Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66460

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Streszczenie

Ten protokół opisuje produkcję i oczyszczanie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pomocą wirowania w gradicynie gęstości jodixanol, niezależnej od serotypów metody oczyszczania AAV, po raz pierwszy opisanej w 1999 roku. Wektory rAAV są szeroko stosowane w terapiach genowych do dostarczania transgenów do różnych typów komórek ludzkich. W tej pracy rekombinowany wirus jest wytwarzany przez transfekcję komórek Expi293 w hodowli zawiesinowej z plazmidami kodującymi transgen, kapsyd wektorowy i geny pomocnicze adenowirusa. Wirowanie w gradiencie gęstości jodixanolu oczyszcza pełne cząstki AAV na podstawie gęstości cząstek. Dodatkowo, ta obecnie wszechobecna metodologia obejmuje trzy etapy mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się z powodu zanieczyszczających białek i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego, odpowiednio: wytrącanie cząstek wirusa z pożywki komórkowej przy użyciu roztworu glikolu polietylenowego (PEG) i chlorku sodu, wprowadzenie drugiej rundy wirowania w gradionym gradionym gęstości jodiksanolu, i wymiana przez filtr odśrodkowy. Stosując tę metodę, możliwe jest konsekwentne osiąganie mian w zakresie10-12 cząstek wirusa/ml o wyjątkowej czystości do stosowania in vivo.

Wprowadzenie

Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) są szeroko stosowanymi narzędziami do leczenia chorób genetycznych, w tym rdzeniowego zaniku mięśni, dystrofii siatkówki i hemofilii A1,2,3. Wektory rAAV są zaprojektowane tak, aby nie zawierały genów wirusowych obecnych w dzikich typach AAV4, mały, bezotoczkowy wirus dwudziestościenny z liniowym jednoniciowym genomem DNA o wielkości 4,7 kb. AAV został po raz pierwszy odkryty w latach sześćdziesiątych XX wieku jako zanieczyszczenie preparatami adenowirusa5. Pomimo małego rozmiaru kapsydu, który ogranicza rozmiar transgenu, który może być upakowany do maksymalnie 4,9 kb, z wyłączeniem ITRs6, AAV jest przydatny do dostarczania transgenu, ponieważ jest niepatogenny u ludzi, umożliwia ekspresję transgenu w wielu typach komórek dzielących i niedzielących się oraz ma ograniczone działanie immunogenne7.

Jako członkowie rodzaju dependoparvovirus, produkcja rAAV opiera się na ekspresji genów pomocniczych obecnych w adenowirusie lub wirusie opryszczki pospolitej8. Opracowano kilka strategii wytwarzania rAAV, ale produkcja w komórkach HEK293 transformowanych za pomocą adenowirusowych genów pomocniczych E1A/E1B jest najbardziej uznaną metodą stosowaną obecnie9. Ogólne podejście do produkcji rAAV rozpoczyna się od transfekcji komórek HEK293 z trzema plazmidami zawierającymi transgen w odwróconych powtórzeniach końcowych (ITR), odpowiednio geny AAV rep i cap oraz dodatkowe geny pomocnicze adenowirusa. Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji komórki są zbierane i przetwarzane w celu oczyszczenia rAAV zawierającego transgen.

W rozwoju nowych wektorów rAAV do celów terapeutycznych, głównym celem jest produkcja wektorów o zwiększonej wydajności transdukcji. Wzrost wydajności transdukcji komórek docelowych oznaczałby zmniejszenie niezbędnej dawki klinicznej rAAV, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia niepożądanych skutków immunogennych, począwszy od neutralizacji za pośrednictwem przeciwciał, a skończywszy na toksyczności ostrej10,11. Aby poprawić skuteczność transdukcji wektorów rAAV, można wprowadzić zmiany w upakowanym genomie lub w kapsydzie. Realne metody dostrajania skuteczności transdukcji za pomocą projektowania upakowanego genomu obejmują włączenie silnych i specyficznych tkankowo promotorów, przemyślany wybór elementów przetwarzających mRNA oraz optymalizację sekwencji kodowania w celu poprawy wydajności translacji12. Zmiany w kapsydzie są dokonywane w celu zwiększenia tropizmu dla docelowych typów komórek ludzkich. Wysiłki zmierzające do opracowania nowych kapsydów wektorów dostarczania transgenu rAAV charakteryzują się na ogół skupieniem się na racjonalnym projektowaniu kapsydów AAV ze specyficznymi mutacjami ukierunkowanymi na określone receptory komórkowe lub ukierunkowanej ewolucji w celu identyfikacji kapsydów z tropizmem dla określonych typów komórek z kombinatorycznych bibliotek kapsydów o wysokiej złożoności bez celowania w jeden konkretny receptor (chociaż niektóre grupy łączą te podejścia)13, 14,15. W podejściu ewolucji ukierunkowanej, kombinatoryczne biblioteki kapsydu są konstruowane przy użyciu określonego szkieletu serotypu ze zmutowanymi regionami zmiennymi na kapsydzie exterior16. Kombinatoryczne biblioteki kapsydu są często konstruowane z serotypów AAV nie pochodzących od ludzi, co zmniejsza ryzyko wystąpienia wcześniej istniejącej odporności podczas stosowania klinicznego10. Dlatego metody oczyszczania, które można zastosować do dowolnego serotypu, są idealne do wyeliminowania potrzeby optymalizacji specyficznej dla serotypu dla rzadziej używanych serotypów służących jako szkielet dla tych bibliotek.

Wirowanie w gradionym gradimencie gęstości jodiksanolu jest wykorzystywane do oczyszczania wysokich mian rAAV o wysokiej zakaźności17. W tym protokole rAAV jest wytwarzany w zawiesinowej hodowli komórkowej w celu zmniejszenia ilości pracy potrzebnej do wytworzenia dużych mian AAV. Uwzględniono również etap wirowania w celu usunięcia lizatu komórkowego w celu zmniejszenia obecności zanieczyszczających białek i zmniejszenia ryzyka wytrącania się wirusa. Protokół ten jest opłacalną metodą wytwarzania preparatów rAAV o wysokiej czystości, odpowiednich do użytku przedklinicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Skład roztworów i buforów wykorzystanych w tym protokole przedstawiono w Tabeli 1.

RoztwórSkład
Bufor do lizy AAV1,2 ml 5 M roztworu NaCl
2 ml 1 M roztworu Tris-HCl o pH 8,5
80 µL 1 M MgCl22 roztwór
wodę mQ do 40 ml
Roztwór do wytrącania AAV40 g PEG 8000
50 ml 5 M roztworu NaCl
wody mQ do 100 ml
frakcja 15% iodiksanolu7,5 ml OptiPrep
3 ml 10X DPBS
6 ml 5 M roztworu NaCl
30 µL MgCl₂ o stężeniu 1 M2 roztwór
mQ do 30 ml
frakcja 25% jodiksanolu12. 5 mL OptiPrep
3 ml 10X DPBS
30 μL 1 M MgCl22 roztwór
60 µL roztworu czerwieni fenolowej
30 ml mQ
frakcja 40% jodiksanolu33,3 ml OptiPrep
5 ml 10X DPBS
50 µl 1 M MgCl22 roztwór
50 ml wody mQ
frakcja 60% jodiksanolu50 ml OptiPrep
100 $\mu$L roztworu czerwieni fenolowej
roztwór buforowy AAV8 ml 5 M NaCl
20 µL 10% Pluronic F-68
PBS do 200 ml

Tabela 1: Składy roztworów stosowanych w niniejszym protokole.

1. Potrójna transfekcja komórek Expi293

  1. Zasiać komórki Expi293 (patrz Tabela materiałów) przy początkowej gęstości 5 x 105 żywych komórek (vc)/mL.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 8% CO2 i prędkości wytrząsania 125 rpm, aż osiągną gęstość 3-5 x 106 vc/mL. Monitorować gęstość i żywotność komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu z wykorzystaniem automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
  3. Po osiągnięciu przez komórki pożądanej gęstości, rozcieńczyć je w stosunku 1:10, dodając świeżą pożywkę w taki sposób, aby całkowita objętość była dziesięciokrotnością objętości początkowej. W razie potrzeby przenieść komórki do większej kolby. Przywrócić do inkubacji.
  4. Kontynuować namnażanie komórek zgodnie z krokami 1.2-1.3, aż osiągną gęstość co najmniej 2 x 106 vc/mL w 250 mL pożywki w kolbie o pojemności 1 L.
  5. W dniu poprzedzającym transfekcję rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 106 vc/mL w 250 mL pożywki, usuwając nadmiar komórek, jeśli jest to konieczne. Inkubować komórki przez noc.
  6. W dniu transfekcji odwirować połowę komórek przy 58 x g przez 5 min w 18 °C. Resuspendować osad komórkowy w takiej samej objętości (125 mL) świeżej pożywki. Żywotność komórek powinna wynosić blisko 98%.
  7. Przygotować dwie probówki stożkowe o pojemności 50 mL. Jedną opisać jako „PEI”, a drugą jako „DNA”.
  8. W probówce stożkowej opisanej jako PEI rozcieńczyć 1,2 mL PEI (polyethylenimine, patrz Tabela materiałów) do całkowitej objętości 12,5 mL w pożywce OptiMEM.
  9. W probówce stożkowej opisanej jako DNA przygotować ekvimolarny roztwór plazmidowego DNA o całkowitej ilości 500 µg DNA w całkowitej objętości 12,5 mL w pożywce OptiMEM.
  10. Dodać roztwór DNA do roztworu PEI, kilkukrotnie odwrócić probówkę w celu dokładnego wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby roztwór DNA-PEI inkubował się przez pełne 10 min, aby PEI mógł utworzyć naładowane kompleksy z DNA.
  11. Po 10-minutowej inkubacji roztworu DNA-PEI, za pomocą pipety serologicznej powoli nanieść roztwór DNA-PEImax do komórek Expi293. Przenieść transfektowane komórki z powrotem do inkubatora i inkubować przez 72 h (Rysunek 1).

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek; analiza wzbudzenia optycznego i emisji, pasek skali 100 µm.
Rysunek 1: Komórki Expi293 wykazujące ekspresję GFP dwa dni po transfekcji. Po transfekcji plazmidem zawierającym gen GFP, komórki Expi293 przejściowo eksponują eGFP. Morfologia komórek jest okrągła. Obraz został zarejestrowany przy czasie ekspozycji 15 ms. Zdjęcia mikroskopowe wykonano za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w oświetlenie epi-fluorescencyjne i obiektyw 10x/0,30. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Oczyszczanie wektora rAAV

  1. Po 72 h przenieść komórki w zawiesinie do dwóch probótek stożkowych o pojemności 250 mL i odwirować przy 415 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  2. Przelać supernatant z medium do nowej probótki stożkowej o pojemności 500 mL i przechowywać w temperaturze 0 °C na lodzie do dalszej obróbki.
  3. Resuspendować każdy osad komórkowy w 10 mL buforu do lizy AAV (Tabela 1). Połączyć oba lizaty w jednej z probótek. Przepłukać drugą probótkę dodatkowymi 5 mL buforu do lizy AAV, a następnie dodać go do połączonych lizatów. Zamrozić w temperaturze -70 °C.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Supernatant z medium należy przechowywać w temperaturze -70 °C zamiast na lodzie.
  4. Dodać do supernatantu z medium z kroku 2.2 roztwór do wytrącania AAV w stosunku objętości 1:4. Odwrócić probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać, i inkubować w temperaturze 0 °C na lodzie przez co najmniej 2 h lub przez noc.
  5. Odwirować zainkubowany roztwór przy 3000 x g przez 1 h w temperaturze 4 °C.
  6. Odlać supernatant i resuspendować osad zawierający wytrąconego wirusa w 5 mL buforu do lizy AAV.
  7. Rozmrozić lizat komórkowy w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
  8. Połączyć wytrąconego wirusa z lizatem komórkowym. Otrzymano w ten sposób lizat surowy. Przepłukać probówkę do wirowania, w której znajdował się wytrącony wirus, dodatkowymi 5 mL buforu do lizy AAV i połączyć z lizatem surowym.
  9. Zamrozić lizat surowy w temperaturze -70 °C, a następnie rozmrozić w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten cykl jeszcze raz.
    UWAGA: Lizatu surowego nie należy pozostawiać w temperaturze 37 °C dłużej, niż jest to konieczne do jego rozmrożenia.
  10. Po trzecim rozmrożeniu natychmiast dodać 4 µL benzonukleazy do lizatu surowego, odwrócić w celu wymieszania i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.
  11. Odwirować lizat surowy przez 10 min przy 650 x g w temperaturze 18 °C.
  12. Przenieść supernatant do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Jest to wirus surowy. Odrzucić osad.
  13. Odwirować wirusa surowego przez dodatkowe 30 min przy 3000 x g w temperaturze 18 °C, aby usunąć zanieczyszczające białka.
  14. Przenieść supernatant do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Jest to wirus oczyszczony.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Zamrozić oczyszczonego wirusa w temperaturze -70 °C.
  15. Przygotować wielokanałową pompę perystaltyczną z czterema przewodami perystaltycznymi (patrz Tabela materiałów). Do obu końców każdego przewodu przymocować kapilary.
  16. Umieścić kapilary po stronie wejściowej pompy w zlewce wypełnionej wodą dejonizowaną. Umieścić kapilary po stronie wyjściowej pompy w pustej zlewce. Uruchomić pompę perystaltyczną z prędkością 25,0 obr./min, aby przemyć przewody wodą dejonizowaną (DI).
  17. Po dokładnym przemyciu opróżnić przewody perystaltyczne, uruchamiając pompę do momentu, aż w przewodach pozostanie samo powietrze. Położyć wszystkie kapilary na czystej, niepozostawiającej włókien ściereczce.
  18. Umieścić cztery probówki do ultrawirowania w statywie po stronie wyjściowej pompy.
  19. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 mL ostrożnie nalać 10 mL oczyszczonego wirusa do każdej probówki do ultrawirowania. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Jeśli jest to konieczne, objętość oczyszczonego wirusa w każdej probówce można zwiększyć do 12 mL. W takim przypadku odpowiednio zmniejszyć ilość 60% jodiksanolu w kroku 2.25 poniżej.
  20. Pod oczyszczonego wirusa należy wprowadzić frakcje jodiksanolu (Tabela 1) od najniższej do najwyższej gęstości przy użyciu pompy perystaltycznej. Najpierw dodaje się frakcję 15%, następnie frakcję 25%, frakcję 40% i na koniec frakcję 60%. Przenieść 22 mL (5,5 mL na probówkę do ultrawirowania) 15% frakcji jodiksanolu do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Umieścić kapilary po stronie wejściowej pompy w probówce, dbając o to, aby wszystkie kapilary dotykały dna probówki.
  21. Uruchomić pompę i pozwolić, aby przewody wypełniły się frakcją jodiksanolu. Gdy frakcja jodiksanolu dotrze do końców kapilar po stronie wyjściowej pompy, zatrzymać pompę.
  22. Włożyć jedną kapilarę wyjściową do każdej z probówek do ultrawirowania z oczyszczonym wirusem, dbając o to, aby kapilary dotykały dna każdej probówki.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby w kapilarach nie pozostało powietrze. Jodiksanol może przepływać przez przewody perystaltyczne z nieco różną prędkością, dlatego przed włożeniem kapilary do oczyszczonego wirusa należy upewnić się, że każda pojedyncza kapilara wyjściowa jest całkowicie wypełniona jodiksanolem. Może być konieczne kilkukrotne zatrzymywanie i uruchamianie pompy.
  23. Uruchomić pompę i pozwolić probówkom do ultrawirowania wypełnić się. Gdy ostatnia część frakcji 15% będzie pobierana do kapilar wejściowych, zatrzymać pompę. Krytyczne jest, aby do przewodów perystaltycznych nie dostały się pęcherzyki powietrza.
    UWAGA: Jeśli pęcherzyki powietrza dostaną się do kapilar wejściowych, można krótko uruchomić pompę w kierunku odwrotnym, aby je wypchnąć.
  24. Przenieść 22 mL (5,5 mL na probówkę do ultrawirowania) 25% frakcji jodiksanolu do probótki stożkowej 50 mL. Upewnić się, że wszystkie kapilary dotykają dna probówki, i uruchomić pompę. Gdy ostatnia część frakcji 25% będzie pobierana do kapilar wejściowych, zatrzymać pompę.
  25. Powtórzyć krok 2.24 z 20 mL (5 mL na probówkę do ultrawirowania) 40% frakcji jodiksanolu, a następnie z 24 mL (6 mL na probówkę do ultrawirowania) 60% frakcji.
  26. Jeśli w probówce do ultrawirowania pozostała wolna przestrzeń, kontynuować dodawanie 60% frakcji, aż probówki zostaną całkowicie wypełnione cieczą.
  27. Napełnić każdą probówkę tak, aby lizat utworzył wypukłość nad górną krawędzią, ale nie wylał się z probówki. Zatrzymać pompę i ostrożnie wyjąć każdą kapilarę wyjściową, dbając o to, aby nie zaburzyć gradientu jodiksanolu.
  28. Zamknąć każdą probówkę do ultrawirowania za pomocą dystansera i załadować ją do rotora typu 70 Ti (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Upewnić się, że rotor jest odpowiednio zrównoważony. Nie próbować obsługi ultrawirowki bez odpowiedniego przeszkolenia.
  29. Załadować rotor typu 70 Ti do ultrawirowki i wirować przy 489 000 x g przez 1 h w temperaturze 18 °C.
  30. Po wirowaniu wyjąć rotor z ultrawirowki. Używając szczypiec półokrągłych, ostrożnie wyjąć każdą probówkę z rotora, dbając o to, aby nie zaburzyć gradientu jodiksanolu.
  31. Użyć statywu z uchwytem, aby unieruchomić jedną probówkę do ultrawirowania.
  32. Do strzykawki 5 mL przymocować igłę 20 GA i odstawić na bok. Zdjąć zakrętkę z probówki do ultrawirowania za pomocą ściereczki niepozostawiającej włókien.
  33. Przebić ściankę probówki do ultrawirowania igłą około 3 mm poniżej granicy między 40% a 60% jodiksanolem (Rysunek 2).
  34. Powoli odessać granicę faz oraz część frakcji 40%. Unikać zasysania górnej części frakcji 40%, pobierając łącznie około 4 mL.
  35. Przykrywając palcem otwartą górę probówki do ultrawirowania, wyciągnąć strzykawkę i przenieść odessaną frakcję AAV do probótki stożkowej 50 mL. Strzykawkę wyrzucić do pojemnika na odpady ostre. Probówkę do ultrawirowania wyrzucić.
  36. Powtórzyć kroki 2.31-2.35 dla każdej probówki do ultrawirowania.
  37. Rozcieńczyć odessaną frakcję AAV około dwukrotnie w buforze do lizy AAV do objętości 40 mL.
  38. Przemyć przewody perystaltyczne zgodnie z opisem w krokach 2.16-2.17.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Rozcieńczoną frakcję AAV należy przechowywać w temperaturze 0 °C przez noc.
  39. Nalać po 20 mL rozcieńczonej frakcji AAV do dwóch nowych probówek do ultrawirowania.
  40. W przypadku drugiej rundy wirowania w gradiencie gęstości jodiksanolu, rozcieńczoną frakcję AAV nakłada się na warstwy zgodnie z opisem powyżej, używając tylko 10 mL (5 mL na probówkę do ultrawirowania) frakcji 40% i 14 mL (7 mL na probówkę do ultrawirowania) frakcji 60%. Powtórzyć kroki 2.29-2.36 dla ultrawirowania i aspiracji.
    UWAGA: Przed odłożeniem pompy perystaltycznej i przewodów, należy przemyć przewody wodą DI zgodnie z opisem w krokach 2.16-2.17.

Wynik wirowania w gradiencie gęstości; probówki z warstwowymi roztworami wykazujące separację makrocząsteczek.
Rycina 2: Gradient jodiksanolu z oznakowanym interfejsem 40%-60% jodiksanolu. (A) Pierwszy gradient jodiksanolu. Czerwony fenol jest stosowany w frakcjach 40% jodiksanolu i 60% jodiksanolu. Ma on inny kolor ze względu na różnicę pH między obiema frakcjami. Strzałka wskazuje miejsce wprowadzenia strzykawki w celu pobrania frakcji rAAV, tuż poniżej interfejsu 40%-60% jodiksanolu. (B) Drugi gradient jodiksanolu. W tym kroku stosowane są tylko frakcje 40% i 60% jodiksanolu. Strzałka wskazuje miejsce wprowadzenia strzykawki w celu pobrania frakcji rAAV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Wymiana buforu i koncentracja wirusa

  1. Po uzyskaniu frakcji AAV z drugiej rundy wirowania w gradiencie gęstości jodiksanolu, rozcieńczyć ją dwukrotnie roztworem buforu AAV.
  2. Urównoważyć filtr wirówkowy, dodając 20 mL roztworu buforu AAV do górnej części filtra. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat.
  3. Przenieść rozcieńczoną frakcję AAV do filtra wirówkowego. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat.
  4. Dodać 20 mL roztworu buforu AAV do górnej części filtra. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat.
    UWAGA: Jeśli membrana filtra wirówkowego ulegnie zapchaniu, co spowoduje nieefektywny przepływ roztworu, ostrożnie użyć mikropipety P200, aby kilkakrotnie wciągnąć i wypuścić roztwór znajdujący się w górnej części filtra. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć filtra końcówką mikropipety.
  5. Powtórzyć krok 3.4 jeszcze dwa razy.
    UWAGA: Aby zapobiec nadmiernej koncentracji AAV, należy utrzymać objętość co najmniej 1 mL w górnej części filtra. Może być konieczne dostosowanie czasu wirowania, aby zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. W przypadku nadmiernej koncentracji AAV może dojść do wytrącenia.
  6. Aby uzyskać końcowy miano w zakresie 1012 vg/mL, wirować wirusa do końcowej objętości około 1 mL.
    UWAGA: W zależności od użytego szkieletu serotypu i wydajności pakowania wirusa, może być konieczne skoncentrowanie wirusa w mniejszej objętości.
  7. Użyć mikropipety p1000, aby przenieść skoncentrowany AAV z górnej części filtra wirówkowego do probówki do mikrocentryfugi. Użyć mikropipety p200, aby przemyć filtr wirówkowy 50 µL buforu AAV w celu zebrania pozostałego wirusa i połączyć go z resztą skoncentrowanego AAV.
  8. Odstawić alikwot 2 µL skoncentrowanego AAV do oznaczania miana. Zob. Supplementary Table 1 w celu zapoznania się z primerami ITR, które można wykorzystać do qPCR.
  9. Przepuścić skoncentrowany AAV przez filtr strzykawkowy 0,2 µm w celu jego sterylizacji.
    UWAGA: Podczas sterylizacji małej objętości należy wybrać filtr strzykawkowy o małej średnicy, aby zminimalizować straty wirusa. Użycie filtra o małej średnicy z niskim wiązaniem białek pozwoli na minimalną utratę wirusa (dane nie przedstawiono).
  10. Sterylowany AAV można wykorzystać niezwłocznie do transdukcji komórek lub przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w ciągu czterech tygodni. Do dłuższego przechowywania należy go przechowywać w temperaturze -70 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metodę tę można zastosować w celu uzyskania mian na poziomie co najmniej 1012 cząsteczek wirusa na ml. Miano można uzyskać (Rysunek 3) metodą qPCR przy użyciu starterów ITR dostarczonych w Tabela uzupełniająca 1, metodą ddPCR lub jakąkolwiek inną metodą miareczkowania. Suboptymalne miana mogą wynikać z zastosowania zakrętka gen kodujący kapsyd o niskiej wydajności pakowania.

Innym możliwym źródłem nieoptymalnych wyników jest ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół oczyszczania z podwójnym gradientem gęstości jodiksanolu jest metodą uniwersalną, ponieważ ma zastosowanie do wszystkich wariantów zmutowanych AAV, niezależnie od ich specyficzności receptorowej. Wczesne metody oczyszczania AAV opierały się na gęstości cząstek i obejmowały wirowanie izopikenne w CsCl oraz ciągłe wirowanie w gradionym poziomie gęstości sacharozy19. Później opracowano podejścia specyficzne dla serotypu, w których wykorzystano przeciwciała monoklonalne związane z kolumnami s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wirówka stołowa 5810 REppendorf22625501
8-kanałowa pompa perystaltyczna Watson-Marlow020.3708.00A
Automatyczny licznik komórek NanoEntekEVE-MC
Avanti J-EBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabconco322491101
Inkubator CO2 z wytrząsarką Ustaw na 8% CO2 oraz 37 ° C
Stożkowe probówki wirówkoweThermo Scientific33965250 ml
Stożkowe probówki wirówkoweThermo Scientific33965015 mL
Jednorazowe mikropipetyFisherbrand21-164-2GKapilary
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FLNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Komórki Expi293FGibcoA14527
Końcówki filtrująceUSA Scientific1126-78101000 µ L
Końcówki filtrówUSA Scientific1120-8810200 µ L
Końcówki filtracyjneUSA Scientific1120-181020 µ L
Końcówki filtrówUSA Scientific1121-381010 µ L
Igły podskórneTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A Wiadro
na lód z pokrywkąVWR10146-184
Rotor JS-5.3Beckman Coulter368690
Roztwór chlorku magnezu (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metalowy stojak i zacisk Fisherbrand05-769-6Q
Probówki do mikrowirówekEppendorf226000281,5 ml
Szczypce półokrągłe
Ultrawirówka Optima XE-90Beckman CoulterA94471
Opti-MEM I Medium o obniżonej surowicyGibco31985062
OptiPrep pożywka o gradiencie gęstości (jodiksanol)SerumwerkAXS-111454260% roztwór jodu
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Fenol czerwony  roztwórSigma-AldrichP0290
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP4474
Kontroler pipet Pipet-Aid XPDrummond Scientific4-000-101
Plazmid pCapsidDe novo lub Addgene itp. Nie dotyczyUżyliśmy pACGrh74. 
Plazmid pHelperAddgene112867
Plazmid pTransgeneDe novo lub Addgene itp. Nie dotyczyUżyliśmy pdsAAV-GFP.
Pluroniczny roztwór poliolu F-68 (10%)Mp Biomedicals92750049
Glikol polietylenowy 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polietylenina HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Rozcieńczyć w wodzie do 40 μ M
Probówki wirówkowe polipropylenowe, sterylneCorning431123500 ml
Probówki wirówkowe polipropylenowe, sterylneCorning430776250 mL
Probówki polipropylenowe OptisealBeckman Coulter361625
Pipety serologiczneAlkali ScientificSP250-B50 ml
Pipety serologiczneAlkali ScientificSP225-B25 ml
Pipety serologiczneAlkali ScientificSP210-B10 ml
Pipety serologiczneAlkali ScientificSP205-B5 ml
Kolby do wytrząsaniaFisherbrandPBV10001 l
TermosyFisherbrandPBV50-0500 ml
Kolby do wytrząsaniaFisherbrandPBV250250 ml
Kolby do wytrząsaniaFisherbrandPBV12-5125 ml
Roztwór chlorku sodu (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterylne strzykawkiFisherbrand14-955-4585 ml
Filtr strzykawkowyMiliporeSLGV013SL0,22 mikrona
Tris-HCl pH 8,5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan niebieski rozwiązanieGibco15250061
Montaż stojaka na probówkiBeckman Coulter361646
Dystanse rurowe (x4)Beckman Coulter361669
Rurka do pompy perystaltycznejFisher Scientific14190516
Type 70 Ti o stałym kącie nachylenia WirnikBeckman Coulter337922
Zamrażarka niskotemperaturowaUstawione na -70 ° C
Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20SartoriusVS2041
Łaźnia wodna Ustawiony na 37 stopni; Z
Wirówka szybkoobrotowa Mikroskop odwrócony

Bibliografia

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
  3. George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
  4. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  7. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
  8. Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
  9. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
  10. Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
  11. Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
  12. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  13. Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
  14. Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
  15. Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
  16. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
  17. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
  18. Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168(2023).
  19. Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
  20. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  21. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  22. Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  23. Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
  24. Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
  25. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  26. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  27. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
  28. Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
  29. Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7(2023).
  30. Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
  31. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  32. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  33. Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
  34. Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
  35. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  36. Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
  37. Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
  38. Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
  39. De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
  40. Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Gradient jodiksanolowyrekombinowany AAVprodukcja wektorów wirusowychterapia genowaoczyszczanie cząsteczek wirusowychwytrącanie PEG
Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.