Przygotowanie ekonomicznych i uniwersalnych kulek kompensacyjnych kompatybilnych dla przeciwciał wielogatunkowych

Podsumowanie

Protokół ten opisuje opłacalną metodę przygotowania wielogatunkowych kulek kompensacyjnych do kompensacji fluorescencji w cytometrii przepływowej, wykorzystując rekombinowane mikrosfery polistyrenowe sprzężone z białkiem A/G/L.

Streszczenie

Protokół ten opisuje opłacalną i powtarzalną metodę przygotowania wielogatunkowych kulek kompensacyjnych do kompensacji fluorescencji w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Tutaj rekombinowane białko wiążące immunoglobuliny A/G/L (Białko A/G/L) zawierające wiele domen wiążących immunoglobuliny zostało wyrażone w Escherichia coli (E. coli), oczyszczone chromatografią powinowactwa niklu i kowalencyjnie sprzężone z karboksylowanymi mikrosferami polistyrenu za pomocą chemii EDC/NHS. Powstałe kulki wiążą przeciwciała różnych gatunków i podklas, generując silne i wyraźne sygnały fluorescencyjne odpowiednie do kompensacji. Wyniki te stanowią praktyczne wskazówki przy wyborze średnicy kulki i obciążenia białkiem, aby osiągnąć intensywność fluorescencji odpowiednią dla różnych wymagań kompensacji. Pomyślne wdrożenie protokołu jest zaznaczone efektywnym oczyszczaniem białek oraz wyraźnym, wysokointensywnym szczytem fluorescencji sprzężonych kulek w porównaniu z kulkami kontrolnymi podczas analizy cytometrii przepływowej. To proste i skalowalne podejście umożliwia rutynowe przygotowywanie stabilnych, wszechstronnych kulek kompensacyjnych w standardowych laboratoriach, obniżając koszty i zwiększając elastyczność w zastosowaniach cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Cytometria przepływowa stała się niezbędnym narzędziem w immunologii, biologii komórki oraz badaniach klinicznych do analizy wieloparametrycznej populacji komórek ^1,2,3. Kluczowym wyzwaniem w tradycyjnej wielokolorowej cytometrii przepływowej jest fluorescencyjne przelewanie, w którym widmo emisji fluorochromu nakłada się na wiele kanałów detektorów, prowadząc do zanieczyszczenia sygnału i błędnej interpretacji ^4,5. Dlatego właściwa kompensacja jest niezbędna do dokładnej interpretacji danych.

Tradycyjnie kontrolę kompensacyjną przygotowuje się przy użyciu jednokolorowych komórek barwionych. Jednak ograniczona liczba komórek, zmienna ekspresja antygenów oraz różnicowanie wiązania przeciwciał z komórkami stanowią wyzwanie⁶. W konsekwencji syntetyczne kulki zmodyfikowane do wiązania przeciwciał sprzężonych z fluorochromem pojawiły się jako praktyczna alternatywa ^7,8. Koraliki oferują zalety w postaci stałej zdolności wiązania, wysokiej intensywności fluorescencji oraz niezależności od poziomu ekspresji antygenów komórkowych⁹. W porównaniu z odczynnikami jednogatunkowymi lub ograniczonymi Fc, włączenie wielu domen wiążących immunoglobuliny (białko A, G i L) rozszerza pokrycie gatunków oraz kompatybilność formatu przeciwciał, pozwalając na przygotowanie pojedynczej kulki do obsługi różnorodnych przeciwciał sprzężonych z fluorochromem.

Wśród koralików stosowanych do kompensacji, sprzężenie białek wiążących immunoglobulinę, takich jak białko A, białko G i białko L, zapewnia szeroką kompatybilność z izotypami przeciwciał różnych gatunków. Białka A i G wiążą się z regionem Fc wielu podklas IgG, podczas gdy białko L wiąże się z κ łańcuchami lekkimi immunoglobulin, rozszerzając tym samym zdolność wiązania do fragmentów Fab i przeciwciał jednołańcuchowych^10,11.

Chociaż dostępne są komercyjne koraliki kompensacyjne, ich stosunkowo wysoki koszt może być zbyt wysoki dla laboratoriów o ograniczonym budżecie, co ogranicza ich szerokie zastosowanie³. W obliczu tych wyzwań istnieje potrzeba elastycznych, konfigurowalnych platform koralików, które pozwolą badaczom definiować rozmiar kulek, domenę wiązania przeciwciał oraz typy przeciwciał wykorzystywane do kontroli kompensacji. Celem tego protokołu jest zapewnienie prostej, ekonomicznej i powtarzalnej metody przygotowania wielogatunkowych kulek kompensacyjnych do wielokolorowej cytometrii przepływowej. Protokół ten opisuje projektowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego białka fuzyjnego zawierającego wiele domen wiążących immunoglobuliny z białek A, G i L, a następnie jego kowalencyjną koniugację z kulkami polistyrenu zmodyfikowanym karboksylem o określonych średnicach.

Protokół określa molekularny projekt białka fuzyjnego, jego ekspresję i oczyszczanie w E. coli oraz przygotowanie odczynników kompensacyjnych opartych na kulkach zgodnych z wieloma przeciwciałami sprzężonymi fluorochromem. Protokół ten jest przeznaczony dla laboratoriów wykonujących wielokolorową cytometrię przepływową w różnych środowiskach badawczych, w tym w immunologii, onkologii i badaniach translacyjnych, szczególnie tam, gdzie wymagana jest redukcja kosztów, kompatybilność międzygatunkowa oraz elastyczne kontrole kompensacyjne.

Protokół

UWAGA: Przygotuj wszystkie bufory i odczynniki na świeżo, zgodnie z Tabelą 1. Przygotuj rozwiązania EDC i NHS tuż przed użyciem; Nie przechowuj ich. Dla wszystkich pozostałych buforów (Lysis, Binding, Wash, Elution, MES, PBS, Tris) przygotuj wcześniej roztwory zapasowe i przechowywaj je w temperaturze 4 °C. Przed użyciem wyrównuj przechowywane bufory do odpowiedniej temperatury reakcji (temperatura pokojowa lub 4 °C). Upewnij się, że bufor FACS i bufor magazynowy są przygotowane świeżo lub przechowywane w temperaturze 4 °C.

1. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego białka A/G/L

1. Ekspresja rekombinowanego białka A/G/L
   1. Przekształcić plazmid A/G/L z białkiem pET28 w komórki kompetentne dla E. coli BL21(DE3) za pomocą standardowego protokołu przeciwsłonecznego.
   2. Nakładaj przekształcone komórki na agar LB zawierający 50 μg·^mL-1 kanamycyny i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
   3. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5–10 mL bulionu LB zawierającego kanamycynę (50 μg·^mL-1) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C, potrząsając 200 × g.
   4. Przełóż nocną hodowlę do 200 mL LB zawierającej kanamycynę (końcowe stężenie 50 μg·^mL-1) w rozcieńczeniu 1:100.
   5. Hodować hodowlę w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna na poziomie 600 nM (OD600) osiągnie 0,6–0,8.
   6. Indukować ekspresję białek poprzez dodanie izopropylowego β-D-1-tiogalaktopyranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 0,5 mM i inkubować w temperaturze 28 °C przez 12–16 godzin.
   7. Komórki pobieraj przez wirowanie w temperaturze 4 °C, 4000 × g przez 10 minut.
   8. Usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórkowy w buforze lizy. Natychmiast należy przystąpić do przejścia lub przechować granulki w temperaturze -80 °C.
      Punkt pauzy: Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni przed lizą.
2. Liza komórek
   1. Ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 10 mL buforu lizy na gram mokrej masy komórkowej.
   2. Lizuj ogniwa za pomocą homogenizatora wysokiego ciśnienia ustawionego na 1000 barów, przepuszczając zawiesinę przez 2–3 cykle, aż roztwór stanie się mniej lepki i przezroczysty.
      Uwaga: Alternatywnie, zakłócenie komórek można przeprowadzić przez sonifikację na lodzie w trybie impulsowym (5 s WŁĄCZONY / 10 s WYŁĄCZONY) przez 8–12 cykli, unikając przegrzewania. Upewnij się o pełną lizę, badając niewielką aliquotę pod mikroskopem.
   3. Wiruj lizatan w 12000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Zbierz supernatant jako rozpuszczalną frakcję białka do oczyszczania.
3. Oczyszczenie powinowactwa Ni-NTA
   1. Wyrównywanie równowagi kolumny i ładowanie próbki
      1. Wyrównaj kolumnę Ni-NTA z objętościami 10 kolumn (CV) buforu wiążącego zawierającego 10 mM imidazolu.
      2. Przefiltruj klarowny lizat przez filtr 0,45 μM, dodaj imidazol do końcowego stężenia 10 mM i załaduj go do kolumny w stężeniu 0,5 CV·^min-1.
      3. Zbieraj frakcję przepływową, aby monitorować efektywność wiązania.
   2. Pranie
      1. Przemyj kolumnę 10 CV buforu wiążącego i buforu płukającego zawierającego 20 mM imidazolu z przepływem 1 CV·^min-1.
   3. Elution
      1. Eluć docelowe białko buforem elucijnym z przepływem 1 CV·^min-1.
      2. Zbieraj frakcje i monitoruj A280, aby zidentyfikować frakcje zawierające białka.
   4. Wymiana buforowa i magazynowanie białek
      1. Przenieś oczyszczony roztwór białka do rurki odśrodkowej z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) o mocy 50 kDa.
      2. Wirować w 3 500 × g przez 15–20 minut w temperaturze 4 °C, aż osiągnie pożądane stężenie.
      3. Usuń przepływ i dodaj równą objętość buforu PBS (pH 7,4) do retencji do wymiany buforu.
      4. Powtórz wirowanie i wymianę PBS 2–3 razy, aby całkowicie zastąpić oryginalny bufor PBS.
      5. Po ostatnim etapie stężenia pobierz retencję i zmierz stężenie białka.
      6. Weryfikuj ułamki eluowane za pomocą SDS-PAGE; oczekiwana masa cząsteczkowa białka A/G/L wynosi około 90 kDa.
      7. Zachowaj oczyszczone białko i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
         UWAGA: Protokół można zatrzymać na tym etapie. Oczyszczone białko A/G/L może być przechowywane w temperaturze -80 °C na potrzeby późniejszej konjugacji kulek. Po stężeniu uzyskano około 10 mg oczyszczonego białka A/G/L z 200 mL hodowli bakteryjnej, z końcowym stężeniem 2–5 mg·mL⁻¹.

2. Sprzęż kulki z białkiem A/G/L

1. Wstępne mycie do koralików
   1. Materiał kulek wirowych z maksymalną prędkością przez 20–30 sekund w temperaturze pokojowej (20–25 °C), aby równomiernie się zawiesić. Przelej 0,2 mL kulki 8 μM (5 mg) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   2. Granulki w granulkach przez wirowanie, 5000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   3. Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant, nie naruszając granulatu.
   4. Dodaj 1 mL buforu MES 0,1 M, delikatnie zawiesz przez pipetowanie lub delikatne wirowanie, ponownie wiruj 5000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usuń supernatant. Powtórz to płukanie raz (łącznie dwa mycia MES).
2. Aktywacja w EDC/NHS
   UWAGA: EDC i NHS są drażniącymi i należy je obchodzić się odpowiednim środkiem ochrony osobistej w okapie parowym.
   1. Ponownie zawiesz kulki w buforze MES 0,5 mL, a następnie kolejno dodaj 50 μL 50 mg·^mL-1 NHS oraz 100 μL 50 mg·^mL-1 EDC.
      Uwaga: Rozwiązania EDC i NHS muszą być przygotowane świeżo bezpośrednio przed użyciem.
   2. Wiruj w koralikach i inkubuj na obrotowym shakerze w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby się aktywować.
3. Usuń odczynniki aktywacyjne i przepłukaj
   1. Koraliki do granulek: 5000 × g, 3 minuty, w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń supernatant.
   2. Dodaj 1 mL buforu PBS, delikatnie ponownie zawiesij, poddaj w wirówce (5000 × g, 3 minuty, w temperaturze pokojowej) i usuń supernatant. Wykonaj jedno mycie PBS, aby usunąć odczynniki aktywacyjne.
4. Sprzężenie białkowe
   1. Ponownie zawieś aktywowany kulkę w 0,4–0,5 mL PBS (cel objętości reakcji 0,5–0,6 mL). Utrzymuj niską objętość, aby zwiększyć efektywne stężenie białka.
   2. Dodaj 100 μg białka A/G/L. Delikatnie wymieszaj.
   3. Inkubuj reakcję na toczącym się shakerze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny dla szybkiego sprzężenia, lub w 4 °C przez noc. Utrzymuj delikatne toczenie, aby zapobiec osiadaniu koralików.
5. Reakcja wygaszania/zakończenia
   1. Granulki (5000 × g, 3 min) i usuń supernatant.
   2. Dodaj 1 mL 0,1 M Tris (pH = 7,4), aby schłodzić pozostałe estry NHS. Ponownie zawiesij i inkubuj na toczącym się shakerze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Granulki i mycie 1 mL PBS w tej samej rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Ponownie wiruj (5000 × g, 3 minuty) i wyrzuć supernatant. Następnie ponownie zawiesz kulki z buforem magazynowym o pojemności 0,5 mL.
      Punkt pauzy: Protokół można zatrzymać na tym etapie. Koraliki resuspendacyjne można przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Mieszaj i przechowuj
   1. Licząc koraliki sprzężone i niesprzężone. Mieszaj kulki sprzężone i niesprzężone w stosunku 25%–75% w nowej rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   2. Zawiesz mieszankę kulek w 1 mL buforu magazynującego (PBS zawierający 1% BSA i 0,05% środka antybakteryjnego).
   3. Przenieś zawieszenie do oznaczonej rurki i przechowuj w temperaturze 4 °C. Nie jest wymagana ochrona przed światłem. Delikatnie zawiesz przed użyciem, aby zapewnić równomierne rozłożenie kulek. W tych warunkach koraliki pozostają stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.

3. Reprezentantski QC

1. Inkubuj 10 μL sprzężonych kulek z 1 μL przeciwciałem fluorescencyjnym w buforze FACS o pojemności 100 μL przez 15–30 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Każda probówka powinna zawierać tylko jedno przeciwciało fluorescencyjne.
2. Myj kulki 1 mL PBS, ponownie zawieszaj w 300–500 μL PBS i pracuj na cytometrze przepływowym.
3. Ustaw kanał detekcji zgodnie z fluoroforem sprzężonym z przeciwciałem (np. laser 488 nM z detektorem FITC dla przeciwciał sprzężonych z FITC). Reprezentatywny zakres napięcia lampy fotopowielacza (PMT) od 0 do 200 V może być używany jako punkt wyjścia i dostosowywany w zależności od wydajności instrumentu. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę.
4. Bramka na koralikach od FSC/SSC. Pozytywne kulki powinny wykazywać wyraźny pojedynczy pik z wysokim MFI w kanale fluoroforu; Negatywna kontrola powinna wykazywać się tylko tłem.

Wyniki

Rekombinowane białko A/G/L składa się z 816 aminokwasów o obliczonej masie cząsteczkowej 90,5 kDa (Plik uzupełniający 1). To białko fuzyjne zachowuje pięć domen B wiążących IgG z białka A, dwie domeny wiążące IgG z białka G oraz pięć domen B wiążących łańcuch lekki κ z białka L, podczas gdy domena wiążąca albuminę została usunięta (Rysunek 1A, Tabela Suplement 1). Do końca C dodano resztę cysteiny, aby ułatwić przywiązanie kowalencyjne, a znacznik 6× Jego zo...

Dyskusja

Protokół ten opisuje praktyczny i efektywny sposób przygotowania kulek kompensacyjnych fluorescencyjnych opartych na rekombinowanym białku A/G/L. Procedura obejmuje ekspresję bakterii, oczyszczanie powinowactwa Ni-NTA oraz kowencyjne sprzężenie oczyszczonego białka z mikrosferami polistyrenu modyfikowanym karboksylem przy użyciu chemii EDC/NHS. Powstałe kulki mogą wiązać przeciwciała z różnych gatunków i podklas, oferując wszechstronne i opłacalne narzędzie do kompensacji fluorescencji w cytometrii przepływowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AF647 Rat Ig2a	BioLegend	141711
Myš APC IgG1	BioLegend	353311
Komórki kompetentne BL21(DE3)	Sangon	B528414
BSA	Solarbio	A8010
EDC	Thermo Fisher	22980	CAS: 1892-57-5
Ormiański chomik FITC IgG	BioLegend	400905
Imidazol	Sigma-Aldrich	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	GoldBio	I2481C	CAS: 367-93-1
Kanamycyna	Sangon	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	Aladyn	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	Aladyn	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	Sigma-Aldrich	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	Aladyn	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	Aladyn	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	Thermo Fisher	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FF	Inteligentne nauki przyrodnicze	SA005005
Mysz PE IgG2a	BioLegend	362603
ProClean 300	Beyotime	ST853
Tris	Sigma-Aldrich	252859	CAS: 77-86-1
Trypton	Oksoid	LP0042
Filtr ultraodśrodkowy, 50 kDa MWCO	Millipore	UFC9050
Jednolite mikrosfery karboksylowo-polistyrenowe	Tomicro Biotech	10 ml, 25 mg/ml	Szanghaj, Chiny
Ekstrakt drożdżowy	Oksoid	LP0021