Pełny tekst protokołu dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Wyznaczenie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. Hemacytometr to grube szkiełko przedmiotowe z obszarem centralnym zaprojektowanym jako komora licznikowa. Zawiesinę komórkową nanosi się na wyznaczony obszar, a następnie dokonuje zliczenia, co pozwala na obliczenie gęstości komórek.

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie demonstrujemy sposób zliczania komórek przy użyciu hemacytometru.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. A ...

Oznaczanie liczby komórek oraz kultury jest istotne w standaryzacji warunków hodowli oraz podczas przeprowadzania eksperymentów, w których wymagana jest precyzyjna liczba komórek. W niniejszym materiale pokażemy, jak zliczać komórki przy użyciu komory countingowej (hemocytometru) oraz jak obliczyć stężenie komórek w zawiesinie. Przedstawimy również sposób oznaczania liczby żywych komórek w kulturze za pomocą testu żywotności z użyciem błękitu trypanu.Cześć, jestem Ricky z laboratorium Dr.LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories Network we wschodnim Tennessee. Dzisiaj pokażę wam, jak zliczać komórki w zawiesinie oraz jak określać ich żywotność. Aby przygotować komorę countingową do liczenia komórek, należy najpierw oczyścić jej powierzchnię oraz dołączone szkiełko nakrywkowe 70% ethanol.Kryszka i szkiełko powinny być czyste, suche i wolne od kłaczków, odcisków palców oraz śladów wody. Następnie należy lekko zwilżyć kranową wodą krawędzie hemocytometru i docisnąć na nim kryszkę. Kryszka powinna równomiernie przylegać do srebrnego pola zliczania.Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania zawiesiny komórkowej do zliczenia. Najpierw, jeśli komórki były hodowane w kulturach monowarstwy, odspój je od powierzchni płytki za pomocą trypsyny, zgodnie z instrukcją pokazaną w filmie dotyczącym pasażowania komórek. Po odspójeniu komórek z płytki, rozcieńcz je w razie potrzeby, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.Podczas korzystania z cytometru hematologicznego należy upewnić się, że wszelkie grudki w zawiesinie zostały rozproszone. Zalecana maksymalna liczba komórek wynosi od 20 do 50 komórek na jeden milimetr kwadratowy. Po przygotowaniu próbki komórkowej do załadowania do cytometru hematologicznego, należy za pomocą mikropipety przenieść zawiesinę komórkową na krawędź komory pomiarowej cytometru.Przytrzymaj końcówkę pipety pod szkiełkiem nakrywnym i nanieś jedną kroplę zawiesiny. Zawiesina zostanie wciągnięta pod szkiełko nakrywne dzięki działaniu kapilarnemu. Po wypełnieniu pierwszej komory, wypełnij drugą komorę liczącą; teraz można przystąpić do liczenia komórek.Należy pozostawić komórki na kilka minut, aby osiadły. Po osadzeniu komórek warto również odsączyć nadmiar cieczy. Preparat można oglądać pod mikroskopem przy powiększeniu 100x.Powinien być widoczny duży obszar centralny siatki, ograniczony zestawem trzech równoległych linii. Podziały wewnątrz dużego obszaru centralnego są również ograniczone trzema równoległymi liniami, a każdy podział jest podzielony na 16 mniejszych kwadratów pojedynczymi liniami. Komórki w tym obszarze powinny być rozmieszczone równomiernie, bez tworzenia skupisk.Jeśli komórki nie są rozmieszczone równomiernie, należy je wypłukać i nanieść ponownie. W przypadku korzystania z hemocytometru używa się licznika ręcznego do policzenia komórek w każdym z czterech narożnych oraz w środkowym kwadracie. Komórki dotykające linii środkowej z potrójnych linii na górze i po lewej stronie kwadratu są liczone; nie liczy się komórek dotykających linii środkowej z potrójnych linii na dole lub po prawej stronie kwadratu.Powtórz zliczanie dla drugiej komory licznikowej. Po zliczeniu komórek można określić ich liczbę na mililitr. Aby to zrobić, oblicz średnią liczbę komórek na pole i pomnóż ją przez czynnik rozcieńczenia oraz przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek w próbce.Pomnóż liczbę komórek na mililitr przez całkowitą objętość zawiesiny komórkowej, z której pobrano próbkę. Teraz możemy przystąpić do określenia żywotności naszej zawiesiny. Aby wyznaczyć liczbę żywych komórek w próbce, użyjemy błękitu trypanu. Najpierw połącz 0,5 ml 4% błękitu trypanu, 0,03 ml HBSS oraz 0,1 ml zawiesiny komórkowej w małej probówce, wymieszaj dokładnie i pozostaw probówkę na pięć minut przed napełnieniem hemocytometru.Żywe komórki powinny pozostać niebarwione, natomiast martwe komórki będą miały kolor niebieski pod cytometrem hemocytometrycznym. Policz całkowitą liczbę komórek oraz całkowitą liczbę komórek żywych (niebarwionych), a następnie oblicz procent żywych komórek w próbce. Po zakończeniu pracy zdezynfekuj szkiełko nakrywkowe w cytometrze hemocytometrycznym, płucząc je 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną.Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj do przyszłego użycia. Właśnie pokazaliśmy, jak określić liczbę i żywotność hodowanych komórek. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.

counting-and-determining-the-viability-of-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Liczenie i określanie żywotności hodowanych komórek

Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Określenie liczby komórek w hodowli jest ważne dla standaryzacji warunków hodowli i przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie pokazujemy, jak komórki są liczone za pomocą hemacytometru.

Summary

Wyznaczenie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. Hemacytometr to grube szkiełko przedmiotowe z obszarem centralnym zaprojektowanym jako komora licznikowa. Zawiesinę komórkową nanosi się na wyznaczony obszar, a następnie dokonuje zliczenia, co pozwala na obliczenie gęstości komórek.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi