Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

Anna E. Tseng; Aoife O'Connell; Aaron Benhamou; Shivraj Yabaji; Igor Kramnik; Nicholas A. Crossland; Emily Speranza

doi:10.3791/67853

Artykuł metodologiczny

Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

DOI:

10.3791/67853

⸱

6 sierpnia 2025

Anna E. Tseng¹^,² , Aoife O'Connell¹ , Aaron Benhamou¹^,³ , Shivraj Yabaji¹^,² , Igor Kramnik¹^,² , Nicholas A. Crossland¹^,²^,³ , Emily Speranza⁴

¹National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL), Boston University, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ³Department of Virology, Immunology and Microbiology, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ⁴Florida Research and Innovation Center, Cleveland Clinic Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy zastosowanie metody Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX), wykorzystującą komercyjnie dostępne, zautomatyzowane barwienia tkanek oraz rozważania optymalizacyjne dla stosowania odczynników opartych na wzmacnianiu sygnału tyramidowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX) to wysoce czuła technika wielorundowego obrazowania fluorescencyjnego oparta na wzmacnianiu sygnału tyramidowego (TSA), umożliwiająca szczegółowe badanie wielu biomolekuł białek w pojedynczej próbce tkanki poprzez powtarzane wybielanie, ponowne barwienie oraz współrejestrację obrazów. Pomimo rosnącego zastosowania do generowania silnie multipleksowanego immunodaminu, wdrożenie IBEX w sposób zautomatyzowany poprzez wdrożenie w kluczowych obiektach przynosi liczne korzyści, w tym zwiększoną przepustowość, powtarzalność oraz ogólną efektywność personelu laboratoryjnego. Tutaj demonstrujemy skuteczne zastosowanie IBEX na dwóch szeroko stosowanych platformach autostainerów oraz omawiamy ważne kwestie optymalizacji projektowania paneli z wykorzystaniem reakcji TSA dla próbek tkanek utrwalonych formaliną i parafiną (FFPE). Obejmuje to metodologię testowania wrażliwości na pobranie przeciwciał antygen, co jest istotnym aspektem przy projektowaniu paneli IBEX przy określaniu kolejności rozwoju przeciwciał. Dodatkowo prezentujemy podejścia do obrazowania w dalszej fazie wykorzystujące komercyjnie dostępne skanery całych slajdów oraz ilustrujemy wyrównanie jakości i analizę za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania do fenotypowania komórek. Poprzez szczegółowe opisy tych metodologii oraz towarzyszące im filmy chcemy podkreślić wszechstronność i łatwość IBEX, oferując praktyczne wskazówki dla kluczowych placówek patologicznych w integracji IBEX z istniejącymi zautomatyzowanymi platformami barwienia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX) to istotny postęp w wysoce czułej, wielorundowej fluorescencyjnej immunohistochemii opartej na TSA, umożliwiający szczegółową wizualizację i ilościową identyfikację licznych biomolekuł w jednej próbce tkanki. Dzięki powtarzającym się cyklom wybielania i ponownego barwienia, IBEX umożliwia badanie złożonych środowisk komórkowych z nieporównywalną głębią i klarownością, czyniąc go potężnym narzędziem w dziedzinie immunobarwienia i multipleksowanego obrazowania ^1,2.

Wiele podmiotów akademickich, rządowych i przemysłowych posiada kluczowe placówki patologiczne wspierające różnorodne metodologie badawcze oparte na tkankach, mające na celu generowanie jakościowych i ilościowych zbiorów danych morfomolekularnych. Te rdzenie są kluczowymi zasobami, oferującymi specjalistyczne usługi tkankowe, które pozwalają laboratoriom badawczym zlecać na zewnątrz złożone i pracopracochłonne procesy patologii molekularnej oraz konsultować się bezpośrednio z patologami przy projektowaniu badań, opracowywaniu testów i interpretacji danych. Aby zapewnić spójność i zmniejszyć zmienność między eksperymentami, te podstawowe zakłady rutynowo polegają na komercyjnie dostępnych autostainerach – zautomatyzowanych instrumentach zaprojektowanych do wykonywania standaryzowanych protokołów barwienia o wysokiej powtarzalności i efektywności³.

Chociaż autostainery stały się podstawą immunodymatycznego barwienia w kluczowych placówkach, umożliwiając wysoką przepustowość i spójne wyniki, nie zostały jeszcze dostosowane do nowszych osiągnięć, takich jak IBEX. Ponadto potrzeba specjalistycznej wiedzy w projektowaniu paneli, szczególnie przy użyciu odczynników opartych na wzmacnianiu sygnału tyramidowym (TSA)⁴, dodaje dodatkową warstwę złożoności, ograniczając szersze wdrożenie IBEX w rutynowych procesach badawczych. W rezultacie badacze chcący wykorzystać wysokorozdzielcze, multipleksowane możliwości obrazowania IBEX często mogą być ograniczeni przez istniejący sprzęt swoich kluczowych obiektów. Ta różnica między innowacyjnymi technikami obrazowania a praktycznymi realiami operacji kluczowych obiektów podkreśla barierę dla szerszego wdrożenia IBEX w badaniach akademickich. Praca ta ma na celu przezwyciężenie tej bariery poprzez wykazanie skutecznego zastosowania IBEX na popularnych platformach autostainerów, koncentrując się na wykorzystaniu odczynników opartych na TSA przy użyciu tkanek utrwalonych formaliną i osadzonych w parafinie (FFPE). Najpierw omawiamy kroki niezbędne do zbudowania panelu IBEX z użyciem barwników na bazie TSA oraz zastosowanie pokrywy tych paneli na dwóch różnych komercyjnie dostępnych autostainerach. Razem oferują praktyczne wskazówki dotyczące testów wrażliwości na pozyskanie przeciwciał i antygenów, omawiają kluczowe kwestie optymalizacji projektowania paneli oraz oferują alternatywną metodę wyrównywania paneli przy użyciu dostępnego komercyjnego oprogramowania oraz poprzez kluczowe laboratoria patologiczne.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa paneli IBEX z barwnikami na bazie TSA

UWAGA: Zawsze używaj świeżego preparatu przeciwciał i barwników oraz przechowuj go w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany.

Testy wrażliwości na pobranie antygenów
1. Przygotowanie slajdów
  1. Użyj mikrotomu, aby pobrać trzy sekcje seryjne dla każdego przeciwciała do testu z tej samej tkanki osadzonej w FFPE na trzech oddzielnych, dodatnio naładowanych szkiełkach.
  2. Etykietuj preparaty z przeciwciałem do badania oraz liczbą cykli pobierania antygenów do testowania: 1 cykl, 3 cykle i 6 cykli.
  3. Susz szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej. Jeśli pracujesz tylko z markerami powierzchniowymi, wypalaj szkiełka w 60 ^°C przez co najmniej 20 minut, aby zmiękczyć wosk. Jeśli pracujesz z markerami jądrowymi, piecz szkiełka w 60 ^°C przez noc.
2. Przygotuj program na autostainerze pod różną liczbę cykli, dbając o trzy etapy mycia między każdym krokiem. Zobacz Tabelę 1 , na przykład protokoły dla testów 1, 3 i 6 cykli.
  UWAGA: Dla każdego pojedynczego przeciwciała należy zapewnić stały czas na etap badania przeciwciał oraz aplikację barwnika TSA.
  W przypadku stosowania barwników na bazie TSA alternatywą dla pozostawienia barwnika na 3-10 minut w temperaturze pokojowej jest pozwolenie na inkubację przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
3. Załaduj próbki do autostainera i uruchom protokół dla odpowiedniej liczby cykli.
4. Powtarzaj ten proces od kroków 1.1.1 do 1.1.3, aby każde pojedyncze przeciwciało zostało zweryfikowane i przetestowane.
5. Wyjmij szkiełka z autostainera i umieść je w PBS.
6. Zamontuj slajdy za pomocą wodnych nośników montażowych (takich jak w przypadku naboju IBEX) oraz pokrywy #1.5 dla optymalnego obrazowania.
7. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby sfotografować 1-cyklowe preparaty barwnika TSA i DAPI, notując czas naświetlania potrzebny do wizualizacji sygnału.
8. Powtarzaj to dla slajdów 3 i 6 cykli, notując czas naświetlania potrzebny do wizualizacji barwnika TSA.
9. Porównaj czasy ekspozycji między różnymi liczbami cykli. Zobacz Rysunek 1 dla przykładów. Zapewnij trzy cykle prania między wszystkimi etapami.
  1. Jeśli czas ekspozycji skraca się wraz ze wzrostem cykli, przełóż to przeciwciało i barwienie na późniejszy etap.
  2. Jeśli czas ekspozycji wydłuża się wraz ze wzrostem cykli, umieść to przeciwciało w wcześniejszym etapie.
  3. Jeśli nie ma dużej zmiany czasu ekspozycji, umieść to przeciwciało na dowolnym etapie.
  4. Grupuj przeciwciała na podstawie wymagań cyklu dla pierwszego przejścia w panelach IBEX.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeprowadź tę walidację na wszystkich pożądanych markerach dla danego panelu IBEX. Walidacja ta wykonuje się za każdym razem, gdy zmieniane są typy tkanek lub pracują z poliklonalnymi przeciwciałami pierwotnymi o unikalnych numerach partii.
Adresowanie przenikania sygnału z barwnika widmowego w pobliżu poprzez ocenę siły sygnału.
1. Grupowanie przeciwciał w potencjalne panele IBEX na podstawie optymalnej liczby cykli pobrania, jak ustalono, w grupy 1, 3 lub 6 cykli.
2. Przygotowanie slajdów
  1. Użyj mikrotomu do stworzenia sekcji seryjnej z próbki FFPE, po jednej dla każdego przeciwciała, aby użyć jej w pojedynczym panelu IBEX.
  2. Każde szkiełko oznacz jednym z przeciwciał przeznaczonych do wykorzystania w panelu IBEX.
  3. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Jeśli pracujesz tylko z markerami powierzchniowymi, pozwól szkiełkom piec się w 60 ^°C przez co najmniej 20 minut, aby zmiękczyć wosk. Jeśli pracujesz z markerami jądrowymi, pozwól preparatom piec się przez noc w 60 ^°C.
3. Dla grup 1, 3 i 6 cykli użyj ustawienia jednego cyklu z Tabeli 1. Upewnij się, że trzy prania pomiędzy każdym etapem
  1. Zmodyfikuj protokół dla każdego przeciwciała z optymalnym czasem barwienia.
  2. Używaj tego samego czasu TSA dla wszystkich przeciwciał.
4. Pobejcie próbki na autostainerze.
5. Usuń próbki i umieść preparaty w PBS.
6. Zamontuj slajdy za pomocą wodnych nośników montażowych (takich jak w przypadku naboju IBEX) oraz pokrywy #1.5 dla optymalnego obrazowania.
7. Zrób zdjęcia preparatów mikroskopem epifluorescencyjnym, używając optymalnego czasu naświetlania dla każdego obrazu.
8. Określ siłę sygnału. Slajdy z krótkim czasem naświetlania mają bardzo wysoką siłę sygnału, podczas gdy slajdy z długim czasem naświetlania mają niską siłę sygnału.
9. Użyj siły sygnału wraz z numerem cyklu do tworzenia paneli IBEX.
  1. Grupuj przeciwciała na podstawie liczby cykli.
  2. Dla danej grupy przeciwciał o określonej liczbie cyklu upewnij się, że silny sygnał nie jest optycznie blisko słabego, aby zminimalizować przelewanie się sygnału.
Zweryfikować poszczególne panele IBEX, aby upewnić się, że każdy panel może generować pożądany efekt.
1. Przygotuj slajdy.
  1. Użyj mikrotomu do tworzenia sekcji szeregowych, po jednej dla każdego multipleksowego panelu IBEX, i oznaczaj kolejność panelu IBEX, który ma być użyty.
  2. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Jeśli pracujesz tylko z markerami powierzchniowymi, pozwól szkiełkom piec się w 60 ^°C przez co najmniej 20 minut, aby zmiękczyć wosk. Jeśli pracujesz z markerami jądrowymi, pozwól preparatom piec się przez noc w 60 ^°C.
2. Ustaw autostainer.
  1. Do pierwszego panelu uruchom program autostainera bez dodatkowych kroków pobierania antygenów.
  2. W drugim panelu wprowadź dodatkowe kroki denaturacji przed pierwszym przeciwciałem równe liczbie kroków denaturacji w pierwszym panelu. Zobacz Tabelę 2 dla przykładowego panelu 1 z pięcioma przeciwciałami oraz Tabelę 3 dla przykładowego panelu 2 z czterema przeciwciałami. Upewnij się, że pomiędzy każdym krokiem należy trzy kroki mycia.
  3. Powtarzaj w razie potrzeby dla dodatkowych paneli IBEX, dodając kolejne etapy denaturacji.
3. Zdejmij szkiełka z autostainera i umieść je w PBS, aż będą gotowe do montażu.
4. Zamontuj slajdy za pomocą wodnych nośników montażowych (takich jak w przypadku naboju IBEX) oraz pokrywy #1.5 dla optymalnego obrazowania.
5. Zrób zdjęcia preparatów mikroskopem epifluorescencyjnym, używając optymalnego czasu naświetlania dla każdego obrazu i każdego barwnika TSA.
6. Sprawdź, czy wszystkie panele wyświetlają się prawidłowo. Jeśli tak, przejdź do obrazowania IBEX. Jeśli nie, ponownie zajmij się cyklami balansowania sygnałów i ich odzyskiwania.
  UWAGA: Niektóre regulacje można wprowadzić w jednym panelu, aby zoptymalizować sygnał i zapobiec efektowi parasola. Niektóre bardzo obfite sygnały mogą blokować barwienie sygnałów w dół strumienia. Najpierw sprawdź w obrębie danego panelu, aby użyć mniej obecnych barwników (patrz Rysunek 2).

2. Adaptacja IBEX z autostainerami z wykorzystaniem odczynników TSA i platform obrazowania całych szkiełek (Rysunek 3)

UWAGA: Porównanie dwóch zweryfikowanych autostainerów użytych i omawianych w tym protokole można znaleźć w Tabeli 4.

Przygotuj wszystkie slajdy do biegu IBEX.
1. Użyj mikrotomu, aby stworzyć przekroje FFPE na dodatnio naładowanym slajdzie. Upewnij się, że dołącz jeden preparat dla każdej próbki eksperymentalnej, preparaty z dodatnim testem tkanek z przekrojami tkanek znanych z antygenów do obrazowania oraz preparat kontroli ujemnej, w którym stosuje się PBS zamiast wszystkich przeciwciał pierwotnych.
  UWAGA: Jeśli pracujesz w partiach, dołącz próbkę kontrolną partii. Próbka kontrolna partii to pojedynczy blok tkanki FFPE, który jest przecinany i włączany do każdej partii próbek eksperymentalnych do normalizacji i kontroli zmienności eksperymentalnej między partiami próbek barwionych. Jest to konieczne tylko wtedy, gdy nie wszystkie próbki zostaną przetworzone razem.
2. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Jeśli pracujesz tylko z markerami powierzchniowymi, pozwól szkiełkom piec się w 60 ^°C przez co najmniej 20 minut, aby zmiękczyć wosk. Jeśli pracujesz z markerami jądrowymi, pozwól preparatom piec się przez noc w 60 ^°C.
Przygotuj przeciwciała i barwniki do pierwszego panelu IBEX do zdjęcia.
Ustaw program autobarwienia. Zobacz Tabelę 2 , aby zobaczyć przykład panelu z 5 markerami. Upewnij się, że trzy razy myj między każdym krokiem.
Załaduj próbki i przeciwciała do autostainera i uruchom program do barwienia próbek.
Usuń szkiełka z autostainera i nałóż pokrywkę z wykorzystaniem wodnych nośników odpowiednich do obrazowania wielospektralnego oraz pokrywki #1.5.
Zrób zdjęcia preparatów w ciągu 2 dni od bejcowania
Obrazowanie fluorescencyjne na epifluorescencyjnym lub fluorescencyjnym skanerze szkiełkowym
1. Zaczynając od dobrze kontrolowanej próbki z dodatnim kontrolem, załaduj ją do mikroskopu.
  1. Zlokalizuj sygnał dodatni w próbce dla każdego z różnych antygenów, które mają być obrazowane.
  2. Ustaw czas naświetlania, aby zapewnić uchwycenie zakresu dynamicznego barwy przy jednoczesnym minimalizowaniu tła, zaczynając od niskiej ekspozycji i stopniowo zwiększając czas naświetlania, aż sygnał pojawi się. Rób to dla każdej farby osobno.
    UWAGA: Sprawdź obecność zarówno wysokiego, jak i niskiego wyrażenia markerów, aby uchwycić pełny zakres dynamiczny.
2. Zapisz ustawienia użyte dla próbki kontroli dodatniej i używaj ich do wszystkich dalszych etapów obrazowania.
3. Załaduj i obrazuj próbkę kontrolną z ujemnym wynikiem oraz wszystkie próbki eksperymentalne, stosując ustawienia określone przez próbkę kontrolną z dodatnim testem.
4. Sprawdź, czy obrazy są optymalnej jakości, zanim przejdziesz do kolejnych kroków.
Usuwanie slipów przykrywkowych
1. Zanurz preparaty w słoiku Coplin z wodą DI. Włóż słoik Coplin do kąpieli wodnej ustawionej na 65 °C na 15-20 minut, aby naturalnie usunąć pokrywę. Alternatywnie, jeśli użyto podłoża mocującego na bazie wody lub nośnik montażowy całkowicie stwardniał, usuń pokrywy, mocząc je na noc w wodzie z buforem fosforanowym (PBS) lub DI, aby pokrywki mogły naturalnie odpadać.
Wybielanie z LiBH₄
1. W okapie przygotowuję świeży roztwór LiBH₄ w stężeniu 1mg/mL w wodzie DI. Zrób tyle, by pokryć każdą próbkę trzykrotnie.
  UWAGA: Nie przygotowuj więcej niż 10 ml naraz ze względu na reakcję LiBH₄ z wodą. Dla optymalnej aktywności wybielania używaj wody DI, a nie Millipore/nanoczystości.
2. Zostaw roztwór na 20 minut. Powstają bąbelki.
3. Pipetą nałóż 1 mL roztworu LiBH₄ na każdą szkiełkę w komorze barwieckiej w okapie oparowym. Pozwól roztworowi odpocząć na szkiełku przez 10-15 minut.
4. Usuń LiBH₄ , pipetując z zasuwki i zamień na świeże 1 mL LiBH_4.Zostaw roztwór na 10-15 minut.
5. Usuń LiBH₄ , pipetując z zasuwki i zamień na świeże 1 mL LiBH_4.Zostaw roztwór na 10-15 minut.
6. Usuń LiBH₄ ze szkiełek przez pipetowanie i zanurz je w wodzie DI lub PBS do krótkotrwałego przechowywania (nie dłużej niż 1 dzień).
7. W ciągu dnia przejdź do kolejnej rundy barwienia IBEX.
8. Opcjonalnie: montaż szkiełek na mokro i wykonanie szybkiej wizualizacji na endoskopie epifluorescencyjnej, aby zweryfikować skuteczność wybielania.
Mokre montaż szkła do autostainera i drugi przebieg barwienia IBEX
1. Przygotuj wszystkie przeciwciała i roztwory barwników TSA dla autostainera.
2. Do autostainera Ventana:
  1. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia autostainer, nałóż około 1 ml buforu do mycia autostainera na szkiełko, aby zapobiec wysychaniu z mokrego uchwytu.
  2. Załaduj ślizgi montowane na mokro do autostainera.
3. Dla recepty na obligacje:
  1. Umieść okładki na zjeżdżalniach.
  2. Na górze pokrywy pipeta 300 μL bufora płukania, aby roztwór mógł przepłynąć do przestrzeni między próbką a pokrywą.
  3. Załaduj próbki do autostainera.
4. Ustaw program autostainer według przykładu z tabeli 2 , ustawiając N na liczbę przeciwciał w panelu.
5. Usuń szkiełka z autostainera i nałóż pokrywkę z wykorzystaniem wodnych nośników odpowiednich do obrazowania wielospektralnego oraz pokrywki #1.5.
6. Zrób zdjęcia preparatów w ciągu 2 dni od barwienia zgodnie z procedurą próbki opisaną w kroku 2.7 podczas organizowania sesji obrazowania i zbierania obrazów.
7. Po zdjęciach pobieraj próbki wybielacza opisane w krokach 2.8-2.9.
Powtarzaj to dla wszystkich pożądanych paneli IBEX.

3. Analiza próbek za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania

Wykonaj całe skanowanie szkiełek zabarwionych preparatów przed przystąpieniem do wyrównania.
Jeśli oprogramowanie na to pozwala, wykonaj rozmieszanie spektralne za pomocą zautomatyzowanej funkcji rozmieszania wbudowanej w funkcje skanowania, w tym usuwanie widm autofluorescencji. Jeśli jest to funkcja używanego oprogramowania, wybierz opcję rozmieszania i uruchom przy standardowych ustawieniach i gotowych barwnikach
UWAGA: Większość programów umożliwiających rozmiksowanie może generować niestandardowe rozłączanie. Aby stworzyć bibliotekę, do pomiarów oprogramowania dodaje się poszczególne sekcje tkanek barwione pojedynczym fluoroforem. Obszar tkanki niebarwionej lub autofluorescencyjnej jest również skanowany w celu scharakteryzowania widma autofluorescencji, który jest wybierany narzędziem autofluorescencji. Spektra te są kompilowane w programie przez naciśnięcie "prepare image", a następnie eksportowane do biblioteki do specyficznej dla projektu biblioteki do rozmieszania. Ta biblioteka jest następnie wybierana jako biblioteka do rozmieszania w opcji rozmieszania.
Zaimportuj zeskanowane slajdy do komercyjnie dostępnego oprogramowania do analizy obrazów w celu wyrównania.
Rejestracja slajdów wielu rund IBEX
1. Wybierz dwie edycje rund IBEX do rejestracji.
2. Kliknij prawym przyciskiem myszy na te dwa i wybierz opcję Zarejestruj się.
3. Wybierz Domyślną Rejestrację z Rejestracją Wysokiej Rozdzielczości , aby podjąć pierwszą próbę rejestracji.
4. Alternatywnie, wybierz Rejestrację Jednego Kanału w opcjach i wybierz jeden kanał, który był spójny we wszystkich uruchomieniach IBEX.
  UWAGA: Ta opcja jest przydatna dla barwników odpornych na wybielanie (zobacz materiały, do których barwniki nie podlegają wybielaniu).
Wyrównanie obrazu
1. Otwórz jedno z zarejestrowanych zdjęć.
2. W zakładce Narzędzia , w sekcji Rejestracja obrazów, wybierz Narzędzia rejestracyjne , aby otworzyć wszystkie zarejestrowane obrazy.
3. W zakładce Narzędzia Rejestracji wybierz funkcję zabytku.
4. Użyj funkcji landmark , aby precyzyjnie dopracować wyrównanie całych slajdów.
  1. Oznaczaj punkty orientacyjne ręcznie na jednym zdjęciu slajdu.
  2. Na pozostałych zdjęciach IBEX zaznacz ten sam punkt orientacyjny. Program doprecyzuje wyrównanie, wykorzystując zidentyfikowany punkt orientacyjny. Powtarzam dla precyzyjnego dostrojenia ustawienia.
5. Gdy jest się zadowolony z wyrównania, bezpiecznik zamków za pomocą bezpiecznika | Funkcja Serial Stain.
6. Powtarzaj ten proces przy kolejnych rundach obrazowania IBEX, aż ukończono ostateczną kompozytę wszystkich obrazów.
Analiza obrazu
1. Segmentacja komórek
  1. W zakładce Analiza wybierz i otwórz moduł HighPlex, a następnie wybierz moduł fenotypowania do identyfikacji komórek.
    1. Załaduj wszystkie markery i zacznij od znalezienia wszystkich jąder za pomocą zakładki Wykrywanie Jądra w module Highplex . Wczytaj znaczniki w zakładce Wybór barwnika . Identyfikacja komórek za pomocą barwienia DAPI.
    2. W zakładce Analiza włącz narzędzie Real-Time Tuning , używając następujących kluczowych parametrów: Minimalna intensywność jądrowa ustawiona na filtrowanie sygnału tła; Maksymalna jasność obrazu ustawiona do kontroli ogólnej widoczności sygnału; Segmentacja jądrowa Agresywność ma na celu doprecyzowanie granic wykrytych jąder.
    3. Każdy parametr należy precyzyjnie dostroić, aby zapewnić dokładną segmentację.
2. Wykrywaj markery cytoplazmy i błon.
  1. Przejdź do zakładki Wykrywanie błon i cytoplazmy .
  2. Ustaw minimalny promień cytoplazmy na wartość odpowiednią dla próbki i oczekiwanego rozmiaru komórek.
  3. W opcji Barwniki Błonowe określ, które kanały są markerami błonowymi.
    UWAGA: Powinno to skutkować lepszą segmentacją poszczególnych komórek do dalszej analizy.
3. Progowanie markerów i przypisywanie fenotypów
  1. Dla każdego markera ustaw progi sygnałów dodatnich i ujemnych. Zrób to pod zakładkami generowanymi dla każdego znacznika.
  2. Wykonuj ręczne progi dla każdego markera, aby zidentyfikować populacje.
  3. Alternatywnie, można użyć automatycznego podejścia do progowania opartego na bioinformatyce. W zaawansowanym | Zapisz dane obiektu (komórki), przełącz opcję na Prawda. W Eksporcie | Dane obiektowe, eksportuj zbiór danych, aby uzyskać informacje o wyrażeniu markerów dla każdej zidentyfikowanej komórki.
  4. Zaimportuj te dane do dodatkowego oprogramowania do dalszej i dopasowanej analizy. Opcje oprogramowania do dalszej analizy znajdują się w Tabeli 5.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy przykład panelu IBEX wykorzystującego odczynniki na bazie TSA na Autostainer 2 (Rysunek 4). Każdy marker można wyraźnie wyznaczyć, a przenikanie między nimi jest minimalne. Obraz został zebrany podczas dwóch rund bejcowania. Próbka to tkanka płucna po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis. Dwa panele barwiarskie IBEX zostały wyrównane za pomocą przykładowego oprogramowania dostępnego komercyjnie. Stosując podejście IBEX z optymalnymi odczynnikami TSA (jak opisano tutaj), można docenić i docenić przestrzenną organizację komórek odpornościowych, markerów zapalnych oraz wyspecjalizowanych komórek płuc. Właściwa optymalizacja pozwala na łatwe pojawienie się znaczników przy minimalnym tle.

figure-results-1
Rysunek 1: Testy pobierania antygenów fluoroforem o emisji 520 nm dwóch różnych antygenów. RAGE i CD3e zostały sfotografowane z wykorzystaniem zachowanych czasów ekspozycji. Epitop tego przeciwciała RAGE jest bardzo czuły i podatny na powtarzalne pobieranie antygenów, z gwałtownym spadkiem czułości testu przy kolejnych pobieraniach antygenów. Z kolei czułość testu CD3e poprawia się po wielokrotnych cyklach pobierania antygenów. Pręty skalowe = 50 μm. Skrót: RAGE = Receptor dla zaawansowanych produktów końcowych glikacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykład znaczenia rozwoju sekwencji w kontekście efektu parasola. RAGE jest wysoko ekspresowanym markerem w komórkach AT1 i w połączeniu z CD31 skutecznie blokuje immunoreaktywność SARS-CoV-2. Jednak gdy najpierw wykona się IHC SARS-CoV-2, wszystkie sygnały można zwizualizować. Pręty skalowe = 25 μm. Skróty: RAGE = Receptor dla zaawansowanych produktów końcowych glikacji; AT1 = Typ pęcherzykowy 1; SARS-CoV-2 = koronawirus z ciężkim ostrym zespołem oddechowym 2; IHC = immunohistochemia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Przegląd procesu z wykorzystaniem zautomatyzowanego sprzętu barwiącego dla protokołu IBEX. Mokre montaże w drugiej rundzie lub dłużej procesu barwienia, aby zapobiec wysychaniu tkanki. Skrót: IBEX = Iteracyjne wybielanie rozszerza mnożność. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykład IBEX z barwnikami na bazie TSA z autostainera 2 na płucach zakażonych Mycobacterium tuberculosis. Panel 1 zawiera wszystkie barwniki, a panel 2 zawiera barwniki, które były podatne na wybielanie. Prezentowany jest połączony obraz wszystkich kanałów w pełnym IBEX obrazu płuc. Pręty skalowe = 200 μm. Skróty: IBEX = iteracyjne wybielanie rozszerza mnożność; TSA = wzmocnienie sygnału tyramidowego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Przykładowy protokół do walidacji wpływu liczby cyklu na przeciwciała w testach 1, 3 i 6 cykli. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przykładowy panel 1 z pięcioma przeciwciałami dla autostainera IBEX do walidacji panelowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Przykładowy panel 2 z czterema przeciwciałami dla autostainera IBEX do walidacji panelowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Porównanie dwóch autostainerów. Tabela podsumowująca zalety i wady Ventana Autostainer oraz Bond Rx. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Podsumowanie oprogramowania do analizy obrazów. Tabela podsumowująca niektóre podejścia analityczne i narzędzia programowe dostępne do analizy obrazów po segmentacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj rozważania dotyczące adaptacji protokołu IBEX do podstawowych placówek patologicznych z zastosowaniem zautomatyzowanego sprzętu barwiącego oraz optymalizacją odczynników opartych na TSA w protokole IBEX. Pokazujemy, jak najlepiej optymalizować powtarzające się rundy pobierania antygenów i prawidłowe ładowanie w drugiej rundzie lub wyższej na zautomatyzowanym sprzęcie. Ponadto demonstrujemy dodatkową metodę wyrównania z wykorzystaniem oprogramowania Halo, która może być dostępna w kluczowych obiektach. Te podejścia okazały się przydatne w określaniu różnic w środowisku płucnym w tkankach naczelnych nieludzkich po zakażeniach SARS-CoV-2⁵.

Kluczowym elementem tych prac jest podkreślenie potrzeby szeroko zakrojonej optymalizacji projektu panelu IBEX przed barwieniem tkanek eksperymentalnych. W szczególności, przy użyciu odczynników opartych na TSA, należy uwzględnić pewne kwestie, których nie występuje w podstawowych metodach IBEX. Pierwszy to wpływ wielu cykli pobierania antygenów na wrażliwość przeciwciał. W przypadku odczynników opartych na TSA każdy nowy rozwój przeciwciał poprzedza denaturacja przeciwciał. Niektóre pary przeciwciał/antygen są podatne na dodatkowe cykle pobierania antygenów i zmniejszają czułość testu, podczas gdy inne osiągną zwiększoną czułość przy powtarzającej się denaturacji/pobieraniu antygenów. Dokładne badanie każdego przeciwciała w tkance docelowej przed zaprojektowaniem paneli jest ważne, aby zapewnić najlepsze praktyki barwienia i ustalić kolejność zarówno przeciwciał, jak i barwników fluorescencjących. , w tym zarówno na bazie cytrynianu (pH 6,0), jak i Tris-EDTA (pH 9,0), są testowane pod kątem wszystkich przeciwciał, aby określić optymalne warunki pobierania antygenów. Polega to na systematycznej ocenie każdego buforu, aby zidentyfikować, który z nich maksymalizuje ekspozycję na antygeny dla danego przeciwciała. Dodatkowo temperatura (np. 20-37 °C), czas inkubacji (zazwyczaj 30-60 min) oraz warunki blokujące są optymalizowane, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienia tła i zapewnić specyficzne wiązanie przeciwciał pierwotnych i wtórnych, jeśli jest to konieczne. Blokowanie przed pojawieniem się przeciwciał pierwotnych i wtórnych może obejmować użycie komercyjnie dostępnych odczynników blokujących do uwzględnienia specyficznej tkankowej autofluorescencji lub interakcji niespecyficznych. Inne ważne kwestie, które należy zoptymalizować przed finalizacją paneli IBEX, to efekt parasola, gdzie osłona epitopów może wystąpić, jeśli kolejność nie jest dostosowana do konkretnego pytania badawczego⁶. Aby uniknąć przecieku fluorescencyjnego, typowe jest umieszczanie celów antygenowych o wyższej ekspresji w daleko czerwonych kanałach, które mają najmniejsze przepuszczenie i słabsze markery w zakresie 480-520 nm, co daje najlepszy stosunek sygnału do szumu, ponieważ te fluorescencyjne barwniki są^{najjaśniejszymi 7}. Jednak należy zwracać uwagę na próbki tkanek o silnej autofluorescencji, które mogą być najjaśniejsze w tym zakresie; Zalecamy rozwiązanie tego problemu poprzez obrazowanie tkanek bez barwników, aby złagodzić potencjalne poziomy autofluorescencji. Razem te kroki optymalizacji, realizowane zgodnie z normalną optymalizacją i kontrolą typowo wykonywaną w IBEX, mogą pomóc w właściwym projektowaniu paneli IBEX z odczynnikami TSA.

W tej metodzie zademonstrowaliśmy zastosowanie dwóch popularnych autostainerów. Jednak te metody można zastosować także do innych metod autostainera. Kluczową częścią jest optymalne usunięcie pokrywek i mokrego ładunku dla dodatkowych naboju do bejcowania. Dodatkowo nie określamy żadnego konkretnego zestawu mikroskopu. Chociaż zestawy mogą zalecać stosowanie niektórych systemów obrazowania do optymalnego skanowania szkiełkowego, każdy zestaw mikroskopu, szczególnie mikroskop epifluorescencyjny z kompatybilnymi kostkami filtrującymi i szerokospektralnym źródłem światła LED, powinien się sprawdzić. Niektóre barwniki wymagają detektorów wielospektralnych lub specjalistycznych kostek filtracyjnych, które mogą nie być dostępne we wszystkich laboratoriach i mogą stanowić wyzwania przy użyciu ze standardowymi kostkami filtracyjnymi ze względu na ich spektralne nakładanie się. Barwniki te lepiej rozdzielać za pomocą systemów obrazowania wielospektralnego lub bardzo specyficznych filtrów. Niektóre fluorofory wykraczają poza zakres konwencjonalnych filtrów dalekoczerwonej (zazwyczaj ~700 nm) i wymagają specjalistycznej kostki filtracyjnej lub detektora zdolnego do rejestrowania sygnałów bliskiej podczerwieni. Specjalistyczne mikroskopy są wyposażone w te filtry, ale dostępne są także alternatywy. Będą one wymagały dodatkowej optymalizacji, aby określić, jak barwniki działają w danej konfiguracji mikroskopu.

Wielospektralne rozmieszanie jest wysoce zalecane dla wielofluorescencyjnych IHC, szczególnie przy pracy z tkankami podatnymi na autofluorescencję, ponieważ skutecznie oddziela prawdziwy sygnał od szumu tła. Autofluorescencja, która często pokrywa się ze spektrami emisji powszechnie stosowanych fluoroforów (szczególnie w kanałach o wyższych długościach fal), może zaciemniać lub zakłócać konkretne sygnały, obniżając dokładność. Rozmieszanie widm matematycznie rozplątuje nakładające się widma emisyjne, izolując rzeczywiste sygnały fluorescencyjne i jednocześnie "oczyszczając" niechcianą autofluorescencję. Rozłączanie spektralne jest szczególnie cenne w procesach IBEX, gdzie osiągnięcie jak najczystszych sygnałów jest kluczowe ze względu na iteracyjny charakter procesu barwienia i obrazowania. W IBEX sygnały z wielu rund barwienia są obrazowane, wybielane i układane jeden na drugim, tworząc obraz złożony. Każda autofluorescencja lub przeciek, które pozostają nierozwiązane w jednej rundzie, mogą propagować się przez ułożone obrazy, co komplikuje dalszą analizę i zmniejsza pewność lokalizacji markerów. Spektralne rozmieszanie skutecznie izoluje prawdziwe sygnały fluorescencji od autofluorescencji tła, zapewniając czystszą i dokładniejszą detekcję sygnału w każdej rundzie indywidualnie. Ta klarowność sygnału jest niezbędna do generowania wiarygodnych obrazów kompozytowych, gdzie wiele markerów jest analizowanych razem w różnych rundach, umożliwiając pewne fenotypowanie i analizę przestrzenną. Platforma obrazowania używana w tym protokole posiada wbudowane możliwości rozłączania, ale potrzebne są dodatkowe opcje rozmieszania dla kompatybilności z innymi fluorescencyjnymi platformami obrazowania całych slajdów.

Dodatkowo ograniczeniem tej pracy jest własnościowy charakter autostainerów, ponieważ ich odczynniki i do mycia są zoptymalizowane pod kątem tych systemów, jednak dokładne formuły pozostają nieujawnione. Ponadto skupiliśmy się wyłącznie na jednym komercyjnie dostępnym oprogramowaniu do analizy obrazów całych slajdów i uznajemy, że koszt licencji może stanowić barierę finansową dla niektórych laboratoriów. Dodatkowe oprogramowanie analityczne ^8,9 oraz opcje w R wydają się obiecujące; w szczególności Bodenmiller Group¹⁰, która stworzyła zestaw pakietów optymalny dla rdzeni, ponieważ IMCDataAnalysis¹¹ jest przeznaczony do odtwarzalnego przepływu pracy przy multipleksowanej analizie obrazu w R. Jednak w przyszłości potrzebne są działania na rzecz opracowania i scharakteryzowania dostępnych i opłacalnych alternatyw dla analizy IBEX na całych slajdach, aby zapewnić szersze wdrożenie w środowiskach o ograniczonych zasobach. Ponadto to podejście z użyciem autostainerów do IBEX można dostosować do bardziej tradycyjnego barwienia w IBEX, w tym z fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami pierwotnymi lub ze standardowymi przeciwciałami wtórnymi bez barwników na bazie TSA, jeśli tkanka jest wystarczająco wysokiej jakości i ma optymalny czas utrwalenia, by umożliwić dobry sygnał.

Ogólnie mamy nadzieję, że te prace pomogą w zastosowaniu wielofluorescencyjnych IHC opartych na TSA, wykorzystujących rutynowo wykorzystywany sprzęt do patologii, aby szerzej dostosować IBEX do tych środowisk. Tego typu zastosowania naprawdę podkreślają wszechstronność protokołu IBEX i świadczą o jego przydatności nawet w trudnych próbkach tkanek lub w podejściach dużych partii.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Emily Speranza jest wspierana przez fundusze początkowe od Cleveland Clinic Foundation. Prace te wykorzystywały instrumenty pozyskane z grantów NIH SIG (S10OD026983 & S10OD030269 dla N.A.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestawy Alexa TSA < odczynnika do barwieniabr/>	ThermoFisher		Alternatywne barwniki TSA, jeśli filtry mikroskopii opalowej nie są dostępne. Należą do nich Alexa Fluor 488 (kanał niebieski/zielony), Alexa Fluor 555 lub 568 (kanał czerwony), Alexa Fluor 647 (kanał daleki czerwony), Alexa Fluor 750 (bliski podczerwień, jeśli wyposażony jest w odpowiednie filtry).
Przeciwciało Arg1	Sygnalizacja komórkowa	93668	Użyte na Rysunku 4 na 1:100
Materiał Ostrza	Leica Biosystems		Lub podobne, wysoki lub niski profil zależy od typu tkanki
Przeciwciało CD11b	Abcam	ab133357	Użyte na Rysunku 4 o 1:2000
Przeciwciała CD163	Abcam	ab182422	Użyte na rysunku 4 o 1:500
Przeciwciała CD31	Sygnalizacja komórkowa	77699S	Użyte na Rysunku 2 na 1:100
Przeciwciała CD3e	Dako	A045201-2	Użyte na Rysunku 1 na 1:100
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	Albo coś podobnego
Materiał Pokrywki	VWR	v48393-026	Albo coś podobnego
Przeciwciało CX3CR1	Abcam	ab308613	Użyte na rysunku 4 o 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Używany do pomiaru intensywności sygnału
Slide Suwaki Fisher Superfront	Fisher Scientific	22-037-246	Albo coś podobnego
Software HALO	Indica Labs		Przykładowe komercyjnie dostępne oprogramowanie do analizy obrazów. Używane do wyrównywania i analizy obrazów.
Przeciwciała Iba1	Sygnalizacja komórkowa	17191	Użyte na rysunku 4 o 1:800
Software inForm	Akoya		Używany do pomiaru intensywności sygnału
Przeciwciała iNOS	Abcam	ab283655	Użyte na rysunku 4 o 1:400
Instrument Leica Bond Rx (lub RXm)	Leica Biosystems	21.2201	W tekście określany jest jako "Autostainer 1". Upewnij się, że dostępne są wszystkie powiązane odczynniki, w tym pudełka do barwienia i roztwory masowe.
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Trzymać w środowisku bezwodnem
Instrument Mantra Snap	Akoya		Do wykrywania barwników potrzebny jest wielospektralny mikroskop mącznowy. Przykładowy mikroskop, który można używać do wykrywania barwników opalowych.
Narzędzie Microtome	Leica Biosystems		Albo podobne, z preferowanymi akcesoriami, takimi jak szczotki
Odczynnik do barwienia Opal IHC 480 Kit	Akoya	FP1500001KT	Użyte na Rysunku 4
Odczynnik do barwienia Opal IHC 6-plex Plex Kit	Akoya	NEL821001KT	520 i 620 nie wybielają, użyte na rysunkach 1, 2 i 4
Odczynnik do barwienia Opal IHC 780 Kit	Akoya	FP1501001KT	Użyte na Rysunku 4
Piekarnik narzędziowy	Millipore Sigma	Z683329	Lub podobne, można też zrobić na autostainerze
Przeciwciała Pancytokeratyna	Abcam	ab9377	Użyte na rysunku 4 o 1:50
Reagent PBS (opcjonalnie)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Wielospektralne obrazowanie całych slajdów z wbudowanym spektralnym rozdzielaniem spektralnym w oprogramowaniu
Odczynnik ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Albo podobne wodne nośniki montażowe
Przeciwciała ProSP-C n-terminalny (ProSPC)	Bioreagenty Siedmiu Wzgórz	WRAB-9337	Użyte na rysunku 4 z 1:250
Przeciwciała RAGE	R& D	MAB1179	Użyte na Rysunkach 1 i 2 w 1:50
Bufor reagent Reaction buffer	Roche	NC1895692	Do użycia z autostainerem Ventana
Przeciwciała SARS-CoV-2-N	Sygnalizacja komórkowa	68344	Użyte na rysunku 2 1:1000
Slajd TOMO Adhesion CC Mikroskopy Preparaty – WH	Avantik	SKUSL6519-1	Jeśli niepokoi się przyczepność tkanek
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		W tekście określany jako "Autostainer 2". Upewnij się, że dostępne są wszystkie powiązane odczynniki, w tym pudełka do barwienia i roztwory masowe.
Reagent Bufor do płukania	Leica Biosystems	AR9590	Do użycia z autostainerem Leica Bond
Odczynnik Woda	Fisher Scientific	15-230-147	DI jest najlepsze, nie miliporne
Kąpiel wodna Tool	Leica Biosystems	140607020C1	Albo coś podobnego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nature Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
Prichard, J. W. Overview of automated immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med. 138, 1578-1582 (2014).
Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, 46-58 (2014).
Speranza, E., et al. Age-related differences in immune dynamics during SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques. Life Sci Alliance. 5, 4(2022).
Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers (Basel). 12 (2), 255(2020).
Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the Basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
Feng, Y., et al. Spatial analysis with SPIAT and spaSim to characterize and simulate tissue microenvironments. Nat Commun. 14, 2697(2023).
Meyer, L., Eling, N., Bodenmiller, B. cytoviewer: an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of highly multiplexed imaging data. BMC Bioinformatics. 25, 9(2024).
Windhager, J., et al. An end-to-end workflow for multiplexed image processing and analysis. Nat Protoc. 18 (11), 3565-3613 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplexowe barwienie immunocytochemiczne amplifikacja sygna u tyramid automatyczne barwienie tkanka FFPE odzyskiwanie antygen w obrazowanie ca ych preparat w fenotypowanie kom rek projektowanie panelu

Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły