Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Podsumowanie

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Streszczenie

W literaturze można znaleźć kilka metod przygotowania mysich komórek dendrytycznych. Przedstawiamy tutaj metodę, która pozwala na uzyskanie w hodowli ponad 85% komórek dendrytycznych CD11c high, które po wstrzyknięciu podskórnym migrują do drenującego węzła chłonnego i prezentują antygen swoistym limfocytom T (patrz wideo). Ponadto wykorzystujemy system Essen Instruments Incucyte do śledzenia dojrzewania komórek dendrytycznych, gdzie w 10. dniu morfologia hodowanych komórek jest typowa dla dojrzałej komórki dendrytycznej, a <85% komórek to komórki CD11chigh. Badanie prezentacji antygenu w obwodowych węzłach chłonnych za pomocą obrazowania dwufotonowego wykazało istnienie trzech odrębnych faz interakcji komórek dendrytycznych z limfocytami T^{1, 2}. Faza I składa się z krótkich, seryjnych kontaktów między wysoce ruchliwymi swoistymi limfocytami T a komórkami dendrytycznymi niosącymi antygen^{1, 2}. Faza druga charakteryzuje się przedłużonymi kontaktami między swoistymi limfocytami T a komórkami dendrytycznymi prezentującymi antygen^{1, 2}. Wreszcie, faza III charakteryzuje się oddzielaniem się limfocytów T od komórek dendrytycznych, odzyskaniem ruchliwości i rozpoczęciem podziałów^{1, 2}. Jest to przykład rodzaju interakcji swoistych dla antygenu, które można analizować za pomocą obrazowania dwufotonowego komórek dendrytycznych obciążonych antygenem i znakowanych barwnikiem typu cell tracker.

Protokół

1) Usuń obie kości udowe od jednej myszy

1. Za pomocą nożyczek sekcyjnych odciąć mięśnie, aby odsłonić kość udową powyżej i poniżej stawów (kolanowego i biodrowego). Chwycić środek kości udowej pęsetą sekcyjną i przeciąć powyżej oraz poniżej stawów, pozostawiając nasadę kości w możliwie najmniej zmienionym stanie.
2. Za pomocą małych nożyczek sekcyjnych usunąć jak największą ilość tkanki mięśniowej. Przenieść kość udową do naczynia z pożywką RPMI.
3. Od tego momentu wszystkie procedury należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając wyłącznie sterylnych pożywek, narzędzi, końcówek do pipet i naczyń hodowlanych.

2) Sterylizacja kości udowych:

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść kości z medium RPMI do małej szalki hodowlanej wypełnionej 70% etanolem na lodzie.
2. Pozostawić kości do namoczenia w etanolu na lodzie przez 5 minut.

3) Pobierz szpik kostny w warunkach sterylnych:

1. Przenieś kości do małej szalki hodowlanej zawierającej sterylnie filtrowaną pożywkę do hodowli pierwotnych komórek DC.
2. Za pomocą sterylnej pęsety przytrzymaj kość nad naczyniem lub probówką na odpady i za pomocą sterylnych nożyczek odetnij każdą nasadę (końce kości). Cięcie powinno odsłonić szpik kostny, który w centrum kości ma jaskrawoczerwony kolor.
3. Za pomocą sterylnej strzykawki (igła o rozmiarze 26-28 G) pobierz około 100-200 mL sterylnej pożywki.
4. Przytrzymaj kość sterylną pęsetą nad nową szalką ze sterylną pożywką i wprowadź igłę do jednej z części kości. Umieść końcówkę igły w pobliżu górnej części kości i powoli wypłukuj kość sterylną pożywką. Jeśli igła znajduje się w centrum kości, powinna wsunąć się z łatwością.
5. Szpik kostny wypłukuje się w postaci małych fragmentów lub jednego większego kawałka. Należy go całkowicie wypłukać z kości do szalki ze sterylną pożywką .
6. Powtarzaj ten krok w razie potrzeby, aż szpik zostanie całkowicie wypłukany z kości.
7. Gdy kość będzie czysta, stanie się biała i półprzezroczysta.
8. Powtórz tę procedurę z drugą kością udową. Każdą kość udową wyrzuć po jej oczyszczeniu.

4) Ponowne zawieszenie i wirowanie komórek szpiku kostnego:

1. Przenieś komórki do sterylnej probówki typu Falcon.
2. Jeśli szpik jest nadal w całości, bardzo delikatnie pipetuj pożywkę w górę i w dół w naczyniu, aby rozbić szpik do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Może to zająć kilka minut i powinno być wykonywane powoli, aby uniknąć zniszczenia komórek przez siły ścinające.
3. Odwiruj komórki w sposób analogiczny do innych komórek ssaków.

5) Liza komórek:

1. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę z wirówki i zlej pożywkę (dekantuj) do małego naczynia na odpady (probówka typu Falcon 50 mL) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Resuspenduj osad, delikatnie uderzając w dno probówki.
3. Przy użyciu sterylnej filtrowanej wody oraz 10x DPBS lub 10x PBS przeprowadź lizę wodną w celu usunięcia erytrocytów (RBC), stosując następujące objętości:
   • 900 mL sterylnej filtrowanej wody
   • 100 mL 10x DPBS lub 10x PBS
4. Dodaj 100 mL 10x PBS od 5 do 10 sekund po dodaniu wody. Bardzo ważne jest, aby zrobić to niezwłocznie, tak aby uległy lizie wyłącznie erytrocyty. Zaleca się, aby obie pipety były napełnione i przygotowane do użycia.
5. Dodaj 5 mL – 10 mL sterylnej podstawowej pożywki DC.

6) Policz komórki:

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wymieszać od 6 do 11 ml komórek szpiku kostnego, delikatnie obracając probówką i lekko ją odwracając, nachylenie pod kątem 45 stopni (nie w taki sposób, aby pożywka dotykała górnej części probówki)
2. Przenieś 10 ml pożywki do sterylnej probówki w celu dokonania odczytu.
3. Ponownie zakręć probówki z komórkami i raz jeszcze odwiruj je w wirówce.

7) Wysiew komórek dendrytycznych:

1. Komórki należy wysiać z gęstością 1 x 106/mL.
2. Wyjąć komórki z wirówki, odlać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości Primary DC Media w celu wysiania.
3. Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych. 

8) Pielęgnacja i dojrzewanie kultur:

Zawsze należy sprawdzić hodowle przed dodaniem kolejnej porcji pożywki lub wykorzystaniem ich w jakichkolwiek eksperymentach. Należy ocenić ogólną kondycję komórek i sprawdzić, czy nie doszło do zanieczyszczenia.

DZIEŃ 0: Wysianie komórek dendrytycznych.

DZIEŃ 3: Usunąć 75% pożywki oraz nieprzylegających komórek, a następnie ponownie dodać pożywkę do pierwotnych komórek DC.

DZIEŃ 6: Po wstępnym wysiewie komórek: Ponownie wysiej komórki zgodnie z poniższą procedurą:

1. Usunąć medium, które na tym etapie powinno zawierać część nieprzylegających komórek dendrytycznych, i przenieść je do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml, pozostawiając płytki lekko wilgotnymi (aby zapobiec wysychaniu komórek przylegających).
2. Do każdej płytki należy dodać 3 mM EDTA w PBS i odstawić pozostawić na 5 minut.
3. Trzymając płytkę pod kątem 45 stopni, należy delikatnie pipetować pożywkę w górę i w dół przy dnie płytki, aby łagodnie oderwać nieprzylegające komórki.
4. Roztwór EDTA/PBS powinien stać się gęstszy, co wskazuje na zbieranie komórek z dna płytki.
5. Po kilku minutach mieszaninę komórek można przenieść do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml.
6. Po wykonaniu tej procedury dla każdej płytki należy odwirować wszystkie komórki.
7. Należy policzyć komórki i wysiać je w nowym sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm w pożywce Secondary DC Media z gęstością 1 x 10^6 komórek na płytkę. Następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych.

DZIEŃ 10-11

Dojrzałe komórki dendrytyczne gotowe do stymulacji/obciążania antygenem.

9) Stymulacja komórek dendrytycznych:

1. Do aktywacji i ładowania peptydów należy użyć LPS (lipopolisacharydu) w połączeniu z wybranym peptydem. W zależności od źródła LPS, lepsze wyniki mogą przynieść różne warunki stymulacji. Ponadto należy zoptymalizować pożądaną ilość peptydu do prezentacji przez DC. Warunki stymulacji w niniejszym protokole wynosiły 100 ng/mL LPS oraz 100 ug/mL OVA (owalbuminy). 
2. Obciążyć antygenem/traktować LPS przez 18-24 godziny przed zbiorem/użyciem.

Pożywka do komórek dendrytycznych: przefiltrować sterylnie po dodaniu wszystkich składników

Przegląd różnych warunków hodowli komórek dendrytycznych oraz wynikającego z nich fenotypu komórek dendrytycznych znajduje się w sekcji dyskusji. Przedstawione warunki hodowli zostały opracowane w celu uzyskania dojrzałych komórek dendrytycznych, które 18-24 godziny po iniekcji podskórnej szybko migrują do drenujących węzłów chłonnych i efektywnie prezentują antygen.

Podłoże do pierwotnych DC: Przefiltrować sterylnie po dodaniu wszystkich składników

• 500 mL IMDM (odjąć 55-60 mL, aby uzyskać końcową objętość 500 mL)
• 50 mL inaktywowanej termicznie FBS
• 5 mL 200 mM L-Gln, końcowe stężenie 2 mM
• 100 IU/mL penicyliny i 100 mg/mL streptomycyny (5 mL roztworu stokowego 10 000 IU/mL Pen i 10 000 mg/mL Strep)
• 50 uM B-Me (roztwór stokowy 14,3 M B-Me, rozcieńczyć 1:100 w dygestorium chemicznym, użyć 35 ul na 100 mL medium dla stężenia 50 micromolar)
• 20-30 ng/mL GM-CSF
• 100-400 IU/mL IL-4, w przybliżeniu 10- 40 ng/mL

Pożywka SecondaryDC do dojrzewania*

100 ng/mL TNF-alpha (dodać do pożywki dla pierwotnych DC)

* Uwaga: GM-CSF + IL-4 powinny prowadzić do powstania niedojrzałych komórek dendrytycznych. Zastosowanie GM-CSF + IL4 (400 IU/ul) + TNF-alpha (100 ug/mL) spowoduje powstanie komórek przypominających dojrzałe komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów. Znane jest, że dojrzałe komórki dendrytyczne nie pobierają antygenu tak efektywnie jak komórki niedojrzałe, a w kulturach może występować endogenny TNF-a uwalniany z komórek zrębu⁴.

Dyskusja

Komórki dendrytyczne są kluczowymi mediatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i najskuteczniejszymi zidentyfikowanymi do tej pory komórkami prezentującymi antygen. Metody hodowli ludzkich i mysich komórek dendrytycznych opisane w literaturze różnią się rodzajem cytokin stosowanych w celu wpływania na rozwój różnych typów komórek dendrytycznych. W szczególności GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha i IFN-gamma są stosowane w różnych kombinacjach w celu wytworzenia in vitro dojrzałych, niedojrzałych, zapalnych oraz ...