Wytwarzanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego do stosowania w obrazowaniu 2-fotonowym

Podsumowanie

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfoidalnych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T. Tutaj pokazujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego, aktywację i znakowanie do obrazowania 2-fotonowego.

Streszczenie

W literaturze można znaleźć kilka metod przygotowania mysich komórek dendrytycznych. Tutaj przedstawiamy metodę, która wytwarza ponad 85% komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości CD11c w hodowli, która mieści się w drenującym węźle chłonnym po wstrzyknięciu podskórnym i przedstawia antygen limfocytom T specyficznym dla antygenu (patrz wideo). Dodatkowo używamy Essen Instruments Incucyte do śledzenia dojrzewania komórek dendrytycznych, gdzie w 10 dniu morfologia hodowanych komórek jest typowa dla dojrzałej komórki dendrytycznej, a <85% komórek to CD11chigh. Badanie prezentacji antygenu w obwodowych węzłach chłonnych za pomocą obrazowania 2-fotonowego wykazało, że istnieją trzy odrębne fazy interakcji komórek dendrytycznych i limfocytów T^{1, 2}. Faza I składa się z krótkich kontaktów szeregowych między wysoce ruchliwymi limfocytami T specyficznymi dla antygenu a komórkami dendrytycznymi przenoszącymi antygen^{1, 2}. Faza druga charakteryzuje się przedłużonymi kontaktami między limfocytami T specyficznymi dla antygenu a komórkami dendrytycznymi zawierającymi antygen^{1, 2}. Wreszcie faza III charakteryzuje się tym, że limfocyty T odłączają się od komórek dendrytycznych, odzyskują ruchliwość i zaczynają dzielić^{się 1, 2}. Jest to jeden z przykładów rodzaju interakcji specyficznych dla antygenu, które można analizować za pomocą obrazowania dwufotonowego komórek dendrytycznych znakowanych antygenem i znakowanych barwnikiem komórek śledzących komórki.

Protokół

1) Usuń obie kości udowe z jednej myszy

1. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć mięśnie i odsłonić kość udową powyżej i poniżej stawów (kolano i biodro). Chwyć środek kości udowej pęsetą preparacyjną i przetnij powyżej i poniżej stawów, aby pozostawić jak największą część nasady nienaruszoną.
2. Oczyść jak najwięcej mięśni za pomocą małych nożyczek do preparowania. Przenieś kość udową do naczynia z RPMI.
3. Od tego momentu wszystkie procedury powinny być wykonywane w kapturze, przy użyciu wyłącznie sterylnych pożywek, narzędzi, końcówek pipet i naczyń hodowlanych.

2) Sterylizuj kości udowe:

1. W kapturze przenieś kości z RPMI do małego naczynia hodowlanego wypełnionego 70% etanolem na lodzie.
2. Pozwól kościom moczyć się w etanolu przez 5 minut na lodzie.

3) Pobieranie szpiku kostnego w sterylnych warunkach:

1. Przenieś kości do małego naczynia hodowlanego zawierającego sterylne, przefiltrowane pierwotne pożywki hodowlane DC.
2. Za pomocą sterylnej pęsety przytrzymaj kość nad wyrzuconym naczyniem lub rurką, a sterylnymi nożyczkami odetnij każdą epifezę (końce kości). Cięcie powinno odsłonić szpik kostny, który jest jaskrawoczerwony w środku kości.
3. Za pomocą sterylnej strzykawki (igła o rozmiarze 26-28) odessać około 100-200 ml sterylnego podłoża.
4. Przytrzymaj kość sterylną pęsetą nad świeżym naczyniem ze sterylnym podłożem i wbij igłę w jedną stronę kości. Umieść końcówkę igły w pobliżu górnej części kości i powoli wypłucz kość sterylnym podłożem. Jeśli znajdujesz się w środku kości, igła powinna łatwo się wsunąć.
5. Szpik kostny wypłukuje się w małych kawałkach lub jako pojedynczy kawałek. Należy go wypłukać z kości i umieścić w naczyniu ze sterylnym podłożem.
6. W razie potrzeby powtórz ten krok, aby całkowicie wypłukać szpik z kości.
7. Kiedy kość jest czysta, będzie biała i półprzezroczysta.
8. Powtórz tę procedurę z drugą kością udową. Wyrzuć każdą kość udową, gdy jest czysta.

4) Ponownie zawiesić i zawirować komórki szpiku kostnego:

1. Przenieś komórki do sterylnej probówki sokoła.
2. Jeśli szpik jest nadal nienaruszony, bardzo delikatnie pipetuj pożywkę w górę i w dół w naczyniu, aby rozbić szpik na zawiesinę jednokomórkową. Może to potrwać kilka minut i powinno być wykonywane powoli, aby uniknąć zabijania komórek samą siłą.
3. Odwiruj komórki tak, jak w przypadku innych komórek ssaków.

5) Liza komórek:

1. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę z wirówki i wylej pożywkę (dekantację) do małego odpadu (50 ml probówki sokoła) w okapie.
2. Ponownie zawiesić pellet, delikatnie przesuwając spód tuby.
3. Używając sterylnej przefiltrowanej wody i 10x DPBS lub 10x PBS, przeprowadź lizę wody w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC) przy użyciu następujących objętości:
   • 900 ml sterylnej przefiltrowanej wody
   • 100 ml 10x DPBS lub 10x PBS
4. Dodaj 100 ml 10x PBS 5-10 sekund po dodaniu wody. Bardzo ważne jest, aby zrobić to natychmiast, aby tylko erytrocyty uległy lizie. Dobrym pomysłem jest posiadanie zarówno napełnionych, jak i gotowych pipet.
5. Dodaj 5 ml – 10 ml sterylnego podłoża zasadowego DC.

6) Policz komórki:

1. W kapturze wymieszaj od 6 do 11 ml komórek szpiku kostnego, delikatnie obracając probówkę z lekkim odwróceniem, przechyleniem o 45 stopni (nie tak, aby podłoże dotykało górnej części probówki)
2. Wyjmij 10 ml pożywki do sterylnej probówki w celu zliczenia.
3. Ponownie zamknij komórki i ponownie odwiruj.

7) Posiewanie komórek dendrytycznych:

1. Komórki należy posiać w gęstości 1 x 106/ml.
2. Usunąć komórki z wirówki, zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pierwotnego podłoża prądu stałego do posiewu.
3. Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych. 

8) Pielęgnacja i dojrzewanie kultury:

Zawsze sprawdzaj kultury przed dodaniem większej ilości mediów lub użyciem w jakichkolwiek eksperymentach. Sprawdź ogólny stan komórek i poszukaj potencjalnego zanieczyszczenia.

DZIEŃ 0: Komórki dendrytyczne platerowane.

DZIEŃ 3: Usuń 75% nośników i komórek nieprzylegających i dodaj z powrotem główne nośniki DC.

DZIEŃ 6: Po wstępnym posiewie komórek: Ponownie pokryj komórki, korzystając z następującej procedury:

1. Usuń pożywkę, która w tym momencie powinna zawierać pewne nieprzylegające DC i umieść w sterylnej probówce falcon o pojemności 50 ml, pozostawiając płytki bardzo lekko mokre (nie chcesz, aby przylegające komórki wyschły)
2. Dodaj 3 mM EDTA w PBS do każdej płytki i pozostaw na 5 minut.
3. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni i delikatnie dobij media do dna płytki w górę i w dół, aby delikatnie usunąć nieprzylegające komórki.
4. EDTA/PBS powinien stać się grubszy, co oznacza, że komórki są zbierane z dna płytki.
5. Po kilku minutach mieszaninę komórek można przenieść do probówki Falcon o pojemności 50 ml.
6. Po wykonaniu tej procedury odkręć wszystkie komórki dla każdej płytki.
7. Policz i pokrzyżuj komórki z gęstością 1 x 10 ^ 6 na płytkę w wtórnych pożywkach DC w nowych sterylnych naczyniach hodowlanych o średnicy 10 cm. Przywrócić komórki do inkubatora do hodowli tkankowych.

DZIEŃ 10-11

Dojrzałe DC gotowe do stymulacji/ładowania antygenem.

9) Stymulacja komórek dendrytycznych:

1. Użyj LPS (lipopolisscacharydu) w połączeniu z pożądanym peptydem do aktywacji i obciążenia peptydowego. W zależności od źródła LPS, różne warunki stymulacji mogą dać lepsze wyniki. Dodatkowo należy zoptymalizować pożądaną ilość peptydu do prezentacji DC. Warunki stymulacji w tym protokole wynosiły 100 ng/ml LPS i 100 ug/ml OVA (albumina jaja kurzego). 
2. Załaduj antygen/potraktuj LPS na 18-24 godziny przed zbiorem/użyciem.

Dendrytyczne podłoże komórkowe: Sterylny filtr po dodaniu wszystkiego

Proszę zobaczyć sekcję dyskusji, aby zapoznać się z różnymi warunkami hodowli komórek dendrytycznych i wynikającym z nich fenotypem komórek dendrytycznych. Te warunki hodowli mają na celu wytworzenie dojrzałych komórek dendrytycznych, które szybko wracają do drenujących węzłów chłonnych 18-24 godziny po wstrzyknięciu podskórnym i skutecznie prezentują antygen.

Podstawowe media DC: Sterylny filtr po dodaniu wszystkiego

• 500 ml IMDM (usuń 55-60 ml dla 500 ml końcowej objętości)
• 50 ml inaktywowany termicznie FBS
• 5 ml 200 mM L-Gln, końcowe stężenie 2 mM
• 100 j.m./ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny (5 ml 10 000 j.m./ml wstrzykiwacza i 10 000 mg/ml staciorkowca)
• 50 uM B-Me (14,3 M bulion B-Me, rozcieńczyć 1:100 w kapturze chemicznym, użyć 35 ul na 100 ml podłoża dla stężenia 50 mikromolowych)
• 20-30 ng/mL GM-CSF
• 100-400 j.m./ml IL-4 około 10-40 ng/ml

Drugorzędne media DC do dojrzewania*

100 ng/mL TNF-alpha (dodać do podstawowych pożywek DC)

* Uwaga: GM-CSF + IL-4 powinny wytwarzać niedojrzałe komórki dendrytyczne. Użycie GM-CSF + IL4 (400 IU / ul) + TNF-alfa (100 ug / mL) stworzy komórki przypominające dojrzałe komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów. Wiadomo, że dojrzałe komórki dendrytyczne nie pobierają antygenu tak skutecznie, jak niedojrzałe komórki dendrytyczne i hodowle mogą mieć endogenny TNF-a uwalniany z komórek zrębu⁴.

Dyskusja

Komórki dendrytyczne są kluczowymi mediatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i najbardziej efektywną komórką prezentującą antygen scharakteryzowaną do tej pory. Metody hodowli komórek dendrytycznych u ludzi i myszy w literaturze różnią się rodzajem cytokin stosowanych do wpływania na rozwój różnych typów komórek dendrytycznych. Warto zauważyć, że GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa i IFN-gamma są stosowane w różnych kombinacjach do wytwarzania dojrzałych, niedojrzałych, zapalnych i w stanie ustalonym, takich jak...