narzędzi. Otworzy się zakładka, w której można zapisać zmiany w trybie ręcznym imagera. Wybierz opcję Nie.
      3. Otworzy się zakładka, w której można zapisać zmiany w eksperymencie 1. Wybierz opcję Nie. Otworzy się zakładka do aktualizacji definicji protokołu. Wybierz opcję Aktualizuj. Zamknij oprogramowanie.
  6. Zaimportuj protokół do BioSpa OnDemand i zakończ konfigurację eksperymentu.
    1. Otwórz oprogramowanie BioSpa OnDemand (oprogramowanie do planowania).
    2. Wybierz dostępne miejsce w oprogramowaniu.
    3. Wyjąć płytkę z systemu obrazowania żywych komórek. Kliknij przycisk Otwórz szufladę, aby uzyskać dostęp do odpowiedniego miejsca w oprogramowaniu do planowania i włóż płytę. Kliknij przycisk Zamknij szufladę.
      UWAGA: Ten krok można wykonać w dowolnym momencie po utworzeniu protokołu w kroku 3.5.7 powyżej. Tabliczka musi jednak znajdować się w cytacji 5, aby można było wykonać pomiar czasu w poniższym kroku 3.6.4.3.
    4. Zaimportuj protokół.
      1. Na karcie Informacje o procedurze wybierz opcję Użytkownik z menu rozwijanego. Obok miejsca Protokół kliknij przycisk Wybierz > Dodaj nowy wpis.
      2. Obok miejsca Protokół kliknij przycisk Select (Wybierz). Spowoduje to otwarcie nowego okna, w którym można przejść do żądanego protokołu w architekturze plików. Kliknij przycisk Otwórz, aby zaimportować protokół do oprogramowania do planowania.
      3. Wprowadź czas potrzebny na zobrazowanie płyty. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Lista protokołów Gen5.
        UWAGA: Ten krok jest szczególnie ważny w przypadku przeprowadzania kilku eksperymentów jednocześnie. Aby określić czas potrzebny do wykonania obrazu, kliknij przycisk Wykonaj teraz przebieg pomiaru czasu. Kliknij przycisk OK.
    5. Ustaw interwały obrazowania i zaplanuj eksperyment.
      1. W polu Interwał wprowadź interwał obrazowania wyznaczony w kroku 3.5.4.
      2. W obszarze Opcje czasu rozpoczęcia wybierz pozycję Gdy jest dostępny. W obszarze Czas trwania wybierz opcję Stały lub Ciągły.
        UWAGA: Można wyznaczyć konkretny czas rozpoczęcia zamiast uruchamiania protokołu w następnym dostępnym czasie. Wybranie opcji Stały czas trwania spowoduje ustawienie określonego punktu końcowego eksperymentu i wymaga od użytkownika wyznaczenia eksperymentalnego przedziału czasu. Ciągły czas trwania pozwoli na uruchomienie eksperymentu bez punktu końcowego i może zostać zakończony tylko przez zatrzymanie eksperymentu przez użytkownika.
      3. Kliknij opcję Blacha zestawieniowa/Zbiornik. Spowoduje to otwarcie sekwencji walidacji płyty. Otworzy się zakładka z proponowanym czasem pierwszego odczytu. Kliknij przycisk Tak, aby zaakceptować ten harmonogram.

4. Analiza obrazu w oprogramowaniu Gen5 (Rysunek 2)

  1. Otwórz moduł Analiza obrazu.
    1. Otwórz 5. kolejkę Gen5. W Menedżerze zadań wybierz pozycję Eksperymenty > Otwórz. Wybierz eksperyment, aby otworzyć plik. Kliknij opcję Blacha > Widok na pasku narzędzi.
    2. Zmień menu rozwijane Dane na Projekcja Z. Kliknij dwukrotnie interesującą Cię studnię. Wybierz opcję Analizuj > chcę skonfigurować nowy krok redukcji danych analizy obrazu. Kliknij przycisk OK.
  2. Analiza komórkowa
    1. Maska główna
      1. W obszarze Ustawienia analizy wybierz opcję Typ: Kanał analizy i detekcji komórkowej: ZProj[Tsf[Jasne pole]] (lewy panel, w środku).
      2. Kliknij przycisk Opcje. Spowoduje to otwarcie strony Maska podstawowa i liczba. W polu Próg zaznacz opcję Auto i kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij pole Podświetl obiekty (prawy panel, na dole), aby wyświetlić obiekty w wyznaczonym progu. W razie potrzeby dostosuj, aby uwzględnić interesujące obiekty.
        UWAGA: Ustawienia progowe są oparte na intensywności pikseli. Na przykład, jeśli próg jest ustawiony na 5000, piksele o intensywności większej niż 5000 zostaną uwzględnione w analizie.
      3. W obszarze Wybór obiektu określ minimalny i maksymalny rozmiar obiektu (μm). Dostosuj w razie potrzeby, aby wykluczyć zanieczyszczenia komórkowe/pojedyncze komórki.
        UWAGA: Rozmiar PDO może się znacznie różnić w zależności od modelu i typu. Użyj narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu Gen5, aby określić minimalne i maksymalne progi rozmiaru PDO dla każdego modelu. Użytkownicy mogą wybrać mniejszy minimalny próg wielkości PDO w stosunku do wartości podanej przez narzędzie pomiarowe, aby zapobiec wykluczeniu fragmentów PDO w późniejszych punktach czasowych po leczeniu odwykowym.
      4. Aby ograniczyć analizę do określonego obszaru odwiertu, usuń zaznaczenie opcji Analizuj cały obraz i kliknij przycisk Zatkaj. W oknie Image Plug (Wtyczka obrazu) użyj menu rozwijanego, aby wybrać opcję Plug shape (Kształt wtyczki). W razie potrzeby dostosuj parametry rozmiaru i położenia, aby dopasować je do obszaru zainteresowania.
        UWAGA: Ważne jest, aby zmaksymalizować liczbę PDO we wtyczce, jednocześnie wykluczając obszary wolne od PDO, aby zminimalizować tło. Wyznacz rozmiar wtyczki, który będzie konsekwentnie przechwytywał większość interesujących obiektów w replikacjach. Wygenerowanie wtyczki, która wyklucza również krawędzie kopuły, jest ważne, ponieważ wyklucza wszelkie obiekty, które mogą wydawać się zniekształcone z powodu załamania światła od ekstremalnej krzywizny kopuły wokół krawędzi. Opcja Uwzględnij obiekty krawędzi głównej może być również odznaczona, aby przechwytywać tylko całe PDO we wtyczce.
    2. Analiza subpopulacji. Przykład oznaczenia subpopulacji znajduje się w Rysunek 3.
      1. Kliknij pozycję Calculated Metrics (Metryki obliczeniowe) na pasku narzędzi Cellular Analysis (Analiza komórkowa). Kliknij Wybierz lub utwórz interesujące nas dane na poziomie obiektu (prawy róg, dół). W obszarze Dostępne metryki obiektów wybierz interesujące Cię metryki (np. cyrkularność) i kliknij przycisk Wstaw. Kliknij przycisk OK.
        UWAGA: Morfologia i gęstość każdego modelu PDO określi najlepsze wskaźniki zainteresowania w celu rozróżnienia subpopulacji.
      2. Kliknij Analiza subpopulacji na pasku narzędzi Analiza komórkowa. Kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nową subpopulację. Otworzy się wyskakujące okienko.
      3. W razie potrzeby wprowadź nazwę subpopulacji. W obszarze Metryki obiektu wybierz interesującą Cię metrykę i naciśnij Dodaj warunek. W oknie Edytuj warunek wprowadź parametry dla wybranej metryki obiektu. W razie potrzeby powtórz te czynności z dodatkowymi wskaźnikami.
        UWAGA: Parametry można regulować ręcznie lub ustawiać za pomocą wyszukiwarki. Na przykład, aby wykluczyć gruz, użytkownicy mogą dodać obszar jako metrykę obiektu i wybrać obiekty mniejsze niż 800. Kołowość jako metryka obiektu jest rutynowo używana, a wszystkie obiekty o kołowości większej niż 0,2-0,5 są uwzględniane, w zależności od modelu.
      4. W tabeli u dołu okna sprawdź żądane wyniki do wyświetlenia. Kliknij przycisk OK > Zastosuj.
      5. Aby wyświetlić obiekty w obrębie subpopulacji, użyj menu rozwijanego Szczegóły obiektu (prawy panel, środek) w celu wybrania subpopulacji. Obiekty, które mieszczą się w parametrach, zostaną wyróżnione na obrazie.
        UWAGA: Aby zmienić kolory podświetlenia maski głównej i subpopulacji, kliknij Ustawienia (prawy panel, na dole).
      6. Aby dostosować parametry subpopulacji, otwórz ponownie okno Analiza subpopulacji z paska narzędzi Analiza komórkowa. Wybierz subpopulację i kliknij przycisk Edytuj. Kliknij Dodaj krok.
        UWAGA: Spowoduje to zastosowanie tej samej analizy do wszystkich studzienek w eksperymencie we wszystkich punktach czasowych. W menu rozwijanym na stronie Macierz można wybrać różne metryki do indywidualnego wyświetlania.

5. Eksport danych z Gen5 do Excela

  1. Aby dostosować plik danych do eksportu, wybierz ikonę Kreator raportów/eksportu na pasku narzędzi. W oknie podręcznym kliknij pozycję Nowy eksport do programu Excel.
  2. Na stronie Właściwości okna podręcznego wybierz opcję Zakres > Blacha i Zawartość > Niestandardowe. Kliknij opcję Zawartość na pasku narzędzi. Kliknij Edytuj szablon, co spowoduje otwarcie programu Excel.
  3. W arkuszu kalkulacyjnym wybierz Dodatki > Tabela > Dane studni. Najedź kursorem na różne opcje, aby wyświetlić opcje eksportu. Wybierz interesującą Cię metrykę (np. Średnia obiektu[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    UWAGA: Układ płyty można dodać do szablonu analizy arkusza kalkulacyjnego, wybierając opcję Dodatki > Podsumowanie protokołu > Układ.
  4. Otworzy się okno Edycja. W polu Studnie oznacz studnie do eksportu według identyfikatora studni lub studni #. Wybierz przycisk OK. Szablon zostanie załadowany do pliku arkusza kalkulacyjnego. Zamknij arkusz kalkulacyjny. Szablon zostanie automatycznie zapisany.
  5. Kliknij przycisk OK w oknie Nowy eksport do programu Excel i zamknij okno Konstruktorzy raportu/eksportu.
  6. Kliknij ikonę Eksportuj na pasku narzędzi Gen5. Zaznacz pole obok żądanego pliku eksportu. Kliknij przycisk OK. Gen5 automatycznie wypełni szablon arkusza kalkulacyjnego i otworzy plik w programie Excel.

6. Zewnętrzna analiza danych

  1. Otwórz plik eksportu (.xlsx) w programie Excel.
  2. Dla każdej studni podziel każdą pojedynczą wartość przez wartość punktu czasowego 0:00 dla tej studni. Spowoduje to ustawienie punktu czasowego 0 równego 1, a każda wartość powyżej tego poziomu będzie względna w stosunku do początkowego odczytu.
  3. Otwórz nowy plik w oprogramowaniu do analizy danych. Wybierz opcję układu XY.
    UWAGA: W tym protokole użyto GraphPad Prism (wersja 9.5.1).
  4. Etykiety wejściowe dla każdej grupy danych. Skopiuj i wklej punkty czasowe i odpowiadające im znormalizowane wartości dla każdej grupy leczenia do tabeli Prism. Wykres danych zostanie wygenerowany automatycznie i można go znaleźć w sekcji Wykresy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Naszym celem było wykazanie wykonalności zastosowania multipleksowego obrazowania żywych komórek do oceny odpowiedzi terapeutycznej organoidów pochodzących od pacjentów (PDO). Eksperymenty dowodzące koncepcji przeprowadzono w dwóch oddzielnych modelach PDO raka endometrium: ONC-10817 oraz ONC-10811 (dane dla ONC-10811 przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1 oraz Ryc. uzupełniającej 2). Kinetycznie monitorowano apoptozę (barwienie aneksyną V) oraz cytotoksyczność (wychwyt Cytotox Green) w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hodowle PDO stają się coraz bardziej popularnym systemem modelowym in vitro ze względu na ich zdolność do odzwierciedlania reakcji i zachowań komórkowych2. Poczyniono znaczne postępy w wytwarzaniu, hodowli i technikach ekspansji PDO, jednak metody analizy odpowiedzi terapeutycznych pozostają w tyle. Dostępne na rynku zestawy do oceny żywotności 3D są testami litycznego punktu końcowego, w których brakuje potencjalnie cennych danych dotyczących odpowiedzi kinetycznej i ogranicza się do późniejszych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

KWT jest współwłaścicielem firmy Immortagen Inc. CJD jest pracownikiem firmy Agilent. JSdB zasiadał w radach doradczych i otrzymywał honoraria od firm Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo i Vertex Pharmaceuticals; jest pracownikiem Instytutu Badań nad Rakiem (ICR), który otrzymał finansowanie lub inne wsparcie na swoje prace badawcze od AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer i Vertex, i który ma interes komercyjny w abirateronie, hamowaniu PARP w naprawie DNA wadliwych nowotworów, oraz inhibitory szlaku PI3K/AKT (brak dochodu osobistego); został wymieniony jako wynalazca, bez interesu finansowego w odniesieniu do patentu 8 822 438, złożonego przez Janssen, który obejmuje stosowanie octanu abirateronu z kortykosteroidami; był CI/PI w wielu sponsorowanych przez przemysł badaniach klinicznych; i jest starszym badaczem w Narodowym Instytucie Badań nad Zdrowiem (NIHR). Żadni inni autorzy nie mają do ujawnienia żadnych potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Dyrektorowi ds. Pozyskiwania Tkanek i dr Kristen Coleman z Uniwersytetu Iowa za dostarczenie próbek guzów od pacjentów oraz dr Sofii Gabrilovich z Wydziału Położnictwa i Ginekologii za pomoc w generowaniu modeli PDO. Dziękujemy również dr Valerie Salvatico (Agilent, USA) za krytyczną analizę manuskryptu. Uznajemy następujące źródła finansowania: NIH/NCI CA263783 i DOD CDMRP CA220729P1 do KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation i Medical Research Council do JSdB. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu lub analizie eksperymentów ani w podejmowaniu decyzji o publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówekDot Scientific Inc1008113
15 ml stożkowa probówka wirówkowaSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
96-dołkowa płytkaCorning Costar3596Podgrzana do 37 stopni; C
Płytka 96-dołkowaAgilent204626-100Podgrzana do 37 stopni C
A83-01Tocris2939Stężenie końcowe wynosi 500 nM (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Zaawansowany DMEM/F-12Gibco12634-010składnik pożywek do hodowli organoidów
B27 SuplementGibco17504044Stężenie końcowe wynosi 1x (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Automatyczny inkubator BioTek BioSpa 8AgilentBIOSPAG-SNInkubator stołowy; Oprogramowanie do planowania BioSpa OnDemand komunikuje się z Gen5 w celu przesyłania płytek między BioSpa a Cytation 5 w celu obrazowania (ten protokół wykorzystuje wersję 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNCzytnik płytek; Dla tego urządzenia używane jest oprogramowanie Gen5 (ten protokół używa wersji 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostuR& D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035Odtworzony w DMSO
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2438
EDTA (0,5 M)Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099Końcowe stężenie wynosi 10 &mikro; M (składnik pożywek do hodowli organoidów)
GlutamaxGibco35050-061Końcowe stężenie wynosi 1x (składnik pożywki do hodowli organoidów)
HEPESGibco15630-080Stężenie końcowe wynosi 10 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzki EGF, Białko rekombinowane bez zwierzątGibcoAF-100-15-1MGStężenie końcowe wynosi 0,5 ng/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzkie białko rekombinowane FGF-10Gibco100-26-1MGKońcowe stężenie wynosi 10 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Ludzkie białko rekombinowane R-Spondin 1Gibco120-38-5UGKońcowe stężenie wynosi 250 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Roztwór podstawowy hydrokortyzonuStemCell Technologies7926Końcowe stężenie wynosi 500 ng / ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Kostka filtra obrazowania - GFPAgilent1225101
Kostka filtra obrazowania - TRITCAgilent1225125
Obrazowanie LED GFP / CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Czerwony barwnikSartorius4641Rozpuszczony w pożywce do hodowli organoidów
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633DMSO roztwór
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA7250Końcowe stężenie wynosi 1,25 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Roztwór do barwieniaFisher-Scientific13366169Dodaj 1:50 objętości
NikotynamidSigma-AldrichN0636Końcowe stężenie wynosi 10 mM (składnik pożywki do hodowli organoidów)
NogginR& D Systems6057-NGStężenie końcowe wynosi 100 ng/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Stężenie końcowe wynosi 10 jednostek/ml (składnik pożywki do hodowli organoidów)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05Stężenie końcowe wynosi 100 &mikro; g/ml (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Rekombinowana ludzka heregulinaβ-1Pepro Tech100-03Końcowe stężenie wynosi 37,5 ng/ml (składnik pożywek do hodowli organoidów)
Roztwór staurosporyny ze Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000Końcowe stężenie wynosi 5 &mikro; M (składnik pożywki do hodowli organoidów)
β-EstradiolSigma-AldrichE2758Stężenie końcowe wynosi 100 nM (składnik pożywki do hodowli organoidów)

Bibliografia

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Organoidy pochodzące od pacjentaanaliza odpowiedzi na lekiobrazowanie multipleksoweprzesiewowe badanie leków na organoidachbarwniki fluorescencyjneobrazowanie kinetyczneobrazowanie w stosie Zkwantyfikacja apoptozyfenotypowanie komórkowe
Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.