Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Granula Ganzhirong hamuje glukoneogenezę wątroby poprzez oś SIRT3-MPC1-PC/PDH w cukrzycy typu 2

416 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

12 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie to badało, czy granula Ganzhirong łagodzi hiperglikemię w cukrzycy typu 2 poprzez hamowanie glukoneogenezy wątroby za pomocą osi SIRT3-MPC1-PC/PDH.

Streszczenie

Cukrzyca typu 2 (T2DM) to globalne zaburzenie metaboliczne charakteryzujące się insulinoopornością wątroby oraz nadmierną glukoneogenezą. Granula Ganzhirong (GZRG), tradycyjna formuła medycyny chińskiej, wykazuje potencjał w leczeniu T2DM, jednak jej podstawowe mechanizmy, szczególnie w kontekście glukoneogenezy wątroby, pozostają niejasne. Badanie to badało, czy GZRG łagodzi hiperglikemię poprzez modulację szlaku sygnalizacyjnego pośredniczonego przez SIRT3. Działanie przeciwcukrzycowe GZRG oceniano u myszy indukowanych wysokotłuszczową dietą (HFD) z T2DM oraz u komórek insulinoopornych na insulinę HepG2 indukowanych przez dietę tłuszczową (HFD). Oceniono parametry metaboliczne, tolerancję glukozy i pirorurianianu, wrażliwość na insulinę oraz profile lipidowe. Mechanizmy molekularne zostały zbadane poprzez nadekspresję i obniżenie poziomu SIRT3, badając ekspresję kluczowych białek (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 i G6Pase) w szlaku glukozogenicznym. Leczenie GZRG znacząco złagodziło hiperglikemię, zwiększyło wrażliwość na insulinę oraz poprawiło metabolizm lipidów zarówno u myszy z cukrzycą typu 2, jak i komórek insulinoopornych (IR) HepG2. Hamował śnieżnictwo wątroby i hamował glukoneogenezę. Mechanicznie GZRG obniżył ekspresję SIRT3, co doprowadziło do jednoczesnych obniżeń poziomów MPC1 i PC oraz wzrostu PDH-E2. Ta zmiana ekspresji białek przekierowała metabolizm pirorowitanów z dala od glukoneogenezy. Nadmierna ekspresja SIRT3 odwróciła działanie hamujące GZRG na glukoneogenezę, podczas gdy knockdown SIRT3 synergizował z GZRG. GZRG łagodzi T2DM, hamując glukoneogenezę wątroby przez oś SIRT3-MPC1-PC/PDH. Te odkrycia wyjaśniają nowy mechanizm molekularny GZRG i podkreślają SIRT3 jako potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu T2DM.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 2 (T2DM) stała się jednym z najbardziej rozpowszechnionych i wyniszczających przewlekłych zaburzeń metabolicznych na świecie, stanowiąc poważne obciążenie dla zdrowia publicznego i gospodarczego 1,2. Charakteryzując się insulinoopornością (IR) oraz postępującą dysfunkcją β komórek trzustki, T2DM jest głównie wywoływana przez zaburzenia homeostazy glukozy i lipidów 3,4. Spośród wielu narządów zaangażowanych w regulację glukozy, wątroba odgrywa centralną rolę, kontrolując endogenną produkcję glukozy poprzez glikogenolizę i glukoneogenezę5. Nadmierna glukoneogeneza wątrobowa jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do hiperglikemii na czczo, będącej znakiem rozpoznawczym patofizjologii T2DM, i stanowi kluczowy cel terapeutyczny dla przywrócenia równowagi glukozy6.

Obecne leki hipoglikemiczne — w tym metformina7, tiazolidydiony8, agoniści receptorów GLP-19 oraz inhibitory SGLT210 — osiągają kontrolę glikemiczną poprzez różne mechanizmy, jednak ich długotrwałe stosowanie często jest ograniczone przez skutki niepożądane, spadek skuteczności lub nietolerancję leczenia. W konsekwencji rośnie zainteresowanie komplementarnymi lub alternatywnymi podejściami terapeutycznymi, które mogą bezpiecznie i skutecznie celować w wiele szlaków metabolicznych. Tradycyjna medycyna chińska (TCM), charakteryzująca się wieloma i wielocelowymi właściwościami farmakologicznymi, oferuje obiecujące perspektywy w leczeniu złożonych chorób metabolicznych, takich jak T2DM 11,12,13,14,15. Kilka klasycznych formuł TCM zgłoszono, że łagodzą insulinooporność, poprawiają metabolizm lipidów oraz hamują glukozogenezę wątrobową dzięki zintegrowanym mechanizmom regulacyjnym16,17.

Granula Ganzhirong (GZRG) to standaryzowana formuła TCM z historią klinicznego stosowania w leczeniu zaburzeń metabolicznych. GZRG to ziołowe preparaty składające się z ośmiu ziół leczniczych. Na podstawie naszych wcześniejszych badań fitochemicznych i farmakologicznych w GZRG zidentyfikowano szereg związków bioaktywnych, w tym między innymi kwas Salvialowy B, D-stachyozę, proantocyjanidy, kwas szczawiowy fioletowy, kwas salwianolowy A, kwas Salwianolowy C, glukozyd kalikosyny 7, 3′-metoksypuerarynę, 3′-hydroksypuerarynę, apigeninę-7-0-beta-d-pyrano, emodynę-8-O-β-D-glukozę, chryzofanol-1-O-glukozyd, chryzofanol-8-O-glukozyd, Puerarin, kwas rozmarynowy, Kryptotanshinon, katechina, ft-nyflawina, kalikosyna, ren, guanozyna, kwas oleinowy, aloesowa emodyna, formononetyna, kwas palmitowy, chryzofanol, D-tryptofan, danshensu, kwas ferulinowy, manitol, kwas galowy oraz L-fenylolanina. Fundamentalną zaletą tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) w leczeniu cukrzycy typu 2 są jej wieloskładnikowe i wielocelowe działania synergistyczne. Dziesiątki aktywnych składników zawartych w GZRG prawdopodobnie oddziałują z wieloma procesami biologicznymi – takimi jak szlaki sygnalizacji insuliny, metabolizm glikogenu oraz reakcje zapalne – co powoduje efekt zintegrowanej sieci, którego nie da się odpowiednio odtworzyć przez żaden pojedynczy oczyszczony związek18. Wcześniejsze badania wykazały, że GZRG wywiera korzystny wpływ na metabolizm glukozy i lipidów w modelach diabetycznych19; jednak dokładne mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych efektów pozostają niejasne. W szczególności nie zostało jeszcze wyjaśnione, czy GZRG działa przeciwcukrzycowe poprzez modulację sygnalizacji glukoneogenicznej wątroby.

Sirtuina 3 (SIRT3), mitochondrialna deacetylaza zależna od NAD⁺, jest kluczowym regulatorem homeostazy energii komórkowej20. Poprzez deacetylację i aktywację kluczowych enzymów metabolicznych, SIRT3 wpływa na mitochondrialną fosforylację oksydacyjną, utlenianie kwasów tłuszczowych oraz glukoneogenezę21. Nieprawidłowa ekspresja SIRT3 została powiązana z patogenezą insulinooporności, stłuszczenia wątroby oraz T2DM22,23. Dowody wskazują, że nadekspresja SIRT3 w wątrobie zwiększa przepływ glukoneogeniczny poprzez modulację enzymów takich jak nośnik pirowierianianu mitochondrialnego 1 (MPC1)24, karboksylaza piruwanianowa (PC)25, dehydrogenaza piruwanianowa (PDH)26, fosfoenolpiruwanowa karboksykinaza (PCK1)27 oraz glukoza-6-fosfataza (G6Pase)28. W związku z tym kontrola metabolizmu pirorozianianu podporządkowana SIRT3 stanowi kluczowy węzeł łączący funkcję mitochondriów z wydaleniem glukozy wątrobowej, czyniąc SIRT3 atrakcyjnym celem do interwencji terapeutycznej w T2DM.

Biorąc pod uwagę ustalone efekty metaboliczne bioaktywnych składników w GZRG oraz centralną rolę SIRT3 w homeostazie glukozy wątrobowej, postawiono hipotezę, że GZRG łagodzi hiperglikemię w T2DM poprzez modulację szlaku glukozogenicznego pośredniczonego przez SIRT3. Aby ocenić tę hipotezę, wpływ GZRG na metabolizm glukozy i lipidów oceniono u myszy z cukrzycą 22 indukowaną dietą tłuszczową (HFD) oraz u komórek insulinoopornych na HepG2 indukowanych przez dietę wysokotłuszczową (HFD). Dalsze badania analizowały udział osi sygnalizacyjnej SIRT3-MPC1-PC/PDH w pośredniczeniu w działaniu hamującym GZRG na glukoneogenezę wątroby. Celem tego badania jest wyjaśnienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw korzyści metabolicznych GZRG oraz dostarczenie dowodów eksperymentalnych potwierdzających jego potencjał terapeutyczny jako wielocelowego modulatora w leczeniu T2DM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół badań na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Changchun (zatwierdzenie nr 2024396). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z krajowymi wytycznymi oraz odpowiednimi krajowymi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt.

Leki eksperymentalne
GZRG (numer 26210483) został dostarczony przez Szpital Afiliowany Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Changchun (Jilin, Chiny). Główne bioaktywne składniki i parametry kontroli jakości GZRG zostały scharakteryzowane w poprzednim badaniu18.

Odczynniki i przeciwciała
Do ilościowej oceny glukozy, glikogenu, nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych (NEFA), trójglicerydów (TG), cholesterolu całkowitego (TC), cholesterolu o wysokiej gęstości (HDL) oraz cholesterolu lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) używano w zestawach testowych. Zestawy enzymatycznego immunosorbentu (ELISA) dla glikozylowanej hemoglobiny i insuliny zostały również uzyskane komercyjnie. Zestawy ELISA dla dehydrogenazy piruwianowej (PDH) oraz karboksylazy pirorozianianowej (PC) również zostały pozyskane komercyjnie. Do badań RNA i cDNA komercyjnie zakupiono zestawy RNA Tissue/Cell Kit, qPCR PreMix oraz gDNA RT SuperMix. Transfekcja przeprowadzono za pomocą odczynnika transfekcyjnego. Przeciwciała pierwotne przeciwko SIRT3 (RRID: AB_2837621), fosfoenolpiruwawanie karboksykinazy 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, glukoza-6-fosfataza (G6Pase; RRID: AB_2845572), nośnik pirogroitanów mitochondrialnych 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) oraz dehydrogenazą gliceraldehyd-3-fosforanową (GAPDH; RRID: AB_2833041) zostały zakupione od komercyjnego sprzedawcy.

Myszy i metody leczenia
Samce myszy C57BL/6J (5-6 tygodni) zostały pozyskane w firmie Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. i utrzymywane w standardowych warunkach (22 ± 2 °C, wilgotność 50%-60%, cykl światła/ciemności 12 godzin) z darmowym dostępem do żywności i wody. Po tygodniowym okresie aklimatyzacji sześć myszy zostało losowo wyznaczonych do grupy kontrolnej (Con) i karmionych standardową dietą chow. Pozostałe myszy otrzymywały dietę wysokotłuszczową (HFD) przez 12 tygodni, aby wywołać otyłość i insulinooporność.

W 13. tygodniu myszy wykazujące poziom glukozy na czczo (FBG) ≥ 11,1 mmol/L zostały sklasyfikowane jako udane modele cukrzycy typu 2 (T2DM). Myszy z cukrzycą zostały losowo podzielone na pięć grup eksperymentalnych (n = 6 na grupę): grupa modelowa HFD, niskodawkowa GZRG (L-GZRG, 3,2 g/kg/d), średnia dawka GZRG (M-GZRG, 6,4 g/kg/d), wysoka dawka GZRG (H-GZRG, 12,8 g/kg/d) oraz metformina (Met, 0,2 g/kg/d). GZRG i Met podawano codziennie doustnie przez 8 tygodni. Grupy modeli Con i HFD otrzymały równoważne objętości wody destylowanej. Po zakończeniu okresu leczenia pobrano próbki krwi i tkanek wątroby od wszystkich myszy do dalszej analizy.

Test tolerancji glukozy wewnątrzotrzewnowej (IPGTT), test tolerancji pirojowian (PTT) oraz test tolerancji insuliny (ITT)
Testy tolerancji metabolicznej przeprowadzono między 6 a 8 tygodniami po rozpoczęciu leczenia farmakologicznym. W przypadku IPGTT i PTT myszy były głodzone przez noc (około 16 godzin). Dla ITT wprowadzono krótszy okres postu trwający 4 godziny. Po okresie postu myszy otrzymały dootrzewną zastrzyk glukozy (2 g/kg dla IPGTT), pirogronianu sodu (2 g/kg dla PTT) lub insuliny ludzkiej (1 U/kg dla ITT). Poziomy glukozy we krwi mierzono na podstawie próbek krwi z żyły ogonowej w ciągu 0 minut, 30 minut, 60 minut, 90 minut i 120 minut po podaniu za pomocą skalibrowanego glukometru.

Analiza biochemiczna i testy aktywności enzymów
Poziomy glukozy na czczo (FBG), hemoglobiny A1c (HbA1c) oraz insuliny (INS) zostały określone za pomocą komercyjnych zestawów testowych zgodnie z zaleceniami producenta. Homeostatyczna Ocena Insulinooporności (HOMA-IR) została obliczona według wzoru:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

Poziomy krążenia NEFA, TG, TC, LDL-C, HDL-C oraz aktywności enzymatyczne PDH i PC w tkankach wątroby zostały oszacowane za pomocą odpowiednich zestawów komercyjnych.

Histopatologiczna analiza tkanek wątroby
Świeże tkanki wątroby były utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 24 godziny, po czym nastąpiła standardowa obróbka w celu osadzania parafiny. Przekroje (o grubości 5 μm) były cięte i barwione hematoksyliną oraz eozyną (H&E) w celu ogólnej oceny morfologicznej. Do wizualizacji lipidów wybrane próbki wątroby zostały osadzone w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamrożone na zatrzask snap-stop, kriosekcjonowane i barwione Olejem czerwonym O.

Hodowla komórek i leczenie
Linia komórkowa ludzkiego wątroby HepG2 została pozyskana z Kolekcji Kultury Typowej Chińskiej Akademii Nauk (Chiny). Komórki hodowano w minimalnym ośrodku niezbędnym (MEM) z dodatkiem 25 mM glukozy, 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz 1% penicylin-streptomycyny. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z zawartością 5%CO2.

Aby ustanowić model in vitro insulinooporności (IR), komórki o łączności 70%-80% poddano leczeniu przez 24 godziny mieszaniną wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) zawierającą kwas oleinowy i palmitowy w stosunku molowym 2:1, na podstawie wcześniej opisanej metody z drobnymi modyfikacjami29. Po indukcji FFA pożywka hodowla została zastąpiona świeżym MEM zawierającym tę samą mieszaninę FFA wraz z różnymi stężeniami GZRG na dodatkowe 24 godziny inkubacji.

Badanie żywotności komórek (CCK-8)
Komórki HepG2 w fazie wzrostu logarytmicznego zostały pobrane i zasiane na płytach 96-dołkowych o gęstości 1 x 104 komórek na odwiert. Studnie peryferyjne wypełniono 100 μL jałowej soli fosforanowej (PBS), aby zminimalizować parowanie. Po nocnej inkubacji, aby zapewnić przyleganie, komórki były traktowane zgodnie z projektem eksperymentalnym. Po oczyszczeniu do każdego otworu dodawano 10 μL roztworu CCK-8, a płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Absorpcja przy 450 nm została zmierzona za pomocą czytnika mikropłytek. Żywotność komórek obliczono jako:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

gdzie As to absorpcja próbki, Ac to absorpcja kontroli (nieprzetworzonych komórek), a Ab to absorpcja pustego (dołków bez komórek).

Transfekcja plazmidów w komórkach HepG2
Plazmid nadekspresji SIRT3 (OV-SIRT3) oraz trzy różne małe interferujące plazmidy RNA celujące w SIRT3 (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#) zostały skonstruowane przez producenta. Transfekcje przeprowadzano przy użyciu reagenta transfekcyjnego, gdy komórki osiągnęły łączność 50%-60%. Kompleks transfekcyjny przygotowano w warunkach sterylnych w następujący sposób: Roztwór A powstał przez rozcieńczenie 1 μg DNA plazmidowego w 250 μL zredukowanego medium surowicowego przy delikatnym mieszaniu. Roztwór B przygotowano przez rozcieńczenie 2-3 μL odczynnika transfekcyjnego w 250 μL zredukowanego medium surowicowego, a następnie inkubację w temperaturze pokojowej przez 5 minut bez wirowania. Oba roztwory zostały połączone, delikatnie wymieszane przez pipetowanie i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 30 minut, tworząc kompleksy DNA-lipidowe. W przypadku transfekcji, 1 godzinę przed zabiegiem, podłoże hodowli komórkowe było aspirowane, komórki myto PBS i dodawano 1 ml zredukowanego medium surowicowego (bez surowicy i antybiotyków). Następnie 500 μL kompleksu transfekcyjnego dodawano kropelo do każdego dołku, a płytka hodowla była delikatnie mieszana, aby zapewnić jednorodność. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin, po czym podłoże zostało zastąpione kompletnym podłożem, aby złagodzić cytotoksyczność. Następnie komórki były hodowane przez dodatkowe 24-48 godzin przed dalszą analizą. Efektywność transfekcji oceniono za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Całkowite RNA zostało wyekstrahowane, odwrócone do cDNA i amplifikowane za pomocą starterów specyficznych dla SIRT3 z 18S rRNA jako wewnętrzną kontrolą. Względne poziomy ekspresji zostały określone metodą ΔΔCt, a na podstawie tych wyników wybrano najskuteczniejszy konstrukt siRNA do kolejnych eksperymentów.

Barwienie olejowym czerwonym O dla nagromadzenia lipidów wewnątrzkomórkowych
Komórki HepG2 w fazie logarytmicznej wzrostu zostały zasiane w płytkach 24-dołkowych o gęstości 2 x 105 komórek na dołek i indukowane za pomocą ośrodka wysokolipidowego zawierającego 250 μM kwasu oleinowego i 250 μM kwasu palmitowego przez 48 godzin, aby ustanowić model akumulacji lipidów. Po zabiegu komórki były myte PBS i utrwalane 10% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po płukaniu wodą destylowaną i krótkim zanurzeniu w 60% izopropanolu, komórki zostały zabarwione świeżo przygotowanym roztworem roboczym Oil Red O (uzyskanym przez mieszanie składników A1 i A2 w proporcji 3:2) przez 10-15 minut. Nadmiar barwnika usuwano przez mycie 60% izopropanolem, a następnie przez wodę destylowaną. Jądra były kontrastkolorowane hematoksyliną Mayera (1,0 g/L) przez 1-2 minuty. Po końcowym myciu komórki zostały zamocowane żelatyną glicerolową, a obrazy wykonane za pomocą mikroskopu świetlnego z powiększeniem 200 razy do jakościowej oceny kropelek lipidowych.

Indukcja insulinooporności i ilościowa identyfikacja glukozy w komórkach HepG2
Komórki HepG2 zostały hodowane na płytkach 24-dołkowych o gęstości nasiania 2 x 105 komórek na dołek, aby ustanowić model in vitro insulinooporności. Po 24 godzinach leczenia pobrano supernatant hodowli do dalszej analizy. Do pomiaru glukozy wewnątrzkomórkowej zawiesiny komórkowe były wirowane w stężeniu 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant został odrzucony, a pellet komórki był myty raz lub dwa za pomocą buforu izotonicznego, po czym nastąpiła wirówka w tych samych warunkach. Następnie pellet był homogenizowany w 0,2 do 0,3 mL medium homogenizacyjnego i poddawany ultradźwiękowemu zakłócaniu w kąpieli lodowodowodziej za pomocą sondy o mocy 300 W, z impulsami 3-5 s, po których następowały 30-sekundowe odstępy, powtarzane 3x-5x. Uzyskany homogenat został przebadany bezpośrednio, bez dalszej wirowania. Poziomy glukozy zarówno w supernatancie hodowli, jak i w homogenacie komórki mierzono za pomocą standaryzowanego zestawu do testów glukozy zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić dokładną i powtarzalną ocenę odpowiedzi metabolicznych.

Pomiar zawartości trójglicerydów komórkowych
Komórki HepG2 zostały pobrane przez wirowanie w stężeniu 1000 x g przez 10 minut, a supernatant został odrzucony. Pellet komórkowy był myty 1 lub 2 razy buforem izotonicznym fosforanowym (0,1 M, pH 7,0-7,4), a następnie wirowaniem w tych samych warunkach. Po usunięciu supernatantu pellet został ponownie zawieszony i ujednoliczony z 0,2-0,3 mL etanolu absolutnego. Homogenat był poddawany zakłóceniom ultradźwiękowym na lodzie (300 W, 3-5 s na wybuch, 30 s w odstępach, powtarzane 3-5 razy). Powstały homogenat był używany bezpośrednio do dalszej analizy bez dalszej wirowania. Zorganizowano płytę z 96 dołami oraz pustymi, standardowymi i odwiertami próbkowymi. Po dokładnym wymieszaniu płytka była inkubowana w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a absorpcja powietrza mierzona na 500 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Zawartość trójglicerydów w próbkach komórek została obliczona na podstawie krzywej standardowej wyprowadzonej z serii rozcieńczeń standardów glicerolu.

Pomiar całkowitej zawartości cholesterolu
Komórki HepG2 (5 x 106) były lizowane w 1 mL buforu ekstrakcyjnego przez zakłócenia ultradźwiękowe na lodzie. Homogenat był wirowany w 10 000 x g przez 10 minut w 4 °C, a supernatant pobierano do natychmiastowej analizy. Przygotowano i rozcieńczono seryjne roztwór cholesterolu (50 μmol/mL), aby uzyskać krzywą standardową (0,3125 do 10 μmol/mL). Działający roztwór chromogeniczny przygotowywano przez wymieszanie odczynników jeden, dwa i trzy dostarczonych w zestawie do testów cholesterolu, a następnie podgrzewano do 37 °C. Próbki lub standardy mieszano z roztworem roboczym, inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a absorpcję zmierzono na poziomie 500 nm. Zawartość cholesterolu została obliczona na podstawie krzywej standardowej.

Barwienie immunofluorescencyjne
Komórki wyhodowane na pokrywkach były płukane lodowatym PBS i utrwalane 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po płukaniu PBS komórki były przepuszczane 0,1% Triton X-100 przez 10 minut i blokowane 5% BSA w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie komórki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem anty-SIRT3 (rozcieńczenie 1:500) w temperaturze 4 °C przez noc. Po płukaniu PBS komórki były inkubowane z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym (rozcieńczenie 1:2000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Jądra były barwione DAPI (0,5 μg/mL) przez 10 minut. Pokrywki montowano na szklanych szkiełkach za pomocą medium anty-fade i były wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Ekstrakcja RNA i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane z komórek za pomocą zestawu RNA Tissue/Cell Kit. Usunięto DNA genomowe, a cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu gDNA RT. Ilościowe PCR przeprowadzono za pomocą zestawu qPCR na systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym. Sekwencje primerów specyficzne dla genów przedstawiono w Tabeli 1.

Analiza zachodniej plamy
Do ekstrakcji białka z tkanek wątroby ważono około 50-200 mg tkanki, posiekano w szalce Petriego i przelano do homogenizatora. Dodano bufor lizy wstępnie schłodzony (RIPA buffer) wzbogacony o inhibitory proteazy i fosfatazy, aby zapobiec degradacji białek. Homogenizację przeprowadzono dokładnie na lodzie, aby zapewnić całkowite uszkodzenie tkanek, a homogenat przeniesiono do rurki wirówki i inkubowano na lodzie przez 30 minut, aby ułatwić rozpuszczalność białek. Następnie homogenat był wirowany w 4 °C przy 12 000 x g przez 10-30 minut, a supernatant był starannie zbierany jako całkowity ekstrakt białkowy, unikając skażenia granulką. Do ekstrakcji białek komórkowych dodawano do komórek wstępnie schłodzony bufor lizowy (bufor RIPA zawierający 1% Triton X-100 i inhibitory proteazy), po czym nastąpiła inkubacja na lodzie przez 15-30 minut, aby uzyskać pełną lizę. Zakłócenie komórek zapewniano poprzez wielokrotne skrobanie skrobakiem komórkowym lub intensywne pipetowanie. Lizat był przelewany do rurki wirówki i wirowany w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g przez 30 minut, a supernatant pobierano jako całkowity ekstrakt białkowy. Stężenie białka było ilościowo określane za pomocą zestawu do analizy białek BCA, a aliquoty przechowywano w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz Western blot lub używano bezpośrednio do przygotowania próbki. Próbki białek były denaturowane w buforze Laemmli w temperaturze 100 °C przez 10 minut, rozdzielane przez SDS-PAGE i przenoszone na membrany PVDF. Błony były blokowane 5% mlekiem beztłuszczowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowane z określonymi przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4 °C. Po płukaniu błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą podłoża o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Sygnały chemiluminescencyjne zostały przechwycone, a intensywności pasm kwantyfikowane za pomocą analizy densytometrycznej za pomocą oprogramowania ImageJ. Surowe zachodnie plamy są zawarte w Pliku Uzupełniającym 1.

Analiza statystyczna
Wszystkie dane wyrażane są jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Porównania statystyczne między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą testu t-test niesparowanego ucznia. Do porównań między trzema lub więcej grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya dla wielu porównań. Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (wersja 9.5.0). Wartość p poniżej 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

GZRG złagodził insulinooporność i glukoneogenezę u myszy wywołanych HFD z T2DM
Model myszy wywołany przez HFD cukrzycą typu 2 (T2DM), charakteryzujący się insulinoopornością, hiperglikemią i dyslipidemią, jest szeroko stosowany do badania patogenezy chorób i oceny interwencji terapeutycznych30. W niniejszym badaniu opracowano model T2DM indukowany HFD u myszy C57BL/6J, aby ocenić skuteczność i mechanizmy leżące u podstaw GZRG.

W porównaniu z grupą ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie wykazuje, że GZRG wywiera istotne działanie antyhiperglikemiczne i insulinowe zarówno w modelach in vivo , jak i in vitro T2DM, głównie poprzez tłumienie glukoneogenezy wątroby poprzez modulację osi SIRT3-MPC1-PC/PDH. Dane eksperymentalne wskazują, że podawanie GZRG osłabiło hiperglikemię na czczo, poprawiło tolerancję glukozy i insuliny, przywróciło homeostazę lipidów oraz zmniejszyło steatozę wątroby u myszy wywołanych HFD. Równolegle leczenie GZRG zwiększało wykorzystanie glukozy, z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane z Planu Rozwoju Nauki i Technologii prowincji Jilin, numer grantu 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FastKing gDNA rozpraszanie RT SuperMix     Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chiny).KR118-02
Przeciwciało glukoza-6-fosfataza (G6Pase)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-D-12610
Przeciwciało gliceraldehyd-3-fosforanowa dehydrogenaza (GAPDH)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-T-0004
Zestawy ELISA do hemoglobiny z glikozylą, czyli do analizy oraz    Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Chiny).MM-0159M2
GZRGSzpital afiliowany Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Changchun (Jilin, Chiny)26210483
Zestawy do testowania cholesterolu lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL)Instytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)A112-1-1
Zestawy insulinowe ELISAJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Chiny).MM-0579M2
Lipofektamina2000 Invitrogen, USA11668-019
Zestawy do testowania cholesterolu o lipoproteinach o niskiej gęstości (LDL)Instytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)A113-1-1
Zestawy do pomiaru glukozyInstytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)F006-1-1
Nośnik pirogroiranu mitochondrialnego 1 (MPC1) PrzeciwciałoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-D-3852
Zestawy do testowania nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych (NEFA)Instytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)A042-2-1
Przeciwciało PCWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-D-4364
Przeciwciało PDH-E2Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-D-14046
fosfoenolpiruwanowa karboksykinaza 1 (PCK1) PrzeciwciałoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-D-6770
karboksylaza piruwana (PC) zestawy ELISA Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-160408H
Zestawy ELISA do dehydrogenazy piruwanowej (PDH)   Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit & nbsp;  Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chiny).DP451
Przeciwciało SIRT3Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chiny)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chiny).FP209-02
Zestawy do testowania cholesterolu całkowitego (TC)Instytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)A110-1-1
Zestawy do testowania trójglicerydów (TG)Instytut Bioinżynierii Jiancheng w Nankinie (Chiny)A111-1-1

Bibliografia

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

szlak SIRT3insulinoopornośćmetabolizm pirogronianukomórki HepG2ekspresja białekmetabolizm lipidówtolerancja glukozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.