W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecne metody stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) u gryzoni obejmują perifuzję ex vivo lub statyczną inkubację wysp trzustkowych i wycinków trzustki. Perfuzja ex vivo i inkubacja statyczna pozwalają na szybkie i efektywne pobranie wielu próbek. Jednak procedury te narażają wyspy trzustkowe na urazy, przerywane niedotlenienie i zmniejszoną sygnalizację insuliny parakrynnej, z których wszystkie mogą wpływać na GSIS. Te negatywne skutki można zminimalizować poprzez perfuzję przez układ krwionośny myszy z nienaruszoną trzustką, co stanowi kolejną metodę porównawczą dla różnych modeli GSIS. Szkielet tej procedury perfuzji obejmował i) podwiązanie naczyń w celu wyizolowania trzustki oraz ii) kaniulację naczyń trzustkowych. Model ten obejmował siedem punktów podwiązania i dwie kaniulacje. Powstałe perfundowane unaczynienie obejmowało dolną część aorty brzusznej, trzewną i tętnicę krezkową górną, rozgałęziające się dopływy i żyłę wrotną.
Perfuzat został wprowadzony do układu krwionośnego w ilości ~ 2 ml / min za pomocą pompy perystaltycznej do rurki PE-50, która kaniuluje dolną aortę brzuszną. Perfuzaty przechodziły przez izolowane naczynia krwionośne i były pobierane przez żyłę wrotną za pomocą kaniulacji z rurką PE-30. Perfuzat zbierano w odstępach 3-minutowych w rundach po 30 minut dla każdego roztworu perfuzatu 2,6 mM glukozy, 16,8 mM glukozy i 2,6 mM glukozy z 3-izobutylo-1-metyloksantyną (IBMX) w buforze wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KRB, 16 mM HEPES i 0,1% BSA, pH 7,4). Roztwór IBMX poprzedzono normalnym roztworem glukozy o stężeniu 2,6 mM w cyklu płukania. Całkowity czas zabiegu chirurgicznego wynosił ~1 h i 2 godziny pobrania perfuzatu. Perfuzaty zamrażano do czasu wykonania testu ELISA w celu zmierzenia wydzielania insuliny.
Ta lista metod ma na celu zapewnienie szczegółowych podstaw proceduralnych do pomiaru wydzielania insuliny poprzez perfuzję trzustki przez naczynia krwionośne, co pozwoli naukowcom na pomyślne przeprowadzenie perfuzji nienaruszonej trzustki w ich laboratoriach.
Wprowadzenie
Kwantyfikacja i zrozumienie funkcji komórek beta zostało osiągnięte przede wszystkim poprzez peryfuzję ex vivo, inkubację statyczną, a ostatnio poprzez plastry trzustki. Podczas gdy procedury te pozwalają na ocenę izolowanych wysepek, dwie pierwsze mogą narażać wyspy na stresory, które wpływają na ich zdolność do funkcjonowania. W badaniu przeprowadzonym przez Rosenberga i wsp. wysepki psie izolowane standardowymi metodami wykazywały zwiększoną apoptozę komórek beta, o czym świadczyła utrata błony podstawnej, pojawienie się jąder piknotycznych i ciał apoptotycznych1. Badanie to zbiega się z innym raportem na temat izolacji ludzkich wysp trzustkowych, w których zmiany morfologiczne obrazujące apoptozę wykazano wkrótce po izolacji wysp trzustkowych 2,3. Zwiększona apoptoza komórek beta doprowadziła do zmniejszonego uwalniania insuliny z tych wysp, co potwierdza koncepcję, że izolacja wysp trzustkowych predysponuje je do uszkodzenia i upośledzenia funkcjonalnego.
Oprócz apoptozy, układ krwionośny zostaje utracony w wyniku izolacji wysp trzustkowych, co prowadzi do upośledzenia transportu składników odżywczych, metabolitów i hormonów 4,5. To ograniczenie doprowadziło do alternatywnych rozwiązań, takich jak przeszczep komórek wysp trzustkowych do oka w celu utrzymania pewnej formy unaczynienia i unerwienia6. Zmiana w architekturze naczyń krwionośnych podczas izolacji wysp trzustkowych tworzy również bardziej zwartą wyspę, odmienną od oczekiwanej in vivo 7,8.
Aby dodać do różnic anatomicznych, zachowanie statycznie inkubowanych wysp trzustkowych różni się od izolowanej perfundowanej trzustki. W przypadku statycznie inkubowanych wysp trzustkowych o niskim poziomie glukozy, 77% całkowitej uwolnionej insuliny (3,31 ng z 4,34 ng ogółem) okazało się być obecne w ciągu pierwszych 30 minut i niewiele w następnym okresie. Jest to wyraźny kontrast w porównaniu z izolowaną perfuzją trzustki przy niskich stężeniach glukozy, gdzie uwalnianie insuliny było praktycznie zerowe we wszystkich punktach czasowych (łącznie <1,8 ng)9. Chociaż należy przeprowadzić dalsze badania, aby w pełni wyjaśnić tę różnicę przy niskich stężeniach glukozy, ta różnica w danych może oznaczać wyciek z niedotlenionych komórek umierających, które zostały następnie zbadane poprzez statyczną inkubację monowarstw komórek wysp trzustkowych. Niemniej jednak te różnice między obecnymi metodami a środowiskami in vivo mogą powodować pogorszenie trafności zewnętrznej (Tabela 1).
Oprócz powodowania niedotlenienia, zarówno peryfuzja ex vivo, jak i inkubacja statyczna obejmują hodowlę i oddzielanie wysp trzustkowych od naczyń do kultur tkankowych, aby utrzymać je w stanie zawieszenia. Podczas tego procesu kolagenaza jest zwykle perfundowana przez przewód trzustkowy, aby umożliwić dysocjację tkanki trzustkowej. Kolagenaza wiąże się z włókienkami kolagenowymi i rozplątuje je za pomocą neutralnych proteaz, żelatynaz i endogennych proteaz trzustkowych. Razem proteazy te kontynuują trawienie, dopóki wyspy nie zostaną uwolnione z macierzy zewnątrzkomórkowej i przyczepów komórek wodopończych. Równoważenie tej mieszaniny proteaz daje różne wyniki zarówno pod względem czystości, jak i funkcjonalności izolowanych wysepek10. Skuteczność kolagenazy zależy również od cech zwierząt, takich jak szczep, wiek, waga i stan cukrzycy. Stosowanie tych proteaz w połączeniu z cechami specyficznymi dla zwierząt może uszkodzić wyspy trzustkowe podczas procesu izolacji. Podczas podawania kolagenazy proteazy te aktywują również endogenne enzymy proteolityczne trzustki, które wspomagają trawienie błony podstawnej. Jednak kontrolowanie endogennej aktywacji enzymów trzustkowych nie jest jeszcze możliwe; W związku z tym może to odgrywać rolę w uszkadzaniu wysepek podczas procesu uprawy 11,12,13. Jeden raport z Edmonton wykazał endogenną aktywność proteazy wpływającą na wydajność izolacji wysp trzustkowych po osiągnięciu wystarczającego poziomu aktywności enzymatycznej do izolacji14,15.
Wykazano, że obecne techniki infuzji kolagenazy (wewnątrzprzewodowe) przenikają również do wnętrza wyspy, co prowadzi do możliwego fragmentacji wysp, a tym samym do niskiej wydajności wysepek16. W badaniu przeprowadzonym przez Balamurugan i wsp. zaobserwowano, że kolagenaza lokalizuje się w wyspach trzustkowych i tkankach groniastych w trzustce myszy, prowadząc do intensywnego stanu zapalnego i aktywacji szlaków apoptotycznych17. Wyspy trzustkowe, które przetrwały fazę izolacji, wykazywały również zmniejszoną zdolność do uwalniania insuliny.
Ponadto inne czynniki, takie jak naprężenia mechaniczne podczas preparowania wysp trzustkowych i nekroza wywołana niedotlenieniem podczas hodowli, odgrywają rolę w funkcjonowaniu wysp trzustkowych18. Cechy te mogą wpływać na żywotność wysepki podczas izolowania trzustki, a tym samym na wynikającą z tego funkcję.
Oprócz izolacji i oceny wysp trzustkowych poprzez peryfuzję ex vivo i inkubację statyczną, wyspy trzustkowe w żywych wycinkach trzustki są kolejną metodą ex vivo stosowaną do pomiaru odpowiedzi komórek endokrynnych19. W tym systemie unika się stresu chemicznego związanego z procedurami izolacji wysepek. Ponadto mikrośrodowisko wysp trzustkowych pozostaje nienaruszone, co pozwala na badanie fizjologii wysp trzustkowych bliższych ich stanowi in vivo 20. Podobnie jak w przypadku peryfuzji ex vivo i inkubacji statycznej, jest to metoda, która będzie nadal odgrywać ważną rolę w zdobywaniu wiedzy o trzustce. Jednak niektóre ograniczenia obejmują naprężenia mechaniczne podczas generowania plastrów, a także brak całościowego spojrzenia na nienaruszoną trzustkę dla patologii i fizjologii. Wycinek reprezentuje określony region w trzustce, co zmniejsza jego uogólnienie ze względu na zmniejszoną wielkość próbki i ograniczony widok21.
Tej izolacji wysepek i innym metodom towarzyszą różne punkty stresorów, które mogą być nakładane na wysepki. Naprężenia mechaniczne, niedotlenienie, nadaktywność proteazy i ograniczony widok odgrywają rolę w wynikowym plonie wysp trzustkowych i ogólnej trafności zewnętrznej. Czynniki te można zmniejszyć poprzez perfuzję trzustki przez układ naczyniowy myszy, co minimalizuje wszystkie powyższe czynniki stresogenne, a jednocześnie pozwala na badanie wpływu innych czynników wydzielających i farmakologicznych obecnych w organizmie ze względu na utrzymanie integralności komórkowej22. Wcześniejsze badania wykazały wpływ przepływu krwi w wyspach trzustkowych na poziom insuliny w osoczu23; Z kolei cząsteczki wazoaktywne, takie jak peptydy angiotensyny i współczulni agoniści, które zmieniają przepływ krwi w wyspach trzustkowych, zmieniają funkcję wysp trzustkowych i uwalniają insulinę24,25. Perfuzja trzustki pozwoliłaby na dalszą ocenę, w jaki sposób te i inne różne cząsteczki mogą wpływać na odpowiedź komórek endokrynnych. System ten ma nadzieję na dalszy postęp koncepcyjny w naszym zrozumieniu biologii endokrynnej trzustki w obecności przesłuchów w jej naturalnym mikrośrodowisku z nienaruszonym unaczynieniem i unerwieniem. Dodatkowo, perfuzja nienaruszonej trzustki w tym protokole pozwala na izolację narządu, zmniejszając potencjalne zakłócenia z innych narządów, takich jak wątroba, która usuwa insulinę z krążenia, w porównaniu z perfuzją całej myszy. Perfuzja całej myszy pozwoliłaby na ograniczenie techniki chirurgicznej; Jednak nadal wymagałoby to pobrania perfuzatu przez naczynie za trzustką i przed dotarciem do wątroby - prawdopodobnie żyły wrotnej. Pobranie żyły wrotnej nadal wymagałoby kaniulacji. Podczas gdy cała perfuzja myszy przyniosłaby korzyści w postaci zmniejszonej liczby kroków chirurgicznych, istniałyby ograniczenia wynikające z czynników zakłócających tworzonych przez narządy takie jak nerki i płuca wytwarzające peptydy angiotensyny. Byłoby to jednak nowatorskie podejście, które mogłoby okazać się przydatne podczas badania wpływu cząsteczek wazoaktywnych wytwarzanych z innych narządów na wyspy trzustkowe, co jest głównym priorytetem.
Perfuzja całej trzustki była w przeszłości z powodzeniem wykonywana przez inne 7,22,26. W tym zaktualizowanym protokole wykorzystanie myszy stanowi zwiększone wyzwanie techniczne ze względu na ich mniejszą anatomię w porównaniu ze szczurami. Jednak ta procedura z powodzeniem demonstruje wykonalność tego protokołu, demonstrując dobrze scharakteryzowany profil wydzielania insuliny z nienaruszonej trzustki 3 niezależnych myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie badania przeprowadzone na gryzoniach są zgodne z wytycznymi Joslin Diabetes Research Center (numer zatwierdzenia 22-01).
UWAGA: Jest to procedura niemająca na celu przeżycia z pierwotną i wtórną metodą eutanazji, zgodnie z wnioskiem komitetu IACUC.
1. Początek
- Podaj znieczulenie.
- Wstrzyknąć myszom na czczo, normoglikemicznym (Flox/Cre 53-74 tygodniowy M/F używany w eksperymentach) mieszaninę ketaminy / ksylazyny (przedawkowanie stosowano jako główną metodę eutanazji: ketamina 100-120 mg / kg i ksylazyna 10 mg / kg; całkowita objętość mieszaniny wstrzykniętej podczas prób ~ 0,08-0,14 ml) podawane dootrzewnowo za pomocą igły 28 G.
UWAGA: Stosowanie myszy na czczo o normoglikemii jest ważne w celu zmniejszenia działania ketaminy; Można jednak zastąpić go środkiem znieczulającym. - Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając tylną stopę kleszczami, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu.
UWAGA: Brak odruchu oznacza brak ruchu uszczypniętej nogi. - Podawać sterylną maść okulistyczną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu i zapobiec owrzodzeniom rogówki.
- Wstrzyknąć myszom na czczo, normoglikemicznym (Flox/Cre 53-74 tygodniowy M/F używany w eksperymentach) mieszaninę ketaminy / ksylazyny (przedawkowanie stosowano jako główną metodę eutanazji: ketamina 100-120 mg / kg i ksylazyna 10 mg / kg; całkowita objętość mieszaniny wstrzykniętej podczas prób ~ 0,08-0,14 ml) podawane dootrzewnowo za pomocą igły 28 G.
- Zabezpiecz obiekt.
- Upewnij się, że mysz jest bezpieczna i pozostanie na swoim miejscu podczas procedury, którą ten eksperyment kończy się za pomocą magnesów przymocowanych do gumowych opasek łączących się z kończynami z magnesami przymocowanymi do tablicy magnetycznej.
- Oczyść miejsce nacięcia.
- Upewnij się, że mysz jest spryskana 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią myszy,
UWAGA: Golenie myszy pozwoliłoby na zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia sierścią.
- Upewnij się, że mysz jest spryskana 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią myszy,
- Wykonaj nacięcie.
- Za pomocą kleszczy/pęsety uszczypnij 2-3 cm od odbytu i przetnij w górę, jednocześnie przekłuwając otrzewną zakrzywionymi nożyczkami.
- Utwórz ukośne nacięcie od linii środkowej do żeber i bocznej części myszy.
- Wykonaj identyczne nacięcie po przeciwnej stronie.
UWAGA: Celem jest stworzenie odpowiedniego widoku jamy brzusznej od okolic odbytnicy do przepony
2. Podwiązanie
- Podwiązać tętnicę żołądkową.
- Przesuń jelita w prawo zwierzęcia za pomocą kleszczy/palców. Podnieś żołądek, aby zlokalizować tętnicę żołądkową i żyłę.
UWAGA: Tętnica i żyła żołądkowa zidentyfikowane poprzez wizualizację naczyń biegnących od dolnego przełyku do górnej części żołądka. - Weź szew 7-0 (bez igły) i umieść go pod tętnicą żołądkową za pomocą kleszczy w ramach przygotowań do podwiązania.
- Stwórz węzeł chirurgiczny i zapewnij odpowiednie podwiązanie za pomocą mocnego węzła.
UWAGA: Rodzaj węzła nie jest ważny; Zapobieganie przepływowi krwi można określić poprzez zmianę koloru podwiązanego narządu na jaśniejszy wygląd lub usunięcie narządu i monitorowanie wydalania krwi z punktu podwiązania. Podwiązanie tętnicy żołądkowej zapewnia brak wpływu treści żołądkowej. Zmniejsza to również przeciekanie do naczyń żołądkowych i kieruje perfuzat do tętnicy trzewnej.
- Przesuń jelita w prawo zwierzęcia za pomocą kleszczy/palców. Podnieś żołądek, aby zlokalizować tętnicę żołądkową i żyłę.
- Podwiązywać lewe naczynia nerkowe.
- Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.3 dla lewych naczyń nerkowych.
- Zidentyfikuj lewe naczynia nerkowe, wizualizując jaskrawoczerwone i ciemnofioletowe naczynia łączące się z lewą nerką. Ten krok zapobiega przeciekowi do naczyń nerkowych i przekierowuje perfuzat do tętnicy trzewnej.
- Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.3 dla lewych naczyń nerkowych.
- Podwiązać górną część aorty brzusznej.
- Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3.
- Zidentyfikuj górną aortę brzuszną, wizualizując jaskrawoczerwone naczynie w linii środkowej z rozgałęzionymi naczyniami tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej i lewych naczyń nerkowych. Wykonaj podwiązanie lepsze niż tętnica trzewna, aby zmniejszyć przeciek przez górną aortę brzuszną i zapewnić przepływ do tętnicy trzewnej, a ostatecznie do trzustki.
- Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3.
- Podwiązywać prawe naczynia nerkowe.
- Przesuń jelita w lewo zwierzęcia. Ściśnij tkankę/tłuszcz otaczający prawą nerkę jako dźwignię do identyfikacji właściwych naczyń nerkowych.
- Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3.
- Zidentyfikuj prawe naczynia nerkowe, wizualizując fioletowe/ciemnoczerwone naczynia (obie prawe żyły nerkowe z tętnicą leżącą pod spodem, która nie jest widoczna) połączone z prawą nerką z połączeniem zarówno z żyłą główną dolną, jak i aortą brzuszną. Ten krok jest równoległy do kroku 2.2 z lewym naczyniem nerkowym, co pozwala na dalszą izolację trzustki; Należy jednak uważać na bliskość tego naczynia do żyły głównej dolnej.
- Podwiązywać brzuszną część żyły głównej dolnej.
- Zidentyfikuj brzuszną część żyły głównej dolnej poprzez wizualizację większego fioletowego naczynia z rozgałęzionym połączeniem z prawą żyłą nerkową.
- Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3.
UWAGA: Ten krok zmniejsza potencjalne czynniki zakłócające z krwi przechodzącej przez żyłę wrotną do żyły wrotnej, gdzie zostanie pobrany perfuzat.
- Podwiązać dolną część aorty brzusznej przed rozwidleniem (ryc. 1)
- Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3.
- Po podwiązaniu tuż przed rozwidleniem należy umieścić nić szwu pod aortą około 0,5 cm powyżej pierwszego węzła. Użyj tej nici do szwów, aby zawiązać kaniulę na miejscu.
- Użyj przestrzeni między nicią szwu a szwem podwiązanym, aby wprowadzić rurkę do kaniulacji. To podwiązanie zapewnia, że perfuzat biegnie przez dolną aortę brzuszną w kierunku tętnicy trzewnej.
- Podwiązywać żyłę wrotną (ryc. 2)
- Przesuń jelita w lewo zwierzęcia, aby umożliwić prawidłową wizualizację żyły wrotnej.
- Wykonaj nacięcie w przeponie i żebrach, aby w razie potrzeby uzyskać więcej miejsca na widok żyły wrotnej i zapewnić odpowiednią przyczepność do podwiązania i kaniulacji.
- Podwiązać naczynie jak najbardziej górno (bliżej wątroby), aby zapewnić miejsce na późniejszą kaniulację.
- Umieść drugi szew poniżej pierwszego, ale powyżej trzustki. Krok 2.7.2 spowoduje, że podmiot umrze. Dodatkowo ten krok jest ważny, aby umożliwić zebranie perfuzatu i zapobiec potencjalnemu przepływowi wstecznemu powyżej punktu kaniulacji.
3. Kaniulacja
- Kankaniul dolną aorę brzuszną.
- Wykonaj nacięcie nożyczkami o średnicy 0,5-1,5 mm w dolnej części aorty brzusznej między dolnym węzłem a szwem górnym.
- Używając najniższego węzła jako dźwigni, włóż rurkę do aorty przez nacięcie, aż dotrze do wyższego szwu; Uważaj, aby nie rozerwać się.
- Zawiąż lepszy szew w węzeł, aby zablokować rurkę na miejscu.
UWAGA: Ten krok pozwala na przedostanie się perfuzatu do zamkniętego systemu. Po założeniu podwiązania, perfuzat powinien przemieszczać się od punktu wejścia w dolnej części aorty brzusznej do tętnicy trzewnej, a następnie do naczyń trzustkowych, kończąc na żyle wrotnej wątroby, w której można pobrać perfuzat.
- Kankaniuluj żyłę wrotną.
- Wykonaj nacięcie 0,5-1 mm w żyle wrotnej tuż po tym, jak żyła wrotna opuści trzustkę.
- Trzymając górny węzeł jako dźwignię za pomocą kleszczy w jednej ręce, włóż rurkę do żyły wrotnej za pomocą kleszczy, aby chwycić rurkę drugą ręką.
- Użyj drugiego szwu, aby zawiązać rurkę na miejscu, jeśli to możliwe.
UWAGA: Ten krok jest punktem końcowym zamkniętego systemu, z którego perfuzat powinien wydostać się wraz z uderzeniem trzustki w obecny płyn.
4. Gromadzenie danych
- Wykonaj perfuzję.
- Przed umieszczeniem rurki aorty w dolnej części brzucha upewnij się, że system perfuzyjny rozpoczął się, a perfuzat przepływa z pożądaną prędkością (~2 ml / min).
UWAGA: Perfuzat powinien spłynąć z kaniulacji żyły wrotnej do probówki zbiorczej. W celu łatwiejszego przechowywania można użyć probówki do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Zastosowane tu roztwory perfuzyjne to 2,6 mM glukozy z 1,2 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), 16,8 mM glukozy i 2,6 mM glukozy z 3-izobutylo-1-metyloksantyną (IBMX) w buforze wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KRB, 16 mM HEPES i 0,1% BSA, pH 7,4). Roztwór perfuzatu zaczynał się od roztworu o niskiej glikemii do wysokiego poziomu glukozy, z powrotem do niskiego poziomu glukozy, a kończył się roztworem IBX do kontroli.
- Przed umieszczeniem rurki aorty w dolnej części brzucha upewnij się, że system perfuzyjny rozpoczął się, a perfuzat przepływa z pożądaną prędkością (~2 ml / min).
- Zbierz perfuzat.
- Zbieraj perfuzat w odstępach 30-minutowych do probówek do PCR (wymieniaj probówki co 3 minuty).
- Po każdym 30-minutowym interwale zmień roztwór.
- Wykonaj test immunoenzymatyczny (ELISA) z próbkami. Można to zrobić w późniejszym czasie, jeśli jest odpowiednio przechowywane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki testu ELISA powinny wykazać wydzielanie insuliny z trzustki myszy w stopniu zależnym od poziomu perfuzatu glukozy. Ze względu na nowość tej procedury u myszy, analiza wyniku i jej sukcesu zależy od porównania z wieloma innymi badaniami perfundowanej trzustki myszy. Dwufazowa odpowiedź insulinowa na wysokie stężenie glukozy jest uważana za fizjologiczną, ocenianą u ludzi i metodami peryfuzji wysp trzustkowych. Przedstawione wyniki są podobne do poprzedniej perfuzji trzustki u szczur...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół ma na celu stworzenie zamkniętego systemu składającego się z nienaruszonej trzustki, dwóch wlotów (tętnica trzewna i tętnica krezkowa górna) oraz jednego ujścia (żyła wrotna wątroby). Wszystkie inne naczynia są podwiązane, aby zapobiec wyciekom podczas przepuszczania perfuzatu, a także w celu zapewnienia izolacji samej trzustki od jej mikrośrodowiska. Etapy podwiązania w tym protokole pozwalają również na przepływ perfuzatu przez trzustkę bez podróży do innych narządów, które mogą potencjalnie za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Christopherowi Cahillowi, Jennifer Hollister-Lock, dr Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Heli i Priscili Carapeto za pomocne konsultacje, pomoc techniczną i mentoring podczas całego projektu. Badania te były wspierane przez grant NIDDK R01 DK132535 oraz NIDDK DRC P30 DK036836.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Natleniacz membranowy z włókna | Aparatura Harvarda | 73-3757 | Umożliwia przenikanie tlenu do perfuzatu |
| Poduszka grzewcza | Naukowe drzewo mózgów | 39OM | |
| Ketamina/ksylazyna | Patterson Weterynaryjny | 78908598 | |
| Tablica magnetyczna | Naukowe drzewo mózgów | 39OM | |
| Magnesy z gumkami | Naukowe drzewo mózgów | 39OM | |
| Mikroskopia | N/A | N/A | Brak konkretnej firmy |
| Butla tlenu | N/A | N/A | Brak konkretnej firmy |
| Probówki do PCR | ThermoFisher/Invitrogen | AM12225 | Służy do zbierania perfuzatu |
| Rurka PE-30 | Naukowe drzewo mózgów | PE30 | |
| Rurka PE-50 | Naukowe drzewo mózgów | PE50 | |
| Pompa perystaltyczna | N/A | N/A | Brak konkretnej firmy |
| Narzędzia chirurgiczne | N/A | N/A | Brak konkretnej firmy |
| Szew | N/A | N/A | Brak konkretnej firmy |
Bibliografia
- Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
- Paraskevas, S., et al. Apoptosis occurs in freshly isolated human islets under standard culture conditions. Transplant Proc. 29 (1-2), 750-752 (1997).
- Bottino, R., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol. 12, 667170(2021).
- Jansson, L., Carlsson, P. -O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Weir, G. C., Atkins, R. F., Martin, D. B. Glucagon secretion from the perfused rat pancreas following acute and chronic streptozotocin. Metabolism. 25 (11 Suppl), 1519-1521 (1976).
- Pisania, A., et al. Quantitative analysis of cell composition and purity of human pancreatic islet preparations. Lab Invest. 90 (11), 1661-1675 (2010).
- Weir, G. C., Leahy, J. L., Braunstein, L. P. Characteristics of insulin and glucagon release from the perfused pancreas, intact isolated islets, and dispersed islet cells. Horm Res. 24 (1), 62-72 (1986).
- Fathi, I., Goto, M. Collagenases in Pancreatic Islet Isolation. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , Elsevier Academic Press. (2019).
- Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. J Clin Lab Anal. 8 (6), 407-411 (1994).
- Basir, I., et al. Improved outcome of pig islet isolation by Pefabloc inhibition of trypsin. Transplant Proc. 29 (4), 1939-1941 (1997).
- White, S. A., et al. A preliminary study of the activation of endogenous pancreatic exocrine enzymes during automated porcine islet isolation. Cell Transplant. 8 (3), 265-276 (1999).
- Lakey, J. R. T., et al. Serine-protease inhibition during islet isolation increases islet yield from human pancreases with prolonged ischemia. Transplantation. 72 (4), 565-570 (2001).
- Rose, N. L., Palcic, M. M., Helms, L. M. H., Lakey, J. R. T. Evaluation of Pefabloc as a serine protease inhibitor during human-islet isolation. Transplantation. 75 (4), 462-466 (2003).
- Cross, S. E., et al. Collagenase penetrates human pancreatic islets following standard intraductal administration. Transplantation. 86 (7), 907-911 (2008).
- Balamurugan, A. N., et al. Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant. 5 (11), 2671-2681 (2005).
- Li, W. Functional analysis of islet cells in vitro, in situ, and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 103, 14-19 (2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Cohrs, C. M., et al. Bridging the gap: pancreas tissue slices from organ and tissue donors for the study of diabetes pathogenesis. Diabetes. 73 (1), 11-22 (2024).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
- Wargent, E. T. Measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent. Methods Mol Biol. 2076, 281-297 (2020).
- Tamayo, A., et al. Pericyte control of blood flow in intraocular islet grafts impacts glucose homeostasis in mice. Diabetes. 71 (8), 1679-1693 (2022).
- Yuan, L., Li, Y., Li, G., Song, Y., Gong, X. Ang(1-7) treatment attenuates β-cell dysfunction by improving pancreatic microcirculation in a rat model of type 2 diabetes. J Endocrinol Invest. 36 (11), 931-937 (2013).
- Carlsson, P. -O., Berne, C., Jansson, L. Angiotensin II and the endocrine pancreas: effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia. 41 (2), 127-133 (1998).
- Penhos, J. C., et al. A rat pancreas-small gut preparation for the study of intestinal factor(s) and insulin release. Diabetes. 18 (11), 733-738 (1969).
- Ma, Y. H., et al. Differences in insulin secretion between the rat and mouse: role of cAMP. Eur J Endocrinol. 132 (3), 370-376 (1995).
- Aynsley-Green, A., Biebuyck, J. F., Alberti, K. G. Anaesthesia and insulin secretion: the effects of diethyl ether, halothane, pentobarbitone sodium and ketamine hydrochloride on intravenous glucose tolerance and insulin secretion in the rat. Diabetologia. 9 (4), 274-281 (1973).
- Chen, H., Li, L., Xia, H. Diabetes alters the blood glucose response to ketamine in streptozotocin-diabetic rats. Int J Clin Exp Med. 8 (7), 11347-11351 (2015).
- Lehmann, R., et al. Effects of ketamine sedation on glucose clearance, insulin secretion and counterregulatory hormone production in baboons (Papio hamadryas). J Med Primatol. 26 (6), 312-321 (1997).
- Sharif, S. I., Abouazra, H. A. Effect of intravenous ketamine administration on blood glucose levels in conscious rabbits. Am J Pharm Toxicol. 4 (2), 38-45 (2009).
- Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H., Sato, Y. Glucose-stimulated insulin secretion: a newer perspective. J Diabetes Investig. 4 (6), 511-516 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
