Artykuł metodologiczny

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Encefalomiopatia mitochondrialna, kwasica mlekowa oraz epizody podobne do udaru (MELAS) to zaburzenia mitochondrialne najczęściej wywoływane przez wariant m.3243A>G w mitochondrialnym tRNALeu. Aby zbadać patofizjologię MELAS, wygenerowaliśmy organoidy mózgowe z wielu linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących od pacjenta z MELAS noszącym wariant m.3243A>G. Linie te mają identyczne tło genetyczne jądrowe, ale różnią się poziomem heteroplazmy w zależności od wariantu m.3243A>G. Zaobserwowaliśmy istotne różnice w rozmiarze organoidów, morfologii i efektywności indukcji nerwowej, które korelowały ze stopniem heteroplazmy. Neurony rozdzielone z organoidów zostały przeniesione do systemu hodowli 2D, co jest wygodne i odpowiednie do wysokoprzepustowego badania leków. Organoidy wykazywały również istotne różnice w formowaniu sieci neuronowych, w zależności od poziomu heteroplazmy. Nasze wyniki sugerują, że modele organoidów oparte na iPSC pochodzące od pacjentów stanowią użyteczną platformę do badania mechanizmów MELAS oraz do badań przesiewowych leków. Ten film przedstawia kompleksowe i przyjazne dla użytkownika metody, w tym protokoły generowania organoidów i oceny fenotypów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mlekowa oraz epizody podobne do udaru (MELAS) to choroby mitochondrialne charakteryzujące się zaburzeniami neurologicznymi, epizodami podobnymi do udaru oraz różnymi objawami ogólnoustrojowymi. Najczęstszą przyczyną jest wariant m.3243A>G w genie tRNA mitochondrialnej leucyny, MT-TL11. Uważa się, że ten wariant upośledza modyfikację tauryny w antykodonie, co zmniejsza efektywność translacji leucyny i przyczynia się do dysfunkcji mitochondrialnej w MELAS 2,3,4. Warto zauważyć, że po podaniu wysokiej dawki tauryny odnotowano poprawę objawów 5,6. Jednak obecność osób nieodpowiadających sugeruje, że dodatkowe, jeszcze niezidentyfikowane mechanizmy patofizjologiczne mogą przyczyniać się do choroby u osób posiadających wariant m.3243A>G.

Aby wyjaśnić mechanizmy choroby wywołane przez warianty genetyczne, idealnie jest stosować modele eksperymentalne, w których wszystkie zmienne są identyczne z wyjątkiem wariantu przyczynowego, co umożliwia dokładne porównania fenotypowe. Linie komórkowe edytowane genomem oraz modele zwierzęce z korygowanymi wariantami są często wykorzystywane jako kontrolne dla zaburzeń genów jądrowych. Jednak naprawa wariantów mtDNA pozostaje technicznie trudna, nawet przy zaawansowanych technologiach edycji genomu7. Dlatego ustanowienie modeli eksperymentalnych o identycznym tle jądrowym pozostaje wyzwaniem. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystaliśmy dwie linie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzące od tego samego pacjenta z MELAS, które różnią się jedynie poziomem heteroplazmy (tj. udziałem mitochondrialnego DNA zawierającego MT-TL1 m.3243A>G wariant8) oraz wygenerowaliśmy organoidy mózgowe jako model choroby. Chociaż poziomy heteroplazmy mogą się wahać podczas przekazywania lub różnicowania komórek, potencjalnie wpływając na fenotypy i powodując zmienność wyników eksperymentalnych partia do partii, komórki pochodzące od pacjentów z wariantami genów mitochondrialnych pozostają cenne do badania patogenezy chorób.

W tym badaniu wygenerowaliśmy organoidy mózgowe z iPSC pochodzących od pacjenta z MELAS i badaliśmy ich patofizjologię, aby lepiej zrozumieć mechanizmy chorobowe. Korzystając z dwóch linii iPSC o wysokim i niskim poziomie heteroplazmy, zaobserwowaliśmy istotne różnice w wydajności indukcji nerwowej, które korelowały ze stopniem heteroplazmy. Nasze ustalenia sugerują, że organoidy mózgowe oparte na iPSC pochodzące od pacjentów stanowią cenną platformę do wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw MELAS oraz ułatwiania badań przesiewowych leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie linie iPSC (2-6 i 2-8) zostały wyprowadzone z tych samych fibroblastów pacjentów z MELAS przy użyciu dobrze ugruntowanych metod8. Różnią się jedynie poziomem heteroplazmy. Linia iPSC 414C2 ustanowiona u zdrowego człowieka została użyta jako kontrola. Protokół użyty w tym badaniu był zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Wydziału Medycznego Uniwersytetu Kitasato (#G22-02).

1. Hodowla komórkowa

  1. Rozmrażanie zamrożonych komórek
    1. Przygotuj płytki z 6 dołkami, pokrywając lamininą zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Podgrzej podłoże hodowlane iPSC bez pokarma zawierające inhibitor ROCK 10 μM do 37 °C.
    3. Pobierz zamrożoną fiolkę iPSC ze zbiornika z ciekłym azotem (LqN2) i szybko rozmroz w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    4. Przełóż rozmrożone zawieszenie do 10 mL podgrzewanego medium. Wirówka w 120 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (22 °C).
    5. Ostrożnie usuń supernatant i delikatnie ponownie zawiesij pellet, stukając w rurkę. Dodaj świeże podłoże i komórki nasion do płytek z sześcioma dołkami wstępnie pokrytymi lamininą. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2.
  2. Zmiana medium
    1. Wymieniaj podłoże (bez inhibitora ROCK) co 1-2 dni.

2. Generowanie organoidów mózgowych

  1. Inicjacja różnicowania (Dzień 0)
    1. Usuń podłoże z płytek hodowlanych iPSC (~70-80% konfluentnych). Przemyj komórki PBS.
    2. Dodaj roztwór enzymów i inkubuj w 37 °C przez 5 minut.
    3. Dodaj podłoże, żeby zatrzymać reakcję. Przełóż ogniwa do probówki 15 mL. Wirować w 190 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (22 °C).
    4. Ponownie zawiesić pellet w 1 mL pożywki różnicowej zawierającej inhibitor ROCK 30 μM, SB431542 5 μM oraz 2,5 μM IWP-2.
      UWAGA: Podstawowy nośnik jest taki sam jak w kroku 1.1.2.
    5. Policz komórki. Nasiono 3 × 103 komórek po 100 μL na dołek w płytkach o kształcie litery U, 96 dołków i o niskim przyczepaniu. Inkubuj przez 6 dni w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  2. Zmiana średniego (Dzień 6)
    1. Przenieś organoidy (od etapu 2.1.5) z płyty z 96 dołkami do naczynia o średnicy 10 cm za pomocą pipety o szerokim przełęcie. Do każdego dołku nowej płyty 96-dołowej należy dodać 50 μL pożywki (DMEM/F12 z 1% N2, 1% substytutu glutaminy, 1% NEAA, 2,5 μM IWP-2, 5 μg/mL siarczanu heparanu oraz 1% PS).
      UWAGA: Używaj pipetek o szerokim przełęczeniu podczas przenoszenia organoidów, aby nie zakłócać ich struktury 3D. Dodatkowo, pipety 8-kanałowe są pomocne do szybkiego i dokładnego wykonywania eksperymentów.
    2. Zbieraj organoidy do probówek po 2 mL. Ostrożnie usuń podłoże, aby nie zasysać organoidów i dodaj 1,5 mL DMEM/F12. Powtarzam 3 razy, aby umyć organoidy.
    3. Usuń podłoże i dodaj 500 μL świeżego medium do rurek z organoidami. Przenieś wszystkie organoidy do naczynia o średnicy 10 cm, a następnie dodaj 5 ml medium, aby ułatwić wyłapywanie każdego organoidu.
    4. Pobierz pojedynczy organoid za pomocą mikropipety ustawionej do 50 μL i przenieś go do jednego dołku z płytą 96-dołkową. Powtarzaj, aż wszystkie organoidy zostaną przeniesione na płytę 96-dołkową (ostateczny pojemność 100 μL). Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  3. Zmiana średniego (dzień 9)
    1. (Opcjonalnie) Przenosi organoidy do naczynia o średnicy 10 cm, używając pipetek 8-kanałowych. Pomiń krok 2.3.1 przy użyciu mikropipet jednokanałowych i przejdź do kroku 2.3.2.
    2. Zbieraj organoidy do probówek po 2 mL. Myj 3 razy DMEM/F12 jako krok 2.2.2.
    3. Ponownie zawiesz w ośrodku różnicującym (1:1 DMEM/F12 i neurobazalny) zawierającym 1% N2, 2% B27 bez witaminy A, 100 μM 2-merkaptoetanolu (ME), insulinę 2,5 μg/mL, 1% substytut glutaminy, 0,5% NEAA oraz 1% ekstrakt z błony podstawnej.
      UWAGA: Przygotuj małe aliquoty ekstraktu z błony podstawowej do jednorazowego użytku i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu potrzeby. Ekstrakt rozmroź w temperaturze 4 °C, nie pozwalając mu przekroczyć 8 °C, następnie wymieszaj go z zimnym medium i podgrzej w temperaturze pokojowej przez około 30 minut.
    4. Przenieś ~10 organoidów na odwierć do płytki z 6 dołkami. Dostosuj końcową objętość medium dla 1 dołka do 2 mL. Hodować statycznie przez 6 dni w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  4. Zmiana średniego (dzień 15)
    1. Zbieraj organoidy do probówek o pojemności 15 mL. Zostaw rurkę nieruszoną, aż wszystkie organoidy się osiedlą. Usuń supernatant i dodaj świeże medium różnicujące (to samo co krok 2.3.3, ale z B27 + witaminą A).
      UWAGA: Zazwyczaj organoidy osiadają na dnie rurki bez wirowania. Jednak małe organoidy pochodzące z iPSC pacjentów mogą nie opadać efektywnie. W takim przypadku wiruj rurki w 120 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać organoidy.
    2. Przenieś ~10 organoidów na odwierć do płytki z 6 dołkami. Hodować statycznie przez 15 dni w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
    3. Wymieniaj medium co 5-7 dni aż do 30. dnia.

3. Dysocjacja organoidów mózgowych dla kultury 2D (Dzień 30)

  1. Powłoki powłokowe poli-L-ornityną (PO)
    1. Przygotuj roztwór PO, rozpuszczając 10 mg PO w 66,7 mLH2Oi przygotowując małe aliquoty do jednorazowego użytku. Przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Rozcieńcz roztwór PO 1:5 H2O i pokryj płytki hodowlanymi rozcieńczonym roztworem. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Powłoka lamininowa
    1. Usuń PO i myj studnie 3 x 5 minut PBS.
    2. Dodaj lamininę (1:1 000 w PBS) i inkubuj w 37 °C przez 3 godziny lub przez całą noc.
      UWAGA: Roztwór stockowy lamininy to 1 mg/mL. Przygotuj małe aliquoty i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu potrzeby.
  3. Dysocjacja do pojedynczych neuronów
    1. Rozmroź roztwór dysocjacyjny w 4 °C przez 1 godzinę przed użyciem.
    2. Przełóż organoidy do rurki o pojemności 15 ml i pozostaw ją niezakłóconą, aż wszystkie organoidy się osiedlą. Usuń supernatant i dodaj 5 ml PBS, aby przepłukać organoidy.
    3. Po usunięciu PBS dodaj 1 ml roztworu enzymatycznego i delikatnie pipetuj 1–2 razy. Inkubować w 37 °C przez 5 minut; pipetować kilka razy. W razie potrzeby inkubuj przez dodatkowe 2–3 minuty. Pipeta ponownie, aż całkowita dysocjacja.
    4. Wiruj w 200 × g przez 5 minut. Usuń supernatant, dodaj 1 ml roztworu dyspersyjnego i pipetę.
    5. Roztwór izolacyjny warstw pod spodem i wirówka w 200 × g przez 5 minut.
    6. Dodaj 1 ml pożywki neuronalnej (neurobazalnej z 1% B27, 0,25% substytutut glutaminy, 1% PS) i wymieszaj. Przepuszcz zawieszenie przez sitko o średnicy 70 μm do rurki 50 mL.
    7. Policz komórki. Komórki nasienne o wielkości 1× 105 komórek/cm 2 na płytkach pokrytych PO/lamininą. Wymieniaj średni co 4-7 dni aż do 60. dnia.

4. Pozyskiwanie komórek i organoidów do analizy komórkowej i molekularnej

  1. Utrwalanie organoidów w immunofluorescencji (dzień 30)
    1. Zbieraj organoidy (krok 2.4.3) do mikrorurek.
    2. Usuń medium ostrożnie, aby nie zasysać organoidów, i dodaj 1 ml PBS, aby płukać organoidy.
    3. Ostrożnie usuń PBS, aby nie zasysać organoidów, i dodaj 4% paradehydu (PFA), aby utrwalić przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Myj 3 razy PBS.
    5. Przechowuj w temperaturze 4 °C do użycia.
  2. Pobranie organoidów do RT-qPCR (dzień 30)
    1. Przenieś organoidy (krok 2.4.3) do mikrorurek. Myj PBS zgodnie z krokiem 4.1.2.
    2. Dodaj bufor lizowy i zamroz na szybko, w ciekłym azocie (LqN2). Przechowywać w temperaturze −80 °C do czasu użycia.
  3. Utrwalanie komórek w immunofluorescencji (dzień 60)
    1. Usuń podłoże hodowlane i dodaj PBS do przepłukania komórek.
    2. Utraż 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń PFA i dodaj PBS do mycia komórek. Powtórz ten krok 3 razy.
    4. Przechowuj w temperaturze 4 °C do użycia.

5. RT-qPCR

  1. Ekstrahować całkowite RNA z organoidów zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
  2. Synteza cDNA z 1 μg całkowitego RNA przygotowanego w kroku 5.1 zgodnie z instrukcjami producenta zestawu w całkowitej objętości reakcji 20 μL.
  3. Wykonaj ilościowe PCR z użyciem następujących starterów: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Ustaw końcowe stężenie dla każdej reakcji następująco: 1x fluorescencyjne mieszanki główne, 0,25 μM zapalnika do przodu, 0,25 μM do przodu zapalnika. Całkowita objętość reakcji wynosi 15 μL, w tym 0,2 μL cDNA od etapu 5.2. Stosuj następujące warunki PCR: początkowa denaturacja w 95 °C przez 1 minutę; 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s.
  4. Normalizuj ekspresję FOXG1 do ACTB jako wewnętrznej kontroli.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Inkubuj organoidy (dzień 30) w 10% sacharozy przez 1 godzinę w 4 °C, następnie 30% sacharozy przez ≥3 godziny w 4 °C.
  2. Zamontuj organoidy w ośrodku osadzonym i przygotuj kriosekcję (10 μm) za pomocą kriostatu. Przechowywać fragmenty na szkłach do przesuwania w temperaturze −20 °C do czasu użycia.
  3. Usuń medium do osadzania przez mycie PBS (2 x 5 min).
  4. Przepuszczać 0,3% PBST przez 10 minut. Myj PBS.
  5. Blokuj 10% normalną surowicę kozią w 0,1% PBST przez 1 godzinę. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z głównymi przeciwciałami: anty-FOXG1 (1:200), anty-TUBB3 (1:500-1:1000). Myj 3 razy PBS.
  6. Inkubuj z przeciwciałem wtórnym (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) przez 1 godzinę. Myj 3 razy PBS.
  7. Zamontuj i obserwuj pod mikroskopem konfokalnym.

7. Analiza heteroplazmy

  1. Zbieraj iPSC za pomocą skrobaków do komórek i przenosi je do mikrorurek. Dodaj 0,5 mL PBS i wiruj w 100 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i przejdź do kroku 7.2.
  2. Ekstraktuj całkowite DNA zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
  3. Ustaw końcowe stężenie dla każdej reakcji PCR: 1x fluorescencyjna mieszanka główna, 0,25 μM zapalnika do przodu, 0,25 μM do przodu podkładu. Całkowita objętość reakcji wynosi 15 μL, w tym 50 ng całkowitego DNA od etapu 7,2. Stosuj następujące warunki PCR: początkowa denaturacja w 95 °C przez 1 minutę; 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s. Sekwencje pierwsze są następujące: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ do przodu: gccaggaggtgtcttcgctgta; FBXO15_ reverse: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Użyj wartości progowych cyklu do obliczenia liczby kopii mitochondrialnego DNA (mutant vs typ dziki).
  5. Normalizuj do numeru kopii genu nuklearnego FBXO15 .

8. Ocena rozmiaru i kształtu organoidów

  1. Rejestruj obrazy organoidów za pomocą mikroskopu w formacie TIFF.
  2. Mierz rozmiar i okręgowość za pomocą otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazów. Otwórz pliki TIFF zapisane w kroku 8.1, klikając File | Otwórz i wybierz plik. Wybierz zawarcia wolnoręczne i obrysuj organoid. Następnie kliknij Analizuj | Zmierz. Wartości powierzchni i obiegu w wynikach zostały wykorzystane w analizie w kroku 8.3.
  3. Przeanalizuj dane, wykonując test t, aby ocenić, czy występują istotne różnice w porównaniu z liniami kontrolnymi, korzystając z oprogramowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wygenerowaliśmy organoidy mózgowe i przeprowadziliśmy 2D hodowle neuronalne za pomocą stosunkowo prostego protokołu z drobnymi modyfikacjami na podstawie Nakamury i in.9 (Rysunek 1). W poprzednim protokole stosowano płytki o kształcie V z 96 dołkami, podczas gdy w tym badaniu zastosowaliśmy płytki o niskim przyczepie w kształcie U o kształcie U, aby umożliwić naturalne gromadzenie się komórek w centrum każdego dołku. Korzystając z zdrowej kontrolnej linii iPSC 414C2, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy indukowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESC)/iPSC stanowią obiecujące modele chorób dla rzadkich, trudnych do leczenia chorób, podczas gdy generowanie organoidów mózgowych zazwyczaj wymaga wydłużonych okresów hodowli trwających kilka miesięcyi 10 oraz użycia kosztownego sprzętu, takiego jak inżynierski pojemnik, który nieustannie miesza pożywkę hodowlową i utrzymuje stabilne warunki do długoterminowej hodowli komórek 3D. W tym badaniu ustaliliśmy organoidy mózgowe w kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

414C2 iPSC pozyskano z RIKEN BRC. Wsparcie finansowe zapewniły JSPS KAKENHI (24H00648 dla M.F., 23K08971 dla C.S.) oraz AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 dla M.F.). Prace te były wspierane przez stypendium Niemieckiej Służby Wymiany Akademickiej (DAAD) dla F.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie do hodowli komórek o średnicy 10 cmCorning353003
Płytka 6-dołkowa – powierzchnia bardzo niskiego przyczepuCorning3471
70 & mu; Sitnik komórek MCorning352350
AccutaseNacalai tesque12679-54enzymy używane do dysocjacji iPSC
Suplement B27Thermofischer scientific17504001
Suplement B27 minus witamina AThermofischer scientific12587010
β-merkaptoetanol (2-ME)SigmaM3148Usuwaj zgodnie z zasadami instytucji.
Wielopłytkowa hodowla 6-dołkowaCorning353046
Wskazówka Cell SaverBMBio ECOBMT-200WSzerokoprzeciążeniowy grot pipettowy
Skrobaki komórekSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Mikroskop konfokalnyZeissLSM710
KriostatLeicaCM3050
Laminin myszy hodowlanej 1R& D3400-010-02stosowany do nakładania płytek w kulturach 2D neuronów dysocjowanych
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Medium montażowe fluorescencyjneDAKOS302380-2Medium montażowe
Przeciwciało FOXG1abcamab196868
GlutamaxThermofischer scientific35050061
Przeciwciało przeciwkozłowe przeciw myszom (H+L) z wysoce krzyżowo adsorbowanym przeciwciałem wtórnym, Alexa Fluor plus 488Thermofischer scientificA32723
Przeciwciało przeciw kozie IgG (H+L) o silnej krzyżowej adsorbcji, Alexa Fluor plus 555Thermofischer scientificA32732
Siarczan heparanu (HS)SigmaH7640
Zestaw RNA-cDNA o wysokiej pojemnościThermofischer scientific4387406Wykorzystywane do syntezy cDNA z RNA
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJWersja 1.52aSłużył do pomiaru rozmiaru i okrągłości organoidów
jedwab iMatrix-511Takara Bio Inc.892021powłoka do płyt do hodowli iPSC
insulinaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810Wykorzystywane do robienia zdjęć do Rysunku 3A
LSM710Carl Zeiss AGMikroskop konfokalny
LSM980Carl Zeiss AGMikroskop konfokalny
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
Suplement N2Thermofischer scientific17502001
Ośrodek neurobazalnyThermofischer scientific21103049
Rozwiązanie do dysocjacji neuronów;FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
Aminokwasy nieistotne (NEAA)Nacalai tesque06344-56
Normalne surowiczki kozyJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunklonowa sfera 96-studnia, nunklonowa sfera obtraktowana, mikropłytka w kształcie litery U na doleThermofischer scientific174929
paraformaldehyd (PFA)Nacalai tesque09154-85Usuwaj zgodnie z zasadami instytucji.
PBSNacalai tesque14249-24
PBSNacalai tesque27575-31
Penicylina/streptomycyna (PS)Nacalai tesque26253-84
Poli-L-ornityna (PO)SigmaP3655
Polioksyetylen(10) Eter oktylfenylowy (Triton)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadWersja 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit & nbsp;QIAGEN51304Wykorzystywane do wyodrębniania całkowitego DNA
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Wykorzystywane do ekstrakcji całkowitego RNA
SB-431542Cayman Chemical13031
Okulary przesuwaneMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Npodłoże używane do hodowli nierozróżnionych iPSC oraz od Dnia T0 do Dnia 6
SacharozaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Ośrodek kriokonserwacyjny
Przeciwciało TUBB3PromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021Inhibitor ROCK
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (edycja)oprogramowanie do analizy wykonanych obrazów  z mikroskopem konfokalnym (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (edycja niebieska)oprogramowanie do analizy wykonanych obrazów  z mikroskopem konfokalnym (LSM980)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zesp MELASindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystegenerowanie organoid wtworzenie sieci neuronalnychpoziomy heteroplazmiiwysokoprzepustowe przesiewaniebarwienie immunofluorescencyjneanaliza RT qPCR

Powiązane artykuły