Artykuł metodologiczny

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Streszczenie

Solidne mysie modele przewlekłego zakażenia Mycobacterium abscessus, patogenem środowiskowym, który najchętniej infekuje płuca, są bardzo potrzebne. Trwające rok terapie wielolekowe zapewniają niedopuszczalnie niski wskaźnik wyleczenia u pacjentów, wynoszący około 50%, stąd potrzeba predykcyjnych narzędzi przedklinicznych w celu opracowania lepszych antybiotyków. Jednak myszy immunokompetentne są ogólnie odporne na infekcję płuc przez M. abscessus. W literaturze opisano liczne próby ustalenia trwałego zakażenia M. abscessus u myszy immunokompetentnych. Spośród nich najbardziej obiecujące okazały się metody oparte na bakteriach osadzonych w kulkach agaru zaszczepionych u myszy C57BL/6 drogą dotchawiczą. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest wyzwanie techniczne związane z przygotowaniem kulek agarowych o powtarzalnej wielkości i liczbie bakterii, a następnie inokulacją dotchawiczą. W tym miejscu najpierw przedstawiamy szczegółowy opis zoptymalizowanego protokołu, który dostarcza koraliki agarowe obciążone M. abscessus o optymalnej średnicy i powtarzalnym obciążeniu bakteryjnym. Następnie przedstawiamy szczegółowy protokół inokulacji dotchawiczej, zoptymalizowany w celu uniknięcia strat kulek i bakterii spowodowanych przyleganiem do powierzchni urządzeń do zaszczepiania oraz uzyskania powtarzalnego osadzania się w płucach M. abscessus zatopionego w agarze . Celem jest zapewnienie łatwości wdrożenia i doskonałej powtarzalności między laboratoriami.

Wprowadzenie

Opcje leczenia choroby płuc Mycobacterium abscessus (Mab) są ograniczone i obejmują całoroczne wielolekowe schematy z doustnymi, pozajelitowymi i czasami wziewnymi antybiotykami, z których większość nie ma optymalnej aktywności bakteriobójczej i wiąże się ze znaczną toksycznością1,2,3,4,5. Pilnie potrzebne są krótsze, bezpieczniejsze i skuteczniejsze terapie. Mysie modele zakażeń prątkami odegrały zasadniczą rolę w odkrywaniu i optymalizacji skutecznych leków i schematów leczenia6,7. Jednak przedkliniczna ocena antybiotyków przeciwko zakażeniom Mab okazała się trudna ze względu na trudności w ustaleniu postępujących i utrzymujących się infekcji płuc u myszy8,9.

Zakażenie immunokompetentnych szczepów myszy Mab w dużej mierze prowadzi do przejściowej kolonizacji, po której następuje szybkie usunięcie patogenu10,11. Aby osiągnąć przewlekłe zakażenie, jak obserwowano klinicznie, środki unieruchamiające, takie jak agaroza lub agar, były stosowane w celu promowania trwałości i odpowiedzi immunopatologicznej na oportunistyczne patogeny, takie jak Pseudomonas aeruginosa lub Haemophilus influenza u myszy immunokompetentnych12,13,14. Model ten został niedawno zaadaptowany do osiągnięcia przewlekłej infekcji dróg oddechowych przez Mab ATCC 19977 u immunokompetentnych myszy C57BL/6N 15,16,17,18. Metoda indukowała uporczywą infekcję przez okres do 45 dni po inokulacji dotchawiczej ~1 × 104 do 1 × 106 jednostek tworzących kolonie (CFU), z częstością przewlekłej infekcji wśród zakażonych myszy wynoszącą 90%-100%19 i tworzeniem się zorganizowanych ziarniniaków wokół rozpadającego się koralika agarowego18. Wygląda na to, że osadzenie Mab w kulkach chroni przed szybkim usunięciem przez wrodzony układ odpornościowy i że kulki wypełnione bakteriami stanowią ogniska rekrutacji komórek odpornościowych, co prowadzi do powstawania ziarniniaków i powstawania przewlekłej infekcji18. Koraliki agaru/agarozy stanowią stosunkowo obojętny biomateriał, który wywołuje minimalne reakcje zapalne. Ponadto kulki rozpadają się powoli, unikając problemów z reakcjami alergicznymi na ciała obce lub wywołanym zwłóknieniem. Zakażenie dotchawicze z urządzeniem do mikrorozpylania lub bez niego zapewnia skuteczne osadzanie inokulum w płucach8,20,21 i odtwarza kliniczne narażenie i infekcję lepiej niż inokulacja dożylna lub donosowa.

Model oferuje zatem wiele zalet. Wiąże się to jednak również z kilkoma wyzwaniami natury technicznej, a mianowicie: (i) osiągnięciem powtarzalnego rozmiaru kulki, (ii) uzyskaniem powtarzalnego obciążenia bakteryjnego koralików oraz (iii) zapewnieniem stałego dostarczania inokulum do tchawicy. W tym miejscu zapewniamy szczegółowe protokoły, aby niezawodnie osiągnąć te cele i zapewnić odtwarzalność między laboratoriami.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee of the NIAID (NIH), Bethesda, MD. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Wszystkie badania z udziałem M. abscessus przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Przygotowanie inokulu M. abscessus z kulką agarową

  1. Przygotować wstępną hodowlę M. abscessus ATCC 19977, zaszczepiając 1,5 ml gęstości optycznej (OD600) 1 (przy użyciu spektrofotometru) kultury w 200 ml pożywki Middlebrook 7H9 uzupełnionej 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) glicerolem i 10% (v/v) wzbogacaniem w albuminę-dekstrozę-katalazę Middlebrooka (ADC).
  2. Inkubować kultury w butelce rolkowej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,6).
  3. Zawiesić 1,2 g bulionu sojowego tryptycznego (TSB) w 40 ml ultraczystej wody i dodać 0,6 g agaru Difco do końcowego stężenia 1,5%.
  4. Przenieść 60 ml ciężkiego oleju mineralnego do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i sterylizować zarówno olej mineralny, jak i agar sojowy tryptyczny (TSA) w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a następnie równoważyć w temperaturze 50 °C w piecu.
  5. Pobrać próbkę z 1 ml kultury i zmierzyć OD600.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3700 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby osiągnąć OD600 około 30.
  7. Zmieszać 3 ml zawiesiny bakteryjnej z 27 ml stopionego TSA wstępnie zrównoważonego w temperaturze 50 °C w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Szybko wymieszać, wirując lub pipetując.
  8. Ostrożnie wlać mieszaninę bakterii i agaru (30 ml) do 60 ml oleju mineralnego i umieścić kolbę w pojemniku wtórnym. Szybko ustawić mieszaninę tak, aby wirowała ze średnią prędkością (420 obr./min) na mieszadle magnetycznym ustawionym na 50 °C, za pomocą mieszadła magnetycznego. Upewnij się, że w mieszance olejowo-agarowej tworzy się widoczny wir. Mieszaj przez 6 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Schłodzić mieszaninę, umieszczając lód w dodatkowym pojemniku i kontynuować mieszanie przez 35 minut.
  10. Przerwij mieszanie i pozwól zawiesinie z kulek agaru odpocząć przez 20 minut (w razie potrzeby uzupełnij lód).
  11. Przenieść mieszaninę zawiesiny do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przemyć 10 razy jedną objętością DPBS w celu usunięcia oleju i wolnych bakterii (3700 g, 6 min, 4 °C, przez pierwsze 5 cykli).
    1. Połącz zawiesiny kulek agarowych w jedną probówkę przy trzecim praniu. Podczas pierwszych 5 cykli prania użyj pipety serologicznej, aby delikatnie zawiesić kulki.
    2. Dla kolejnych 5 cykli płukania należy stosować następujące parametry wirowania: 2000 g przez 5 minut, a następnie 1000 g odpowiednio przez 4, 3, 2 i 2 minuty.
  12. Zawiesić kulki agarowe w DPBS do końcowej objętości 40 ml, przenieść do sterylnej butelki o pojemności 125 ml i rozcieńczyć 4x, dodając 120 ml DPBS.
  13. Przepuścić zawiesinę przez sitko o wielkości 200 μm.
    1. Podłącz sitko do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie dodaj próbkę materiału na sitko i przefiltruj zawiesinę kulek.
    2. Aby ułatwić proces filtracji, połącz sitko do komórek, lejek, pierścień łączący i probówkę o pojemności 50 ml w jednostkę. Zmontuj części w kolejności lejka, sitka do komórek, pierścienia łączącego i probówki 50 ml i powoli pociągnij tłok strzykawki 30 ml przymocowanej do pierścienia łączącego.
  14. W razie potrzeby przepłucz sitko z przeciwnej strony DPBS, aby zmyć wszelkie zatrzymane większe kulki. Rozcieńczoną zawiesinę zagęścić wirując z prędkością 1000 g przez 2 minuty lub pozwalając kulkom osiąść grawitacyjnie. Po zbiorach przechowuj kulki agarowe w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. Do każdej partii eksperymentów zaleca się świeże przygotowanie.
  15. Odpipetować 5 μl zawiesiny kulki na szkiełko podstawowe, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i wykonać zdjęcia w kilku losowych miejscach za pomocą mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego z soczewką obiektywową 10×. Zapisz obrazy i zmierz średnicę ściegu za pomocą ImageJ (żądany zakres rozmiarów: 200 ± 50 μm).

2. Miareczkowanie inokulu M. abscessus zatopionego w koraliku agarowym

  1. Dodać 1 ml zawiesiny kulek do probówki M i przeprowadzić aseptyczną homogenizację w celu uwolnienia bakterii osadzonych w kulkach za pomocą dysocjatora ustawionego na wstępnie zdefiniowany program RNA.02.01.
  2. Pobrać 100 μl homogenatu i rozcieńczyć seryjnie w stosunku 1:10 do 1 × rozcieńczeniu 10-5. Rozcieńczyć na agarze 7H10 uzupełnionym 10% kwasem oleinowym, albuminą, dekstrozą-katalazą (OADC) i 2% glicerolem. Wyliczyć jtk macierzysty po 3 do 5 dniach inkubacji.
  3. Dostosuj miano inokulum w razie potrzeby. Na przykład, jeśli każda mysz otrzyma 100 μl zawiesiny kulek zawierającej 1 × 105 CFU na 10 myszy, przygotowuje się łącznie 2 ml zawiesiny zawierającej 1 × 106 CFU/ml plus ~25%, aby uwzględnić straty w strzykawkach.

3. Testowanie dozowania koralików przez strzykawkę i igłę

UWAGA: Następujące kroki zostały uwzględnione, aby upewnić się, że koraliki nie przylegają do powierzchni strzykawki lub igły. Stwierdzono, że ważne jest, aby używać szklanej strzykawki i metalowej igły do karmienia 24 G, aby zapobiec utracie kulek z powodu przylegania do powierzchni plastikowych.

  1. Przygotować PBST, dodając 1,25 ml sterylnego Tween 80 do 500 ml sterylnego PBS.
  2. Dodać 900 μl PBST do pięciu probówek M w celu zbadania kulek agarowych przechodzących przez igłę do karmienia, a także 900 μl PBST do sterylnych probówek o pojemności 2 ml, aby przygotować od -2 do -6 rozcieńczeń każdej próbki przepychanej.
  3. Wymieszaj przygotowany wcześniej koralik agarowy M. abscessus za pomocą pipety P1000, aby upewnić się, że wszystkie kulki są równomiernie rozproszone.
  4. Przymocuj metalową igłę do karmienia 24 G do szklanej strzykawki i odessaj zawiesinę z kulek agaru, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  5. Gdy strzykawka jest pełna i nie ma pęcherzyków powietrza, umieścić nylonowe klipsy lub korki na tłoku strzykawki, nie zachowując odstępu między klipsami. Zatyczki pozwalają na dokładne dozowanie 50-100 μL. Możliwe jest zamontowanie do 6 klipsów wzdłuż tłoka.
  6. Dozować 100 μl kulek ("push-through") do probówek M w odpowiedniej kolejności.
  7. Po zebraniu 5 przepchnięć homogenizować kulki za pomocą dysocjatora tkankowego dostosowanego do ustawienia RNA.02.01, odpowiedniego do przygotowania RNA z zamrożonych narządów, który okazał się skutecznie uwalniać M. abscessus z kulek bez wpływu na żywotność komórek.
  8. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie homogenatów w zakresie od -1 do -6. Rozcieńczenia rozcieńczyć na płytkach agarowych 7H11 uzupełnionych OADC. Policz CFU po 5 dniach.

4. Inokulacja dotchawicza myszy

  1. Przygotuj myszy CD-1 w wieku od 6 do 8 tygodni.
  2. Uspokoić myszy za pomocą systemu ekspozycji na aerozol izofluranowy, przy natężeniu przepływu 1-5%, jak opisano wcześniej1.
    UWAGA: Dodaj maść okulistyczną do zwierzęcia po znieczuleniu. Zwierzę nie jest leczone izofluranem w masce na twarz; Dlatego nie ma dużo czasu na wykonanie tej procedury.
  3. Ogranicz myszy za pomocą trójwymiarowej (3D) drukowanej pochylonej podstawki (specjalnie zaprojektowanej i wyprodukowanej). Pręt na środku stojaka ma sznurek do szycia, który utrzymuje mysz pionowo za siekacze, umieszczając mysz w brzusznej pozycji leżącej z uniesioną głową.
  4. Przymocuj metalową igłę do karmienia zwierząt 24 G do szklanej strzykawki wypełnionej kulką agarową zatopioną w M. abscessus. Umieść nylonowe klipsy lub korki na tłoku strzykawki, aby zarazić każdą mysz 50 μl inokulum.
  5. Gdy uspokojona mysz zostanie unieruchomiona na żądle szwu, przesuń język na bok jamy ustnej za pomocą aplikatora do bawełnianego wacika.
  6. Wizualizuj tylną część ust myszy, aby wyraźnie zidentyfikować białą część z tyłu jamy ustnej i celować w tchawicę myszy.
  7. Ustaw metalową igłębkę pod kątem pionowo nad myszą i włóż ją w górną część tchawicy. Podczas przechodzenia przez nagłośnię może wystąpić niewielki opór.
    UWAGA: Potwierdzenie umieszczenia zgłębnika w tchawicy można potwierdzić poprzez wyczucie grzbietów tchawicy podczas wkładania zgłębnika.
  8. Wsuń igłębkę w dół do tchawicy, wyjmij nylonowy klips lub korek i dozuj 50 μl kulki agarowej zatopionej w M. abscessus.
  9. Pozwól myszy odpocząć przez 5 minut i powtórz kroki 4.2-4.8 po raz drugi. Celem dwuetapowej procedury inokulacji jest zapewnienie powtarzalnego i głębokiego osadzania pełnego inokulum w płucach.
    UWAGA: Dodaj wsparcie cieplne pod klatką, gdy zwierzęta dochodzą do siebie po znieczuleniu.
  10. Pozwól infekcji postępować przez 24 godziny, po czym mysz jest uśpiona w celu wyliczenia odkładania się bakterii w płucach.

Wyniki

Rozmiar koralików i obciążenie
Aby uwidocznić kulki agaru i ich obciążenie bakteryjne, białko czerwonej fluorescencji mCherry uległo ekspresji pod konstytutywnym promotorem Hsp60 w szczepie typu Mab ATCC 19977 i osadziło ten szczep w kulkach agarowych, jak opisano powyżej. Rysunek 1A pokazuje zakres rozmiarów koralików (podziałka = 200 μm). Rysunek 1B pokazuje obciążenie 6 niezależnych preparatów koralików, demonstrując powtarzalność opisanej procedury.

Wykonanie przepchnięcia strzykawki i implantacji bakteryjnej po inokulacji dotchawiczej
Inokulacja dotchawicza została zoptymalizowana w dwóch etapach. CFU/ml policzono w inokulum przed i po przejściu przez szklaną strzykawkę, aby upewnić się, że nie powstały żadne straty kulek lub bakterii, gdy kulki przechodziły przez strzykawkę i podłączoną rurkę. Tabela 1 przedstawia początkowe miano bakterii w dwóch niezależnych preparatach kulek (próby 1 i 2) oraz liczbę CFU odzyskanych na 100 ml próbek "przepchniętych" z jednego wsadu strzykawki. Aby uniknąć strat perełek i bakterii, wymagana jest szklana strzykawka podłączona do metalowej rurki. Koraliki agarowe mają tendencję do przylegania do plastikowych powierzchni.

Liczenie CFU w czasie w przygotowaniu koralików wykazało, że obciążenie bakteryjne koralików pozostawało stabilne na poziomie 4 °C przez 1 tydzień, z ~2-krotnym spadkiem obciążenia bakteryjnego na 2 tygodnie i niezaburzonym odkładaniem się w płucach. Następnie grupy od 5 do 8 myszy zostały zakażone trzema niezależnymi preparatami kulkowymi w celu przetestowania powtarzalności procedury inokulacji dotchawiczej. Tabela 2 przedstawia liczbę CFU płuc na mysz, wyliczoną 24 godziny po zakażeniu, zgodnie z opisem.

Na koniec, międzyoperatorska odtwarzalność infekcji została oceniona poprzez zakażenie trzech grup po 10 myszy CD-1, z których każda była wykonywana przez innego operatora. CFU płuc wyliczone 24 godziny po zakażeniu są pokazane na Rysunek 2.

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperyment pilotażowy mający na celu ocenę wielkości koralików, wizualizację i ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego M. abscessus. (A) Koraliki agarowe zawierające szczep M. abscessus ATCC 19977, zaprojektowane do ekspresji białka fluorescencyjnego mCherry red pod konstytutywnym promotorem hsp60. Pięć μl zawiesiny kulek rozprowadzono na szklanym szkiełku podstawowym i zobrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę (obiektyw 10x). Każda czerwona kropka to fluorescencyjna komórka bakteryjna, zamknięta w kulkach agarowych o średnicach od ~70 do 250 μm. (B) Obciążenie bakteryjne, w jtk/ml, 6 pojedynczymi preparatami kulek wskazujące na odtwarzalność metody. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Międzyoperatorska odtwarzalność infekcji. Grupy 10 samic myszy CD-1 zostały zakażone dotchawiczo przez trzech niezależnych operatorów, jak opisano, przy użyciu tego samego preparatu kulkowego. Pokazano CFU płuc wyliczone 24 godziny po zakażeniu. O1, O2, O3: operatory 1, 2 i 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

jtk/100 μL
Przygotowanie koralikówPróba 1Próba 2
1.13E+052.40E+05
Próbka przepychana przez strzykawkę
11.14E+055.10E+05
cyfra arabska1.36E+054.10E+05
39.30E+043.90E+05
49.80E+043.60E+05
51.14E+05
średnia1.11E+054.18E+05
Sd1.69E+04 (15%)6.50E+04 (16%)

Tabela 1: Jednostki tworzące kolonie (CFU) na 100 μL-sample po przejściu przez szklaną strzykawkę i metalową igłę do karmienia.

Próba 1Próba 2Próba 3
Identyfikator myszyPłuca CFU/myszIdentyfikator myszyPłuca CFU/myszIdentyfikator myszyPłuca CFU/mysz
M-16.50E+03M-62.20E+05Samolot M-116.80E+04
M-21.10E+04M-72.70E+05Samolot M-121.70E+05
M-31.40E+04Zobacz materiał M-88.10E+04M-132.10E+05
Zobacz materiał M-43.20E+03M-91.40E+05M-144.40E+04
Zobacz materiał M-54.50E+03Zobacz materiał M-101.30E+05Zobacz materiał M-157.50E+04
M-161.01E+05
M-177.00E+04
M-185.80E+03
średnia7.84E+03średnia1.68E+05średnia9.30E+04
Sd4.54E+03 (58%)Sd7.57E+04 (45%)Sd6.67E+04 (72%)

Tabela 2: Implantacja kulki agarowej osadzonej w płucach myszy M. abscessus 24 godziny po inokulacji

Dyskusja

Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie bakterii w kulkach agarowych, ważne jest, aby równomiernie zawiesić stopioną mieszaninę agaru i bakterii przed dodaniem jej do fazy olejowej. Stosunek objętości oleju do bakterii agarowych ma kluczowe znaczenie w kontrolowaniu wielkości kulek. Wyższy stosunek oleju do agaru prowadzi do tworzenia mniejszych kulek agaru. Podczas mieszania zawiesiny agarowo-bakteryjnej z fazą olejową kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie. Mieszanina oleju i agaru musi być wystarczająco ciepła, aby umożliwić emulgację i tworzenie kropel, ale wystarczająco chłodna, aby nie zaszkodzić bakteriom. Ciągłe mieszanie podczas schładzania mieszaniny do temperatury pokojowej lub niższej umożliwia tworzenie się i zestalanie kropelek agaru.

Właściwa kalibracja płytki mieszającej, rozmiar mieszadła oraz kształt i rozmiar kolby są ważnymi wyznacznikami jednolitego wiru. Mieszadło umieszczone w środku kolby tworzy symetryczny wir, zapewniając równomierne mieszanie. Mieszadło poza środkiem może prowadzić do niestabilnego wiru, co skutkuje koralikami o nieregularnych kształtach i wprowadzaniem pęcherzyków powietrza do kulek. Zalecane jest monitorowanie w czasie rzeczywistym i regulacja położenia mieszadła. Objętość kolby musi być proporcjonalna do objętości mieszaniny oleju i agaru. Kolba o pojemności 500 ml jest idealna do wirowania mieszaniny oleju i agaru o pojemności 90 ml, wytwarzając widoczny wir. W przypadku stosowania większych kolb ważne jest, aby dostosować objętość mieszaniny olejowo-agarowej, wielkość mieszadła i prędkość wirowania, aby osiągnąć równowagę między skutecznym mieszaniem a stabilnym wirem. Utrzymanie stałej prędkości wirowania podczas procesu i podczas przygotowywania kulek ma kluczowe znaczenie dla powtarzalności między partiami.

Proces przygotowania kulek agarowych, w szczególności prędkość wirowania i stosunek oleju do agaru, są dostosowane do16,22, z niewielkimi modyfikacjami. Siły ścinające w wirującym wirze z natury wytwarzają koraliki o różnych rozmiarach. Aby zminimalizować tę zmienność wielkości, etap zbierania kulek został zmodyfikowany poprzez wprowadzenie kilku etapów mycia, wykorzystując gradient zmniejszającej się prędkości i czasu wirowania, aby zapewnić usunięcie kulek o małych rozmiarach (i wolnych bakterii). Zastosowano filtr z mikrosiatką, aby wzbogacić kulki o pożądanym rozmiarze, skutecznie odfiltrowując większe kulki i te, które mogły powstać w wyniku przypadkowej koalescencji. Aby uniknąć strat kulek lub bakterii, gdy zawiesina kulek przechodzi przez strzykawkę i podłączoną rurkę do inokulacji dotchawiczej myszy, ważne jest, aby użyć szklanej strzykawki, metalowych igieł do karmienia 24 G i rurki połączonej z metalem.

Głównym ograniczeniem metody jest złożoność techniczna przygotowania kulek i inokulacji dotchawiczej w celu uzyskania powtarzalnego obciążenia kulkami i implantacji płuc. Wymagana jest dbałość o szczegóły i umiejętność rozwiązywania problemów. Ponadto model nie został w pełni zwalidowany poprzez testowanie skuteczności standardowych antybiotyków i najczęstszych kombinacji antybiotyków podawanych pacjentom z MAB.

Obecnie żaden mysi model przewlekłego zakażenia Mab nie został zwalidowany w takim stopniu, aby skuteczność pojedynczych leków i kombinacji leków u pacjentów można racjonalnie przewidzieć za pomocą modelu9. Mysi system C57BL/6 z zatopionymi kulkami agarowymi został wykorzystany do przetestowania skuteczności leczenia przeciwbakteryjnego 15,19,23. Najbliższą alternatywą dla systemu mysiego C57BL/6 osadzonego w kulkach agarowych jest mysi model C3HeB/FeJ, który opiera się na immunosupresji deksametazonu w celu uzyskania trwałej przewlekłej infekcji24,25. Zaletą opisanego tutaj protokołu jest to, że (i) można użyć w pełni immunokompetentnych i najbardziej przystępnych cenowo myszy C57BL/6, (ii) można uzyskać produktywną i przewlekłą infekcję za pomocą dobrze scharakteryzowanego szczepu typu ATCC 19977 oraz (iii) nie ma chemicznie indukowanej potrzeby immunosupresji, co pozwala obejść potrzebę codziennych zastrzyków deksametazonu, unikając w ten sposób potencjalnych interakcji lek-lek i wpływu na immunopatologię płuc.

Biorąc pod uwagę brak zwalidowanych mysich modeli przewlekłego zakażenia Mab do oceny nowych kandydatów na leki i schematów leczenia 8,9, opisana tutaj technika ma potencjał, aby posunąć tę dziedzinę do przodu, poprawić wartość predykcyjną przedklinicznych danych dotyczących skuteczności, pomóc w ustaleniu priorytetów schematów leczenia o największym potencjale w celu zapewnienia trwałego wyleczenia i ogólnie przyspieszyć odkrywanie i opracowywanie leków na chorobę płuc Mab. Metoda może być stosowana do innych patogenów płuc i ma ugruntowaną historię w przypadku P. aeruginosa lub Haemophilus influenza. Głównym celem opisanego tutaj protokołu jest dostarczenie wystarczających szczegółów i zaleceń, aby zapewnić łatwość wdrożenia i doskonałą odtwarzalność między laboratoriami.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Mukowiscydozy, nagroda DICK24XX0, dla TD i VD, oraz R01-AI132374 od NIH-NIAID dla TD i VD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka 125 mlCorning8388Sterylny
stojak na probówki 3 x 3Fisher5972-0030PKDezynfekowany przed użyciem
Wydrukowany w 3D stojak na myszTransworld Marketing specjalnie zaprojektowana i wyprodukowanaDezynfekowana przed użyciem
48-dołkowa płytka rozcieńczającaCelltreat 229192Sterylne
probówki wirówkowe 50 mlGreiner Bio-One227261Sterylna
maszyna do znieczulaniaE-Z SystemsEZ-AF9000 SYSTEMnie dotyczy
Avanti J-15R Beckman Coulter  B99517z barierą wirówkową
w stojaku z podnoszoną pokrywą 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ASterylna
torba BiohazardFisherbrand22-044561
Pierścień łączący pluriSelect41-50000-03
Aplikatory z bawełnianą końcówkąPuritan 22-029-571Sterylne
jednorazowe pętle do zaszczepiania Żółte sterylne 100 w torbiestrunowej Cole-Parmer Essentials 03-391-562Sterylna
jednorazowa serweta na ręczniki z podszewką poliestrowąDynarex19-310-671Sterylna
sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoThomas Scientific21-031-CMSterylny
lejekpluriSelect42-50000Sterylny
spektrofotometrGE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630
Gentlemacs Dysocjator tkanekMiltenyi Biotec130-096-427Nie aktywowana termicznie
strzykawka Hamiltona Hamilton 80801Zdezynfekowany przed użyciem
Ciężki olej mineralnySigma-Aldrich330760-1LSterylny
roztwór izofluranu Butelka 250 mlCovetrus29405Działanie/drażniące na skórę: Kategoria 2, Poważne uszkodzenie oczu/Działanie drażniące na oczy: Kategoria 2A, Specyficzny toksyczny wpływ na narządy docelowe (jednorazowe narażenie): Kategoria 3
Może powodować senność i zawroty głowy, Działa drażniąco na oczy, Działa drażniąco na skórę. Nie wdychać, stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
M Tubes (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Sterylne
mieszadło magnetyczne MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
Mieszadło magnetyczneThomas Scientific  1181L08Sterylna
pipeta mechaniczna 100– 1000 &mikro; L Gilson PIPETMAN L FA10006MZdezynfekowany przed użyciem
Pipeta mechaniczna 20– 200 i mikro; L Gilson PIPETMAN L FA10003MGZdezynfekowane przed użyciem
Metalowa igła do karmienia zwierząt 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SMusi być sterylizowana (autoklawowana)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GSterylizowana (autoklawowana)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Sterylizowana (autoklawowana)
Middlebrook 7H9 średniaBeckton Dickinson271310Sterylizowane (autoklawowane)
części stojaka na myszTriMech Solutions SRV-AMS-FDMZdezynfekowany przed użyciem
Niewchłanialny szew jedwabnyFisher Scientific18020-50n/a
Płyn OADC Wzbogacony płynem do stosowania z Middlebrook Media 500 mlThermo Scientific Remel R450605Sterylny
PBS (10x), pH 7,4 Sterylny filtrowany 500 mlGibco70-011-044Sterylne
chusteczkiPeroxiguard Peroxigard29221n/a
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką okrągłe 100mmx 15mmFisherbrand FB0875712Sterylne
sitko PluriStrainer 200 mmpluriSelect43-50200-03Sterylne; sitko do komórek
Butelki rolkoweCorning430165Sterylna
pipeta serologicznaCorning4489Sterylne
kuwety spektrofotometru 1,5 mlFisher Scientific14955127Sterylizowane (autoklawowane)
Korki do strzykawek lub klipsy (nylonowe)Trimech SRV-AMS-MJFZdezynfekowany przed użyciem
Tryptyczny bulion sojowySigma-AldrichT8907-500GSterylny
Tween 80 Fisher170793Filtr sterylizowany 
Końcówki do pipet z filtrem o szerokim otworze Stojak z podnoszoną pokrywą 200G Thermo Scientific ART21-236-1ASterylne
Końcówki do pipet

Bibliografia

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie kulek agarowychinokulacja wewn trzkrtaniowaprzewlek a infekcja p ucmodel infekcji p ucnejtestowanie skuteczno ci antybiotyk wenumeracja bakteriiprotok infekcji myszyprzedkliniczne testowanie lek w

Powiązane artykuły