Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Podsumowanie

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Streszczenie

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neokorze, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronowej z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta polega na implantacji czaszkowego okna obrazującego, wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia, który może zostać pobrany przez dużą liczbę neuronów, a następnie zarejestrowaniu aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia w odstępach czasu przy użyciu mikroskopu dwufotonowego in-vivo. Współiniekcja barwników specyficznych dla astrocytów pozwala na odróżnienie neuronów od astrocytów. Technikę tę można przeprowadzić u myszy wykazujących ekspresję cząsteczek fluorescencyjnych w specyficznych subpopulacjach neuronów, aby lepiej zrozumieć interakcje sieciowe różnych grup komórek.

Protokół

1. Przygotować roztwór fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Stosujemy barwniki z estrem acetoksymetylowym, w skrócie barwniki AM. Są to barwniki, które mogą być pobierane przez komórki podczas wstrzykiwania pozakomórkowego. Zazwyczaj używamy Oregon-Green BAPTA-1 AM lub Fluo-4 AM w stężeniu 1 mM. Barwniki AM można nabyć od firmy Invitrogen w fiolkach o zawartości 50 µg. Najpierw przygotowujemy 20% roztwór Pluronic F-127 w DMSO. Roztwór ten podgrzewamy codziennie przed użyciem, aż stanie się klarowny. Rozpuszczamy wskaźnik wapnia w 20% Pluronic F-127/DMSO przez 15-20 minut do stężenia 10 mM. Następnie rozcieńczamy roztwór do 1 mM w roztworze zawierającym (w mM): 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, pH 7.4. Dodatkowo zazwyczaj dodaje się 100 µM Sulforhodamine 101 w celu znakowania astrocytów i wizualizacji pipety podczas wstrzykiwania. Przed wstrzyknięciem filtrujemy roztwór za pomocą wirówkowego filtra 0.49 µm (Stosiek et al., 2003; Garaschuk et al., 2006).
   
   
2. Zaimplantować okno czaszkowe nad obszarem poddanym obrazowaniu. Opisaliśmy ogólne podejście w JoVE, jednak następujące modyfikacje są istotne dla wstrzykiwania barwnika wapniowego:
   
   Wykonujemy mniejszą kraniotomię o średnicy 2 mm nad interesującym nas obszarem kory, zachowując szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej. Mocujemy szkiełko nakrywkowe nad kraniotomią, ale zakrywamy ją tylko częściowo, pozostawiając niewielką szczelinę między krawędzią kraniotomii a szkiełkiem, aby umożliwić ukośne wprowadzenie pipety do kory. Przed wstrzykiwaniem formujemy płytką studzienkę z cementu dentystycznego wokół kraniotomii. Studzienka powinna rozciągać się w kierunku rostralnym i być na tyle płytka, aby umożliwić wprowadzenie mikropipety do wstrzykiwania.
   
   
3. Przenieść mysz na stolik mikroskopu i unieruchomić głowę, zgodnie z instrukcjami w naszym filmie dotyczącym obrazowania przepływu krwi.
   
   
4. Wytworzyć szklane pipety mikroelektrod o średnicy końcówki zapewniającej rezystancję 2-4 Mega Ohm, używając wyciągarki do pipet. Napełnić szklaną pipetę mieszaniną barwnika wskaźnika wapnia za pomocą mikrosyringi. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie opuścić mikropipetę na powierzchnię mózgu, korzystając z obiektywu 4X, a następnie precyzyjnie ustawić ją pod obiektywem 40X. Wybrać odpowiednie miejsce wstrzyknięcia, tak aby nad nim znajdowało się mało lub żadnych naczyń krwionośnych, które mogłyby utrudniać obrazowanie. Przy użyciu mikroskopii dwufotonowej wizualizujemy końcówkę pipety i powoli wprowadzamy ją do kory na głębokość 200 µm poniżej opony twardej. Następnie wstrzykujemy mieszaninę barwnika pod ciśnieniem 10 PSI przez 1 minutę za pomocą Picospritzera. Zazwyczaj wykonujemy od dwóch do czterech wstrzyknięć mieszaniny barwnika wapniowego AM, oddalonych od siebie w przestrzeni o około 200-300 µm. To podejście polegające na masowym wprowadzaniu lekko nakładających się wstrzyknięć zapewnia odpowiednie zabarwienie obszaru o wielkości do 600 x 600 µm dla obrazowania wapnia. Obrazowanie rozpoczynamy 1 godzinę po wstrzyknięciu mieszaniny barwnika AM, aby umożliwić dyfuzję barwnika i jego pobranie przez neurony.
   
   
5. Przeprowadzić obrazowanie dwufotonowe in-vivo przy użyciu specjalnie zbudowanego mikroskopu dwufotonowego z laserem tytano-szafirowym Chameleon (dostrojonym do 800-880 nm) i lustrami galwanometrycznymi Cambridge Technology. Obrazy pozyskujemy przy użyciu oprogramowania ScanImage opracowanego w laboratorium Karela Svobody (Pologruto et al., 2003). Moc lasera w punkcie próbki wynosi zazwyczaj znacznie poniżej 70 mW. Obrazy całego pola pozyskiwane są przy użyciu obiektywów Olympus 20X (0.95 NA) lub 40X (0.8 NA), z prędkością 1.95-15.63 klatek na sekundę (od 512 x 256 pikseli do 256 x 64 pikseli). Skany liniowe są pozyskiwane z częstotliwością 500 Hz. Podczas obrazowania zwierzęta znajdują się pod lekką anestezją izofluranem (0.6-0.9%) i są utrzymywane w temperaturze 37°C przy użyciu urządzenia do kontroli temperatury Harvard Apparatus. Dbamy o to, aby częstość oddechów zwierząt była jak najbliższa 100 oddechom/minutę. Ten poziom anestezji jest najniższym poziomem, który unieruchamia zwierzę, ale wciąż pozwala na rejestrację aktywności spontanicznej.

Dyskusja

Przewagą tej metody nad rejestracją elektrofizjologiczną jest jej mniejsza inwazyjność oraz możliwość rejestrowania aktywności w gęstych sieciach neuronalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas kraniotomii, aby nie uszkodzić opony twardej. Nawet niewielka ilość krwawienia podtwardówkowego może znacznie pogorszyć jakość obrazowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oregon Green BAPTA1-AM	Odczynnik	Invitrogen	O-6807
Fluo 4- AM	Odczynnik	Invitrogen	F-14201
Sulforhodamine 101	Odczynnik	Invitrogen	S-359
Pluronic F-127 w DMSO	Odczynnik	Invitrogen	P-3000MP
Filtr wirowkowy (0.45 micron)	Odczynnik	EMD Millipore	UFC3 0HV 0S