Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Streszczenie

Opracowaliśmy prosty system przesiewowy do oceny toksyczności nerwowo-mięśniowej i ogólnej w zarodkach danio pręgowanego. System modułowy składa się z przetworników elektrodynamicznych, nad którymi można umieścić szalki do hodowli tkankowych z zarodkami. Można połączyć wiele takich par naczyń do hodowli tkankowej głośnika. Bodźce wibracyjne generowane przez przetworniki elektrodynamiczne wywołują w zarodkach charakterystyczną reakcję zaskoczenia i ucieczki. Napędzany paskiem napęd liniowy sekwencyjnie umieszcza kamerę nad każdym głośnikiem, aby rejestrować ruch zarodków. W ten sposób można zwizualizować i określić ilościowo zmiany w reakcji na przerażenie spowodowane śmiertelnością lub toksycznością nerwowo-mięśniową związków chemicznych. Przedstawiamy przykładowy przebieg procesu badań przesiewowych związków chemicznych przy użyciu tego systemu, w tym przygotowanie zarodków i roztworów leczniczych, działanie systemu rejestracji oraz analizę danych w celu obliczenia wzorcowych wartości stężeń związków aktywnych w teście. Modułowy montaż oparty na dostępnych na rynku prostych komponentach sprawia, że system ten jest zarówno ekonomiczny, jak i elastycznie dostosowujący się do potrzeb konkretnych konfiguracji laboratoryjnych i celów przesiewowych.

Wprowadzenie

W ostatnich latach, danio pręgowany stał się bardzo popularnym organizmem modelowym do oceny efektów związków chemicznych, obejmując obszary badawcze od opracowywania leków po toksykologię środowiskową¹. Jako kręgowce, danio pręgowany ma wiele wspólnych aspektów swojego składu genetycznego i ogólnej fizjologii z ludźmi^2,3. Dlatego wyniki uzyskane w tym modelu często mają bezpośrednie znaczenie dla zdrowia człowieka. Kilka kandydatów na leki, które są obecnie w fazie badań klinicznych, zostało zidentyfikowanych w złożonych badaniach przesiewowych przy użyciu danio pręgowanego⁴.

Ocena toksyczności to jedno z głównych zastosowań, gdzie interesujące są testy z wykorzystaniem etapów embrionalnych danio pręgowanego. Istnieją różne wytyczne Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) dotyczące stosowania danio pręgowanego w testach toksyczności środowiskowej^5,6. Niewielki rozmiar i szybki rozwój zarodków danio pręgowanego sprawiają, że doskonale nadają się one do badań przesiewowych w skali od średniej do wysokiej przepustowości^1,3,4. Toksykologiczne punkty końcowe, na które ukierunkowane są takie badania, obejmują wady rozwojowe i śmiertelność embrionów⁷, zaburzenia endokrynologiczne⁸, toksyczność narządów⁹ oraz oceny behawioralne wskazujące na toksyczność neuronalną^10,11. Testy behawioralne są możliwe, ponieważ zarodki danio pręgowanego wykazują różne rodzaje reakcji lokomotorycznych na różne bodźce w zależności od ich etapu rozwoju. Na przykład zarodki 1 dzień po zapłodnieniu (dpf) wykazują spontaniczne zwijanie ogona¹² i reagują na sekwencję impulsów świetlnych typową sekwencją ruchów, tzw. reakcją fotomotoryczną (PMR)¹⁰. Po wykluciu, zwykle występującym około 48-72 godzin po zapłodnieniu (hpf), swobodnie pływające eleutheroembryos¹³ stopniowo rozwijają reakcje zaskoczenia i ucieczki na bodźce wibracyjne, zaczynając około 4 dpf¹⁴. Reakcje te charakteryzują się charakterystycznym zgięciem w kierunku przeciwnym do kierunku bodźca (tzw. C-bend lub C-start), po którym następuje mniejsze przeciwzgięcie i zachowanie podczas pływania^14,15,16,17. Warto zauważyć, że zachowania embrionalne są regulowane przez obwody neuronalne wykorzystujące różne systemy neuroprzekaźników, co pozwala na badanie efektów związków chemicznych ukierunkowanych na te systemy. Na przykład test PMR ujawnił wpływ związków zakłócających sygnalizację cholinergiczną, adrenergiczną i dopaminergiczną¹⁰, podczas gdy reakcja zaskoczenia obejmuje neurony cholinergiczne, glutaminergiczne i glicynergiczne^16,18. Co więcej, związki, które uszkadzają mięśnie lub interfejs nerwowo-mięśniowy, również wpływają na te zachowania, podobnie jak związki toksyczne dla komórek rzęsatych ucha wewnętrznego/linii bocznej^19,20. Obserwacja zachowań lokomotorycznych danio pręgowanego w odpowiedzi na bodziec jest zatem odpowiednim sposobem oceny nie tylko neurotoksyczności, ale w równym stopniu ototoksyczności i miotoksyczności. Ocena zachowań lokomotorycznych służy również jako wskaźnik zastępczy dla ogólnej oceny toksyczności/śmiertelności, ponieważ martwe zarodki nie poruszają się. W ten sposób zachowania lokomocji embrionalnej stanowią integracyjny odczyt dla podejścia do badań przesiewowych toksyczności pierwszego poziomu, które wskazuje efekty śmiertelne i nerwowo-mięśniowe w jednym układzie. Biorąc pod uwagę, że eleutheroembryos są już zdolne do metabolizowania związków, podejście to może również wykrywać efekty produktów przemiany metabolicznej^7,21,22. Co ważne, zarodki danio pręgowanego nie są uważane za chronione stadium życia zgodnie z niektórymi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt do etapu swobodnego karmienia po 120 hpf¹³. Dlatego uważa się je za alternatywę dla badań toksyczności na zwierzętach.

Rysunek 1: Konfiguracja systemu reagowania na przestraszenie wibracjami. (A) Przegląd systemu. Płytki z zarodkami wystawionymi na działanie badanych związków umieszcza się na matrycy przetworników elektrodynamicznych ("głośnikach"). Kamera jest sekwencyjnie przesuwana przez napędzany paskiem napęd liniowy do pozycji nagrywania powyżej docelowego przetwornika. (B) Szczegółowy widok przetwornika/głośnika z naczyniem do hodowli tkankowej umieszczonym na górze. Płyty są oświetlone od dołu folią świetlną LED o natężeniu 4000-5000 luksów. Dioda LED obok głośnika zapala się, gdy podawany jest bodziec. (C) Nieruchomy obraz wideo zarejestrowany przez kamerę podczas stymulacji zarodków. (D) Zrzut ekranu pliku konfiguracyjnego. (E) Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania do nagrywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tutaj opisujemy protokół testowy do oceny wpływu związku na reakcję na wibracje przy użyciu własnego prostego urządzenia testującego opartego na bodźcach wibracyjnych generowanych przez przetworniki elektrodynamiczne w połączeniu z automatycznym zapisem wideo kilku swobodnie poruszających się zarodków w naczyniu do hodowli tkankowej²³. System jest modułowy i pozwala na sekwencyjny zapis z kilku naczyń do hodowli tkankowych równolegle. W obecnie używanej konfiguracji pięć przetworników elektrodynamicznych dostarcza bodziec wibracyjny (500 Hz, czas trwania 1 ms) do naczyń do hodowli tkankowych zawierających 20 zarodków umieszczonych na nich (Rysunek 1). Płyty są podświetlane od dołu o natężeniu 4000-5000 luksów za pomocą arkuszy świetlnych LED. Dioda LED obok każdego przetwornika wskazuje okresy stosowania bodźca, a oscyloskop wskazuje przebiegi i częstotliwość zastosowanego bodźca (szczegółowe informacje znajdują się w odnośniku 23). Zachowanie zarodków jest rejestrowane przez szybką kamerę (Table of Materials) z prędkością 1000 klatek na sekundę (fps), która jest przesuwana nad docelowym głośnikiem za pomocą napędzanego paskiem napędu liniowego. Ta prędkość nagrywania jest wymagana, aby niezawodnie rozwiązać problem reakcji zaskoczenia. System stanowi tanią, indywidualnie dostosowywaną alternatywę dla obecnych systemów komercyjnych. Dokładny przebieg opisany poniżej jest obecnie wykonywany w ramach inicjatywy Toksykologii Precyzyjnej²⁴ w celu określenia odpowiednich warunków narażenia do pozyskiwania danych OMICS z zarodków danio pręgowanego poddanych działaniu wybranego zestawu substancji toksycznych.

Protokół

Wszystkie hodowle i obchodzenie się z danio pręgowanym zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi standardami ochrony zwierząt i zatwierdzone przez rząd Badenii-Wirtembergii, Regierungspräsidium Karlsruhe, Niemcy (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Przygotowanie roztworów podstawowych substancji chemicznych do badania

1. Oznaczyć szklaną fiolkę (lub podwielokrotność chemiczną) nazwą/skrótem związku, stężeniem podstawowym i datą przygotowania. Na przykład CdCl₂_2,5 g·^L-1_210813.
2. Odwirować podwielokrotność chemiczną przy 2000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
3. Pod wyciągiem zważyć związek (jeśli to konieczne) na wadze czułej na 0,001 g i przenieść go do oznakowanej fiolki. Jeśli związek jest płynny, dodaj go do fiolki za pomocą pipety i plastikowej końcówki do pipety.
   UWAGA: Na przykład dla zapasu metanosulfonianu trikainy użytego w przykładzie wyników pokazanym w Rysunek 2, 400 mg zostało zważone do oznakowanej fiolki.
4. Dodać rozpuszczalnik (np. sterylną czystą wodę lub dimetylosulfotlenek (DMSO), w zależności od właściwości fizykochemicznych związków) za pomocą pipety i plastikowej końcówki do pipety. Jeśli to możliwe, preferowanym rozpuszczalnikiem jest woda.
   UWAGA: Na przykład dla wywaru z tricainy przygotowano 15,3 mM roztwór w 100 ml wody.
5. Zamknąć fiolkę, delikatnie wstrząsnąć i sprawdzić, czy nie ma opadów.
6. Przygotować rozcieńczone roztwory podstawowe (jeśli to konieczne) w szklanych fiolkach za pomocą pipet i plastikowych końcówek do pipet.
   UWAGA: Na przykład, dalsze rozcieńczanie nie było konieczne w przypadku materiału trikainowego.
7. Przechowywać roztwór podstawowy (roztwory) podstawowy (roztwory) podstawowy w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
8. Pozostałą podwielokrotność substancji chemicznej należy przechowywać w tych samych warunkach, co poprzednio.
9. Zapisz informacje o podwielokrotnościach zapasów w notatniku laboratoryjnym.

2. Zbieranie i hodowla zarodków danio pręgowanego

1. Zebrać zarodki w fazie rozszczepienia (stadium 2-8 komórek) z naturalnego tarła krzyżówek grupowych w 10 cm szalkach do hodowli tkankowych.
2. Wybierz partię o odpowiedniej jakości: mniej niż 10% niezapłodnionych/martwych jaj.
3. Umyj naczynia (usuń niezapłodnione jaja, zanieczyszczenia, łuski itp.).
4. Umieść 60 zarodków na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej w 15 ml pożywki E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄)²⁵.
5. Umieść naczynia w nawilżonej komorze przygotowanej przez ułożenie ręczników papierowych nasączonych wodą.
6. Hodować zarodki do temperatury 72 hpf w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

3. Przygotowanie roboczego rozcieńczenia chemikaliów do testowania

1. Wyjmij roztwór podstawowy z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozwól mu się rozmrozić.
2. Jeżeli rozpuszczalność związku jest wystarczająco wysoka, należy przygotować seryjne rozcieńczenia w pożywce E3 w szklanych butelkach, 1 ml na kontrpróbę na stężenie. Upewnij się, że stężenie jest 10 razy wyższe niż pożądane stężenie ekspozycji. Pozwala to uniknąć konieczności zmiany całego podłoża zarodków na początku ekspozycji. W przypadku niskiej rozpuszczalności należy przygotować seryjne rozcieńczenia bezpośrednio przy pożądanych stężeniach ekspozycji, 10 ml na kontrpróbę na stężenie.
3. Sprawdź, czy nie ma opadów (jeśli to konieczne). Jeśli roztwór się wytrącił, zapisz to, a następnie rozcieńcz, aby osiągnąć następne najwyższe stężenie. Sprawdź ponownie, czy nie ma opadów. Powtarzaj, aż nie będzie opadów.
4. Sprawdź pH roztworu ekspozycyjnego. Jeśli pH wykracza poza zakres 7,0-8,5, należy to zanotować i przygotować roztwory w E3 zawierające 5 mM HEPES/pH 7,4, dostosowując pH za pomocą HCl lub NaOH.
5. Niewykorzystane media ekspozycyjne należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.

4. Wystawienie embrionów na działanie substancji chemicznych, które mają być badane

1. Sprawdź szalki ze starymi zarodkami 72 hpf pod kątem martwych/niewyklutych zarodków i usuń je. Jeśli partia zarodków zawiera więcej niż 5% niewyklutych jaj, należy usunąć partię.
2. Umieścić 10 zarodków na 6 cm naczyniu do hodowli tkankowej w 9 ml pożywki E3 (płytka ekspozycyjna).
3. Oznacz tabliczki naświetlające nazwą związku, stężeniem narażenia i numerem repliki. Na przykład "CdCl₂ 1 mg·^L-1 01". W razie potrzeby dołączyć wystarczającą ilość płytek zawierających tylko E3 i płytkę kontrolną rozpuszczalnika (patrz punkt 5).
4. Dodaj 1 ml roztworu ekspozycyjnego do każdej płytki, zaczynając od najniższego stężenia, i zamieszaj płytkę. W przypadku związków o niskiej rozpuszczalności należy zastąpić całe 10 ml płytki roztworem ekspozycyjnym (patrz krok 3.2).
5. Zapisać kolejność czasową, w jakiej roztwory złożone zostały dodane do zarodków.
6. Inkubować płytki w wilgotnej komorze w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przez 48 godzin, aż osiągną 120 hpf.

5. Przeprowadzanie testu wibracji przestraszenia

UWAGA: Przeanalizuj płytki w tej samej kolejności, jak w kroku 4.5. Do każdego przejazdu powinna być dołączona tabliczka kontrolna E3.

1. Włącz komputer i urządzenie wibracyjne (niebieska dioda LED powinna się świecić).
2. Przygotuj plik konfiguracyjny w arkuszu kalkulacyjnym, jak pokazano w Rysunek 1D i załączony jako plik uzupełniający 1. Zapisać informacje o ekspozycji dla każdej z 5 pozycji płytki (związek, stężenie, kontrpróba).
3. Otwórz program ogólnego interfejsu użytkownika (GUI) (dostępny pod adresem https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , identyfikator projektu 43215.)
4. Sprawdź ruch kamery, wybierając różne pozycje w programie GUI i obserwując ruch kamery.
5. Wyjąć z inkubatora płytki z próbkami do pomiaru. Umieść płytki z próbkami w 5 pozycjach (patrz Rysunek 1A, "głośniki") i pozwól zarodkom osiąść przez kilka minut.
6. Kliknij na Nagraj; otworzy się okno, w którym można wybrać plik konfiguracyjny.
7. Wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny przygotowany w kroku 5.2 dla tego przebiegu.
8. Sprawdzić, czy opis próbki odpowiada próbkom w każdej pozycji (1-5).
9. Pomiar zostanie przeprowadzony automatycznie (10 s / pozycję). Gdy impuls dźwiękowy zostanie przyłożony przez program, włącza się dioda LED. Zapis przez 10 s/pozycję pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości danych, aby oszacować prędkość pływania i przebyty dystans zarówno przed, jak i po zastosowaniu bodźca oraz zapobiega przyzwyczajeniu się do kolejnych bodźców.
10. Po zakończeniu nagrywania kamera wraca do pozycji 1, a oprogramowanie rozpoczyna kompresję plików. W tym czasie zastąp próbki następnym zestawem, który należy zmierzyć.
11. Przejdź do kroku 5.2, aby nagrać następny przebieg.
12. Po zmierzeniu wszystkich płytek zbierz roztwory ekspozycyjne. Użyj sita, aby zatrzymać zarodki.
13. Poddaj zarodki eutanazji przez szybkie schłodzenie w kąpieli lodowo-izopropanolowej (5%).
14. Roztwory ekspozycyjne i martwe zarodki należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.

6. Analiza danych

1. Otwórz dane wideo za pomocą VirtualDub (1.10.4).
2. Oceń wizualnie liczbę zarodków reagujących na impuls dźwiękowy (gdy świeci się kontrolna dioda LED).
3. Wprowadzanie danych do arkusza kalkulacyjnego. Zapisz nazwę związku, kontrpróbę, stężenie związku i procent nieruchomych zarodków zgodnie ze wzorem dostarczonym w pliku uzupełniającym 2, który zawiera przykładowy zestaw danych pokazany w Rysunek 2C.
   UWAGA: Szablon ma elastyczną strukturę i zasadniczo umożliwia zastosowanie do danych innych organizmów i punktów końcowych. Opisano w nim reakcje dla każdego stężenia, a także przedstawiono opisy punktów końcowych, a także definicje parametrów generowanych w późniejszym modelowaniu stężenie-odpowiedź.
4. Przeprowadź analizę stężenia wzorcowego (BMC) przy użyciu przepływu pracy KNIME (KNIME analytics 4.6²⁶) z osadzonymi skryptami R (R wersja 3.6., R-packages plotrix, drc i bmd^27,28).
   UWAGA: Zasadniczo ocenę można również przeprowadzić bezpośrednio w R. Jednak dla wygody i umożliwienia oceny jako usługi internetowej, analiza została zorganizowana w przepływie pracy zgodnym z serwerem KNIME. Dane wyjściowe przepływu pracy KNIME znajdują się w pliku uzupełniającym 3. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat parametrów statystycznych generowanych przez przepływ pracy KNIME, zapoznaj się z tym szablonem. Parametry statystyczne służące do oszacowania stopnia dopasowania oraz progi pozwalające zaakceptować wyznaczone wartości BMC przedstawiono w tabeli 1. Sam przepływ pracy KNIME jest dostępny za pośrednictwem GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Stężenie-odpowiedź jest modelowane przy użyciu 4-parametrowego modelu logarytmiczno-logistycznego. Dwa parametry dopasowania krzywej można ustalić. Zazwyczaj w przypadku danych procentowych ustala się maksimum na 100. W przypadku, gdy nie zaobserwuje się żadnych efektów tła, minimum można ustalić na 0%.

Wyniki

Rysunek 2A pokazuje procent nieruchomych zarodków w 48 lęgach nieleczonych zarodków typu dzikiego (szczep AB2O2). Średnio 14,33% nieleczonych zarodków typu dzikiego nie reaguje na bodziec wibracyjny. W 4 lęgach odsetek larw nieruchomych osiągnął 50%, ale 75% lęgów miało odsetek larw nieruchomych poniżej 20%.

Rysunek 2B,C pokazuje przykład typowego obliczenia wzorcowego stężenia/dawki (BMC/BMD^29,30) dla złożonego wpływu na ruchliwość za pomocą przebiegu testu przestraszenia drgań, obecnie wykonywanego w ramach konsorcjum PrecisionTox²⁴. Wartości BMC10, BMC25 i BMC50 odpowiadają stężeniom, przy których odpowiednio 10%, 25% i 50% zarodków wykazuje poziom nieruchomości wyższy niż tło. W obliczeniach uwzględnia się tylko zarodki, które są całkowicie nieruchome, a nie te, które nadal wykazują częściowe reakcje, takie jak tylko zgięcie w kształcie litery C bez późniejszego pływania ucieczki lub tylko ruchy ogona (Rysunek 2B). Zarodki poddano działaniu 8 stężeń inhibitora kanału sodowego metanosulfonianu trikainy, który jest często stosowany do znieczulenia ryb³¹. Dane wskazują na poziom tła wynoszący około 25% bezruchu w odpowiedzi na bodziec wibracyjny. Począwszy od 1% tricainy, ruchliwość zmniejsza się, a następnie ustaje powyżej 2,5%. Przepływ pracy KNIME oblicza BMC50 jako 164,9 μM, co odpowiada 1,07% trikainy i poziomowi nieruchliwości 75% (Rysunek 2C). Małe 95% przedziały ufności (oznaczone szarymi odcieniami na krzywej) wskazują na solidną odtwarzalność wartości ruchliwości w tym teście.

Rysunek 2D przedstawia przykład nieoptymalnego testu, którego dane nie powinny być wykorzystywane do obliczeń BMC. Pokazano pięć grup kontrolnych traktowanych E3 z różnymi zarodkami pochodzącymi z tego samego lęgu (AB2O2 [szczep typu dzikiego] replikuje 1-5). Tylko pierwsza grupa wykazuje prawie normalną odpowiedź, wykazując około 25% imruchliwości, która jest zgodna z wartościami literaturowymi³² i tymi uzyskanymi w teście opisanym tutaj, jak pokazano w Rysunek 2A, podczas gdy wszystkie inne grupy wykazują zmniejszone i/lub niekompletne reakcje behawioralne (np. wykazując tylko zgięcie w kształcie litery C, po którym nie następuje pływanie, lub ruchliwość bez wyraźnego zgięcia w kształcie litery C na początku). Taka reakcja może wystąpić, gdy zarodki nie rozwijają się prawidłowo i są w stanie niedojrzałym z powodu opóźnienia rozwoju, co wpływa na odporność reakcji na zaskoczenie^14,33.

Rysunek 2: Przykład typowego wyniku, w tym obliczanie dawki wzorcowej. (A) Odsetek niereagujących zarodków po impulsie dźwiękowym dla nieleczonych larw typu dzikiego na 48 lęgów (n = 10 na lęg). Średnia (14,33%) i odchylenie standardowe (±16,19%) są zaznaczone na czerwono. (B) Ocena zachowania reakcji na przerażenie zarodków (n = 20 na stan) traktowanych wskazanym stężeniem tricainy w pożywce E3 lub samym E3 jako kontrolą. Zachowanie jest klasyfikowane zgodnie ze schematem kolorów i kreskówkami wskazanymi po prawej stronie wykresu, przy czym każdy zarodek jest przypisany tylko do jednej z następujących klas: "nieruchomy": zarodek nie wykazuje żadnych ruchów; "ruch ogona": zarodek wykazuje ruch ogona, ale nie wykazuje wygięcia w kształcie litery C ani zachowania podczas pływania; "ruchliwy": zarodek wykazuje ruch pływacki, ale nie ma zgięcia w kształcie litery C w odpowiedzi na bodziec wibracyjny; "tylko zgięcie w kształcie litery C": zarodek wykazuje zgięcie w kształcie litery C, ale nie ucieka przed pływaniem; "Wygięcie C + ruchliwość": zarodek wykazuje typowe zachowanie w zgięciu C, po którym następuje ucieczka z pływania (typowa pełna reakcja na przerażenie). Różne zachowania są pokazane jako procent całkowitej liczby zarodków dla każdego leczenia. (C) Wykres obliczeniowy BMC wygenerowany przez przepływ pracy KNIME, wskazujący odsetek "nieruchomych" zarodków dla każdego stężenia poddanego działaniu substancji. Niebieskie, czerwone i czarne linie oznaczają wartości BMC10, BMC25 i BMC50, czyli stężenia, przy których odpowiednio 10%, 25% i 50% zarodków wykazuje poziom nieruchomości wyższy niż tło. (D) Przykład odrzuconej serii testów. Pokazano pięć serii kontrolnych poddanych działaniu E3 z różnymi zarodkami AB2O2 typu dzikiego pochodzącymi z tego samego lęgu (powtórzenie 1-5). Tylko powtórzenie 1 wykazuje prawie normalną odpowiedź, podczas gdy zarodki pozostałych serii nie wykazują typowej odpowiedzi C-bend + escape pływanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Parametry statystyczne do oszacowania stopnia dopasowania i progi do zaakceptowania określonych wartości BMC. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Właściwości wybranych systemów testów wibracyjnych reakcji na przestraszenie. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: szablon Excela dla pliku konfiguracyjnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Szablon wejściowy KNIME z przykładowym zestawem danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Przykład pliku wyjściowego KNIME. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiamy przepływ pracy i analizę danych do oceny związków chemicznych przy użyciu specjalnie zbudowanego zestawu do badania drgań zarodków zebry danio pręgowanego. Proces pracy generuje wiarygodne dane, które umożliwiają obliczenie typowych parametrów określających toksyczność związku, takich jak stężenie/dawka wzorcowa (BMC/BMD). Modułowość konfiguracji pozwala na dostosowanie do różnych potrzeb w zakresie przepustowości i wymagań przestrzennych. Ponieważ system jest wykonany z tanich komponentów podstawowych, po stosunkowo prostej konfiguracji, stanowi tanią alternatywę dla istniejących systemów komercyjnych, które są zazwyczaj projektowane dla kilku typów testów jednocześnie, opierają się na zastrzeżonym oprogramowaniu i pozostają stosunkowo kosztowne.

Zarówno te systemy komercyjne, jak i inne systemy wykonane na zamówienie pozwalają na ocenę pojedynczych zarodków lub larw na płytkach wielodołkowych (np. 12-dołkowych³⁴, 16-dołkowych^32,35, 24-dołkowych 20,33,36, 48-dołkowych³⁷, 96-dołkowych 38,39,40,41,42, a nawet 384-dołkowych [jako 4x96-dołkowych]⁴³), ale ograniczenie przestrzenne w odwiertach sprawia, że analiza niektórych parametrów danych dotyczących reakcji na ucieczkę (np. przebyta odległość) jest trudniejsza. Co więcej, w niektórych z tych konfiguracji obrazowanie jest ograniczone do podzbioru dołków płytki, co zmniejsza przepustowość^36,39. Obrazowanie zarodków w szalkach pozwala na lepszą ocenę parametrów reakcji ucieczki i umożliwia rejestrację zachowania kilku zarodków jednocześnie (do 30 w naczyniu o średnicy 6 cm). Zwykle obrazowanie na talerzu ogranicza się do jednej szalki na cykl 44,45,46,47,48 (wyjątki wykonują obrazowanie równolegle na 6 szalkach z jedną larwą na każde⁴⁹ lub na 4 larwach na 2 podzielone szalki⁵⁰), wadę, którą można rozwiązać za pomocą równoległych projektów, takich jak w naszym przypadku. Zestawienie niektórych cech systemu zastosowanego w niniejszym opracowaniu oraz innych rozwiązań komercyjnych i niestandardowych znajduje się w tabeli 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50^{,
Lokal mieszkalny 51,52}.

Jedną z zalet tej metody jest odczyt rejestrujący zarówno śmiertelność, jak i zmiany w zachowaniu, co może zwiększyć wydajność ocen toksyczności. Na przykład, podczas gdy wykazano, że badanie ostrej toksyczności zarodków ryb danio pręgowanego (FET)⁵ dość dobrze przewiduje toksyczność w teście ostrej toksyczności dorosłych ryb⁵³ , jego dokładność przewidywania została poprawiona dzięki włączeniu odczytów behawioralnych⁵⁴. Powodem tego jest słaba śmiertelność wywołana przez związki neuroaktywne obserwowane w zarodkach ryb, prawdopodobnie z powodu braku zespołu niewydolności oddechowej powodującego zwiększoną toksyczność u młodych lub dorosłych ryb. Neuroaktywność można jednak zidentyfikować poprzez ocenę zachowania. Co więcej, odczyty behawioralne mogą również uchwycić efekty miotoksyczne i ototoksyczne, a także inne, bardziej subtelne skutki toksyczne na fizjologię, które są subletalne, ale wpływają na wydajność behawioralną organizmu.

Podczas przeprowadzania testu kluczowe znaczenie ma zapewnienie właściwego obchodzenia się ze związkami, a także wykorzystanie jednorodnie rozwijającej się partii zarodków danio pręgowanego. Tak więc używanie szklanych fiolek do przechowywania związków powinno zminimalizować spadek stężeń chemikaliów, w szczególności związków hydrofobowych, ze względu na absorbancję materiału z tworzywa sztucznego. W przypadku związków o wysokim potencjale absorpcyjnym do "plastycznego" polistyrenu, do inkubacji można również stosować płytki szklane. Czyszczenie komórek jajowych w szalkach do hodowli tkankowych używanych do pobierania i usuwania martwych zarodków jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia standardowego rozwoju. Normalna szybkość rozwoju jest ważna, ponieważ opóźnienia rozwojowe mogą wpływać na dojrzałość sieci neuronowych leżących u podstaw ocenianego zachowania^14,33. Ponadto, aby umożliwić porównanie efektów złożonych, jaja powinny pochodzić z tego samego szczepu, ponieważ doniesiono, że różne szczepy prezentują różne profile behawioralne 38,55,56,57. Podczas ekspozycji ważne jest, aby inkubować zarodki w wilgotnej komorze, aby uniknąć nadmiernego parowania pożywki E3, co mogłoby zmienić badane stężenia.

Kontrole E3 powinny być włączone do każdej serii w celu określenia wyjściowego poziomu odpowiedzi dla danej partii zarodków wykorzystanych w serii badań. Zazwyczaj uruchamiamy jedną płytę kontrolną wzdłuż każdego zestawu 5 pomiarów. Jak pokazano na rysunku 2D, podejście to pozwala również na wykrycie partii z nieoptymalnymi reakcjami z powodu opóźnionego rozwoju lub z innych powodów, takich jak genetyczne efekty tła. W przypadku nieoczekiwanego braku reakcji na bodziec należy również uważać na potencjalną awarię przetwornika. Zazwyczaj reakcje na zaskoczenie wykazują sigmoidalne zachowanie stężenie-odpowiedź, które pozwala na dopasowanie krzywej przy użyciu modelu logarytmiczno-logistycznego. Jednak w rzadkich przypadkach z odpowiedziami dwufazowymi może być konieczne zastosowanie innych modeli, takich jak modele Gaussa lub Cedergreena. Są one dostępne w pakietach R drc i bdm^27,28.

Brak reakcji na bodziec wibracyjny może wskazywać po prostu na śmierć zarodków lub poważne upośledzenie funkcji życiowych z powodu ogólnej cytotoksyczności, ale może również odzwierciedlać bardziej specyficzną toksyczność ukierunkowaną na obwody neuronalne percepcji bodźców, integracji i wyjścia lokomotorycznego. Inne możliwe efekty złożone to zakłócenia w interfejsie nerwowo-mięśniowym lub w strukturze i funkcji mięśni. Aby rozróżnić te możliwości, konieczne są dalsze testy. Na przykład integralność strukturalna mięśni może być oceniona za pomocą testu dwójłomności^58,59, a linie transgeniczne są dostępne do oceny perurbancji funkcji mięśniowych i nerwowych^60,61. Jednak zarejestrowane dane wideo pozwalają już na bardziej szczegółową analizę morfologii i reakcji behawioralnej zarodków, które mogą dostarczyć pierwszych dodatkowych informacji. Czy upośledzone jest tylko zgięcie w kształcie litery C, czy cała ruchliwość? Czy nadal obecne są pozostałości aktywności nerwowo-mięśniowej, na co wskazują słabe lub drżące ruchy ogona? Czy takie zmienione zachowania idą w parze ze zmianami w morfologii, takimi jak obrzęk lub zwiększona krzywizna ciała? Dodatkowo można ocenić takie parametry, jak czas opóźnienia do zgięcia w kształcie litery C lub odległość przebyta podczas reakcji ucieczki (patrz na przykład Ref. 44).

Opisany tutaj protokół badań przesiewowych pozwala na szybką i solidną ocenę toksyczności związków, z wartością dodaną w postaci specyficznego wykrywania nieśmiertelnych związków neurotoksycznych, ototoksycznych i miotoksycznych. Dostarczony przepływ pracy analizy jest łatwy do wdrożenia i zapewnia solidny odczyt. Modyfikacje protokołów bodźców stosowanych w teście przestraszenia wibracyjnego zostały wykorzystane do zajęcia się złożonymi skutkami również na bardziej złożone aspekty zachowania przestraszenia, takie jak hamowanie przedimpulsowe (PPI)^39,44 i habituacja^32,33, i mogą być dostosowane do konfiguracji bodźca opartej na przetworniku elektrodynamicznym zastosowanej w tym badaniu.

Głównym zastosowaniem systemów przesiewowych opartych na reakcji na zaskoczenie jest ocena skutków złożonych w chemicznych badaniach przesiewowych, co ma znaczenie zarówno dla oceny toksyczności dla ludzi, jak i dla opracowywania leków ^1,4,62. Jednocześnie, dzięki badaniu wczesnych stadiów rozwojowych organizmu wodnego, uzyskane wyniki mają bezpośrednie znaczenie dla oceny ryzyka ekotoksykologicznego^63,64. Ponadto systemy reakcji na przerażenie mogą być wykorzystywane do fenotypowania behawioralnego w genetycznych badaniach przesiewowych 65,66,67,68,69. Nasz łatwy do wdrożenia i adaptacji system stanowi przystępną cenowo konfigurację dla mniejszych laboratoriów, które zamierzają prowadzić własne projekty przesiewowe w tych różnych dziedzinach zastosowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drobne sita testowe, mosiężna rama, wielkość porów 250 i mu; m	Sigma-Aldrich	Z289744-1EA	Lub porównywalny materiał
Szybka kamera	XIMEA&	nbsp; MQ013MG-ON USB 3
Butelki laboratoryjne, z wąską szyjką, z nakrętką	VWR	215-3261	Numer referencyjny do 50 ml, dostępne do 20 l. Lub porównywalny materiał
Końcówka do pipet, objętość robocza: 10 &mikro; L	SARSTEDT	70.3010.210	Lub porównywalny materiał
Końcówka do pipet, objętość robocza: 1000 &mikro; L	SARSTEDT	70.3050.100	Lub porównywalny materiał
Końcówka do pipet, objętość robocza: 20 &mikro; L	SARSTEDT	70.3020.210	Lub porównywalny materiał
Końcówka do pipety, objętość robocza: 200 &mikro; L	SARSTEDT	70.3030.100	Lub porównywalny materiał
Pipeta serologiczna 10 ml	SARSTEDT	86.1254.001	Lub porównywalny materiał
Pipeta serologiczna 25 ml	SARSTEDT	86.1685.001	Lub porównywalny materiał
Pipeta serologiczna 5 ml	SARSTEDT	86.1253.001	Lub porównywalny materiał
Naczynie do hodowli tkankowych 60,0 mm/15,0 mm wentylowane (Polistyren)	Greiner bio-one	628102	Lub porównywalny materiał
Naczynie do hodowli tkankowych 100, zawiesina (Polistyren)	SARSTEDT	83.3902.500	Lub porównywalny materiał
Pipeta transferowa 6 ml	SARSTEDT	86.1175	Lub porównywalny materiał
Rurka 15 ml 120 mm x 17 mm PP	SARSTEDT	62.554.502	Lub porównywalny materiał
Rurka 50 ml 114 mm x 28 mm PP	SARSTEDT	62.5472.54	Lub porównywalny materiał