Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Podsumowanie

Do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do ilościowego oznaczania RNA lub białek. Dzięki technikom immunoprecypitacji chromatyny opisanym w niniejszej pracy, możliwe będzie mapowanie metylacji histonów oraz innych epigenetycznych regulatorów ekspresji genów w materiale mózgu pobranym po śmierci.

Streszczenie

Uważa się, że przewlekłe schorzenia neuropsychiatryczne, takie jak schizofrenia, choroba afektywna dwubiegunowa i autyzm, wynikają z kombinacji czynników genetycznych i środowiskowych, które mogą prowadzić do epigenetycznych zmian w ekspresji genów oraz innych patologii molekularnych. Tradycyjnie badania ekspresji w materiale mózgu pobranym po śmierci ograniczano jednak do ilościowego oznaczania mRNA lub białek. Ograniczenia występujące w badaniach mózgu postmortem, takie jak zmienność czasu autolizy i stopnia integralności tkanek, prawdopodobnie wpływają również na wszelkie badania struktur chromatyny wyższego rzędu. Niemniej jednak organizacja nukleosomowa DNA genomicznego – w tym wiązanie DNA z histonami rdzeniowymi – wydaje się być w znacznym stopniu zachowana w reprezentatywnych próbkach dostarczanych przez różne banki tkanek mózgowych. W związku z tym możliwe jest badanie wzorców metylacji oraz innych kowalencyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych w określonych loci genomicznych w materiale mózgu postmortem. W niniejszej pracy przedstawiamy uproszczony protokół natywnej immunoprecypitacji chromatyny (NChIP) dla zamrożonych (nigdy nieutrwalanych) preparatów ludzkiego mózgu. Rozpoczynając od trawienia homogenatów mózgowych nukleazą mikrokokkową, procedurę NChIP z następującym po niej qPCR można ukończyć w ciągu trzech dni. Przedstawiona tutaj metodologia powinna być użyteczna w wyjaśnianiu epigenetycznych mechanizmów ekspresji genów w zdrowym i chorym ludzkim mózgu.

Protokół

Procedura:

1^st Dzień

1. Homogenizować 50-500 mg zamrożonej tkanki istoty szarej pobranej po śmierci w buforze do homogenizacji (Douncing Buffer).

! UWAGA ! - Tkanki ludzkie należy obchodzić z ostrożnością, w rygorystycznych warunkach bezpieczeństwa. Należy je przetwarzać zgodnie ze standardami bezpieczeństwa poziomu BSL-2 lub wyższego.

1. Wyjąć wcześniej wypreparowany mózg pośmiertny z temperatury -80°C, rozhomogenizować go za pomocą homogenizatora Dounce w 5-krotnej objętości buforu do homogenizacji (Douncing Buffer) i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL. Pary dopasowanych próbek i kontroli należy przetwarzać jednocześnie.

2. Trawienie nukleazą mikrokokkową (MN)

1. Do próbki dodać nukleazę mikrokokkową w stężeniu 5U/mL i wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie umieścić na lodzie.
   * KROK KRYTYCZNY - Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ MN wykazuje aktywność nawet w temperaturze 4°C.
2. Inkubować próbki przez 7 minut w temperaturze 37°C.
3. Po 7-minutowej inkubacji dodać EDTA 0.5M do stężenia końcowego 10mM, aby zatrzymać aktywność MNazy.

3. Hipotonizacja

1. Przenieść próbki do probówki typu Falcon o pojemności 15 mL. Dodać 10-krotność objętości próbki 0,2mM EDTA, 1/2000 objętości próbki 0,2M benzamidyny oraz 1/1000 objętości próbki 0,1M fenylometanosulfonylofluororku (PMSF). Te dwa ostatnie związki są stosowane jako inhibitory proteaz.
   * KROK KRYTYCZNY - Ważne jest, aby podczas wszystkich tych etapów przechowywać próbki w lodzie.
2. Inkubować próbkę przez 1 godzinę, mieszając ją w vortexie co 10 minut.
3. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji dodać 1/2000 objętości próbki 3M DTT, który jest kolejnym inhibitorem proteaz.
4. Ponownie wymieszać próbkę w vortexie i odwirować przy 3175 RCF przez 10 minut w temperaturze 4°C.
   * KROK OPCJONALNY - Oczyszczanie wstępne za pomocą agarozy z białkiem G.
   1. Odbrać nadsącz i przenieść go do nowej probówki typu Falcon o pojemności 15 mL.
   2. Dodać 500 µL agarozy z białkiem G.
   3. Mieszać rotacyjnie w temperaturze pokojowej przez 30 min.
   4. Odwirować przy 4000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C.
5. Rozdzielić nadsącz w taki sposób, aby 500 µL wykorzystać jako kontrolę Input (zawierającą wyłącznie DNA genomiczne), a pozostałą część podzielić na dwie probówki zawierające po 1600 µL próbki — które posłużą jako próbki do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).
6. Kontrolę Input umieścić w temperaturze -80°C O/N do czasu dalszego użycia.
7. Do próbek ChIP dodać 1:10 objętości 10XFSB oraz 4μg przeciwciała, następnie wymieszać próbki w vortexie i inkubować rotacyjnie w temperaturze 4°C przez noc.
   ! UWAGA ! - Ilość i rozcieńczenie przeciwciała mogą wymagać optymalizacji.

2^nd Dzień

! UWAGA ! - Rozpocznij 2^nd dzień, myjąc agarozę z białkiem G, która zostanie wykorzystana do izolacji DNA nukleosomalnego. Ze względu na wysoką wrażliwość kuleczek agarozowych, podczas pipetowania każdego roztworu zawierającego te kuleczki należy odcinać końcówki końcówek do pipet.

1. Badanie wiązania kuleczek agarozy z białkiem G z DNA

1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL dodać 1,6 mL 1XFSB do 245 µL agarozy z białkiem G (ilość wystarczająca na 4 probówki) (pętla).
2. Rozdzielić roztwór do dwóch probówek o pojemności 2 mL i uzupełnić każdą do objętości 1,6 mL za pomocą 1X FSB.
3. Mieszać w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.
4. Usunąć nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.
5. Ponownie dodać 1,6 mL 1X FSB. Mieszać próbki w rotatorze przez 30 s, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.
6. Ponownie usunąć nadsącz, a następnie połączyć zawartość obu probówek z 1,5 mL 1XFSB.
7. Dodać 15 µL sonikowanego DNA z plemników łososia (10mg/mL).
   ! UWAGA ! - Krok ten powinien w zasadzie ograniczyć nieswoiste wiązanie immunoprecypitatu z kuleczkami. Jednakże może to również prowadzić do wyników fałszywie dodatnich dla niektórych sekwencji DNA (ludzkiego).
8. Mieszać w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wirować przy 0,1 RCF przez 30 s.
9. Usunąć nadsącz. Dodać 200 μL 1XFSB.
10. Do każdej próbki ChIP dodać 90 µL kuleczek agarozowych. Mieszać w rotatorze w temperaturze 4°C przez 1 h.
11. Do pozostałych kuleczek agarozowych dodać 1mL 1XFSB, aby służyły jako kontrola negatywna, i mieszać w rotatorze w temperaturze 4°C przez 1 h. 
12. Po godzinnej inkubacji wirować próbki oraz kontrolę negatywną przy 0,1 RCF przez 30 s. Odrzucić nadsącz.

2. Przemywanie kulek

! OSTROŻNIE ! - Bufory do płukania należy przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia i stosować wyłącznie, jeśli nie minął miesiąc od ich przygotowania.

1. Do kulek dodać 1 mL każdego roztworu piorącego i rotować przez 3 min w RT.
2. Wirować przy 0.1 RCF przez 30 sec. 
3. Usunąć nadsącz za pomocą odsysacza próżniowego.

* Każdy roztwór piorący

-- Bufor do płukania z niską zawartością soli

-- Bufor do płukania z wysoką zawartością soli

-- Roztwór chlorku litu - rotować tylko w temperaturze pokojowej przez 1 minutę!

-- bufor TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH=8)

3. Elucja

* KROK KRYTYCZNY - Przed każdym eksperymentem należy przygotować świeży bufor elucyjny w dniu jego użycia.

1. Do każdej próbki dodać 250 µL świeżo przygotowanego buforu elucyjnego.
2. Inkubować w rotacji przez 15 min w RT, a następnie odwirować przy 0,4 RCF przez 1 min.
3. Nadpłyn przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,0 mL (pętla).
4. Do każdej próbki dodać 250 µL buforu elucyjnego i wymieszać ręcznie w wstrząsarze typu vortex przez kilka sekund. Następnie mieszać próbki w wstrząsarzu wieloprzóbkowym przez 15 minut.
5. Odwirować przy 16 RCF przez 4 minuty i zebrać nadpłyn do tej samej probówki 2,0 mL (pętla).

4. Trawienie białka

1. Do każdej próbki ChIP dodać 10 μl 0.5M EDTA, 25 μl 0.8M Tris-HCl, pH 6.5 oraz 10 mg/ml Proteinazy K (1/200 objętości próbki).
2. Do każdej kontroli Input dodać bufor lizujący do trawienia proteinazą K (1/10 objętości buforu do próbek) oraz 10 mg/ml Proteinazy K (1/200 objętości buforu do próbek).
3. Inkubować próbki Input i ChIP w temperaturze 52°C przez co najmniej 3 h.

5. Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa

! UWAGA ! - Eksperyment wymagający użycia fenolu/chloroformu należy przeprowadzić pod wyciągiem. Podczas pracy z fenolem/chloroformem należy używać rękawiczek nitrylowych.

1. Po 3-godzinnej inkubacji do każdej próbki dodajemy 500 μl fenolu z chloroformem.
2. Wszystkie próbki mieszamy na wirówce typu vortex przez kilka sekund, a następnie wirujemy przy 13 RCF rpm przez 5 min.
3. Na tym etapie powstaną dwie fazy, a nas interesuje zawartość fazy górnej.  Pobieramy fazę górną i przenosimy ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL.
4. Do każdej próbki dodajemy mieszaninę 2µL glikogenu i 50µL 3M octanu sodu wraz z 1,375 mL 100% etanolu.
5. Wszystkie próbki intensywnie mieszamy na wirówce typu vortex. Następnie pozostawiamy je w temperaturze -80°C przez noc.

Dzień 3^rd

1. Wyjąć próbki z temperatury -80°C i umieścić je na lodzie w celu rozmrożenia.
2. Wirować przy 15 RCF przez 10 minut w temperaturze 4°C.
3. Ostrożnie usunąć nadsącz, aby nie naruszyć osadu na dnie probówki.
4. Do każdej próbki dodać 1 mL zimnego 75% etanolu,  następnie odwrócić probówki 4-6 razy.
5. Wirować przy 18 RCF przez 5 min w temperaturze 4°C.
6. Ponownie usunąć nadsącz i pozostawić osady do wysuszenia na powietrzu.
7. Rozpuścić wysuszone osady w 50 µL 4mM Tris-HCl, pH8 i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

Dyskusja

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu jest szczególnie przydatny dla badaczy zainteresowanych sygnaturami metylacji histonów i/lub DNA w ludzkim mózgu, ponieważ te modyfikacje chromatyny mogą być mniej podatne na artefakty pośmiertne w porównaniu z innymi rodzajami modyfikacji, takimi jak acetylacja i fosforylacja (histonów)^{1, 2}. Mózg pośmiertny nadaje się do badania preparatów mononukleosomalnych; DNA pozostaje w dużej mierze związane z histonami rdzeniowymi, przynajmniej w próbkach z reprezentatywnymi od...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Sześciowodny chlorek magnezu	OmniPur, EMD Millipore	5980
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0,5 M roztwór, pH 8,0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Chlorek sodu	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
Roztwór SDS 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Chlorek litu	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Octan sodu (bezwodny)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nukleaza mikrokokowa ze Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Fluorek fenylometanosulfonylu	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Białko G Agaroza, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonikowany zestaw DNA plemników łososia	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinaza K z Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Fenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Milipore	6810
Glikogen, z małży	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Alkohol etylowy (200 dowodów)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Bufor douncingowy: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 dostosuj pH do 7,5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl Dostosuj pH do 7,5 Bufor myjący o niskiej zawartości soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl Wysokosolny bufor myjący: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM Bufor NaCl litowo-chlorkowy: 1% IGEPAL-CA 630, 1% kwas deoksycholowy, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M bufor LiCl TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Bufor elucyjny: 0,1 M NaHCO3, 1% SDS Bufor trawienia K (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl Dostosuj pH do 8,0 3 M Octan sodu: 24,61 g bezwodnego octanu sodu (MW=82,03) w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. Dostosuj pH do 5,2 za pomocą stężonego kwasu octowego.
nChIP Bufor dokuwający: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 dostosuj pH do 7,5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl Dostosuj pH do 7,5 Bufor myjący o niskiej zawartości soli: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl Wysokosolny bufor myjący: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM Bufor NaCl litowo-chlorkowy: 1% IGEPAL-CA 630, 1% kwas deoksycholowy, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M bufor LiCl TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Bufor elucyjny: 0,1 M NaHCO3, 1% SDS Bufor trawienia K (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl Dostosuj pH do 8,0 3 M Octan sodu: 24,61 g bezwodnego octanu sodu (MW=82,03) w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. Dostosuj pH do 5,2 za pomocą stężonego kwasu octowego.