Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neokorze, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronowej z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta polega na implantacji czaszkowego okna obrazującego, wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia, który może zostać pobrany przez dużą liczbę neuronów, a następnie zarejestrowaniu aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia w odstępach czasu przy użyciu mikroskopu dwufotonowego in-vivo. Współiniekcja barwników specyficznych dla astrocytów pozwala na odróżnienie neuronów od astrocytów. Technikę tę można przeprowadzić u myszy wykazujących ekspresję cząsteczek fluorescencyjnych w specyficznych subpopulacjach neuronów, aby lepiej zrozumieć interakcje sieciowe różnych grup komórek.
Protokół
- Przygotować roztwór fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Stosujemy barwniki z estrem acetoksymetylowym, w skrócie barwniki AM. Są to barwniki, które mogą być pobierane przez komórki podczas wstrzykiwania pozakomórkowego. Zazwyczaj używamy Oregon-Green BAPTA-1 AM lub Fluo-4 AM w stężeniu 1 mM. Barwniki AM można nabyć od firmy Invitrogen w fiolkach o zawartości 50 µg. Najpierw przygotowujemy 20% roztwór Pluronic F-127 w DMSO. Roztwór ten podgrzewamy codziennie przed użyciem, aż stanie się klarowny. Rozpuszczamy wskaźnik wapnia w 20% Pluronic F-127/DMSO przez 15-20 minut do stężenia 10 mM. Następnie rozcieńczamy roztwór do 1 mM w roztworze zawierającym (w mM): 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przewagą tej metody nad rejestracją elektrofizjologiczną jest jej mniejsza inwazyjność oraz możliwość rejestrowania aktywności w gęstych sieciach neuronalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas kraniotomii, aby nie uszkodzić opony twardej. Nawet niewielka ilość krwawienia podtwardówkowego może znacznie pogorszyć jakość obrazowania.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Oldze Garaschuk za pomocne dyskusje na temat optymalizacji masowego wprowadzania wskaźników wapnia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Odczynnik | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Odczynnik | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Odczynnik | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 w DMSO | Odczynnik | Invitrogen | P-3000MP | |
| Filtr wirowkowy (0.45 micron) | Odczynnik | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
Bibliografia
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
