Method Article

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/69095

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Washington State University, 2Department of Biosciences, Biotechnology and Environment, University of Bari Aldo Moro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednia obserwacja jest podstawową metodą odkryć naukowych i zrozumienia. Obrazowanie fluorescencji pojedynczej cząsteczki poklatkowej pozwala obserwować poszczególne białka w trakcie ich ruchu i interakcji z otoczeniem, czyniąc stany, które normalnie byłyby ukryte w pomiarach zbiorowych, widocznymi. Śledzenie pojedynczego białka jest szczególnie odpowiednie do badania białek błonowych, gdzie jego dwuwymiarowy charakter umożliwia szybkie, szerokokątne obrazowanie z czułością na pojedynczy fluorofor. Stosowanie sztucznych dwuwarstw lipidowych naśladujących błony, w których występują białka błon transbłonowych lub obwodowych (takie jak błony plazmatyczne lub błony organelli wewnątrzkomórkowych różnych typów komórek), umożliwia pomiar specyficznych interakcji w środowiskach bliskich naturalnym. Pozwala to także na stopniowe dodawanie złożoności, po jednym składniku, jednocześnie tłumiąc zakłócenia tła spowodowane fluorescencją i rozpraszaniem Ramana. Dodając kontrolę temperatury, możliwe staje się także określenie właściwości termodynamicznych oddziaływań pojedynczych cząstek. W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania próbek, zbierania danych, śledzenia fluorescencji pojedynczych cząsteczek oraz analizy trajektorii białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych z użyciem akwaporyny-4. Ta praca stanowi podstawowy przykład i może być dostosowana do różnych białek i składu dwuwarstwowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naturalnych warunkach biologicznych białka błonowe otaczają rozległą sieć interakcji, która obejmuje inne białka błonowe, białka w płynach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, różne rodzaje lipidów i cholesterolu, substraty lub ligandy, interakcje roztworów oraz interakcje między macierzami zewnątrzkomórkowymi a wewnątrzkomórkowymi. Klasyczne podejście biofizyczne do lepszego zrozumienia specyficznych i zbiorowych interakcji zaczyna się od jednego komponentu, stopniowo wprowadzając kolejne elementy, aż złożoność odzwierciedla rodzime środowisko – podejście "dziel i rządź" w biofizyce. Nowoczesną metodą molekularną badania tych interakcji jest bezpośrednia obserwacja z wykorzystaniem poklatkowego obrazowania fluorescencyjnego pojedynczej cząsteczki, śledzącej poszczególne białka podczas ich ruchu i interakcji ze środowiskiem. W niniejszym artykule opisujemy podstawowe etapy tego podejścia, w tym tworzenie dwuwarstw lipidowych na kwarcowych pokrywkach oraz wprowadzenie dużego białka błonowego do tych gotowych dwuwarstw w sposób odpowiedni do obrazowania pojedynczego białka. Następnie zostanie wprowadzony protokół "roboczy" do śledzenia pojedynczych białek w wspieranych dwuwarstwach.

Ten artykuł opisuje, jak tworzyć dwuwarstwy lipidowe wspierane w stałych elementach za pomocą małych pęcherzyków jednoilamelarnych (SUV), które pękają na hydrofilowych pokrywach kwarcowych. Powierzchnie kwarcu są przygotowywane poprzez mycie kwasowe lub ultrafioletowe (UV) oczyszczanie ozonem. Lipid używany do tworzenia SUV-ów powinien, jeśli to możliwe, odpowiadać głównemu składowi chemicznemu interesującej się błony biologicznej (np. akwaporynę-4 (AQP4) występuje w błonie plazmatycznej astrocytatów, a głównymi składnikami są POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), cholesterol (30%), PI (2,5%) oraz SM (5,6%))1,2). Aby zapobiec interakcji z podłożem stałym, dodatki takie jak glikol polietylenowy (PEG) szczepiony do lipidu unoszą dwuwarstwę z powierzchni 3,4. Ilość każdego dodatku musi być starannie regulowana, aby dyfuzja białek nie była blokowana, a jednocześnie zapewnić wystarczające wsparcie do podniesienia błony z powierzchni podłoża. Dodatki, takie jak lipidy PEGylowane, zazwyczaj wykazują dwie fazy: "fazę szczotkowania" i "fazę grzyba". Faza szczotki zachodzi, gdy PEG jest w wysokim stężeniu, powodując, że polimer stoi pionowo, zmniejszając przeszkody steryczne. Faza grzybowa występuje w niskich stężeniach, gdy polimery są wystarczająco rozdzielone, by mogły istnieć jako przypadkowe spirale. Ogólnie faza szczotki utrudnia dyfuzję, ale faza grzyba zapewnia niewielkie wsparcie. Stężenie między fazą szczotki a grzyba jest optymalne, zapewniając wsparcie przy minimalnym wpływie na dyfuzję 3,4.

Niektóre białka błonowe samoistnie wchodzą do błon lipidowych wspieranych przez stałe, takie jak P450 i reduktaza cytochromu P4505, podczas gdy inne trzeba wprowadzać za pomocą detergentów, co jest delikatnym procesem. Konieczne jest staranne pranie, aby usunąć te detergenty oraz wszelkie niewchłonięte białka, które mogą zakłócać śledzenie pojedynczego białka – proces ten zostanie szczegółowo opisany. Głównym tematem tego artykułu jest przygotowanie próbki do śledzenia pojedynczych cząsteczek (SMT) za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w powrocie czasowym. Wymaga to obiektywu o dużym powiększeniu i aperturze numerycznej (NA) – zazwyczaj obiektywu immersyjnego oleju 100x i 1,45 NA 6,7. Wymaga także szybkiej, bardzo czułej kamery (EMCCD, CMOS lub ICCD) oraz wzbudzenia laserowego. Wzbudzenie laserowe musi obejmować wystarczająco duże pole widzenia, aby mierzyć długie trajektorie białek, co często osiąga się za pomocą całkowitego odbicia wewnętrznego do utworzenia pola unikającego o wymiarach około 50 μm x 100 μm lub oświetlenia epi-illuminacji z optyczną wiązką kształtującą wiązkę (od Gaussa do cylindra) około 80 μm x 80 μm8 lub wysoko pochyloną i laminowaną płytę optyczną (HILO) z polem podobnym do TIRF. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF) ma tę zaletę, że zmniejsza sygnał tła. Poniżej przedstawiono prosty, stosunkowo niedrogi projekt mikroskopu TIRF. Dodając kontrolę temperatury, można zmierzyć kilka właściwości termodynamicznych, takich jak entalpia, entropia oraz energia swobodna Gibbsa9. Technika ta wymaga również znakowania fluorescencyjnego białka błonowego na poziomie znakowania, który zapewnia, że większość białek błonowych nosi znacznik fluorescencyjny.

Białkiem transbłonowym, którym interesuje się ten artykuł, jest AQP4. AQP4 to kanał wodny spolaryzowany w końcach stóp astrocytatów oraz innych obszarach naczyń ośrodkowego układu nerwowego10. Może transportować do 3 miliardów cząsteczek wody na sekundę i bierze udział w homeostazie wody, migracji komórek, obrzęku mózgu, uczeniu się i formowaniu pamięci dzięki plastyczności synaptycznej11. Zaburzenia funkcjonowania AQP4 zostały powiązane z różnymi schorzeniami neurologicznymi, w tym obrzękiem mózgu, neuromielitis optica oraz padaczką 12,13,14,15. AQP4 to białko o masie 32-37 kD, w zależności od izoformy, posiada tetramerową strukturę czwartorzędową z ośmioma hydrofobowymi domenami błonowymi połączonymi pętlami, wewnątrzkomórkową domeną N-terminalną oraz dużą wewnątrzkomórkową domeną C-terminalną16. Istnieją dwie główne izoformy AQP4, M1 i M23; Różnica wynika z inicjacji na resztie metioniny 1 lub na resztie metioniny 23. Badania wykazały, że izoforma M1 może tworzyć dyady lub triady ze sobą, w zależności od stanu palmitoylacji9. Izoforma M23 łączy się w duże agregaty białkowe zwane Ortogonalnymi Układami Cząstek (OAP). W przypadku współekspresji izoforma M1 ogranicza wzrost OAP, tworząc obwodową powłokę białkową wokół swojej zewnętrznej powierzchni 17,18,19. Dynamika agregacji OAP może być kluczowym czynnikiem modulującym przepuszczalność wody i homeostazę w mózgu. W tym artykule opisujemy niezbędne kroki do śledzenia pojedynczych AQP4 w błonie oraz obserwowania interakcji pojedynczych białek z białkiem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie małych pęcherzyków unilamellarnych

  1. Wyjmij roztwory lipidowe z zamrażarki i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową.
  2. Wyjmij czystą kolbę 10 ml z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
  3. Do chłodnej kolby o okrągłym dnie dodaj 900 μL chloroformu o jakości spektroskopowej oraz 100 μL metanolu o jakości spektroskopowej, a następnie do mieszanki dodaj odpowiednie ilości każdego lipidu. Zamieszaj kolbę, aby lipidy dobrze się wymieszały.
    UWAGA: Inni autorzy stosują różne proporcje chloroformu do metanolu, ale my stwierdziliśmy, że najlepszy stosunek do tworzenia jednolitych ciast lipidowych wynosił 9:1.
    Arkusz kalkulacyjny do obliczania prawidłowych ilości lipidów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1. Jeśli przygotowujesz lipidy do weryfikacji powstawania dwuwarstwy lipidowej na powierzchni podłoża, użyj lipidu znakowanego fluorescencjonie.
  4. Umieść złącze destylacji próżniowej na górze kolby o okrągłym dnie, jak pokazano na Rysunku 1, i podłącz je do linii azotowej (urządzenia suszące).
    UWAGA: Użyj oczyszczonego N2(g) i przepuścić go przez filtr 0,22 μm przed podłączeniem do urządzenia suszącego.
  5. Włącz N2(g) i dostosuj ciśnienie tak, aby przepływ był taki, że ledwo odczuwalny jest na grzbiecie dłoni.
    UWAGA: Zwilżenie grzbietu dłoni może pomóc wyczuć parowanie.
  6. Pozwól próbce wyschnąć pod przepływem N2(g) przez 2,5-3 godziny, okresowo sprawdzając, czy azot nadal płynie. Próbka prawdopodobnie będzie wyglądać na suchą w ciągu pierwszych trzydziestu minut; jednak kontynuować przepływ azotu przez dodatkowe 2-2,5 godziny, aby usunąć pozostałe rozpuszczalniki.
    UWAGA: Próbkę można również suszyć przez noc.
  7. Dodaj 1 ml buforu na każde 5,0 μmol całkowitej ilości lipidów do kolby o okrągłym dnie.
    UWAGA: Bufor użyty w tym badaniu składał się ze 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 oraz 140 mM NaCl; jest to ten sam bufor, który jest używany podczas przygotowania próbki.
  8. Przyłóż korek szklany na kolbkę i owiń ją folią parafinową.
  9. Umieść kolbę w zacisku na stojaku pierścieniowym i zanurz jej dno w kąpieli sonikatora ustawionego na 60 °C. Pozostawij kolbę do inkubacji przez 1 godzinę, delikatnie mieszając co 15 minut, tworząc wielolamelowe liposomy, które wyglądają jako nieprzezroczysty roztwór bez lipidów przyczepionych do piersiów.
  10. Po 1-godzinnej inkubacji włącz soniator (~35 kHz) i ustaw amplitudę na najwyższe ustawienie. Następnie przesuwaj kolbę w wannie, aby znaleźć miejsce, gdzie występuje największe mieszanie, tak aby roztwór uderzał i rozpryskiwał wnętrze kolby. Sonikuj przez 30 minut, szukając zmiany z nieprzezroczystej na przezroczystą i lekko opalescentyjną.
  11. Wyjmij roztwór lipidowy z kolby i umieść go w rurce mikrowirówki, następnie wiruj w 100 000 × g przez godzinę w 4 °C. Usuń supernatant z rurki mikrowirówki.
    UWAGA: Na dnie rurki może pojawić się mały pellet. Jeśli granulka jest duża, wyrzuć ją i powtórz proces.
  12. Używaj SUV-ów po wirówce, przechowuj je w temperaturze 4 °C przez tydzień lub utrzymuj w temperaturze -80 °C z odrobiną trehalozy.
    UWAGA: Zalecana dawka trehalozy to 1 mg na ml roztworu lipidowego. Dla optymalnych rezultatów nowe SUV-y można produkować co tydzień i przechowywać w lodówce.
    UWAGA: To tylko jedna z metod przygotowania SUV-ów. Oprócz SUV-ów, małe, średnie i duże pęcherzyki jednoilamelarne mogą być wytwarzane za pomocą wytłaczania lub olbrzymich liposomów unilamellarnych poprzez elektroformację 20,21,22,23.

2. Znakowanie białek

UWAGA: Znakowanie białek fluorescencyjnymi sondami za pomocą różnych sprzężonych substancji, takich jak estery NHS i maleimidy, jest dobrze udokumentowane i dobrze zrozumiane. Jednak stopień znakowania (DOL) jest szczególnie istotny w śledzeniu pojedynczego białka. W tym badaniu kluczowe było określenie, jaki procent białek transbłonowych został oznakowany oraz jaki jest rozkład fluoroforów na każdym tetramerze AQP4.

  1. Umieść sondę dializyjną w zlewce zawierającej bufor fosforanowy 0,1 M o pH 8,3, który został przepuszczony przez filtr 0,22 μm. Następnie pozostawić ją na noc w buforze w pozycji odwróconej, pozwalając membranie się ukształtować.
  2. Następnego dnia wymień bufor wewnątrz sondy dializacyjnej roztworem białkowym.
    UWAGA: Objętość roztworu białkowego powinna mieścić się w granicach 20-250 μL. W roztworze powinno być ~1-5 mg rozpuszczonego białka.
  3. Po umieszczeniu białka w sondzie dializyjnej pozostaw je odwrócone przez noc w buforze fosforanowym 0,1 M.
  4. Po dializach przenieś białko do rurki mikrowirówki.
  5. Przygotuj nową sondę dializującą, powtarzając krok 2.1.
  6. Przygotuj barwnik NHS, umieszczając kilka ziaren (3-4) na małym kawałku papieru wagowego, następnie przelać je do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i rozpuścić w 100 μL DSMO. Następnie stosuje się dwie 1 mL 10-krotne rozcieńczenia w DMSO, wykorzystując końcowe rozcieńczenie do określenia stężeń każdej próbki za pomocą spektroskopii UV-vis. Aby uzyskać średni DOL 2-3, dodaj trzykrotny nadmiar molowy barwnika reaktywnego do roztworu białkowego, delikatnie potrząsając.
    UWAGA: Standardowy spektrometr UV-vis wystarczy do tego celu, choć spektrometr o małej objętości jest korzystny ze względu na rozmiar próbki.
  7. Dodaj reaktywny barwnik do rurki mikrowirówki zawierającej białko w równych objętościach. Gdy barwnik reaktywny i białko zostaną połączone, nutuj przez co najmniej 8 godzin.
  8. Po nutacji przenieś oznakowane białko do sondy dializacyjnej przygotowanej w kroku 2.5 i umieść je w zlewce zawierającej świeży bufor fosforanowy. Włóż do bufora mieszankę i pozwól delikatnie kręcić przez 6 godzin, następnie zamienię bufora i kolejne 6 godzin dializy.
  9. Po dwóch wymianach umieszczaj sondę dializującą z oznakowanym białkiem w czystej zlewce zawierającej ostatni bufor roboczy.
    UWAGA: Ostateczny bufor roboczy użyty w tym badaniu składał się ze 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 oraz 140 mM NaCl przy pH 7,4.
  10. Po dializach zmierz DOL za pomocą spektrometru UV-vis.
    UWAGA: Ważne jest, aby stosować standardowe metody pomiaru DOL. Poniżej znajduje się równanie do obliczeń.
    figure-protocol-1(1)
    Gdzie absorpcja mierzona na szczycie barwnika wynosi , figure-protocol-2 a pik białka na 280 nm wynosi . figure-protocol-3 Współczynnik wymierania białka to figure-protocol-4 (obliczany na podstawie masy cząsteczkowej białka), natomiast figure-protocol-5 oraz figure-protocol-6 są dostarczane przez producenta barwnika.

3. Przygotowanie kryjów kwarcowych o średnicy 25 mm

UWAGA: Poniżej przedstawiono dwie różne metody:

  1. Wash kwasowy
    UWAGA: Opublikowano kilka procedur płukania kwasem, w tym piranie i trawienie bazowe. Stwierdziliśmy, że poniższa procedura zapewnia niezwykle czystą i hydrofilową powierzchnię bez trawienia, co jest korzystne w badaniach pojedynczych cząsteczek z użyciem obrazowania fluorescencyjnego.
    1. Metoda Acid Wash wymaga okapu do parowania podczas podgrzewania roztworu oraz środków ochrony osobistej (gogle, fartuch laboratoryjny, rękawiczki). W okapie powinna być dostępna butelka z wodorowęglanem sodu na wypadek rozlania.
    2. Umieść pokrywy w zlewce i napełnij nanoczystą wodą, nadtlenkiem wodoru 30% oraz skoncentrowanym kwasem azotowym w równych częściach objętościowej (roztwór 1:1:1).
    3. Podgrzewaj pokrywki w tym roztworze przez 30 minut, aż roztwór zacznie się bąbelkować.
    4. Sprawdź roztwór i wymieszaj, delikatnie mieszając co 10 minut, aby pokrywki nie przyklejały się do siebie. Podczas mieszania roztworu obserwuj, jak ślizgi się rozsuwają, a następnie rozdzielają. Gdy są rozdzielone, stopniowo zwalniaj, aby je rozdzielić, pozwalając bulgoczącemu roztworowi otulić slipy.
      UWAGA: Roztwór nie powinien być podgrzewany zbyt intensywnie, ponieważ reakcja wytwarza ciepło. Ustawij płytę grzewczą na delikatne bulgotanie, zwykle na najniższym poziomie. Przy tych ustawieniach roztwór pozostaje w temperaturze ~70 °C. Zaleca się również stosowanie świeżego nadtlenku wodoru.
    5. Po upływie 30 minut lub przestanie się bulgotać roztwór, pozwól roztworowi 1:1:1 ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie dokładnie przepłucz pokrywy oczyszczoną wodą, delikatnie mieszając się w powietrzu.
  2. Ozon UV
    1. Oczyść pokrywy kwarcowe n-heksanem, a następnie metanolem, używając chusteczek soczewek.
    2. Umieść pokrywy w środku do czyszczenia ozonu UV, tak że powierzchnia do obróbki jest skierowana do lampy.
    3. Przepływ tlenu do komory pod ciśnieniem 5 psi przez 5 minut; Następnie wyłącz dopływ tlenu.
    4. Następnie włącz światła UV na 15 minut i pozwól pokrywkom leżeć co najmniej 10 minut, aby ozonowi się wydostać.
    5. Po użyciu którejkolwiek z metod czyszczenia koniecznie użyj czyszczonych pokrywek od razu. Jeśli używasz wcześniej wyczyszczonych slipów, powtórz ten proces, aby zregenerować powierzchnię.
      UWAGA: Ozonowanie UV wymaga stałej cyrkulacji, aby usunąć ozon z powietrza. System powinien być umieszczony pod rurką do klimatyzacji lub w okapie spalinowym.

4. Tworzenie dwuwarstwowego i włączenie AQP4 do błony dwuwarstwowej

UWAGA: Bufor użyty w tym badaniu składał się ze 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 oraz 140 mM NaCl przy pH 7,4.

  1. Umieść świeżo wyczyszczoną pokrywkę w uchwytie na próbkę o średnicy 25 mm, używając 1/4-calowej tuby soczewki SM1. Następnie wytnij dwuwarstwową uszczelkę parafilmową o średnicy 8 mm i umieść ją na środku uchwytu próbki (patrz Rysunek 3).
  2. Nałóż kroplę 50 μL SUV-ów na środek uszczelki o średnicy 8 mm, uszczelnij ją, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    UWAGA: Pozwala to liposomom na fuzję z powierzchnią kwarcu hydrofilowego i pęknięcie, tworząc ciągłą dwuwarstwę.
    Najprawdopodobniej ilość liposomów dodanych do powierzchni uszczelki może się różnić, a większa uszczelka może wymagać większej liczby liposomów, aby utworzyć ciągłą dwuwarstwę. Jednak ilości określone w kroku 4.2 niemal zawsze sprzyjają powstawaniu ciągłej dwuwarstwy.
  3. Po inkubacji przepłucz próbkę pipetą w celu usunięcia roztworu. Następnie dodaj 50 μL świeżego buforu do dwuwarstwy. Następnie powtórz ten proces łącznie 10 razy.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby końcówka pipety nie dotykała dwuwarstwy lipidowej i aby pozostała jakaś ilość roztworu, która utrzymuje dwuwarstwę nawilżoną. Gdy doprowadzasz końcówkę do szczytu kropli, zobaczysz, że nawiązuje kontakt. Możesz usunąć roztwór bez uszkodzenia dwuwarstwy, utrzymując minimalny kontakt z powierzchnią kropli. W końcu kropla się odwróci i spłynie w stronę uszczelki; To idealny moment, by przestać usuwać roztwór. Światło odbite powinno się zmieniać w tym momencie i może służyć jako sygnał do zatrzymania. Jeśli obawiasz się usunięcia zbyt dużej ilości roztworu, obniż ustawienie pipety podczas mycia, aby zostawić odpowiednią ilość buforu nad dwuwarstwą lipidową.
    Integralność powstawania dwuwarstwy lipidowej w tych warunkach można ocenić z wyprzedzeniem, korzystając z odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Wymaga to posiadania składnika w mieszance lipidowej oznaczonej fluorescencją 6,7,24,25.
  4. Po zakończeniu ostatniego mycia ponownie usuń bufor i dodaj 50 μL aliquoty pożądanego białka do detergentu przy lub poniżej jego krytycznego stężenia micelarnego. Pozwól co najmniej godzinę włączenia białka w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Detergent delikatnie zmiękczy dwuwarstwę i pomoże białkowi wchłonąć się w błonę. W tym protokole detergentem było 50 μM n-Dodecyl-beta-D-tiomaltozyd (DOTM), detergent niejonowy, a stężenie białka wynosiło 2 nM.
  5. Po godzinie przepłukaj próbkę buforem, aby usunąć niewobecnione białko i detergent.
  6. Dodaj do próbki 5 mg kulek polistyrenowych (Bio-kulek), pozostaw na minimum 1 godzinę przed usunięciem. Próbka jest następnie gotowa do obrazowania (patrz niżej).

5. Dodatek antyfadowy

  1. Rozpuścić 5 mg Trolox i 80 mg D-glukozy w 10 ml buforu (patrz wyżej). Potrząśnij i zacznij wirować, aż nie zostaną żadne stałe składniki. Nutuj przez noc w ciemności, a następnie przefiltruj roztwór przez filtr o średnicy 0,22 μm. Przygotowuj świeżo co tydzień.
  2. Rozpuścić 6,5 mg oksydazy glukozy (1650 U) i 8 μL katalazy (29 200 U/mL w buforze) w 92 μL buforu. Wymieszaj roztwór delikatnie, bez wirowania, następnie wiruj i przelej supernatant do nowej rurki. Przechowuj w temperaturze 4 °C i chroń przed światłem.
    UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w lodówce przez kilka miesięcy; Jednak jeśli pojawi się mętność, usuń ją i przygotuj świeży roztwór.
  3. Wymieszaj 99 μL roztworu z 5,1 z 1 μL z kroku 5,2 do nowej probówki. Po ostatecznym płukaniu próbki dodaj na nią roztwór antyfady (zwany roztworem obrazującym).
    UWAGA: Roztwory antyfady mogą zmieniać funkcje białek transbłonowych; Ważne jest, aby zweryfikować kompatybilność z systemem.

6. Ustawienia i ustawienia mikroskopu

UWAGA: Do tego badania pojedyncząsteczkowego użyto niestandardowego mikroskopu TIRF. Ta sekcja opisuje główne komponenty oraz kluczowe techniki wyrównania dla podstawowego mikroskopu fluorescencyjnego odpowiedniego do szybkiego obrazowania poklatkowego (Rysunek 4), który jest niezawodnym instrumentem.

  1. Użyj lasera He:Ne o średnicy 633 nm, aby wzbudzić próbki. Laser przechodzi przez filtr pasmowy i płytę falową 1/4, aby udoskonalić linię lasera i przekształcić wzbudzenie z światła liniowo spolaryzowanego na światło spolaryzowane kołowo.
    UWAGA: Polaryzacja kołowa zmniejsza wpływ orientacji sondy.
  2. Wiązka przechodzi przez soczewkę 300 mm i filtr liniowy laserowy 633 nm, odbija się od lustra dichroicznego o długości 633 nm i jest skupiona na tylnej części obiektywu mikroskopowego olejowego o średnicy 100x, 1,45 N/A. Wyrównaj belkę tak, aby płynnie przechodziła przez środek obiektywu i pozostawała prosta podczas wyjścia z obiektywu.
    UWAGA: W tym momencie mikroskop jest skonfigurowany do epifluorescencji (epina). Do kiwety z przezroczystym dnem można dodać niewielką ilość mleka w proszku. Następnie kiweta jest umieszczana na obiektywie mikroskopu z kroplą oleju immersyjnego pomiędzy nimi. Pozwala to zauważyć, że wiązka przechodzi prosto przez obiekt.
  3. Emisja z białek oznaczonych fluorescencją przechodzi przez obiektyw, lustro dichroiczne, filtr długprzepustowy oraz obiektyw 300 mm, a następnie jest obrazowana na kamerze EMCCD. Używaj soczewek rurowych o dłuższej ogniskowej do powiększania obrazów na aparacie i poprawy dokładności superlokalizacji, co jest korzystne dla wolno poruszających się białek i agregatów transbłonowych. Upewnij się, że skalibrujesz piksele aparatu do nanometrów.
    UWAGA: Jednak powiększenie 1x osiąga się za pomocą soczewki tubowej zalecanej przez producenta obiektywu, która zwiększa stosunek sygnału do szumu poprzez skupienie fluorescencji na mniejszej liczbie pikseli. Typowe ogniskowe to obiektywy 200 mm, 180 mm, 165 mm i 164,5 mm. Zalecamy użycie celu powiększenia USAF z 1951 roku. Używając obiektywu 300 mm w tym układzie, kalibracja pikseli na 74 nm została zmierzona przy całkowitym powiększeniu 170x.
  4. Kontroluj temperaturę próbki za pomocą kołnierza obiektywu oraz uchwytu na próbkę wyposażonego w grzejnik/chłodzenie Peltiera26.
    UWAGA: Utrzymanie stabilnej temperatury jest kluczowe dla zapewnienia stabilności termicznej mikroskopu oraz umożliwienia dokładnych pomiarów zależnych od temperatury i ostrości instrumentów.
  5. Siłowniki piezo-piezo-przesuwają próbkę w kierunku XYZ. Gdy próbka jest ostra, dostosuj wiązkę do krawędzi obiektywu mikroskopowego (patrz Rysunek 4) za pomocą stołu przymocowanego do końcowego lustra obrotowego, aż osiągniesz krytyczny kąt. Generuje to pole wzbudzenia unikającego. Mikroskop jest teraz ustawiony w TIRF.
    UWAGA: Można określić, że mikroskop jest w trybie TIRF, gdy odbijanie od lasera jest linią (a nie plamką), a tło próbki maleje i wydłuża się.

7. Zbieranie danych

UWAGA: Kamera musi być skonfigurowana do szybkiego zbierania danych.

  1. Ustaw pionową prędkość przesunięcia pikseli na około 600 ns i podkręć pionowe napięcie zegara (zazwyczaj +4). Następnie ustaw poziomy odczyt pikseli na jego maksymalne ustawienie (30 MHz przy 16-bitowym w tym przykładzie). Ustawij wzmocnienie przedwzmacniacza na 2 i skonfiguruj wyjście wzmacniacza do mnożenia elektronów. Na koniec ustaw wzmocnienie mnożnika elektronów na najwyższy poziom.
  2. Ustaw ekspozycję na 25 ms. Przy ekspozycji 25 ms zadbaj o nieco dłuższą liczbę klatek (25,802 ms na aparacie używanej tutaj).
  3. Reguluj moc lasera tak, aby sygnał był wyraźnie nad tłem.
    UWAGA: Regulacja mocy lasera może być wyzwaniem. Za wysoko i sonda wybiela zbyt szybko; zbyt niski, a stosunek sygnału do szumu utrudnia śledzenie. Zalecamy ustawienie mocy tak, aby sygnał przewyższał tło 3-5 razy dla cząstek o najsłabszym sygnalecie. Sekcja 2 wyjaśnia, dlaczego jasność cząsteczkowa wykazuje rozkład.
  4. Zbieraj wystarczająco dużo danych, aby zapewnić co najmniej 1000 śladów na próbkę.

8. Analiza śledzenia

UWAGA: W naszych laboratoriach analiza śledzenia pojedynczych cząstek jest zazwyczaj przeprowadzana za pomocą niestandardowych skryptów w MATLAB, opartych na pracach Crockera i Griera, zmodyfikowanych przez autorów 3,26,27. Poniżej znajduje się opis za pomocą ImageJ, bezpłatnego oprogramowania dla społeczności badawczej. Obie metody dają identyczne rezultaty.

  1. Przytnij zestawy danych do jednolitego rozmiaru, a następnie koryguj tło za pomocą ImageJ.
    UWAGA: Jeśli zebrane dane są takie same między zestawami, nie ma potrzeby kadrowania. Zazwyczaj dzieje się to tylko wtedy, gdy obszar zainteresowania na sensorze kamery przesunął się między zebraniami danych. Możliwości ImageJ można znacznie rozszerzyć za pomocą wtyczek. Jedną z opcji jest instalacja i używanie FIJI, czyli ImageJ dołączonego do zestawu standardowych wtyczek. Wśród tych wtyczek jest TrackMate, który będzie używany dla protokołu tutaj28,29.
    Strona ImageJ Wiki oferuje poradniki i przykłady wielu wtyczek. Zawiera także wideotutoriale.
  2. W FIJI przeciągnij i upuść film lub plik *.tif do analizy (patrz Plik Uzupełniający 2).
  3. Wprowadź szczegóły kalibracji pikseli. W zakładce Analizuj wybierz Ustaw skalę i zastosuj kalibrację piksel do odległości dla instrumentu.
  4. Zapisz kopię, aby śledzić wszelkie zmiany względem oryginału.
  5. Odejmij tło od wybranego okna i zastosuj je do zapisanej kopii oryginalnych danych. W zakładce Proces wybierz Odbierz tło.
    UWAGA: Zostanie to zoptymalizowane na podstawie danych. Dobrym punktem wyjścia jest użycie "toczącej się kuli", która jest większa niż obrazowane cząstki.
  6. W zakładce Wtyczki wybierz Śledzenie | TrackMate. Otwiera to okno dialogowe TrackMate , które prowadzi użytkownika przez proces śledzenia.
    UWAGA: Po zakończeniu śledzenia możliwe jest eksportowanie ścieżek do dalszej analizy poza ImageJ.

9. Przetwarzanie danych

UWAGA: Omówiono tutaj, jak przetwarzać reprezentatywne dane oraz obliczać rozkłady wielkości kroku, aby uzyskać średnią stałą dyfuzji.

  1. Przeciągnij i upuść stos obrazów do FIJI; Następnie zastosuj kalibrację (74 nm/piksel).
  2. Odejmij tło za pomocą odejmowania kuli toczącej się o szerokości 5 pikseli. Przytnij pole do czterech oddzielnych sekcji o wymiarach 11 μm x 11 μm i analizuj osobno.
    UWAGA: Ma to na celu zminimalizowanie wariancji progowej spowodowanej polem wzbudzającym podczas śledzenia białek błonowych.
  3. Uruchom wtyczkę TrackMate. Sprawdź, czy kalibracja została zastosowana do pikseli (patrz Plik Uzupełniający 3) i że czas pokrywa pożądany zakres.
    1. W TrackMate wybierz Laplacian Gaussian (LoG) jako metodę detekcji dla cząstek, o szacowanej średnicy 350 nm przy użyciu filtra przedprocesowego. Kliknij przycisk Podgląd, aby zweryfikować, czy wykryte cząstki są rozsądne.
      UWAGA: Niektóre cząstki mogą wyraźnie znajdować się w tle; Nie martw się o te – zostaną wyeliminowane w kolejnym etapie.
    2. Gdy zadowolisz się z ustawieniami liczenia, przetworz resztę stosu, a następnie przekonuje progowanie. Użyj automatycznego progowania lub przeciągnij pole wyboru, aby dostosować próg.
    3. Po wybraniu sposobu wizualizacji wykrytych cząstek wybierz metodę śledzenia: Advanced Kalman Tracker dla tego zbioru danych, z następującymi ustawieniami: 350 nm dla promieni wyszukiwania i maksymalną przerwą klatki 2 klatki.
      UWAGA: Możliwe jest również dodanie kar, podziału torów oraz łączenia się z torami. Dla tego zbioru danych wykonywano jedynie śledzenie.
    4. Zdecyduj, jak filtrować i wizualizować utwory.
      UWAGA: W tym zbiorze danych wyświetlane są tylko wykryte plamy (patrz Plik Uzupełniający 4).
    5. Po przetworzeniu poszczególnych ścieżek eksportuj dane śledzenia jako plik XML do użycia w oprogramowaniu do edycji arkuszy kalkulacyjnych (patrz Plik Uzupełniający 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w sekcji 2 protokołu, lizyny oznaczano za pomocą esterów NHS sprzężonych z fluorescencyjną cząsteczką barwnika (barwnik NHS). Po sprzężeniu z białkiem zmierz DOL spektrometrem UV-Vis. W tym eksperymencie DOL tetramerów AQP4 wynosił 4,12. Następnie określ prawdopodobieństwo, że każdy tetramer AQP4 będzie zawierał co najmniej jedną cząsteczkę barwnika, stosując rozkład Poissona podany poniżej.

figure-results-1(2)

Gdzie P to prawdopodobieństwo, że każdy AQP4 jest oznaczony, według równania 2, prawdopodobieństwo, że każdy tetramer AQP4 ma przymocowaną etykietę fluorescencyjną, wynosi 98%. Rozkład etykiet na tetramery przedstawiono na Rysunku 2 i odzwierciedla rozkład jasności zaobserwowany w próbce.

Stosunek sygnału do szumu osiągnięty w tym przykładzie danych wynosił 8-9 razy więcej niż tło dla pojedynczego fluoroforu i powyżej 15-20 dla najjaśniejszych cząstek. Ta wariancja wynika z pozycji wiązki wzbudzającej oraz DOL opisanej w kroku protokołu 2.

W wygenerowanym pliku XML interesujące kolumny to J, K, L i M, które odpowiadają identyfikatorowi numeru cząstki, ramce, w której wykryta była cząstka, pozycji X cząstki oraz pozycji Y cząstki odpowiednio (patrz Plik Uzupełniający 6). Na drugim arkuszu pliku oblicza się rozkład wielkości kroku i średni współczynnik dyfuzji, gdzie rozmiary kroków to odległości pokonywania cząstki między ramami, a średnia dyfuzja jest dana równaniem 3:

figure-results-2(3)

Gdzie Dave to średni współczynnik dyfuzji, a Δt to liczba klatek na sekundę. To równanie zakłada ruch Browna, który zazwyczaj jest prawdziwy dla małych przesunięcia i można potwierdzić, analizując średnią kwadrat przesunięcia względem czasu na próbie poszczególnych torów 3,30,31.

Histogram wielkości kroków pokazuje rozkład cząstek dyfuzujących, co można przypisać różnym rozmiarom OAP (Rysunek 5).

figure-results-3
Rysunek 1: Urządzenie do suszenia lipidów. Aparat składa się z kolby o okrągłym dnie o pojemności 10 mL i złączem destylacji próżniowej. Azot wchodzi do wody przy niskim ciśnieniu przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 μm z igłą przymocowaną do żółtej nasadki syntezowej, która jest połączona z złączem destylacji próżniowej. Ciśnienie jest uwalniane przez rurkę Tygon podłączoną do strzykawki z igłą odcinaczącą. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 2: Oczekiwany rozkład fluorescencyjnych etykiet na każdej jednostce AQP4 z użyciem równania 2. Najbardziej prawdopodobna liczba fluoroforów to 4, a 98% wszystkich AQP4 będzie miało etykietę fluorescencyjną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 3: Zespół uchwytu na próbki. Zespół wykonany jest z rury soczewki SM1 o średnicy 1" z usuniętymi i fazowanymi gwintami męskimi, aby zapobiec zakłóceniom obiektywu mikroskopowego. Zawiera kwarcową pokrywę i uszczelkę parafilmową. Cały zespół jest zabezpieczony pierścieniem stabilizującym SM1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 4: Mikroskop. Po prawej stronie znajduje się uproszczony diagram mikroskopu; Zielona linia pokazuje światło wzbudzające pochodzące z lasera. Zaczynając od prawej strony, światło lasera przechodzi przez płytę falową o średnicy 1/4, a następnie jest skupiane przez soczewkę o średnicy 300 mm. Światło jest odbite przez długoprzepustowe lustro dichroiczne na obiektyw, gdzie skupia się na tylnej aperturze. Poprzez zastosowanie lustra translacyjnego do przesunięcia wiązki wzbudzającej, wiązka jest umieszczona na krawędzi otworu obiektywu, tworząc pole unikające w próbce. Światło emitowane w ostrości jest zbierane przez obiektyw i reprezentowane przez czerwoną linię. Emitowane światło przechodzi następnie przez filtr dichroiczny, następnie przez długoprzepustowy filtr i jest skupiane obiektywem 300 mm na kamerze, zapewniając 1,7-krotne powiększenie optyczne (170-krotne całkowite powiększenie obiektywu i soczewki tubowej). Po lewej stronie znajduje się obraz mikroskopu. Należy zauważyć, że do prawidłowego ustawienia lasera stosuje się dodatkowe lustra obrotowe. Jednocześnie ramię detekcyjne jest ułożone tak, aby maksymalizować zbieranie fotonów z fluorescencyjnych białek transbłonowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 5: Histogram wielkości kroków. Niebieska linia z czerwonymi kółkami to histogram wszystkich rozmiarów kroków. linia jest dopasowana do wielu współczynników dyfuzji. Rozkład prawdopodobieństwa wielkości kroku jest dany wzorem: figure-results-8 gdzie fi jest ułamkową populacją każdego typu cząstek dyfundującej, zakładając, że każda podlega ruchowi Browna. Histogram i dopasowanie pokazują niejednorodny rozkład wolniejszych i szybszych cząstek, przypisywany rozkładowi wielu rozmiarów OAP. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Plik uzupełniający 1: Kalkulator arkusza kalkulacyjnego służący do określenia składu mol%, całkowitej ilości lipidów oraz opcjonalnych składników fluorescencyjnej/FRAP do przygotowania SUV-a. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Surowy stos obrazów poklatkowych mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczącej cząsteczki używany w śledzeniu trajektorii (plik źródłowy do tutorialu TrackMate). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Animowany podgląd surowych danych fluorescencji pojedynczej cząsteczki, pokazujący intensywność i tło przed obróbką. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Animacja filtrowanych ścieżek cząstek (post-thresholding) pokazująca reprezentatywne trajektorie AQP4 w czasie. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Animowana nakładka pokazująca pełnopolowe śledzenie cząsteczek cząsteczek AQP4 za pomocą wyjścia TrackMate. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Arkusz kalkulacyjny przedstawiający wyodrębnione współrzędne trajektorii oraz obliczone rozkłady wielkości kroku używane do analizy dyfuzji. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy metodę śledzenia pojedynczych cząstek, umożliwiającą bezpośrednią obserwację pojedynczych białek błonowych podczas ich przemieszczania się przez membranę lipidową podpartą przez stałe i wzajemne oddziaływanie. AQP4 został wybrany jako reprezentatywny przykład ze względu na zdolność tworzenia dynamicznych samoskładów regulowanych przez różne izoformy 32,33,34. Powyżej przedstawiamy wiarygodną metodę przygotowania próbki oraz kluczowe parametry śledzące białka jednobłonowe w milisekundowych skalach czasowych. Etapy obejmują: (1) przygotowanie SUV-ów, (2) określenie odpowiedniego poziomu znakowania fluorescencyjnego, (3) przygotowanie solidnych podpór, (4) stworzenie próbek białek transbłonowych w dwuwarstwie lipidowej podpartej stałym, (5) przygotowanie środków antyzanikania, (6) zbudowanie prostego mikroskopu jednocząsteczkowego, (7) zbieranie danych śledzących pojedynczych cząsteczek oraz (8) analizę danych śledzących za pomocą ImageJ.

Opisana metoda krok po kroku jest koncepcyjnie prosta; Jednak każdy kluczowy krok ma swoje pułapki i ograniczenia. Spośród nich przygotowanie próbki jest najtrudniejsze (kroki 1-5). Dlatego należy pamiętać o kilku szczegółach. Pierwsza to jak stworzyć lipidową dwuwarstwę wspieraną przez stałe. Istnieją trzy główne metody: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fuzja i pęknięcie SUV-a oraz (3) powłoka obrotowa 35,36,37,38,39. Każda metoda ma swoje zalety i wady. Na przykład metoda Langmuira-Blodgetta zapewnia większą kontrolę nad właściwościami i składem chemicznym dwuwarstw, w tym asymetrycznym składem między dwoma listkami, oraz umożliwia kontrolowane tworzenie wielowarstwowych warstw. Jednak użycie LB-trough jest technicznie wymagające, czasochłonne i kosztowne w pozyskaniu35. Spin-coating to stosunkowo prosta technika tworzenia dwuwarstw lipidowych; jednak zwykle produkuje wielowarstwowe i wymaga dużej ilości materiału, często niepraktycznie dużej ilości39. Zespolenie i pęcherzykowe pęcherzyki to proste procesy, które wymagają tylko niewielkiej ilości materiału. Jednak stworzenie powierzchni hydrofilowej jest kluczowe, a niektóre składy lipidowe łatwiej tworzą się w dwuwarstwy poprzez fuzję pęcherzyków niż inne (np. w naszym laboratorium odkryliśmy, że pęcherzyki o ładunku ujemnym netto tworzą dwuwarstwy przez fuzję pęcherzyków tylko po dodaniu kationów dwuwartościowych i wydłużeniu czasu inkubacji)40. Poza ustanowieniem powierzchni hydrofilowej (krok 3), inne ważne kwestie przy tworzeniu dwuwarstwy wspieranej na stałe poprzez fuzję pęcherzyków obejmują płukanie nowo powstałej dwuwarstwy zarówno przed, jak i po włączeniu białka błonowego. Przedwstawienie usuwa nadmiar SUV i większe pęcherzyki wielolamelowe (MLV), natomiast ostatnie płukanie po wszczepieniu błony usuwa nieinkorporowane białko. Niewystarczające płukanie może wprowadzać sygnały tła podczas badań śledzenia.

Przeanalizowaliśmy liczne detergenty, aby ustalić, czy nadają się do inserwacji białek transbłonowych do lipidowych dwuwarstw wspieranych przez ciało stałe, w tym C12E9, Tween-20, TritonX-100 i wielu innych. Naszym ulubionym detergentem jest DOTM, ponieważ łatwo go usunąć i jest najdelikatniejszy dla błony (mniej narażony na jej integralność). Ilość dodanego białka jest kluczowa. Za dużo i niemożliwe będzie obserwowanie pojedynczych ścieżek. Podczas adaptacji tej procedury do innych białek transbłonowych, ilość należy dostosować metodą prób i błędów. Jednak wartości podane w tej procedurze są doskonałym punktem wyjścia. Ilość detergentu musi być utrzymwana na poziomie lub poniżej krytycznego stężenia micelarnego; w przeciwnym razie dwuwarstwa zostanie rozpuszczona i usunięta z podłoża kwarcowego.

Wprowadzenie białek błonowych do wspieranej dwuwarstwy lipidowej musi być zoptymalizowane pod kątem każdego zestawu warunków eksperymentalnych. Istnieje jednak kilka powszechnych metod osiągnięcia tego celu, w tym użycie proteoliposomów oraz bezpośrednie włączenie białek błonowych do uformowanej dwuwarstwy41. Proteoliposom to liposom, taki jak SUV, z wbudowanym białkiem. Te proteoliposomy mogą zespolić się z uformowaną, stałą dwuwarstwą lipidową lub być włączone jednocześnie do SUV-ów podczas formowania dwuwarstwy42. Zespolenie powoduje pęknięcie, uwalniając białko do błony. Jest prosta do implementacji, ale skutkuje losową orientacją białek błonowych. Może to prowadzić do silnych interakcji z ciałem stałym, co skutkuje różnymi właściwościami dyfuzyjnymi w zależności od orientacji białka3. Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą bezpośrednią inkorporację, co daje preferencję orientacyjną dla AQP4 i innych białek błonowych z dużymi domenami hydrofilowymi po jednej stronie białka 2,5,43,44.

Bezpośrednia obserwacja to potężne narzędzie wykorzystywane w odkryciach naukowych. Dynamiczne obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest szczególnie ważne w biofizyce błonowo-białkowej, gdzie obserwacja ruchu i interakcji poszczególnych białek służy do testowania hipotez lub generowania nowych, które lepiej opisują, jak białko się zachowuje. Opisany protokół i metody są idealne dla dwuwymiarowych dwuwarstw lipidowych wspieranych przez ciało stałe, ale można je rozszerzyć na bardziej złożone środowiska z wieloma składnikami2, komórkami żywymi 34,45,46,47 oraz trójwymiarowymi 48. Śledzenie pojedynczych cząsteczek otwiera drzwi do wielu innych eksperymentów, w tym dwukolorowego śledzenia pojedynczych cząsteczek49, pojedyncząsteczkowego FRET 50,51 oraz dynamicznego obrazowania superrozdzielczego, takiego jak Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) oraz Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). Rozszerzając instrument o regulację temperatury, można również zbadać właściwości termodynamiczne białek błonowych 26,43,52.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-20-1-0324, FA9550-23-1-0583 (J.A.B. i G.P.N.) oraz FA9550-18-1-0395 (J.A.B.).

G.P.N. uznaje następujące instytucje finansujące:
(1) NEXTGENERATIONEU (NGEU) finansowane przez Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) – Wieloskalowe zintegrowane podejście do badania układu nerwowego w zdrowiu i chorobach (DD nr 1553, 11.10.2022)
(2) NEXTGENERATIONEU (NGEU) finansowany przez Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności (NRRP), projekt CN_00000041 - Narodowe Centrum Terapii Genowej i Leków opartych na technologii RNA (DD nr 1035, 17.06.2022).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płyta falowa 1/4ThorlabsWPQ05M-633Upewnij się, że laser jest dopasowany
100X Oil ObjectiveOlympus12-563-6591,45 N/A apochromatyczne
16:0-18:1 PCAwantyczne lipidy polarne850457Fosfolipidy POPC
18:0 PEG2000 WFAwantyczne lipidy polarne880210Sól amonowa
Obiektyw 300mmThorlabsAC254-300-A-ML
Laser He:Ne 633 nmMelles Griot05-LHP-927Można je zmieniać na inne źródła i na inne długości fal
Filtr pasmowy 633 nmChroma Tech633/10XDopasowanie do używanego lasera
Filtr długoprzepustowy 655nmChroma TechET655lpZmień tak, aby dopasować się do długości fal barwnika/lasera
Andor Solis IAndor Andor Solis IOprogramowanie do przechwytywania obrazów
ATTO 655 ATTO-TEC655 n.e.Modyfikacja NHS-Ester, dowolny barwnik o tej modyfikacji odpowiedni do pracy z pojedynczą cząsteczką, może być użyty. Zaleca się ATTO, ale można też używać Cy5/7
Bio-kulki SM-2 żywicaBioRad1523922
Chlorek wapniaMillipore SigmaC4901
KatalazaSigma-AldrichC3155-50MGz wątroby bydłej, soltion wodny i ge; 30000 jednostek/mg
ChloroformFisher Scientific  C547-1HPLC lub spektroskopowy
CholesterolSigma-AldrichC8667-500MG
PokrywkiOptyka ESCOR525000Kwarc 25mm
Dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockFF545/650-Di01-25x36Zmień tak, aby dopasować się do długości fal barwnika/lasera
Kamera EMCCDAndor iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15mL Greiner Bio-one188261Rurki do hodowli komórek Cellestar
GlukozoksydazaSigma-AldrichG2133-50KUod Aspergillus niger, typer VII, ≥ 100000 jednostek/g stałego (bez dodatku tlenu)
OpalarkaTransport portowy56434Używana do podgrzewania parafilmu, zazwyczaj można użyć dowolnej pistoletu na oparcze
HEPESBioreagenty FisheraBP310-500
Olej immersyjny o niskiej autofluorescencjiThorlabsMOIL-30
MetanokalnaFisher Scientific  A452-1HPLC lub spektroskopowy
Rurka mikrowirówkiVMR525-11261,5 mL 
Mikro PipeteryEpendorfRóżne; 1000 &mikro; L, 100 & mikro; L i 10 & micro; L są sugerowane
Ø Rurki obiektywowe 1,5"ThorlabsSM1.5L10Zewnętrzny gwint jest ścięty do przygotowania próbki
Tabela optycznaNewportRPR RelianceRozmiar tabeli zależy od dostępnej przestrzeni
Tkanki optyczneThorlabsMC-50ECzyszczenie różnych komponentów
ParafilmMillipore SigmaP7669Nie sprawdzaj, czy podczas procesu nie ma żadnych fluorescencyjnych gazów
Siłownik piezo-piezonowyNewportPZA12
Pneumatyczne izolatory drgańNewportSeria I-2000używany do stabilizacji tablicy optycznej w przypadku wszelkich nierówności  
ChłodniaFisher Scientific  Isotemp 3016
Kontroler migawkiThorlabsSC10Powiązane z oprogramowaniem obrazującym
Chlorek soduMillipore SigmaS988
Filtr SteritopMillipore SigmaS2GPT05RE
Sterownik i kontroler Switchbox NewportPZC200Kontroler sceny
Filtr strzykawkowyJ.T. BakerSF01-98PES 25mm 0.2 & micro; M
TEC ElementThorlabsTEC3-2.5Używany do łączenia pompy ciepła Peltirer z uchwytem na próbkę i kołnierzem obiektywu
Kontrolator temperaturyMeerstetter EngineeringTEC-1091
Detektor temperaturyThorlabsTH100PT
TermistorThorlabsTH10K
Tube-O-DialyzerG Biosciences786-6114K MWCO
Oczyszczacz ozonu UVNovascanPSDP_UVSeria Pro - cyfrowa & nbsp;
Zoom Optics ThorlabsSM1NR1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fitzner, D., et al. Cell-type- and brain-region-resolved mouse brain lipidome. Cell Rep. 32 (11), 108132(2020).
  2. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  3. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. Single particle tracking reveals corralling of a transmembrane protein in a double-cushioned lipid bilayer assembly. Langmuir. 27 (1), 320-327 (2011).
  4. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24 (13), 6820-6826 (2008).
  5. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  6. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. J Vis Exp. (52), e2696(2011).
  7. Zheng, C. -Y., Petralia, R. S., Wang, Y. -X., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence-tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. J Vis Exp. (50), e2568(2011).
  8. Khaw, I., et al. Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging. Opt Express. 26 (12), 15276-15288 (2018).
  9. Carder, J. D., et al. Thermodynamics and S-palmitoylation dependence of interactions between human aquaporin-4 M1 tetramers in model membranes. J Phys Chem B. 128 (3), 603-621 (2024).
  10. Saadoun, S., Papadopoulos, M. C. Aquaporin-4 in brain and spinal cord oedema. Neuroscience. 168 (4), 1036-1046 (2010).
  11. Mader, S., Brimberg, L. Aquaporin-4 water channel in the brain and its implication for health and disease. Cells. 8 (2), (2019).
  12. Salman, M. M., et al. Emerging roles for dynamic aquaporin-4 subcellular relocalization in CNS water homeostasis. Brain. 145 (1), 64-75 (2021).
  13. Graber, D. J., Levy, M., Kerr, D., Wade, W. F. Neuromyelitis optica pathogenesis and aquaporin-4. J Neuroinflammation. 5 (1), 22(2008).
  14. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG-Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), e62(2015).
  15. Takahashi, T., et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titre. Brain. 130 (Pt 5), 1235-1243 (2007).
  16. Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 Å and its mechanism of conductance. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7437-7442 (2009).
  17. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  18. Crane, J. M., Verkman, A. S. Determinants of aquaporin-4 assembly in orthogonal arrays revealed by live-cell single-molecule fluorescence imaging. J Cell Sci. 122 (6), 813-821 (2009).
  19. Jin, B. -J., Rossi, A., Verkman, A. S. Model of aquaporin-4 supramolecular assembly in orthogonal arrays based on heterotetrameric association of M1-M23 isoforms. Biophys J. 100 (12), 2936-2945 (2011).
  20. Hamai, C., Cremer, P. S., Musser, S. M. Single giant vesicle rupture events reveal multiple mechanisms of glass-supported bilayer formation. Biophys J. 92 (6), 1988-1999 (2007).
  21. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  22. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. In Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  23. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
  24. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  25. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  26. Martinez, M. J., et al. Thermodynamic driving forces of redox-dependent CPR insertion into biomimetic endoplasmic reticulum membranes. J Phys Chem B. 126 (5), 1141-1151 (2022).
  27. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. J Colloid Interface Sci. 179 (1), 298-310 (1996).
  28. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  29. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. The effect of a phase transition on single molecule tracks of annexin V in cushioned DMPC assemblies. Soft Matter. 8 (44), 11285-11293 (2012).
  31. McCain, K. S., Hanley, D. C., Harris, J. M. Single-molecule fluorescence trajectories for investigating molecular transport in thin silica sol-gel films. Anal Chem. 75 (17), 4351-4359 (2003).
  32. Loughran, G., et al. Evidence of efficient stop codon readthrough in four mammalian genes. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8928-8938 (2014).
  33. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  34. Crane, J. M., Van Hoek, A. N., Skach, W. R., Verkman, A. S. Aquaporin-4 dynamics in orthogonal arrays in live cells visualized by quantum dot single particle tracking. Mol Biol Cell. 19 (8), 3369-3378 (2008).
  35. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  36. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  37. Hardy, G. J., Nayak, R., Zauscher, S. Model cell membranes: techniques to form complex biomimetic supported lipid bilayers via vesicle fusion. Curr Opin Colloid Interface Sci. 18 (5), 448-458 (2013).
  38. Simonsen, A. C., Bagatolli, L. A. Structure of spin-coated lipid films and domain formation in supported membranes formed by hydration. Langmuir. 20 (22), 9720-9728 (2004).
  39. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18 (21), 8172-8177 (2002).
  40. Silva-López, E. I., Edens, L. E., Barden, A. O., Keller, D. J., Brozik, J. A. Conditions for liposome adsorption and bilayer formation on BSA-passivated solid supports. Chem Phys Lipids. 183, 91-99 (2014).
  41. Granéli, A., Rydström, J., Kasemo, B., Höök, F. Formation of supported lipid bilayer membranes on SiO2 from proteoliposomes containing transmembrane proteins. Langmuir. 19 (3), 842-850 (2003).
  42. Puu, G., Artursson, E., Gustafson, I., Lundström, M., Jass, J. Distribution and stability of membrane proteins in lipid membranes on solid supports. Biosens Bioelectron. 15 (1), 31-41 (2000).
  43. Davis, R. W., et al. Nanoporous microbead supported bilayers: stability, physical characterization, and incorporation of functional transmembrane proteins. Langmuir. 23 (7), 3864-3872 (2007).
  44. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  45. Zepernick, A. -L., et al. Single-molecule imaging of aquaporin-4 array dynamics in astrocytes. Nanoscale. 16 (19), 9576-9582 (2024).
  46. Verkman, A. S., Rossi, A., Crane, J. M. Methods Enzymol. 504, 341-354 (2012).
  47. Tajima, M., Crane, J. M., Verkman, A. S. Aquaporin-4 (AQP4) associations and array dynamics probed by photobleaching and single-molecule analysis of green fluorescent protein-AQP4 chimeras. J Biol Chem. 285 (11), 8163-8170 (2010).
  48. Nguyen, T. D., Chen, Y. -I., Chen, L. H., Yeh, H. -C. Recent advances in single-molecule tracking and imaging techniques. Annu Rev Anal Chem. 16, 253-284 (2023).
  49. Schirripa Spagnolo, C., Moscardini, A., Amodeo, R., Beltram, F., Luin, S. Optimized two-color single-molecule tracking of fast-diffusing membrane receptors. Adv Opt Mater. 12 (9), 2302012(2024).
  50. Bartels, K., Lasitza-Male, T., Hofmann, H., Löw, C. Single-molecule FRET of membrane transport proteins. ChemBioChem. 22 (17), 2657-2671 (2021).
  51. Sasmal, D. K., Pulido, L. E., Kasal, S., Huang, J. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer in molecular biology. Nanoscale. 8 (48), 19928-19944 (2016).
  52. Lam, K. T., et al. Direct measurement of single-molecule ligand-receptor interactions. J Phys Chem B. 124 (36), 7791-7802 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Protein TrackingLipid BilayersFluorescence MicroscopyMembrane ProteinsSingle Molecule ImagingTime Lapse ImagingAquaporin 4Protein DiffusionBiomimetic MembranesTrackMate Analysis

Related Articles