Ten protokół przedstawia w pełni zautomatyzowany przepływ pracy do ekstrakcji geosminy i 2-metyloizoborneolu z wody i bogatych w lipidy tkanek ryb. Metoda pozwala na wczesne wykrycie tych cząsteczek, zanim osiągną one progi zapachowe. Przedstawiono reprezentatywne dane z otoczenia akwakultury.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Geosmin i 2-metyloizoborneol to lotne związki organiczne pochodzenia mikrobiologicznego, które często występują w recyrkulacyjnych systemach akwakultury i nadają rybom w nich nieprzyjemne zapachy i smaki, nawet przy ekstremalnie niskich stężeniach. Istniejące metody analityczne dla tych związków u ryb mają trudności z osiągnięciem wystarczającej przepustowości próbek i często nie są zautomatyzowane, co wymaga intensywnego przygotowania praktycznego. Opracowaliśmy metody analizy geosminy i 2-metyloizoborneolu odpowiednio z wody i tkanek ryb przy użyciu metalowej sondy z fazą ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności. Osiągnięto solidną i ilościową detekcję zarówno w wodzie, jak i w tkankach ryb, przy minimalnych granicach wykrywalności wynoszących 1,2 ng/l dla geosminy i 1,1 ng/l dla 2-metyloizoborneolu z wody oraz odpowiednio 18,1 ng/kg i 13,6 ng/kg z tkanek ryb. Stężenia te były znacznie poniżej progów wykrywalności u ludzi. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że metody te mogą wykryć geosminę i 2-metyloizoborneol, zanim staną się one odczuwalne dla ludzi. W przeciwieństwie do innych technik ekstrakcji sorpcyjnej o dużej wydajności, takich jak ekstrakcja sorpcyjna z mieszadłem, technika ta jest w pełni zautomatyzowana, co znacznie poprawia przepustowość i wyklucza błędy ręcznej obsługi, a wytrzymała konstrukcja sondy wyklucza pękanie, co jest powszechne w przypadku mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME). Ta metoda jest odpowiednia do monitorowania nawaniaczy we wszystkich ustawieniach jakości wody, a także do wykrywania związków o nieprzyjemnym smaku w matrycach stałych i półstałych.
Wprowadzenie
Geosmin (GSM) i 2-metyloizoborneol (MIB) występują naturalnie w wodzie i glebie jako produkty uboczne metabolizmu mikrobiologicznego1,2. Chociaż generalnie nie są niebezpieczne dla środowiska lub zdrowia ludzkiego, nadają wodzie nieprzyjemne "ziemiste" i "błotniste" zapachy i smaki, które są wyczuwalne nawet przy ekstremalnie niskich stężeniach, tak niskich jak 10 i 20 ng/L odpowiednio dla GSM i MIB3,4. W związku z tym obecność tych substancji zapachowych obniża postrzeganą jakość wody i jest wysoce niepożądana w większości kontekstów. W śródlądowych drogach wodnych substancje zapachowe zmniejszają atrakcyjność dla odwiedzających i mogą powodować skargi do organów ochrony środowiska5, podczas gdy w wodzie pitnej substancje zapachowe nadają nieprzyjemny zapach i smak, który konsumenci uważają za niedopuszczalny6. Rzeczywiście, wiele krajów nałożyło limity regulacyjne dotyczące poziomów substancji zapachowych w wodzie pitnej, przy czym Chiny określają 10 ng / L jako maksymalne dopuszczalne stężenie GSM7.
Recyrkulacyjne systemy akwakultury (RAS) stają się coraz ważniejsze w branży akwakultury jako sposób produkcji ryb. Systemy te działają na lądzie i stale ponownie wykorzystują wodę, zmniejszając w ten sposób wpływ na środowisko, ale konieczne jest intensywne filtrowanie wody RAS, aby utrzymać optymalne warunki do hodowli ryb. Biofiltry z ruchomym złożem zostają skolonizowane przez mikroorganizmy z powodu obfitości składników odżywczych w kale ryb i niezjedzonej paszy8. Mikroorganizmy te są korzystne w usuwaniu odpadów azotowych i nadmiaru składników odżywczych; jednak niektóre gatunki mogą wytwarzać GSM, MIB i inne substancje zapachowe4. Te substancje zapachowe następnie przedostają się do wody i są wchłaniane do mięsa ryb, gdzie mogą nadawać nieprzyjemny zapach i cechy smakowe, które konsumenci uważają za niewłaściwe. Wartości progowe zapachu w mięsie ryb są zależne od gatunku, ale wartości dla łososia atlantyckiego, gatunku pospolitego w RAS, wynoszą 44 - 500 ng/kg dla GSM i >900 ng/kg dla MIB4. W związku z tym operatorzy systemów bezpieczeństwa powinni regularnie monitorować stężenia GSM i MIB w swoich systemach, aby upewnić się, że nie osiągają one problematycznych poziomów4. Dotknięte ryby można oczyścić ze związków o nieprzyjemnym smaku przed zbiorem, aby odzyskać jakość fileta; Jest to jednak kosztowny proces, wymagający od zakładu zatrzymania recyrkulacji wody i zamiast tego przepływu nowej wody przez system przez 10 -14 dni9. Biorąc pod uwagę, że GSM i MIB stanowią stały i kosztowny ekonomicznie problem w wielu branżach, zasadna jest ponowna ocena i ulepszenie metod analitycznych wykrywania. Idealnie byłoby, gdyby operatorzy systemu RAS byli w stanie monitorować zarówno wodę w systemie RAS w celu identyfikacji rosnących stężeń GSM i MIB, zanim staną się one problematyczne, jak i tkanki ryb w celu określenia, czy i w jakim stopniu poziomy GSM i MIB wpłynęły na jakość produktu.
Większość metod wykrywania GSM i MIB używa chromatografii gazowej (GC) ze spektrometrem masowym (MS) lub detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) do separacji i wykrywania, ale sposób początkowego ekstrakcji substancji zapachowych z matrycy wodnej jest bardzo różny, z wieloma metodami opublikowanymi10. Fakt, że tak różnorodne metody zostały wypróbowane i w rzeczywistości są nadal rutynowo stosowane, świadczy o tym, że każda z nich ma poważne wady. Wady te obejmują wymóg dużej wielkości próbki i dużych objętości rozpuszczalnika, jak w przypadku ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE), niską czułość i interferencję wody, jak w metodach opartych na przestrzeni nadpowierzchniowej, lub rozległe problemy z przenoszeniem i zanieczyszczeniem systemu, jak w przypadku przedmuchiwania i pułapkowania (P i T).
Ekstrakcja sorpcyjna obejmuje szereg technik ekstrakcji, w których można użyć stałej fazy sorpcyjnej do ekstrakcji substancji zapachowych z przestrzeni nad próbką lub z samej próbki poprzez bezpośrednie zanurzenie10. Techniki te są kompatybilne z mniejszymi objętościami próbek niż inne techniki, nie wymagają rozpuszczalników i zwykle nie mają na nie poważny wpływ ingerencja wody. Jednak najpowszechniejsza forma ekstrakcji sorpcyjnej, mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME), wykorzystuje tylko niewielką objętość fazy sorpcyjnej o niskiej pojemności dla analitów, co ogranicza wydajność ekstrakcji. Dodatkowo, kruche włókna mogą ulec uszkodzeniu lub uszkodzeniu11, przerywając przepływ pracy. Ekstrakcja sorpcyjna z mieszadłem (SBSE) pokonuje te trudności dzięki większej objętości fazowej i trwalszej konstrukcji, ale nie jest łatwo zautomatyzowana, co wymaga ręcznego przenoszenia mieszadeł do próbek i z próbek do probówek do desorpcji termicznej12. W kontekście rutynowych badań przesiewowych wody, gdzie kluczowa jest wysoka przepustowość, ten brak automatyzacji stanowi istotną barierę.
Celem naszej metody jest ulepszenie wyżej wymienionych metod pod względem przepustowości próbek i ogólnej zdolności ekstrakcji sorpcyjnej. W związku z tym opracowaliśmy technikę wykorzystującą sondy do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności (HCSE), łącząc wysoką pojemność i wytrzymałość analitu SBSE z doborem fazy i automatyzacją SPME do ilościowej, wysokoprzepustowej analizy GSM i MIB. Po pewnych modyfikacjach technika ta może być stosowana zarówno do próbek wody, jak i do próbek homogenizowanej tkanki ryb. W tym miejscu opisujemy protokół w całości i prezentujemy dane walidacyjne, które pokazują, że jest on powtarzalny, liniowy i bardzo czuły. Chociaż próbki akwakultury są tutaj wykorzystywane do celów demonstracyjnych, protokół nadaje się do monitorowania substancji zapachowych w szerokim zakresie rodzajów próbek, w tym w wodach, glebach i różnych środkach spożywczych. Dzięki pełnej automatyzacji protokół jest szczególnie korzystny tam, gdzie oczekuje się, że liczba próbek będzie wysoka.
Protokół
Próbki ryb zostały pobrane od zwierząt, które zostały już poddane ubojowi w celu spożycia przez ludzi. W związku z tym nie było wymagane żadne poświadczenie etyczne.
1. Przygotowanie wzorców kalibracyjnych i wewnętrznych
- Przygotowanie wzorca kalibracyjnego
- Przygotować roztwór podstawowy C1, dodając 10 μl roztworu geosminy i 2-metyloizoborneolu (100 μg/ml) do kolby miarowej o pojemności 100 ml i napełniając do kreski metanolem klasy LC-MS. Otrzymany roztwór będzie zawierał każdy analit w stężeniu 10 μg/l (ppb).
- Przygotować wzorce kalibracyjne, dodając roztwór podstawowy C1 w objętości wskazanej w tabeli 1 do kolby miarowej o pojemności 100 ml i napełniając do kreski wodą dejonizowaną.
- Codziennie twórz nowe wzorce kalibracyjne, ponieważ są one bardzo łatwo psujące się.
UWAGA: Ważne jest, aby codziennie przygotowywać te roztwory podstawowe na świeżo.
- Przygotowanie wzorca wewnętrznego
- Przygotować roztwór podstawowy (I1) przez dodanie 10 mg 2-izopropylo-3-metoksypirazyny (IPMP) (o czystości >98%) do kolby miarowej o pojemności 1 l, wypełnionej do objętości metanolem klasy LC-MS, co daje masę 10 mg/l.
- Pobrać pipetą 100 μl roztworu I1 do kolby miarowej o pojemności 100 ml i napełnić do pełnej objętości wodą dejonizowaną, aby uzyskać roztwór I2 (10 μg/l). Wstrzyknąć 50 μl do każdej fiolki z próbką, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 ng/l.
2. Analiza wody
- Przygotowanie próbki
- Umieścić jedną fiolkę o pojemności 20 ml na każdą analizowaną próbkę wody w tacce na próbki.
- Za pomocą skalibrowanej wagi odważyć i umieścić 2,5 g NaCl w każdej 20 ml fiolce z zaciskaną górną próbką.
UWAGA: Dodanie soli zwiększa przenoszenie MIB i geosminy z wody do przestrzeni nad głową. - Za pomocą pipety lub dozownika zatyczonego do butelki dodać 5 ml wody z próbką do każdej fiolki z zaciskaną nakrętką o pojemności 20 ml.
- Odpipetować 50 μl roztworu wzorca wewnętrznego I2 do każdej próbki, wzorca kalibracyjnego i wszelkich próbek QA/QC, w tym próbek ślepych.
- Umieścić wieczko na wierzchu fiolki i uszczelnić je narzędziem do zaciskania fiolki, aby zminimalizować straty analitu.
- Przetwarzaj tylko 1-2 próbki na raz i szybko zamknij każdą fiolkę po zakończeniu, aby zminimalizować utratę analitu lotnych analitów.
- Ekstrakcja analitem (woda)
- Umieść tacę na próbkę w uchwycie tacy automatycznego podajnika próbek.
- Aby przygotować metodę instrumentu, otwórz program instrumentu i kliknij Edytor metody.
- Utwórz nową metodę, wprowadzając następujące parametry do edytora metody (pozostawiając inne parametry z wartościami domyślnymi):
- W opcji "Wstępne pobieranie próbek" należy ustawić czas mieszania fiolki na 10 minut, aby umożliwić anality rozdzielenie się z wody do przestrzeni nad roztworem.
- W opcji "Pobieranie próbek" ustaw temperaturę inkubacji na 65 °C, czas inkubacji na 30 minut, a prędkość mieszadła na 400 obr./min.
- Upewnij się, że "sonda myjąca HiSorb" jest włączona; w przeciwnym razie pozostała matryca próbki może zanieczyścić system.
- W polu "Desorpcja sondy" ustawić czas desorpcji na 15 minut, atemperaturę esorpcji D na 270 °C.
- W ustawieniach pułapki ustaw niską temperaturę pułapki na 25 °C i "przepływ dzielony" na 8 ml/min.
- Uruchom metodę automatycznego podajnika próbek w połączeniu z metodą GC-MS, naciskając przycisk Start na każdym z odpowiednich programów.
3. Analiza tkanek ryb
- Przygotowanie próbki
- Umieścić jedną fiolkę o pojemności 20 ml na każdą próbkę analizowanej ryby w tacce na próbki.
- Homogenizuj tkankę ryby za pomocą dostępnego w handlu robota kuchennego.
- Używając skalibrowanej wagi, odważyć 1,00 g homogenizowanej tkanki rybnej do każdej fiolki.
- Odpipetować pipetą 5 ml nasyconego roztworu NaCl do każdej fiolki.
- Odpipetować 100 μl roztworu wzorca wewnętrznego I2 do każdej próbki, próbki kalibracyjnej i wszelkich próbek QA/QC.
- Umieścić wieczko na wierzchu fiolki i uszczelnić za pomocą narzędzia do zaciskania fiolki.
- Przygotuj tylko 1-2 próbki na raz, aby zmniejszyć utratę związków półlotnych i lotnych.
- Ekstrakcja analitu (ryby)
- Umieść tacę na próbkę w uchwycie tacy automatycznego podajnika próbek.
- Przygotuj metodę instrumentu w następujący sposób (pozostawiając inne parametry z wartościami domyślnymi).
UWAGA: czas mieszania fiolki przed pobraniem próbek i temperatura inkubacji różnią się od sekcji 2.2.2.- W przypadku "Wstępnego pobierania próbek" ustawić czas mieszania fiolki na 20 minut.
- W trybie "Pobieranie próbek" ustawić temperaturę inkubacji na 80 °C, czas inkubacji na 30 minut, a prędkość mieszadła na 400 obr./min.
- Upewnij się, że włączona jest sonda "wash HiSorb", w przeciwnym razie resztkowa matryca próbki może zanieczyścić system.
- W polu "Desorpcja sondy" ustaw czas desorpcji na 15 minut, a temperaturę desorpcji na 270 °C.
- W ustawieniach pułapki ustaw niską temperaturę pułapki na 25 °C i podziel przepływ na 8 ml/min.
UWAGA: Wymagany jest dłuższy, cieplejszy etap wstępnego pobierania próbek ze względu na wyższe powinowactwo MIB i GSM do bogatych w lipidy tkanek ryb w porównaniu z wodą.
- Uruchom metodę automatycznego podajnika próbek w połączeniu z metodą GC-MS, naciskając przycisk Start na każdym z odpowiednich programów.
4. Separacja i detekcja za pomocą GC-MS
- Używaj tych samych parametrów GC-MS dla metod wodnych i tkanek rybnych.
- Upewnij się, że GC jest wyposażony w kolumnę 5MS, 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm i jest zasilany ultraczystym helem nośnym. Ustaw natężenie przepływu nośnika na 2 ml/min.
- Przygotować program pieca GC w następujący sposób: Temperatura początkowa 60 °C, utrzymywana przez 3 minuty, następnie wzrost temperatury od 10 °C/min do 100 °C, następnie 20 °C/min do 190 °C, następnie 30 °C/min do 280 °C, z końcowym czasem podtrzymania wynoszącym 2 min. Całkowity czas pracy jest ustawiony na 16,5 min.
- Ustaw linię przesyłową między GC i MS na 280 °C i źródło jonów oraz poczwórną odpowiednio na 250 °C i 200 °C.
- Do wykrywania stwardnienia rozsianego w trybie skanowania należy użyć zakresu skanowania m/z 50-350.
- Do operacji monitorowania wybranych jonów (SIM) należy użyć jonów kwantyfikacyjnych i potwierdzających odpowiednio m/z 95 i 107 dla MIB, m/z 137 i 152 dla IPMP oraz m/z 112 i 55 dla GSM.
UWAGA: Wiele pakietów oprogramowania do chromatografii posiada funkcję automatycznego wyboru pików, ale zdecydowanie zaleca się ręczne przejrzenie wyboru piku pod kątem błędów.
Wyniki
Optymalizacja metody
Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu optymalizacji metody, w tym ocenę przeniesienia próbek (carryover), optymalizację czasu desorpcji sondy, ocenę standardu wewnętrznego, ocenę fazy sondy, ocenę liniowości i powtarzalności oraz obliczenie granicy wykrywalności metody.
Ocena przeniesienia
Eksperyment rozpoczęliśmy od temperatury desorpcji sondy wynoszącej 250 °C. Standardy kalibracyjne przygotowano zgodnie z Tabelą 1. Aby ocenić przeniesienie (carryover), przeanalizowano standardy GSM i MIB w stężeniu 20 ng/L, a następnie wykonano kolejno następujące pomiary: analizę parametrów GC-MS bez wstrzykiwania czegokolwiek do kolumny (ślepa próba kolumny), desorpcję pułapki ogniskującej bez przenoszenia substancji z injektora (ślepa próba pułapki), ogrzewanie injektora bez wprowadzania sondy (ślepa próba injektora) oraz desorpcję sondy bez uprzedniego pobierania próbek (ślepa próba sondy). W przypadku ślepej próby kolumny, pułapki i injektora zaobserwowano przeniesienie poniżej 1%, jednak w ślepej próbie sondy przeniesienie wyniosło odpowiednio 9,35% dla GSM i 3,77% dla MIB (Tabela 2). Stwierdzono zatem, że w zastosowanych warunkach występuje istotne przeniesienie GSM na sondzie PDMS.
Optymalizacja czasu desorpcji
Po zidentyfikowaniu efektu przeniesienia (carryover) na sondzie PDMS, podjęto próbę rozwiązania tego problemu poprzez dostosowanie temperatury desorpcji sondy. Oczekiwano, że wyższa temperatura desorpcji sondy zwiększy szybkość desorpcji analityku z sondy, tak aby desorpcja była bardziej kompletna po zakończeniu 15 min czasu desorpcji sondy. Jednakże wyższa temperatura mogłaby również sprzyjać rozkładowi analityku, a w konsekwencji negatywnie wpłynąć na czułość. Wysokie temperatury mogą również uszkodzić materiały sorpcyjne, dlatego należy unikać temperatur powyżej 280 °C. Przeniesienie GSM było znaczące przy temperaturze desorpcji sondy 250 °C, ale uległo ono znacznemu zmniejszeniu do poziomu znacznie poniżej progu akceptowalności 5%, gdy zamiast niej zastosowano 270 °C (Rysunek 1). Poprawę tę osiągnięto bez utraty czułości, ponieważ powierzchnie pików uzyskane w analizie początkowej przy 270 °C nie były mniejsze niż w przypadku niższych temperatur desorpcji sondy (Rysunek 1). Wskazuje to, że ewentualny wzrost rozkładu analityku jest pomijalny.
Zastosowanie standardu wewnętrznego
Związek 2-izopropylo-3-metoksypyrazyna był szeroko stosowany jako standard wewnętrzny podczas wykrywania GSM i MIB13. Porównaliśmy obliczone stężenia GSM i MIB ze znanymi stężeniami wzbogaconymi, zarówno z korekcją standardem wewnętrznym, jak i bez niej. Odzysk bez korekcji standardem wewnętrznym był słaby, a obliczone stężenia wynosiły 60% znanych stężeń wzbogaconych (Rycina 2). W przeciwieństwie do tego, przy zastosowaniu korekcji standardem wewnętrznym, odzysk był bardzo dobry i wynosił około 100%. W związku z tym w późniejszych analizach zastosowano korekcję standardem wewnętrznym.
Wybór fazy
W analizach SPME do PDMS często dodaje się szeroki zakres węgli (CWR) i/lub dwinylobenzen (DVB) w celu zwiększenia czułości, co jednak podnosi koszty. Podjęliśmy próbę porównania sond składających się z samego PDMS z sondami trójfazowymi (DVB/CWR/PDMS), przyjmując, że zwiększona objętość fazy sondy prawdopodobnie poprawi czułość w porównaniu z włóknami SPME. Dane dotyczące odzysku dla sond PDMS i trójfazowych (Rysunek 3) wykazują w szerokim zakresie podobną wydajność obu typów sond, przy czym odzyski były nieco bliższe 100% w przypadku sond PDMS. Zatem, biorąc pod uwagę nieco lepszą wydajność i niższe koszty, wszystkie kolejne analizy przeprowadzono z użyciem sond PDMS. Należy zauważyć, że ponieważ sonda zbiera anality z przestrzeni nad próbką, a nie poprzez ze względu na bezpośredni kontakt z matrycą próbki, kinetyka podziału GSM / MIB do materiału fazowego nie powinna różnić się pomiędzy próbkami wody i ryb.
Walidacja metody
Przeanalizowano serię kalibracyjną obejmującą sześć stężeń analitów w wodzie, w zakresie od 1 do 100 ng/L (Rycina 4). Uzyskano doskonałą liniowość, przy r2 wyniosły odpowiednio 0,9999 dla GSM oraz 0,9999 dla MIB. Błąd standardowy regresji wyniósł 0,43 dla GSM i 0,37 dla MIB. Wskazuje to, że metoda jest odpowiednia do analiz ilościowych w badanym zakresie. Powtarzalność określono na podstawie ośmiu powtórzeń standardów laboratoryjnych zawierających GSM i MIB w stężeniu 40 ng/L w wodzie. Wartości RSD wyniosły 6,3% dla GSM i 4,8% dla MIB, co świadczy o bardzo dobrej odtwarzalności wyników. Powtórzenia te analizowano w trzech oddzielnych seriach w różne dni, co dodatkowo potwierdziło precyzję metody. Zatem HCSE z analizą GC-MS jest metodą ilościową i niezawodną.
Granice wykrywalności (MDL)
Granicę wykrywalności metody (MDL) obliczono zgodnie z protokołem U.S. EPA14, wykorzystując wzbogaconą wodę (n=10) lub wzbogacone próbki ryb (n=11). Metoda ekstrakcji i detekcji GSM oraz MIB w wodzie pozwoliła uzyskać granice wykrywalności na poziomie 1,2 ng/L dla GSM i 1,1 ng/L dla MIB. Wartości MDL te były znacznie niższe od ludzkich progów zapachowych, które wynoszą odpowiednio około 10 i 20 ng/L. Zatem zaproponowana metoda pozwala na pewną i ilościową detekcję akumulacji tych cząsteczek zapachowych, zanim osiągną one ludzkie progi sensoryczne. Granice wykrywalności dla ekstrakcji i detekcji GSM oraz MIB z ryb wyniosły 18,1 ng/kg dla GSM i 13,6 ng/kg dla MIB.
Analiza próbek wody z akwakultury
Przeanalizowano próbki wody pobrane z siedmiu recyrkulacyjnych systemów akwakultury, z pięcioma powtórzeniami (system 3) lub trzema powtórzeniami (wszystkie pozostałe systemy) dla każdego z nich. Wszystkie analizowane recyrkulacyjne systemy akwakultury, z wyjątkiem jednego, zawierały geosminę oraz MIB w stężeniach powyżej naszej granicy wykrywalności MDL (Rysunek 5), co wskazuje na potencjalny problem z jakością wody. Zauważono jednak, że we wszystkich przypadkach stężenie MIB było znacznie poniżej ludzkiego progu wyczuwalności zapachowej wynoszącego 20 ng/L, natomiast tylko jeden system przekroczył próg zapachowy GSM wynoszący 10 ng/L (system 1, stężenie GSM = 12,69 ng/L). Choć w systemie 3 wykryto GSM i MIB, odnotowano, że stężenie MIB jest niższe od obliczonych przez nas wartości MDL, w związku z czym nie można go wiarygodnie określić ilościowo. Metoda wykazała imponującą precyzję we wszystkich systemach, mimo zastosowania rzeczywistych próbek wody, przy bardzo niewielkich różnicach w obliczonym stężeniu pomiędzy próbkami powtórzeniami w każdym systemie (Rysunek 5).
Analiza tkanek ryb
Tkanka ryb, bogata w lipidy, wywołuje silny efekt matrycy, który utrudnia ekstrakcję GSM i MIB podczas stosowania tej metody. Z tego powodu w metodzie wprowadzono niewielkie zmiany w celu zwiększenia wydajności ekstrakcji, w tym wyższą temperaturę inkubacji (80 °C) oraz dłuższy czas inkubacji (20 min) w porównaniu z metodą ekstrakcji z wody. Tkanki ryb poddano wcześniej analizie w celu oznaczenia stężeń tła GSM i MIB. Te same próbki wzbogacono następnie znaną ilością GSM i MIB, a następnie przeanalizowano w trzech powtórzeniach, aby określić procent odzysku oraz precyzję (Rysunek 6).
Rysunek 1: Wpływ temperatury desorpcji sondy na przenoszenie (carryover). (A) Standard laboratoryjny zawierający GSM i MIB w stężeniu 20 ng/L analizowano trzykrotnie w jednej z trzech temperatur desorpcji sondy, wyznaczając średnie powierzchnie piku. Następnie każdą sondę desorbowano dwukrotnie przy początkowej temperaturze w celu oceny przenoszenia, a wyniki przedstawiono w punktach (B) (GSM) i (C) (MIB). Przenoszenie wyrażono jako powierzchnia piku w procentach powierzchni piku początkowego. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe dla trzech powtórzeń. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 2: Zastosowanie standardu wewnętrznego. Porównanie skorygowanych oraz nieskorygowanych danych o odzysku dla standardów analitycznych przy stężeniach 15 lub 40 ng/L, przy ekstrakcji wyłącznie za pomocą sond PDMS. Stężenia próbek zostały skorygowane z wykorzystaniem IPMP jako standardu wewnętrznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Odzysk analityczny. Dane dotyczące odzysku standardów analitycznych GSM (po lewej) i MIB (po prawej) przy stężeniu 15 ng/L, z ekstrakcją za pomocą sond wyłącznie PDMS lub trójfazowych (PDMS, DVB, CWR). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Krzywe kalibracji analitycznej. Regresje liniowe krzywych kalibracyjnych dla GSM (linia ciągła, r2 = 0,9999; S=0,37) oraz MIB (linia przerywana, r2 = 0,9999; S=0,37). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Zastosowanie w wodach akwakultury. Stężenia (A) GSM i (B) MIB w próbkach wody pobranych z siedmiu systemów akwakultury (n ≥ 3 dla każdego systemu). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 6: Zastosowanie w tkankach ryb. Stężenia GSM i MIB w dwóch próbkach ryb wzbogaconych o GSM i MIB (F1 i F2). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Nazwa roztworu | Dodana objętość roztworu stokowego C1 | Objętość całkowita | Stężenie wynikowe |
| Stock C1 | 10ul | 100ml | 10 ug/ml |
| Cal 1 | 10 ul | 100 ml | 1 ng/L |
| Cal 2 | 20 ul | 100 ml | 2ng/L |
| Cal 5 | 50 ul | 100 ml | 5 ng/L |
| Cal 10 | 100 ul | 100 ml | 10 ng/L |
| Cal 20 | 200 ul | 100 ml | 20 ng/L |
| Cal 50 | 500 ul | 100 ml | 50 ng/L |
| Cal 100 | 1000 ul | 100 ml | 100 ng/L |
| Cal 200 | 2000 ul | 100ml | 200 ng/L |
Tabela 1: Standardy kalibracyjne. Standardy geosminy i 2-MIB przygotowano z roztworu CRM47525 geosminy i 2-metyloizoborneolu (100 µg/mL) w metanolu, który rozcieńczono do otrzymania roztworu zapasowego C1 (10 µg/ml) w metanolu.
| Analiza | Przeniesienie (%) | |
| GSM | MIB | |
| Analiza GC | 0.04 | 0.08 |
| Desorpcja z pułapki | 0.09 | 0 |
| Desorpcja z wlotu | 0 | 0 |
| Redesorpcja z sondy | 9.35 | 3.77 |
Tabela 2: Ocena przeniesienia sondy. Przeniesienie po ekstrakcji, desorpcji i analizie GC-MS standardu laboratoryjnego zawierającego GSM i MIB w stężeniu 20 ng/L, z wewnętrznym standardem IPMP w stężeniu 30 ng/L. Opisy analiz podano w punkcie 2.2.1.
Dyskusja
GSM i MIB to związki o nieprzyjemnym smaku występujące w szerokim zakresie ustawień monitorowania wody, a zapotrzebowanie na zdolność testowania jest wysokie. Co więcej, GSM i MIB są dostrzegalne dla ludzi na śladowych poziomach. Idealny system analityczny musi zatem łączyć wysoką czułość z wysoką przepustowością, aby generować duże ilości wysokiej jakości danych. Wykazaliśmy w poprzednich sekcjach, że ekstrakcja za pomocą sond HCSE zapewnia czułość przekraczającą wymaganą.
Solidna konstrukcja sond HCSE wyklucza wszelkie awarie, które mogą zakłócić przepływ pracy SPME. Po optymalizacji metody nie doświadczyliśmy żadnych problemów z zanieczyszczeniem systemu lub przeniesieniem, które są częstymi problemami w przypadku metodologii P i T. Największy wkład w wysoką przepustowość tej metody miała jednak niewątpliwie zastosowana platforma automatycznego podajnika próbek. W przypadku tego systemu analiza była kontynuowana przez całą dobę, przy czym wymagana była ręczna interwencja, aby dostarczyć próbki tylko do tacki na próbki. Jest to przeciwieństwo innych metod ekstrakcji sorpcyjnej o dużej wydajności, takich jak SBSE, które wymagają obsługi ręcznej. Chociaż SPME jest zwykle w pełni zautomatyzowany, przepustowość jest ograniczona, ponieważ inkubacja następnej próbki może zazwyczaj rozpocząć się dopiero po wstrzyknięciu poprzedniej próbki do kolumny GC. Zakładając, że czas cyklu GC jest krótki, GC może zatem pozostać bezczynny, podczas gdy następna próbka zakończy ekstrakcję. Dzięki naszej metodzie wiele próbek może być jednocześnie poddawanych wstępnemu próbkowaniu i ekstrakcji, co minimalizuje czas przestoju GC. Dzięki temu byliśmy w stanie przetworzyć 1,8 próbki na godzinę na system.
Wykazaliśmy wartości MDL wynoszące odpowiednio 1,2 i 1,1 ng/l dla GSM i MIB, znacznie przekraczając wymaganą czułość. Podczas gdy inne techniki, takie jak P i T, LLE, SBSE i SPME, mogą być w stanie osiągnąć niższe MDL w pewnych okolicznościach11, te wzrosty czułości mają ograniczoną wartość praktyczną i nie uzasadniają utraty zalet sond HCSE opisanych powyżej. Co więcej, niektóre z tych technik wymagają dużych objętości próbek, co wiąże się ze wzrostem kosztów wytwarzania odpadów i transportu. W przypadku LLE objętości próbek mieszczą się zwykle w zakresie 200 - 500 ml 15,16,17, podczas gdy dla SPME, SBSE oraz P i T typowe wartości to 10 - 100 ml 18,19,20,21,22. Doskonałą odtwarzalność zaobserwowano przy wartościach RSD wynoszących odpowiednio 6,34% i 4,82% dla GSM i MIB. Wartości te są zasadniczo podobne do wartości stwierdzonych w innych metodach11, a w szczególności przewyższają RSD w opublikowanych metodach SPME23,24. Ponownie, nasze niskie wartości RSD zostały osiągnięte przy objętości próbki wynoszącej zaledwie 5 ml, czyli niższej niż w przypadku zdecydowanej większości opublikowanych technik ekstrakcji. Dlatego jesteśmy przekonani, że sondy HCSE zapewniają wystarczającą czułość i odtwarzalność, a także szeroki zestaw korzyści, które łączą najlepsze aspekty wszystkich znanych alternatyw w jedną prostą, w pełni zautomatyzowaną i zrównoważoną metodę.
Geosmina i 2-metyloizoborneol są związkami lipofilowymi, co stanowi wyzwanie dla naukowców próbujących wyekstrahować te związki z tkanki bogatej w lipidy do analizy. W związku z tym dostosowaliśmy nasze warunki wstępnego pobierania próbek, stosując dłuższą i gorętszą procedurę wstępnego pobierania próbek, aby wprowadzić więcej analitów z matrycy próbki do przestrzeni nad głową. Po wprowadzeniu tych poprawek ustaliliśmy, że metoda działa dobrze w przypadku analizy GSM i MIB w tkankach ryb. Należy zauważyć, że w przypadku próbek o bardzo wysokiej zawartości lipidów może być konieczne zmniejszenie masy użytej próbki, np. do 0,50 g. Ma to na celu uniknięcie tworzenia przez lipidy całkowitego uszczelnienia na powierzchni wody, co zapobiega przedostawaniu się analitów do przestrzeni nad głową.
Metoda ta wykorzystuje zasady równowagi do ekstrakcji analitów z przestrzeni nad próbką. Chociaż używamy tutaj próbek wody i ryb z akwakultury, uważamy, że metoda ta ma zastosowanie do ekstrakcji nawaniaczy z dowolnej stałej lub ciekłej matrycy, która może być homogenizowana i umieszczona w fiolce do pobierania próbek o pojemności 20 ml. Przykładowe zastosowania obejmują monitorowanie wód i gleb w środowisku, testowanie wody pitnej oraz testowanie żywności, takiej jak owoce i warzywa, lub organizmy wodne nieuprawiane w gospodarstwach. W rolnictwie GSM i MIB są często znajdowane w wilgotnych glebach i mogą nadawać nieprzyjemny smak uprawianym tam uprawom2, dlatego zarówno gleba, jak i uprawy mogą być testowane za pomocą naszej metody w celu monitorowania poziomu odorantów jako formy kontroli jakości i/lub diagnozowania źródła dolegliwości związanych z nieprzyjemnym zapachem. Wiele wód środowiskowych, takich jak rzeki i jeziora, doświadcza sezonowych skoków stężenia odorów z powodu zakwitów glonów25, a ta metoda oferuje wysokowydajny i bardzo czuły sposób monitorowania zasięgu tych skoków. Metoda ta nadaje się również do badań akademickich, na przykład do pomiaru szybkości wytwarzania substancji zapachowych przez mikroorganizmy26 lub do zbadania związku między stężeniami substancji zapachowych w wodzie i tkankach zwierzęcych27. Inne grupy badawcze wykorzystały proces HCSE do ekstrakcji z szeregu rodzajów próbek, takich jak napoje alkoholowe28, mięso baranie29, oliwa z oliwek30, pożywki do hodowli komórek ludzkich31i pistacje32. Badania te były ukierunkowane na inne anality lub są badaniami profilowania nieukierunkowanego, a zatem nie zostały zoptymalizowane pod kątem analizy GSM i MIB, ale są prezentowane tutaj, ponieważ oferują ogólne informacje na temat przygotowania różnych typów próbek do ekstrakcji sond HCSE.
Podczas gdy opisana metoda wodna prawdopodobnie będzie miała zastosowanie do wszystkich próbek wodnych lub próbek na bazie wody z minimalną modyfikacją, zastosowanie do innych próbek stałych lub półstałych może wymagać pewnych specyficznych dla matrycy zmian w przygotowaniu próbki (sekcja 3.1) i ekstrakcji analitu (sekcja 3.2). Chociaż nie byłoby możliwe omówienie tutaj wszystkich scenariuszy próbkowania, oferujemy następujące rozważania. (1) Próbki stałe powinny być homogenizowane do postaci drobnego proszku poprzez tarcie, mielenie lub mieszanie w celu zapewnienia reprezentatywności i maksymalnej możliwej powierzchni do wyprowadzania analitów. (2) Próbki stałe o niskiej zawartości lipidów mogą nie wymagać dodawania wody lub soli, tj. może wystarczyć zważenie 1,00 g do fiolki i nakrętki. Pozwoli to na bardziej bezpośrednie przenoszenie analitów z próbki do przestrzeni nad głową, bez pośredniego przenoszenia z matrycy próbki do dodanej wody. Zmniejszy to jednak skuteczność mieszania. Analitycy powinni przeprowadzać eksperymenty w celu określenia optymalnej techniki przygotowania próbki dla swojej matrycy próbki. (3) Różne matryce będą miały różne powinowactwa do GSM i MIB. Dlatego wymagane będą różne temperatury inkubacji, aby w odpowiednim czasie osiągnąć równowagę analitu. Jednak niektóre matryce mogą być chemicznie zmieniane przez ciepło w taki sposób, że zakłócenia są wytwarzane w wyniku reakcji chemicznych w wysokich temperaturach. Również w tym przypadku wymagane są eksperymenty w celu określenia optymalnej temperatury inkubacji dla określonego rodzaju próbki (uwaga: Próbki o wysokiej zawartości wilgoci nigdy nie powinny być inkubowane w temperaturze powyżej 90 °C, aby uniknąć pękania fiolek pod wpływem ciśnienia pary wrzącej wody).
Opracowaliśmy metody wykrywania geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i tkankach ryb. Testy na wzorcach laboratoryjnych potwierdzają, że metody są ilościowe i odtwarzalne, a zastosowanie do próbek rzeczywistych (woda z recyrkulacyjnych systemów akwakultury, tkanki ryb pochodzące z takich systemów) wykazuje skuteczność nawet w kontekście złożonych, brudnych próbek. Chociaż zastosowaliśmy nasze metody do próbek z akwakultury, sugerujemy, że nadają się one do monitorowania GSM i MIB w szerokim zakresie typów próbek, w tym wody oraz materiałów stałych lub półstałych.
Oświadczenia
Autorzy tej publikacji zatrudnieni w Markes International Ltd lub Markes International GmbH pomagali w szkoleniu systemowym, protokołach systemowych, projektach eksperymentalnych i pisaniu. Aby uniknąć stronniczości lub postrzeganej stronniczości w naszych badaniach, wszystkie badania laboratoryjne i analizy danych zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Maine pod bezpośrednim nadzorem Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych – Służby Badawczej Rolnictwa (USDA-ARS) oraz Instytutu Badawczego Akwakultury Uniwersytetu Maine.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Departamentowi Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służbie Badań Rolniczych (USDA-ARS) za fundusze na zakup używanego sprzętu i kontynuację finansowania na zakończenie wszystkich tych badań. Chcielibyśmy również podziękować dr Heather Hamlin, dr Amalii Harrington, dr Deborah Bouchard, dr Sarah Turner, Garethowi Dobsonowi, Cameronowi Coulombe'owi i Abriah James za ich pomoc i wsparcie podczas tych badań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipeta 0,5-10uL | Nichipet Air | A21405581 | |
| 1000uL | Pipeta VWR | 76322-154 | |
| Pipeta 100-1000uL | eppendorf | 285612 | |
| szklana kolba 100 ml | VWR | 76008-704 | |
| Pipeta 10-100uL | Nichipet Air | A20814031 | |
| 10-100uL Końcówki do pipet | mega | 24502-18 | |
| 10xL Końcówki do pipet | VWR | 76322-132 | |
| 20mL Szklane zlewki | VWR | 10754-698 | |
| 2-izopropylo-3-metoksypirazyna | TCI | I0577 | Wzorzec wewnętrzny |
| 40 ml Bursztynowy typ-1 (borokrzemianowy) Fiolka ze szkła | Firma zajmująca się pobieraniem próbek środowiskowych | 0040-0400-QC | Fiolka do pobierania próbek wody |
| 5 ml Końcówka do pipet | VistaLab technologie | 4058-5102 | |
| Balance | VWR | VWR-124B2 | |
| Centri 360 | Markes | U-CENTRI-1691 | Autosampler |
| Chromeleon Wersja 7.3 | Oprogramowanie Thermo Scientific | GC-MS | |
| Pułapka ostrości | Markes | U-T12ME-2S | |
| Chromatograf gazowy, ślad 1310 | Thermo Scientific | 14800403 | |
| Kolumna GC | Thermo Scientific | 26098-1420 | TG-5MS |
| Geosmin i roztwór 2-metyloizoborneolu | SIGMA-ALDRICH lub MilliporeSigma | CRM47525 | |
| Fiolka z przestrzenią nad głową, 20 ml | Markes | C-VCC20 | |
| Uchwyt HiSorb | Markes | C-HH-6 | |
| Nasadka wtryskiwacza HiSorb | Znaki | C-HSPCCS | |
| HiSorb wkładka wtryskiwacza | Sonda HiSorb | U-LINER-HISORB | |
| , PDMS, WERSJA SKRÓCONA | Markes | H1-XXABC | |
| Nasadki na fiolki HiSorb | Markes | C-HSPCCS | |
| Laboratoryjna metalowa szufelka | |||
| do spektrometru masowego, ISQ 7000 | Thermo Scientific | ISQ7K-NOVPI | |
| Metanol | VWR chemicals | BDH1135-4LP | |
| Metanol, Optima LC-MS klasy | Fisher-scientific | A456-4 | |
| O-ringi rozmiar 201 | Markes | U-COV201 | Do nasadki wtryskiwacza HiSorb i przechowywania HiSorb |
| Automatyczny pipetor Ovation (100-5000uL) | Technologie VistaLab | 213626 | |
| Fioletowe bezpudrowe rękawice egzaminacyjne nitrylowo-Xtra | Kimtech | 50602-54 | |
| Chlorek sodu ( sól) | VWR chemicals | BDH9286-2.5K | |
| Adapter przełączający (pipetor automatyczny) | CUI INC | SMI10-5 | |
| Narzędzie do zaciskania fiolek | Markes | U-HSVCR | |
| Decapper do fiolek | Markes | U-HSVDC | |
| Łodzie do ważenia | Grainger | 8AG69 |
Bibliografia
- Zaitlin, B., Watson, S. B. Actinomycetes in relation to taste and odour in drinking water: Myths, tenets and truths. Water Res. 40 (9), 1741-1753 (2006).
- Liato, V., Aïder, M. Geosmin as a source of the earthy-musty smell in fruits, vegetables and water: Origins, impact on foods and water, and review of the removing techniques. Chemosphere. 181, 9-18 (2017).
- Omür-Ozbek, P., Little, J. C., Dietrich, A. M. Ability of humans to smell geosmin, 2-MIB and nonadienal in indoor air when using contaminated drinking water. Water Sci Technol. 55 (5), 249-256 (2007).
- Lindholm-Lehto, P. C., Vielma, J. Controlling of geosmin and 2-methylisoborneol induced off-flavours in recirculating aquaculture system farmed fish-A review. Aquac Res. 50 (1), 9-28 (2018).
- Kutovaya, O. A., Watson, S. B. Development and application of a molecular assay to detect and monitor geosmin-producing cyanobacteria and actinomycetes in the Great Lakes. J Great Lakes Res. 40 (2), 404-414 (2014).
- Piriou, P., Devesa, R., De Lalande, M., Glucina, K. European reassessment of MIB and geosmin perception in drinking water. AQUA. 58 (8), 532-538 (2009).
- Ministry of Health of China. Standards for Drinking Water Quality. GB-5749-2006. , (2006).
- McQuarrie, J. P., Boltz, J. P. Moving bed biofilm reactor technology: process applications, design, and performance. Water Environ Res. 83 (6), 560-575 (2011).
- Burr, G. S., Wolters, W. R., Schrader, K. K., Summerfelt, S. T. Impact of depuration of earthy-musty off-flavors on fillet quality of Atlantic salmon, Salmo salar, cultured in a recirculating aquaculture system. Aquac Eng. 50, 28-36 (2012).
- Piri-Moghadam, H., Ahmadi, F., Pawliszyn, J. A critical review of solid phase microextraction for analysis of water samples. TrAC. 85, 133-143 (2016).
- Bristow, R. L., Young, I. S., Pemberton, A., Williams, J., Maher, S. An extensive review of the extraction techniques and detection methods for the taste and odour compound geosmin (trans-1, 10-dimethyl-trans-9-decalol) in water. TrAC. 110, 233-248 (2019).
- Baltussen, E., Sandra, P., David, F., Cramers, C. Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles. J Microcolumn Separat. 11 (10), 737-747 (1999).
- Chang, J., Biniakewitz, R., Harkey, G. Determination of geosmin and 2-MIB in drinking water by SPME-PTV-GC--MS. , (2008).
- Definition and procedure for the determination of the method detection limit, Revision 2. , Environmental Protection Agency EPA. (2016).
- Ma, X., Gao, N., Chen, B., Li, Q., Zhang, Q., Gu, G. Detection of geosmin and 2-methylisoborneol by liquid-liquid extraction-gas chromatograph mass spectrum (LLE-GCMS) and solid phase extraction-gas chromatograph mass spectrum (SPE-GCMS). Front Environ Sci. 1, 286-291 (2007).
- Li, X., Yu, J., Gu, Q., Su, M., Liu, T., Yang, M., Xhao, Y. Source-water odor during winter in the Yellow River area of China: Occurrence and diagnosis. Environ Pollut. 218, 252-258 (2016).
- Lu, J., Willis, P. S., Wilson, P. C. Trace analysis of off-flavor/odor compounds in water using liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-positive chemical ionization-tandem mass spectrometry. Front Environ Sci. 10, 477-481 (2016).
- Ochiai, N., Sasamoto, K., Takino, M., Yamashita, S., Daishima, S., Heiden, A., Hoffman, A. Determination of trace amounts of off-flavor compounds in drinking water by stir bar sorptive extraction and thermal desorption GC-MS. Analyst. 10, 1652-1657 (2001).
- Nakamura, S., Daishima, S. Simultaneous determination of 22 volatile organic compounds, methyl-tert-butyl ether, 1,4-dioxane, 2-methylisoborneol and geosmin in water by headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 548, 79-85 (2005).
- Sung, Y. H., Lu, T. Y., Huang, S. D. Analysis of earthy and musty odors in water samples by solid-phase microextraction coupled with gas chromatography/ion trap mass spectrometry. Talanta. 65, 518-524 (2005).
- Sibali, L. L., Schoeman, C., Morobi, J. S., Molalatladi, B. S. Comparison of two selective methods for determination of geosmin (1,2,7,7-tetramethyl-2-norborneol) and 2-MIB (2-methylisoborneol) in drinking and raw water samples by capillary gas chromatography-mass spectrometry. WQRJ. 42, 491-497 (2010).
- Yu, S., Xiao, Q., Zhong, X. x, Su, G., Xu, Y., Zhu, B. Simultaneous determination of six earthy-musty smelling compounds in water by headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry. Anal Methods. 6, 9152-9159 (2014).
- Hurlburt, B., Lloyd, S. W., Grimm, C. C. Comparison of analytical techniques for detection of geosmin and 2-methylisoborneol in aqueous samples. J Chromatogr Sci. 47, 670-673 (2009).
- Chen, X., Luo, Q., Yuan, S., Wei, Z., Song, H., Wang, D., Wang, J. Simultaneous determination of ten taste and odor compounds in drinking water by solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry. J Environ Sci. 25, 2313-2323 (2013).
- Espinosa, C., Abril, M., Bretxa, È, Jutglar, M., Ponsá, S., Sellarès, N., Vendrell-Puigmitjà, L., Llenas, L., Ordeix, M., Proia, L. Driving factors of geosmin appearance in a Mediterranean river basin: The Ter river case. Front Microbiol. 12, 741750(2021).
- Lukassen, M. B., Saunders, A. M., Sindilariu, P. D., Nielsen, J. L. Quantification of novel geosmin-producing bacteria in aquaculture systems. Aquaculture. 479, 304-310 (2017).
- Howgate, P. Tainting of farmed fish by geosmin and 2-methyl-iso-borneol: A review of sensory aspects and of uptake/depuration. Aquac. 234 (1-4), 155-181 (2004).
- Hearn, L., Cole, R., Spadafora, N. D., Szafnauer, R. Volatile and semi-volatile compounds in flavoured hard seltzer beverages: Comparison of high-capacity sorptive extraction (HiSorb) methods. Adv Sample Prep. 3, 100032(2022).
- Bu, N., Yang, Q., Chen, J., Li, Y., Liu, D. Characterised and discrimination of volatile compounds in chilled Tan mutton meat during storage using HiSorb-TD-GC-MS and E-nose. Molecules. 28, 4993(2023).
- Fella, P., Stylianou, M., Agapiou, A. A green sorptive extraction method (HiSorb-TD-GC-MS) for determining the extra virgin olive oil (EVOO) aroma profile. Pure Appl Chem. 95, 595-610 (2023).
- Fenn, D., Lilien, T. A., Hagens, L. A., Smit, M. R., Heijnn, N. F. L., Tuip-de Boer, A. M. Validation of volatile metabolites of pulmonary oxidative injury: a bench to bedside study. ERJ Open Res. 9, (2023).
- Schincaglia, A., Purcaro, G., Beccario, M. Unlocking the aroma compounds of pistachios using the power of multi-dimensional gas chromatography. Poster presented at Advances in Separation Science. , (2023).
Przedruki i uprawnienia
