Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaawansowany model współhodowli bariery krwiowo-mózgowo-rdzeniowej do oddzielnej analizy nabłonka i śródbłonka splotu naczyniówki

429 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

28 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Ustalono współhodowlę ludzkich komórek nabłonka i śródbłonka splotu naczyniówkowego, aby stworzyć zaawansowany model in vitro bariery krew-mózgowo-rdzeniowy. Opisujemy oddzielną izolację nabłonka i śródbłonka do późniejszego przygotowania RNA i analizy transkrypcyjnej w wybranych warunkach.

Streszczenie

Silnie przepełniony splot naczyniówkowy (CP), położony w układzie komorowym mózgu, składa się z kilku elementów strukturalnych, w tym nabłonka sześciennego oraz rozłożonego śródbłonka, i jest miejscem bariery krew-mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Aby zbadać CP in vitro, możliwe są różne układy hodowli komórkowych. Model filtra odwróconej hodowli komórkowej o silnej funkcji barierowej, oparty na ludzkich komórkach brodawkowaka CP (HIBCPP), został opracowany przez nasze laboratorium i jest szeroko stosowany. Niedawno udało nam się wygenerować stabilną, uwiecznioną linię komórek śródbłonka ludzkiego CP (iHCPEnC). Łącząc obie linie komórkowe, stworzyliśmy zaawansowany funkcjonalny model typu dwukomórkowego, który rozwinął zwiększoną funkcję bariery w porównaniu do samych komórek HIBCPP. Ponieważ model ten reprezentuje zarówno nabłonek CP, jak i śródbłonek, pozwala na badanie wzajemnego oddziaływania tych dwóch typów komórek w wybranych warunkach, takich jak infekcje, stan zapalny lub inne. W tym protokole opisujemy metody tworzenia modelu typu dwukomórkowego z późniejszym rozdzieleniem komórek nabłonkowych i śródbłonkowych do analiz transkrypcyjnych. Opisujemy primery PCR specyficzne dla nabłonka i śródbłonka, które służą wykrywaniu możliwego zanieczyszczenia krzyżowego między tymi dwoma typami komórek. Aby zbadać możliwy wpływ śródbłonka CP na nabłonek w tym modelu w warunkach zapalnych, przeanalizowano poziomy ekspresji wybranych genów w kontekście leczenia lipopolisacharydami (LPS) w frakcji komórek HIBCPP. Zaawansowany model CP in vitro oraz możliwość oddzielnej analizy odpowiedzi nabłonkowych i śródbłonkowych są istotne dla badań nad procesami komórkowymi obejmującymi biologiczne i patologiczne funkcje CP.

Wprowadzenie

Splot naczyniówkowy (CP) to silnie unaczyniony zlepek różnych populacji komórek zlokalizowanych we wszystkich czterech komorach mózgu. Między innymi pełni funkcję bariery fizjologicznej, tzw. bariery krew-mózgowo-rdzeniowo-rdzeniowej (BCSFB), pomiędzy ośrodkowym układem nerwowym (OUN) a krwią, zapobiegając np. krążeniu przez mózg substancji zakaźnych we krwi. CP składa się z różnych typów komórek, w tym spolaryzowanych komórek nabłonkowych, zawierających połączenia ścisłe i przylegające oraz desmosomy, umieszczone na błonie podstawnej. Powierzchnia komórek nabłonkowych jest powiększona przez obecność mikrowiątek na powierzchni luminalnej. Rozgałęzione naczyń śródbłonkowych, otoczone tkanką łączną, taką jak fibroblasty i komórki odpornościowe, znajdują się pod błoną podstawną 1,2,3. Niedawno poinformowano, że komórki śródbłonka CP są w stanie wzmacniać integralność BCSFB wraz z komórkami nabłonkowymi, co może odgrywać rolę w ochronie mózgu podczas procesów zapalnych 4,5.

Do tej pory odwrócona hodowla ludzkich komórek nabłonkowego brodawczaka CP (HIBCPP) jest najczęściej stosowanym modelem in vitro do naśladowania ludzkiego BCSFB o wysokiej oporności elektrycznej przeznabłonkowej (TEER) i silnej funkcji barierowej. Aby lepiej zrozumieć funkcje komórkowe i jednocześnie unikać eksperymentów na zwierzętach, ważne jest, aby uzyskać jak najwięcej informacji z eksperymentów in vitro. Pierwsza stabilna, uwieczniona ludzka linia komórkowa śródbłonka CP (iHCPEnC) została niedawno ustanowiona w naszym laboratorium 6,7. Dzięki komórkom HIBCPP i iHCPEnC jesteśmy w stanie złożyć model współkultury in vitro, imitujący BCSFB w bardziej zaawansowany sposób8. Korzystając z tego modelu dwukomórkowego, mogliśmy wykazać, że współhodowla komórek HIBCPP i iHCPEnC prowadzi do wzrostu wartości TEER w porównaniu z samymi komórkami HIBCPP. Ważne jest, aby zauważyć, że sam iHCPEnC nie rozwija TEER 7,8. Oddzielne przygotowanie i późniejsze analizy dwóch typów komórek stosowanych w tym modelu pozwoliłyby nam zbadać ich wzajemne oddziaływanie w warunkach zdrowych i chorych.

Tutaj opisujemy dwa różne podejścia do osiągnięcia tego celu. Podstawą jest to, że w obu przypadkach podejście opiera się na modelu odwróconej hodowli komórkowej komórek HIBCPP (Rysunek 1). Metoda 1, metoda "bezpośredniej współhodowli", obejmuje obie komórki na jednej wkładce filtracyjnej. Komórki HIBCPP hodowane są odwrócone przed zasiewem iHCPEnC w standardowy sposób 7,8. Metoda 2, hodowla "membrana w-w-wkładzie", tutaj dodaliśmy osobną membranę o tych samych właściwościach, co ta użyta w wkładkach filtracyjnych. Ta dodatkowa błona jest umieszczana w wkładce filtracyjnej, gdzie komórki HIBCPP już rosną w odwróconej hodowli. iHCPEnC są zasiewane na dodatkowej błonie w sposób standardowy hodowli.

Późniejsze rozdzielenie komórek do analizy RNA pozwala na poznanie reakcji transkrypcyjnej nabłonka i śródbłonka CP w wybranych warunkach. Opisujemy primery PCR specyficzne dla komórek HIBCPP oraz iHCPEnC, które umożliwiają potwierdzenie skutecznej i czystej separacji obu typów komórek. Po leczeniu lipopolisacharydem (LPS) używamy opisanych modeli do badania odrębnych odpowiedzi nabłonka CP w obecności śródbłonka w warunkach zapalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Komórki HIBCPP

UWAGA: W poniższe części opisujemy hodowlę i utrzymanie komórek HIBCPP oraz przygotowanie inwentur z odwróconej hodowli komórkowej z użyciem komórek HIBCPP. Protokół ten został zaprojektowany do wzrostu komórek HIBCPP na 12-dołkowych filtrach do hodowli komórek. Szczegółowy protokół wraz z towarzyszącym filmem dotyczący hodowli komórek HIBCPP na wkładkach do hodowli komórek 24-dołkowych został opublikowanywcześniej 9.

  1. Pobieranie komórek HIBCPP do hodowli
    1. Rozmroź fiolkę z komórkami HIBCPP w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Ponownie zawiesij zawartość fiolki w 10 mL pożywki DMEM/HAMS-F12 zawierającej 10% surowicy cielętej płodu (FCS) oraz 5 μg insuliny/mL podgrzewanego podłoża (10% HIBCPP).
    3. Umieść ponownie zawieszone komórki HIBCPP w kolbie z hodowlą komórek T75 i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    4. Zmień medium w kolbie, aby usunąć DMSO 24 godziny po zasiewaniu komórek.
    5. Hoduj komórki do 90% zbiórki, ten etap trwa około 2 tygodni. Zmieniaj medium dwa razy w tygodniu.
  2. Ciągła hodowla komórek HIBCPP
    UWAGA: Do hodowli ciągłej dziel komórki HIBCPP 1:3 na nowe kolby do hodowli komórek T75.
    1. Usuń podłoże hodowlane z kolby T75.
    2. Umyj komórki raz 10 mL PBS.
    3. Usuń PBS.
    4. Odłącz komórki HIBCPP za pomocą 3 mL 0,25% trypsyny-EDTA. Ten krok trwa około 10-20 minut w temperaturze 37 °C. W międzyczasie mieszaj kolbę, aby zapewnić pełne pokrycie warstwy komórkowej trypsin-EDTA.
    5. Dodaj 7 ml medium HIBCPP i wiruj w 50 x g przez 10 minut w stanie RT.
    6. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 30 mL pożywki 10% HIBCPP i rozprowadź do 3 nowych kolb T75.
    7. Hodować komórki do 90% zbiórki; Komórki osiągną zbieg za około tydzień.
    8. Zmieniaj medium dwa razy w tygodniu.
      UWAGA: Komórki HIBCPP nie są hamowane wzrostem; dlatego kolba stanie się zbiegająca, a komórki będą nadal rosnąć i tworzyć wielowarstwowe warstwy.
  3. Rozsiewanie komórek HIBCPP w hodowli odwróconej
    1. Usuń podłoże hodowlane z kolby T75.
    2. Umyj komórki raz 10 mL PBS.
    3. Usuń PBS.
    4. Odłącz komórki HIBCPP za pomocą 3 mL 0,25% trypsyny-EDTA. Ten etap trwa około 10-20 minut w temperaturze 37 °C. W międzyczasie mieszaj kolbę, aby zapewnić pełne pokrycie warstwy komórkowej trypsin-EDTA.
    5. W międzyczasie przygotuj wkładki filtracyjne. Wkładki z 12-dołkami obróć w odwróconej pozycji w płytkę do hodowli komórek z 6 dołkami za pomocą kleszczy i napełnić je podgrzanym medium 10% HIBCPP. Membranę zwilż kroplą medium na wierzch każdej wkładki filtracyjnej.
    6. Ponownie zawiesz komórki trypsynizowane 17 mL 10% HIBCPP w podłożu.
    7. Wiruj w 50 x g przez 10 minut w RT i dostosuj ogniwa HIBCPP do stężenia 1 × 106 komórek /mL.
      UWAGA: Komórki HIBCPP mają tendencję do tworzenia małych aglomeranow. Nie jest konieczne całkowite rozpuszczanie ich przed zasiewem na wkładki filtra. Upewnij się, że 90% komórek jest pojedynczych.
    8. Rozsajmij komórki HIBCPP odwróconym na wkładkach filtrów z 12 dołkami o gęstości 4 × 105 komórek /wkładce.
    9. Poczekaj, aż zawiesina komórkowa zostanie przejęta przez błonę. Zamknij pokrywkę płytki hodowli komórek z 6 dołkami.
    10. Włóż płytki z odwróconymi wkładkami do inkubatora.
    11. 24 godziny po wysiewaniu obróć wkładki za pomocą kleszczy w ich właściwą orientację, tworząc nową płytkę do hodowli komórek z 12 dołkami. Włóż 2 mL 10% pożywki HIBCPP do dolnej komory i 1 ml do górnej komory.
    12. Pozostawić komórki na 5 do 6 dni bez żadnej zmiany w podłożu, a następnie rozpocząć wyznaczanie TEER i przygotowanie współhodowli.

2. Ustalenie TEER

UWAGA: Określanie wartości TEER odbywa się za pomocą MilliCell ERS2 oraz elektrody z pałeczką. Do obliczeń wymagany jest pomiar pustej z wkładek filtrujących kultury komórkowej w medium bez komórek (pusta pustka w Ohm).

  1. Przechowuj elektrodę pałeczki na sucho. Przed rozpoczęciem pomiaru umieść elektrodę w 80% etanolu na 10 minut w celu dezynfekcji.
  2. Następnie przepłucz elektrodę PBS.
  3. Rozpoczynając pomiar: Włóż długi koniec elektrody do studni, a krótki koniec elektrody do wkładki filtracyjnej zawierającej zasiadzone ogniwa.
  4. Zarejestruj wartość Ohm wkładki do filtra hodowli komórek 12-dołkowej (próbka Ohma).
  5. Oblicz TEER następująco: Ohm·cm2 = (próbka Ohm –pusta pustka) × 1,1 cm2.
  6. Po zakończeniu pomiaru opłucz elektrodę 80% etanolem i przechowuj na sucho.
    UWAGA: Pomiędzy pomiarami różnych warunków eksperymentalnych lub pomiarami różnych linii komórkowych elektroda pałeczkowa musi zostać zdezynfekowana i przepłukana PBS, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

3. iHCPEnC

  1. Wprowadzenie iHCPEnC do kultury
    1. Rozmroz fiolkę iHCPEnC w RT.
    2. Ponownie zawiesij zawartość fiolki podgrzanym 5 mL Complete Classic Endothelial Medium (iHCPEnC).
    3. Wirówka z 500 g przez 5 minut w RT.
    4. W międzyczasie pokryj kolbkę z hodowlą komórek T25 2 mL czynnika przywiązywania przez około 1 minutę. Aspiruj Attachment Factor i zostaw kolbę do momentu zasiewania iHCPEnC.
    5. Ponownie zawiesij pellet komórkowy z 5 mL pożywki iHCPEnC i umieść go w przygotowanej kolbie do hodowli komórek T25.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez tydzień bez zmiany medium.
  2. Ciągła hodowla iHCPEnC
    UWAGA: Do hodowli ciągłej podziel iHCPEnC w proporcji 1:4 na nowe piersiówki z hodowlą komórek T25.
    1. Usuń podłoże iHCPEnC i przepłucz komórki raz 3 mL PBS. Uważaj, aby nie odłączyć komórek.
    2. Aspiruj PBS.
    3. Odłącz konfluentny iHCPEnC za pomocą 1 mL Trypsyny-EDTA. Ten etap zajmuje około 3-5 minut w RT.
    4. Ponownie zawiesij komórki w 5 mL nośnika iHCPEnC.
    5. Wirówka z 500 g przez 5 minut w RT.
    6. W międzyczasie nałóż 4 nowe piersiówki T25 po 2 mL Attachment Factor na kolbę.
    7. Ponownie zawiesij granulkę komórkową z 20 mL pożywki iHCPEnC.
    8. Rozdaj 5 ml zawiesiny ogniwowej do każdej z 4 przygotowanych kolb.
    9. Ponownie, hoduj komórki przez tydzień bez zmiany podłoża. Osiągną zbieg za tydzień.
      UWAGA: komórki iHCPEnC są hamowane wzrostem; dlatego kolba stanie się zbiegiem i pozostałe komórki będą unosić się na powierzchni.

4. Przygotowania do eksperymentów kokulturowych

  1. Metoda 1: Do "bezpośredniej współhodowli" (hodowla nabłonka i komórek śródbłonka po obu stronach jednej insetki) nie przygotowuj żadnych dodatkowych rzeczy.
  2. Metoda 2: W przypadku metody "membrana w-w-insert" wykonaj następujące kroki:
    1. Wyciąć membrany filtracyjne do hodowli komórek o rozmiarze 12-dołkowym za pomocą żelaza perforującego nr 11 (o średnicy 11 mm) z osobnej membrany Din-A-4.
    2. Włóż wybite błony do szalki Petriego.
    3. Sterylizuj wycięte błony przez 60 minut przy użyciu światła ultrafioletowego (UV-C, 254 nm).
      UWAGA: Wybite i sterylizowane membrany w kształcie wkładek w kształcie 12-dołków można przygotować wcześniej i przechowywać w warunkach sterylnych.

5. Tworzenie kokultury

UWAGA: Na tym etapie komórki HIBCPP są już przygotowane do modelu hodowli in vitro typu dwukomórkowego. Komórki HIBCPP hodowano przez 5 do 6 dni (porównaj kroki 1.3.8-1.3.12). Komórki HIBCPP powinny zacząć rozwijać TEER (około 20 Ohm·cm2).

  1. Dla obu metod, Metoda 1 ("bezpośrednia współhodowla") i Metoda 2 ("membrana w-wkładce") zastępuje się pożywkę HIBCPP o 10% na podłoże 1% HIBCPP. W tym celu należy umieścić 2 mL pożywki 1% HIBCPP do dołku z płytką hodowli 12-dołkowej.
  2. Opróżnij wkładkę filtracyjną zawierającą odwróconą kulturę za pomocą pipety i kleszczy, a wkładkę w standardowej orientacji umieść w przygotowanej 12-dołce.
  3. Dla Metody 2 ("membrana w-wkładce") przygotuj wkładki filtracyjne w następujący sposób:
    1. Umieść wybitą i sterylizowaną błonę do przygotowanego wkładu z 12 dołkami z komórkami HIBCPP w hodowli odwróconej przy użyciu kleszczy.
  4. Umieść płytki hodowlane komórkowe z powrotem do inkubatora w celu trypsynizacji iHCPEnC (opisanej w kroku 6).

6. Siew i uprawa iHCPEnC w współkulturze

UWAGA: W następnej sekcji opisano ustanowienie współhodowli komórek HIBCPP i iHCPEnC na wkładkach do 12-dołkowych filtrów do hodowli komórkowych. Szczegółowy protokół współhodowli komórek HIBCPP i iHCPEnC na wkładkach do kultury komórkowej 24-dołkowej został opisany wcześniej8. Przed odłączeniem iHCPEnC oblicz, ile komórek jest potrzebnych do przeprowadzenia współhodowli. Jedna kolba do hodowli komórek T25 pozwala uzyskać około 5 × 105 komórek .

  1. Usuń podłoże z kolby T25 zawierającej iHCPEnC.
  2. Umyj iHCPEnC 3 mL PBS. Unikaj odłączania komórek.
  3. Usuń PBS.
  4. Odłącz konfluentny iHCPEnC za pomocą 1 mL Trypsyny-EDTA. Ten etap zajmuje około 3-5 minut w RT.
  5. Ponownie zawiesij komórki w kolbie 5 mL/T25 z nośnikiem iHCPEnC.
  6. Policz cele w komorze Neubauera.
  7. Wirówka 500 × g przez 5 minut w RT.
  8. Ponownie zawiesij pellet komórkowy do końcowego stężenia 1× 105 komórek /mL w nośniku iHCPEnC.
  9. Zarówno Metoda 1 ("bezpośrednia współhodowla"), jak i Metoda 2 ("membrana w wkładce"): nasiono 700 μL iHCPEnC (7x105 komórek ) w 12-dołkowym filtrze filtracyjnym.
  10. Monitoruj wartości TEER w ko-hodowli i kontroli (tj. komórki HIBCPP i wyłącznie hodowle iHCPEnC) po raz pierwszy 24 godziny po zasiewaniu iHCPEnC, a następnie codziennie.

7. Leczenie LPS

UWAGA: Kokultury powinny wykazywać wyższe wartości TEER w porównaniu do hodowli wyłącznie komórkowych HIBCPP (sugerowany czynnik: 1,5 lub wyższy).

  1. Mierz i rejestruj wartości TEER insercji hodowli komórkowych przygotowanych do eksperymentów.
  2. Przygotuj mieszankę główną zawierającą 5 μg/mL LPS w medium 1% HIBCPP.
  3. Przygotuj nowe płytki z 12 dołkami zawierające 2 mL i 1% HIBCPP na odwiert.
  4. Opróżnij wkładki za pomocą kleszczy i pipetowania.
  5. Włóż wkładki do przygotowanych dołków.
  6. Dodaj odpowiednio 1 mL miksu LPS master lub 1% medium HIBCPP (kontrola ujemna).
  7. Inkubuj przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  8. Zmierz i zapisz wartości TEER przed przejściem do sekcji 8.

8. Oddzielna izolacja RNA od komórek HIBCPP i iHCPEnC do dalszej analizy transkrypcyjnej

UWAGA: Aby uzyskać dwie oddzielne frakcje komórkowe i uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego z komórek hodowanych w modelu ko-hodowli, frakcje komórkowe są starannie zeskrobywane z wkładu osobno. Wykonaj wszystkie etapy izolacji RNA dla każdej wkładki filtracyjnej bez przerw (wstawki nie mogą się wysuszyć).

  1. Wkładki filtra myj raz za pomocą PBS. W tym celu przygotuj płytki hodowli komórek 12-dołkowe, zawierające 1,5 mL PBS/dołek.
  2. Opróżnij wkładki filtra do hodowli komórkowych za pomocą pipety i kleszczy. Umieść wkładki w płytkę hodowli komórek wypełnioną PBS z 12 dołkami.
  3. Dodaj 1 mL PBS do wkładek.
  4. Aby przygotować komórki iHCPEnC i HIBCPP do Metody 1 ("bezpośrednia współhodowla"), wykonaj następujące kroki:
    1. Wyjmij PBS z wkładu i umieść go w pustej, suchej płytce hodowli komórek z 12 dołkami.
    2. Za pomocą końcówki pipety i pipetowania 10-20 μL PBS, iHCPEnC są odłączane od wkładu przez skrobanie.
    3. Umieść tę frakcję komórkową w probówce o pojemności 1,5 mL zawierającej 350 μL buforu lizy RNA. Pipetuj w górę i w dół, aby odpowiednio wymieszać komórki z buforem lizy RNA.
    4. Po zakończeniu pobrania frakcji iHCPEnC należy odwrócić wkład do góry do góry do pokrywy płytki hodowli komórkowej.
    5. Usuń komórki HIBCPP z błony, podobnie jak frakcję iHCPEnC, i umieść je w przygotowanej probówce o pojemności 1,5 mL zawierającej 350 μL RLT-β-merkaptoetanolu.
      UWAGA: Jeśli przygotowuje się wiele współhodowli dla jednej choroby, należy pobrać 350 μL buforu lizy RNA na wkładkę i frakcję komórkową. Pojedyncze przygotowane frakcje komórek o jednym konkretnym stanie są kolejno oczyszczane w tej samej kolumnie.
  5. Aby przygotować komórki iHCPEnC i HIBCPP do Metody 2 ("membrana w-w-insert"), wykonaj następujące kroki:
    1. Usuń dodatkową błonę za pomocą kleszczy i umieść ją w suchej pokrywce z 12-dołkową płytką hodowli komórek. Pipeta 100 μL buforu lizyzującego RNA na błonę do lizy iHCPEnC.
    2. Włóż ten 100 μL lizatu do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 250 μL buforu RNA i dobrze wymieszaj.
    3. Wyjmij PBS z wkładki filtracyjnej i włóż ją do góry nogami do pokrywki płytki hodowli komórek z 12 dołkami. Dodaj 100 μL buforu lizyzującego RNA na błonę wkładki i lizuj frakcję komórek HIBCPP.
    4. Umieść ten 100 μL lizatan w probówce o pojemności 1,5 mL zawierającej 250 μL buforu RNA.
  6. Przeprowadz izolację RNA zgodnie z protokołem producenta.
  7. Zmierz ilość RNA za pomocą spektrofotometru.
  8. Wykonaj odwrotną transkrypcję i analizę qPCR próbek RNA, zgodnie z opisem producenta.
    UWAGA: Ponieważ współkultury zawierają mniej iHCPEnC w porównaniu do komórek HIBCPP, potrzebne są kilka wkładek filtrów 12-dołkowych do izolacji wystarczającej ilości RNA z iHCPEnC, w zależności od dalszej analizy. Lizaty RNA z różnych insertów filtrujących muszą być łączone. Transkrypcję odwrotną i qPCR można wykonać zgodnie z opisaniem powyżej6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym protokole opisujemy krok po kroku generowanie dwukomórkowego modelu ludzkiego CP, składającego się z nabłonka (komórki HIBCPP) i śródbłonka (iHCPEnC) na wkładkach do filtrów hodowli komórkowych, jak pokazano schematycznie na Rysunku 1. W tym modelu komórki HIBCPP hodowane są odwrócone po dolnej stronie filtra, natomiast iHCPEnC są zasiewane albo na górnej stronie filtra wkładu, albo na drugim filtrze umieszczonym na membranie wkładki.

Wartości TEER m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ludzkie CP składa się z kilku różnych typów komórek, w tym nabłonka barierowego oraz śródbłonka rozciągniętego naczynia3. Chociaż komórki śródbłonkowe CP są fenestrowane, najnowsze badania wykazały ich wkład w funkcjonowanie bariery na poziomie BCSFB 4,7. Aby zbadać złożone interakcje między śródbłonkiem a nabłonkiem w narządach jako CP, wymagane są zaawansowane modele in vitro umożliwiające analizę obu typów komórek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTALife Technologies 25200056
12-dołkowa płyta hodowla komórkowa StarLabCC7682-7512
Wkłady filtrów 12 dołków (3 i mikro; Pory m.Greiner Bio One665631
24-dołkowa płyta hodowla komórek & nbsp;StarLabCC7672-7524
Wkład filtra 24 dołków   (0,4 & mikro; Pory m.Greiner Bio One662641
Wkład filtra 24 dołków (3 i mikro; Pory m.Greiner Bio One662631
6-dołkowa płyta hodowla komórek  StarLabCC7682-7506
Zestaw do syntezy cDNA AffinityScript (synteza cDNA)Agilent600559
Współczynnik przywiązaniaSystemy komórkowe4ZO-500Część kompletnego zestawu Classic Endothelial Medium.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR w czasie rzeczywistym)Agilent600828
Elektroda pałeczkiMilliporeMERSSTX01Ten produkt został wycofany.
Kompletne klasyczne ośrodek śródbłonkowy (iHCPEnC medium)Systemy komórkowe4ZO-500Zestaw zawierający medium, suplementy i współczynnik przyczepności do powłoki.
DMEM/F-12 (1:1) z fenolowanym (10% medium HIBCPP)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) bez fenolowanego (1% medium HIBCPP)Thermo Fisher11039-021
Serum łydki płodu (FCS) (1% i 10% HIBCPP medium)Thermo Fisher10270-106
Insulina (medium 1% i 10% HIBCPP)SigmaI9278
Lipopolisacharyd (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Ten produkt został wycofany.
Nanodrop (spektrofotometr)Thermo ScientificND1000Ten produkt został wycofany.
Żelazo perforujące nr 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Narzędzie do projektowania sprężynNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primery SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (część mikro zestawu Qiagen Rneasy)Qiagen74004
Kolba do hodowli komórek T25Sarstedt AG & Co KG83,39,10,002
Kolba do hodowli komórek T75Sarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (oddzielna membrana)SabeuSK4580
Światło UVCarl RothH469.1

Bibliografia

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Śródbłonek splotu naczyniówkowegokomórki HIBCPPunieśmiertelnione komórki śródbłonkafunkcja barierowamodel in vitroanaliza ekspresji genówtraktowanie lipopolisarydem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.