Optyczne mapowanie elektrofizjologicznych i wapniowych nieprawidłowości w leczeniu przedsionków w modelu szczura z bezpłodnym zapaleniem osierdzia

Podsumowanie

Protokół ten opisuje podwójne optyczne mapowanie napięcia i przejściowych zjawisk wapnia w sercach z bezpłodnym zapaleniem osierdzia szczurów, aby ocenić remodelację przedsionków wywołaną zapalną leżącą u podstaw pooperacyjnego migotania przedsionków.

Streszczenie

Migotanie przedsionków pooperacyjne (POAF) często pojawia się po operacji serca i wiąże się ze zapaleniem przedsionków oraz remodelacją przedsionków. Model bezpłodnego osierdzia (SP) odtwarza tę chorobę u szczurów, stanowiąc cenną podstawę do badania elektrofizjologii przedsionków wywołanej zapaleniem. Protokół ten opisuje przygotowanie serc szczurów perfuzowanych Langendorffem po indukcji SP oraz zastosowanie jednoczesnego podwójnego mapowania optycznego do rejestrowania transbłonowego napięcia i przejściowych przypadków wapnia. Serca są barwione barwnikami wrażliwymi na napięcie RH237 oraz wskaźnikiem wapnia Rhod-2 AM, podczas gdy kurczliwość jest tłumiona za pomocą blebbistatyny, aby zminimalizować artefakty ruchu. Obrazowanie o dużej prędkości umożliwia mapowanie przestrzenno-czasowe potencjałów czynnościowych przedsionków oraz dynamiki wapnia podczas protokołów kontrolowanego tempa. Parametry ilościowe obejmują czas trwania potencjału czynnościowego, prędkość przewodzenia, czas trwania przejściowego przepływu wapnia, czas do szczytu oraz wartość alternanu. Metoda pozwala na precyzyjną ocenę heterogeniczności przewodzenia przedsionków, sprzężenia elektrowapnia oraz podatności na arytmię pod wpływem stresu zapalnego. To wizualizowane podejście zapewnia powtarzalną i wszechstronną platformę do badania mechanizmów POAF oraz testowania interwencji farmakologicznych lub genetycznych ukierunkowanych na remodelację przedsionków.

Wprowadzenie

Migotanie przedsionków po operacji przedsionków (POAF) to częste powikłanie po operacji kardio-torakalnej, charakteryzujące się przejściowymi epizodami migotania przedsionków (AF), które zazwyczaj osiągają szczyt w ciągu 2-4 dni po operacji. Chociaż POAF często jest samoograniczające, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem udaru, dłuższymi pobytami w szpitalu oraz podwyższonymi kosztami opieki zdrowotnej¹. Stres zapalny w mięśniu przedsionkowym jest uważany za kluczowy czynnik jego patogenezy².

Model bezpłodnego zapalenia osierdzia (SP) to dobrze ugruntowany model małych zwierząt do badania POAF ^3,4. W tym modelu aplikacja talcu naepikardzowego wywołuje miejscowy stan zapalny osierdzia, który naśladuje zmiany pooperacyjne. Poprzednie badania z wykorzystaniem tego modelu wykazały przebudowę strukturalną, zmienioną ekspresję złączy szczelin oraz nieprawidłowości w obsłudze wapnia, które predysponują do arytmogenezy ^5,6,7. Jednak konwencjonalne techniki elektrofizjologiczne dostarczają ograniczonych informacji przestrzenno-czasowych, co utrudnia uchwycenie heterogeniczności przewodzenia i dynamiki sprzężenia elektrowapnia na nienaruszonej powierzchni przedsionka.

Mapowanie optyczne umożliwia jednoczesne obrazowanie wysokorozdzielczości napięcia transbłonowego i przejściowych czynników wapniowych (CaT) na powierzchni przedsionka, umożliwiając precyzyjną wizualizację przewodzenia przedsionków, repolaryzacji i sygnalizacji wapnia⁸. W tym protokole opisujemy podwójne mapowanie optyczne w sercach szczurów SP perfuzowanych przez Langendorffa. To podejście pozwala na ilościową określenie prędkości przewodzenia, czasu trwania potencjału czynnościowego (APD), właściwości CaT oraz alternanów przy protokołach kontrolowanego tempa. Integrując ocenę elektryczną i wapniową w przygotowaniu przedsionków zapalnych, metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania mechanistycznych podstaw POAF oraz do testowania ukierunkowanych interwencji terapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) na podstawie ID zatwierdzenia [2024] IACUC numer 4241 i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Przez cały czas badania utrzymywano ścisłe przestrzeganie wytycznych dotyczących dobrostanu zwierząt, z jasno określonymi humanitarnymi celami: szczury wykazujące utrzymującą się ospałość, nagłą utratę masy ciała przekraczającą 20%, zaburzenia oddechowe, niemożność normalnego jedzenia lub picia lub poważne powikłania pooperacyjne były natychmiast uśpione przedawkowaniem izofluranu (5% przy przepływie tlenu przy 1 L/min), aby zminimalizować cierpienie.

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

1. Przygotuj zmodyfikowany roztwór Tyrode (w mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,3 CaCl₂, 1,05 MgCl₂, 1,19 NaH₂PO₄, 20 NaHCO₃, 11,1 glukozy. Rozgrzej 95_{% O2}/5%_CO2, dostosuj pH do 7,38-7,42 i podgrzej do 37 ± 1 °C.
2. Blebbistatyna: rozpuszczać w DMSO (5 mg/mL), przechowywać w temperaturze -20°C, chronić przed światłem. Użyj przy końcowym stężeniu 10 μM.
3. RH237 (barwnik na napięcie): Rozpuszczać w DMSO (2 mg/mL), przechowywać w temperaturze −20 °C, chroniony przed światłem. Użyj przy końcowym stężeniu 2 μM.
4. Rhod-2AM (wskaźnik wapnia): rozpuszcza się w DMSO (1 mg/mL); przechowywać w temperaturze −20 °C, chroniony przed światłem. Użyj przy końcowym stężeniu 0,89 μM.
5. Pluronowy F-127 (Surfaktant): 20% roztwór w DMSO (odczynniki dostępne komercyjnie).
6. Pentobarbital sodu (1%): Rozpuścić 0,1 g w 10 mL soli fizjologicznej do znieczulenia (40 mg/kg, doskołko).
   UWAGA: Obchodzić się z barwnikami i zapasami DMSO z odpowiednią ochroną osobistą; Chronić blebbistatynę i barwniki przed światłem. Przestrzegaj zasad bezpieczeństwa biologicznego i chemicznego.

2. Wyposażenie

1. System Langendorffa z regulacją temperatury (37 ± 1 °C), zbiornikiem, kolumną bąbelkową oraz pompą perystaltyczną (przepływ 10-12 mL/min).
2. Obrazowanie: kamera CMOS o wysokiej prędkości (≥ 1 kHz klatka na sekundę; ≥ 80 × 80 pikseli pola widzenia dla przedsionków), źródło wzbudzenia LED (530 ± 25 nm), dichroiczny rozdzielacz wiązki (~630 nm), filtry emisyjne (Rhod-2 ~590 nm; RH237 >700 nm), obiektyw z regulowaną przysłoną, tablica optyczna z izolacją drgań. Źródło światła wzbudzeniowego: laser LED o maksymalnym prądzie 5 A, zielone światło o maksymalnej mocy 2,2 W.
3. Stymulacja: stymulator o stałym napięciu, elektrody do stymulacji bipolarnej.
4. Fizjologia: elektrody EKG zanurzalne; sondę termistorową; czarne tło podłoża (guma) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia światłem komorowego; precyzyjne narzędzia chirurgiczne; Respirator dla szczurów. Szczegółowy inwentarz jest dostępny w Tabeli Materiałów.

3. Wywołanie bezpłodnego zapalenia osierdzia (SP) u szczurów

1. Znieczulać samce szczurów Sprague-Dawley (200-220 g) 1% pentobarbitalu sodu (40 mg/kg, i.p.). Potwierdź głębokość znieczulenia (utrata odruchu pedałowego).
2. Intubuj szczura za pomocą kaniuli polietylenowej lub metalowej pod bezpośrednią wizualizacją. Ostrożnie przesuwaj rurkę w głąb tchawicy, ustawiając się tuż nad cariną, i zabezpiecz ją, aby zapobiec przemieszceniu. Podłącz się do respiratora ustawionego na objętość pływową 2 mL/100 g, 55 oddechów na minutę, I:E = 1:1. Potwierdź skuteczną wentylację, obserwując symetryczne rozszerzenie klatki piersiowej i stabilne oddychanie.
   UWAGA: Unikaj głębokiego lub płytkiego ułożenia, aby zapobiec intubacji oskrzeli lub przypadkowej ekstubacji.
3. Przygotuj pole operacyjne. Wykonaj małą torakotomię przy-sternalną (druga przestrzeń międzyżebrowa w pobliżu mostka). Delikatnie odsłoń serce.
4. Podnieś grasicę, aby zobaczyć oba przedsionki. Ostrożnie otwórz osierdzie nad powierzchnią przedsionka za pomocą cienkich kleszczy.
5. Równomiernie nakładaj sterylny talk na lewą i prawą powierzchnię przedsionka za pomocą cienkiej szpatułki (dawka talku: 50 mg/100 g masy ciała szczura). Unikaj rozlewania się na duże naczynia lub komory. Zamień grasicę na przedsionkach, aby ograniczyć migrację talku.
6. Przesunąć mięśnie klatki piersiowej, aby zakryły nacięcie międzyżebrowe chirurgiczne. Po dezynfekcji 0,5% povidon-jodem, zszyj mięśnie i skórę, aby zamknąć jamę piersiową, a pooperacyjnie podaj penicylinę (160 000 U/100 g, i.p.).
7. Sham: Torakotomia bez perikardiotomii lub aplikacji talku.
   UWAGA: Nakładaj cienką, jednolitą warstwę talku wyłącznie na epikardium przedsionkowe; Nadmierne zanieczyszczenie talkiem lub komorami zwiększa śmiertelność i może zakłócić odczyty specyficzne dla przedsionków. Wcześniejsze badania potwierdziły, że operacja aseptycznego zapalenia osierdzia u szczurów powoduje ciężkie zapalenie przedsionków z wyraźnym włóknieniem i podwyższonymi czynnikami zapalnymi, w tym IL-6, IL-1β i TGF-β1 ^3,9.

4. Izolacja serca i perfuzja Langendorffa

1. Trzeciego dnia po operacji znieczulać szczury izofluranem (2-3%) przez stożek nosa i podać heparynę układową (250 U/kg, i.p.), aby zapobiec powstawaniu zakrzepów wewnątrznaczyniowych, które mogłyby utrudnić krążenie wieńcowe i zahamować perfuzję Langendorffa. Ten punkt czasowy wybrano na podstawie naszych wcześniejszych ustaleń in vivo , że indukowalność AF osiąga szczyt 3-4 dni po SP³, co umożliwia uchwycenie ostrej, zapalnej fazy arytmogenicznej, jednocześnie unikając późniejszych zrostów zakłócających ładowanie barwnika i zapisy optyczne.
   UWAGA: Zanim zaczniesz, przygotuj świeżo; wyrównuj gaz i temperaturę. Wyrównaj optykę i potwierdź filtry/dichroiczny. Konfiguruj oprogramowanie do akwizycji (1-2 kHz, ekspozycja 1 ms) i wykonaj kalibrację za pomocą karty fluorescencyjnej.
2. Wykonaj szybką torakotomię środkową, aby odsłonić jamę piersiową. Wyciąć serce en bloc wraz z częścią łuku aorty i natychmiast zanurzyć je w lodowatym, natlenionym roztworze Tyrode, aby zatrzymać metabolizm i zachować żywotność tkanek. Ostrożnie rozciąć otaczającą tkankę łączną, zachowując długość aorty 0,5 mm do kanilowania. Przymocuj aortę do kanili Langendorffa za pomocą jedwabnych szwów 4-0, zapewniając szczelność i dopasowanie dolnej krawędzi cewnika do górnej krawędzi przedsionka. Rozpocznij perfuzję retrogradacyjną z natlenionymi Tyrode ze stałym przepływem 10-12 mL/min, utrzymując temperaturę perfuzacji na poziomie 37 ± 1 °C. Dla powtarzalności specyfikacja kaniuli aortowej szczura przedstawia się następująco: średnica zewnętrzna: 1,4 mm; średnica wewnętrzna: 1,0 mm; całkowita długość: 3-4 cm; głębokość wstawienia: około 0,5-1,0 cm w korzeń aorty; Kształt końcówki: lekko zwężony; Materiał: stal nierdzewna lub rury z tępego metalu. Kanyula musi być na tyle sztywna, by wytrzymać ciśnienie perfuzyjne (zazwyczaj 60-80 mmHg) bez zginania, a czubek powinien unikać zatykania ostii wieńcowej.
3. Obserwuj serce pod kątem natychmiastowych efektów reperfuzji. Udana perfuzja objawia się szybkim i szybkim wypłukaniem pozostałej krwi z naczyń wieńcowych, przywróceniem jednolitego różowego koloru mięśnia sercowego oraz wznowieniem spontanicznych skurczów rytmicznych. Przed dalszymi eksperymentami wymagane są minimalne obrzęki mięśnia sercowego oraz stabilne tętno (zazwyczaj 300-400 uderzeń na minutę). Jednocześnie wykonaj elektrokardiogram serca. Pozwól sercu wyrównać się przez co najmniej 20 minut pod stałą perfuzją przed rozpoczęciem protokołów mapowania optycznego.

5. Tłumienie ruchu i wentylacja

1. Dodaj blebbistatynę do perfuzjatu (końcowe 10 μM). Perfuzuj przez ~10 minut, aż skurcze ustaną.
2. Należy wprowadzić cewnik hipociśnieniowy do lewej komory przez żyłę płucną przez zastawkę mitralną, aby ucisnąć komorę, zmniejszając ciśnienie wewnątrzdoczynowe przy jednoczesnym zachowaniu morfologii przedsionka i integralności sygnału. Dla powtarzalności specyfikacja cewnika to: średnica zewnętrzna: 1,4 mm; średnica wewnętrzna: 1,0 mm; całkowita długość: 1,5 cm; Głębokość wcięcia do serca: 1,0 cm. Nie otwieraj przedsionków, aby zachować geometrię przedsionków i sygnały.

6. Załadunek barwnika

1. Perfuzja serca: Po zatrzymaniu akcji serca perfuzuj serce w temperaturze pokojowej ze stałym przepływem 10-12 mL/min.
2. Barwienie wapniowe: Dodaj Rhod-2 AM (końcowe stężenie 0,89 μM) oraz 20 μL 20% Pluronic F-127 do 100 mL roztworu perfuzyjnego. Przekręć serce tym roztworem przez około 30 minut, aż przedsionki i komory zaczną wykazywać jednolitą czerwoną fluorescencję.
3. Barwienie barwnikami wrażliwymi na napięcie: Dodaj RH237 (końcowe stężenie 2 μM) do 100 mL roztworu perfuzyjnego. Perfuzuj serce przez ~5 minut, aż przedsionki i komory zaczną się różować.
4. Podgrzewanie i wypłukanie: Przenieś serce z powrotem do oryginalnego systemu perfuzji. Podgrzej do temperatury fizjologicznej i przeprowadź przez 5-10 minut, aby wypłukać niewchłonięty barwnik.
   UWAGA: Słabe sygnały CaT często odzwierciedlają niewystarczające obciążenie Rhod-2; przedłuż ładowanie o 10-15 minut i potwierdzi, że Pluronic jest świeży. Jeśli ruch się utrzymuje, sprawdź moc blebbistatyny i ochronę przed światłem.

7. Geometria obrazowania i izolacja sygnału

1. Umieść serce w kąpieli obrazowej o temperaturze 37 °C. Skieruj lewy atrium (LA) w stronę kamery. Ustaw główne i dodatkowe źródła LED w kierunku LA.
2. Podtrzymaj serce, by zapobiec dryfowi; Delikatnie rozchyl przedsionek i zabezpiecz je igłami akupunkturowymi dla maksymalnej wizualizacji. Przykryj komory czarnymi gumowymi foliami, aby zminimalizować zanieczyszczenie światłem komor.
3. Umieść elektrody stymulujące bipolarne na prawym przedsionku (RA). Umieść elektrody EKG blisko przedsionków, aby wychwycić duże fale P.

8. Protokoły akwizycji i tempa

1. Uruchom oprogramowanie mapujące (oprogramowanie OMapRecord4.0). Ustaw liczbę klatek na 1-2 kHz; dostosowując obciążenie LED do 3-4 A; pole widzenia obejmujące całe LA. Dostosuj wzmocnienie/ekspozycję, aby uniknąć nasycenia w obu kanałach. Zoptymalizuj wzmocnienie kamery i ekspozycję, aby uniknąć nasycenia i maksymalizować stosunek sygnału do szumu. Parametry obrazowania: ekspozycja 1 ms; maksymalna częstotliwość kamery 30 kHz; częstotliwość próbkowania 12,5 kHz; rozdzielczość 2048 × 2048 pikseli; ROI do 3,5 kHz; rozdzielczość przestrzenna 70 μm. Te ustawienia zapewniają wysokiej jakości nagrania AP i CaT.
2. Stymulacja S1S1 (stan wyjściowy): stymulacja RZS o częstotliwości 7 Hz (szerokość impulsu 2-4 ms; próg rozkurczowy dwukrotny). Zdobędź ≥ filmów 5 sekund dla czasu trwania APD/CaT (CaD), czasu do szczytu oraz prędkości przewodzenia.
3. Protokół S1S2 (refraktorność/AF): Dostarczaj 30 uderzeń S1 przy 7 Hz, następnie pojedynczy S2; zmniejszyć odstęp S1-S2 z 140 ms w krokach (10/5/1 ms) do refraktorności. Rejestr odzyskiwania CaT (A2/A1), efektywny okres osłabienia (ERP), indukowalność/czas trwania migotania przedsionków.
4. Tempo stopniowe (alternany): Zwiększ tempo RA z 8 do 18 Hz w krokach 1-2 Hz. Rejestruj ≥ 5 sekund przy każdej szybkości, aby zmierzyć Ca-ALT, APD-ALT i DIS-ALT. Zachowaj jednoczesne filmy dwukanałowe oraz zsynchronizowane ślady EKG/stymulacji do analizy.
   UWAGA: Utrzymuj stałą temperaturę i perfuzję przez cały czas stymulacji; Hipotermia zmniejsza przewodnictwo i wyolbrzymia artefakty alternanów.

9. Przetwarzanie i ilościowość danych

1. Analizuj sygnały optyczne za pomocą oprogramowania OMapScope 4.0. Zastosowano filtr przestrzenny 3×3 Gaussa, aby zmniejszyć szum przy jednoczesnym zachowaniu morfologii sygnału poprzez uśrednianie każdego piksela z jego sąsiadami. Czasy aktywacji definiuje się jako punkt maksymalnego dF/dt podczas ruchu w górę, od którego prędkość przewodzenia oblicza się przez podzielenie odległości liniowej między najwcześniejszym a najpóźniejszym miejscem aktywacji przez odpowiadającą różnicę czasu aktywacji. APD_70/90 definiowano jako czas od maksymalnego dF/dT potencjału czynnościowego do repolaryzacji amplitudy AP w 70% lub 90%. CaD_70/90 został zdefiniowany jako czas od szczytu przejściowego zjawiska wapnia (Ca²⁺) do rozpadu 70% lub 90%. Alternany zostały zmierzone w następujący sposób: Ca-ALT obliczono jako 1 minus stosunek średniej amplitudy mniejszej do większej CaT, APD-ALT jako różnicę między dłuższymi a krótszymi wartościami APD₈₀ , a DIS-ALT jako alternany przestrzennie poza fazą, oddzielone liniami węzłowymi. Współczynnik odzysku RyR został obliczony jako stosunek dwóch kolejnych szczytów CaT (mniejszych/większych).

10. Parametry krytyczne i kryteria akceptacji

1. Przelew: 10-12 mL/min, 37 ± 1 °C; stabilny rytm zatokowy lub rytm o uregulowanym tempie; LA dobrze przepuszczone.
2. SNR: Upstroke dF/F ≥ 3 dla obu kanałów; Minimalne fotobielenie w okresie zakupowym.
3. Ruch: Pomijalny ruch resztkowy po blebbistatynie; stabilna rejestracja obrazu w różnych klatkach.
4. Temperatura: Ciągły monitoring; wyklucz zbiory danych z kąpielą < 36 °C lub > 38 °C podczas pozyskiwania.

11. Analizy statystyczne

1. Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone przy użyciu GraphPad Prism 9. Dane są przedstawiane jako średnie ± SEM. Normalność rozkładu danych oceniano za pomocą testu Shapiro-Wilka. Dla danych o rozkładzie normalnym analizowano różnice między obiema grupami za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu Student's t; dla danych nierozproszonych normalnie zastosowano test Mann-Whitney U. Zmienne kategoryczne analizowano za pomocą testu χ² . P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

Indukowalność AF
Aktywność pozamaciczna i powrót są kluczowymi mechanizmami przyczyniającymi się do inicjacji i utrzymania POAF². Długość fali wejścia (λ) jest określana przez iloczyn ERP i prędkości przewodzenia (CV), tj. λ = ERP × CV. W sercach operowanych pozornie stymulacja S1S2 wywołała stabilne reakcje przedsionkowe bez arytmii (Rysunek 2A). Dla porównania, serca leczone SP często wykazywały nieprawidłowe reakcje, w tym ektopię przedsionków (...

Dyskusja

Protokół ten opisuje podwójne optyczne mapowanie AP i CaT w izolowanych sercach szczurów po SP, czyli modelu POAF napędzanym zapaleniem. Jednoczesne nagrywanie sygnałów Vm i^{Ca 2+} w wysokiej rozdzielczości na nienaruszonej powierzchni przedsionka przy programowalnym tempie pozwala ocenić APD, czas do szczytu, prędkość przewodzenia, przestrzenną heterogeniczność repolaryzacji, CaD, amplitudę CaT, czas CaT do szczytu oraz regionalną zmienność obsługi Ca. Umożliwia także wykrywanie i ilościowe określenie alternanó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Blebbistatyna	Abcam	ab120425
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Kamera CMOS	MappingLab	OMS-PCIE-2002
System EKG	Chengdu Techman	BL-420F
FE32 -Metr	Mettler Toledo	30254108
Filtry/lustra dichroiczne	MappingLab	RH237 >700 nm; CaT 590 nm
Glukoza	Sigma-Aldrich	921-60-8
Kąpiel imgae	MappingLab	Nie ma
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
System perfuzji Langendorffa	Radnoti / Custom	Nie ma
Źródło LED (530 i plusmn; 25 nm)	MappingLab	Nie ma
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	10049-21-5
NaHCO3	Sigma-Aldrich	144-55-8
Oprogramowanie OMapRecord4.0	MappingLab	Nie ma
Oprogramowanie OMapScope4.0	MappingLab	Nie ma
Pompa perystaltyczna	Cole-Parmer	Masterflex® L/S®
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
RH237 (barwnik napięciowy)	Thermo Fisher / Invitrogen	S1109
Rhod-2 AM (wskaźnik CA)	Thermo Fisher / Invitrogen	R1245MP
Respiratory dla małych zwierząt	YUYANBIO	V-100
Pentobarbital sodu	Sigma-Aldrich	P3761
Szczury Sprague-Dawley (200 i ndash; 220 g, mężczyzna)	Lokalny certyfikowany sprzedawca	Nie ma
Sterylny proszek talkowy	Sigma-Aldrich	T1586
Stymulator	MappingLab	LEDC-2002
Kąpiel wodna (kontrolowana temperaturą)	Ningbo Xinzhi	SC-15